JP2003509027A - クリーンな合成ベクター、プラスミド、トランスジェニック植物、及びこれらを含む植物の部分、並びにこれらを得る方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、クリーンな合成ベクターであって、興味有る一以上の遺伝子を真核細胞、特には植物細胞へ導入することを容易及び改善することを意図したものに関する。本発明はまた、これらのベクターを得る方法、並びにこれらを含む遺伝子導入植物にも関する。 本発明は、クリーンな合成ベクターであって、植物のバイオテクノロジー分野において遺伝的形質転換に対して特に使用されるものに関する。本発明は、完全に既知のヌクレオチド配列の、小型サイズの、クリーンな合成ベクター、 特にはバイナリープラスミドであって、最もよく使用される既存のベクターのものよりも顕著に複製速度の速いものを提示するものに関する

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、クリーンな合成ベクターであって、植物のバイオテクノロジー分野
において遺伝的形質転換に対して特に使用されるものに関する。

【０００２】 生物工学及び遺伝子操作の分野ベクターが、一般に知られている。しかしなが
ら、遺伝的 形質転換、特に植物 のバイオテクノロジーにおいて最も普通に使用
される現在のベクターは、使用において複数の不利な点を提示する。事実、そし
て特に植物の遺伝子導入の場合、pBin19 (Frisch et al.，1995)とよばれるベク
ターがしばしば使用されている。このバイナリー（二成分）プラスミドpBin19
の全核酸配列が知られている。しかしながら、このプラスミドはサイズが大きく
(11.8 kbp)、即ち制御の観点からは無用、又は良好な複製にとっては有害でさえ
もあるエレメント(pBin19の半分を越える)を含んでいることが問題である。更に
、このプラスミドの選択カセットは、T-ＤＮＡの右側の境界の近傍に位置してい
る。従って、このT-ＤＮＡ を上記の選択カセットより切断した場合には、 所望
の遺伝子の発現カセットを有する植物のみを保持するためのいかなる選択も不可
能となる。

【０００３】 本願の明細書及び特許請求の範囲において使用される表現は、以下の意味を有
する。

【０００４】 -「ベクター」とは、発現システムを意味し、例えば ＤＮＡ被覆の発射体、核
酸ベースの移行性ビヒクル、核酸のデリバリーに順応した核酸分子、及びプラス
ミド、コスミド、ファージミド等の自律性自己複製性環状DNAである。微生物又
は組換細胞の培養物を「発現ベクター」の宿主として記載する場合には、これは
更に染色体外環状ＤＮＡ(例えば、ミトコンドリア又は葉緑体のＤＮＡ)、宿主の
染色体内へ組み込まれたＤＮＡをも含むが、ここで当該ベクターは、自律構造、
宿主のゲノム内に組み込まれたもの、又は宿主の核内若しくは細胞質内に維持さ
れたもののいずれかとして、有糸分裂中の細胞により安定な様式において複製さ
れる。

【０００５】 -遺伝的 形質転換に使用されるベクターは通常は、プラスミドの形態において
存在する。この場合、「プラスミド」は、自律性の環状ＤＮＡであって、細胞内
で複製できる分子である。微生物又は 組換細胞の培養物を、「発現」プラスミ
ドの宿主として記述する場合、これには染色体外の環状ＤＮＡ分子及び宿主染色
体内へ組み込まれたＤＮＡの両方を含む。プラスミド が宿主細胞により維持さ
れる場合、当該プラスミドは、自律性構造、又は宿主のゲノム内に組み込まれた
もののいずれかとして、有糸分裂中の細胞により安定した様式において複製する
;

【０００６】 -「クリーンな」とは、ベクターがその機能性に不可欠な配列のみを含み、そ
して宿主細胞の発現に不可欠なエレメントのみを含む核酸配列を有することを意
味する;

【０００７】 -「核酸」とは、ＤＮＡ又は ＲＮＡを意味する;

【０００８】 -「核酸配列」とは、 ５’末端から3’末端へと読まれるヌクレオチド塩基の
単一鎖若しくは二本鎖のオリゴマー又はポリマーを意味し、そして自己複製性プ
ラスミド、遺伝子、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリマーを含むが、これらは感染性で
あってもそうでなくてもよく、そして DNA、 又はRNAは、機能的であっても、又
は非機能的であってもよい。本願で使用するヌクレオチドの表記においては、特
に言及しないかぎり、一本鎖核酸配列の左側の末端は、５’末端である;

【０００９】 -「誘導された（由来の）核酸配列」とは、参照する配列から直接的に又は間
接的に由来する配列を意味し、例えば一以上のヌクレオチドの、置換、欠失、付
加、変異、断片化、及び／又は合成によるものがある;

【００１０】 -「プロモータ」とは、翻訳開始コドンの上流にあり、ＲＮＡ ポリメラーゼ及
び他の転写蛋白質の認識及び結合に関与する核酸領域を意味する；

【００１１】 -「植物プロモータ」とは、 植物細胞において転写を開始できるプロモータで
ある;

【００１２】 -「構成性プロモータ」とは、当該プロモータに操作可能に結合した核酸配列
を、宿主生物の全て又は実質的に全ての組織において、当該生物の全体の発生中
に、発現できるプロモータである；

【００１３】 -「組織特異的プロモータ」とは、当該プロモータに操作可能に結合した核酸
配列を、当該宿主生物中のある特異的な組織において選択的に発現できるプロモ
ータである;

【００１４】 -「操作可能に結合」とは、機能的又は調節エレメント、例えばプロモータの
、発現するための核酸配列又は遺伝子であって、蛋白質をコードするものへの結
合であって、結合した当該核酸配列の転写にこのエレメントが影響を与えるよう
にする結合を意味する;

【００１５】 -「発現カセット」とは、核酸 配列又は遺伝子であって、産生するポリペプチ
ド をコードするものの、そのような配列に適合性のある宿主生物中での発現を
指示することができる核酸配列を意味する。このようなカセットには、少なくと
も 一の プロモータ及び転写終結シグナル、そして適宜、他の因子であって、発
現に必要又は有用ものを含む;

【００１６】 -「異種配列」又は「異種核酸配列」とは、一の供給源又は一の種由来の、そ
の環境に対して外来の配列、あるいは同じ環境に由来する場合には、もともとの
形態に対して修飾されたもの、を意味する。当該核酸配列の修飾は、例えば 当
該核酸を制限酵素で処理して、プロモータへ操作可能に結合できる核酸断片を作
り出すことにより行える。この修飾は更に、定方向突然変異誘発等の技術により
行える;

【００１７】 -「ボックス」とは、制御機能を担う核酸配列を意味する;

【００１８】 「〜様（like）」とは、この用語が連結しているボックス及び／又は核酸配列
が、参照配列とよばれるボックス及び／又は既知の核酸配列に関して、配列の同
一性又はコンセンサスを有するものを意味し、好ましくは参考配列に関して、少
なくとも 50%の配列同一性、より好ましくは少なくとも 75%の配列同一性、 そ
して より特には、少なくとも90%の配列同一性を有する ものである。配列同一
性の割合は、少なくとも 6 ヌクレオチド塩基の比較ウィンドウに基づいて計算
する。比較ウィンドウの決定 は、参考配列との相同性を決定するための配列整
列アルゴリズム、 例えば局所相同性アルゴリズム、相同性整列アルゴリズム、
及び類似度検索アルゴリズムを利用して行うことができるが、これらのアルゴリ
ズムは、コンピュータ化した形態でも存在し、ＧAP、BESTFIT、FASTA、及びTFAS
TAの名称で知られる。この配列同一性の割合は、参考配列を当該ボックス及び／
又は当該核酸配列と比較することにより得られる;

【００１９】 -「位置する」とは、同定されたエレメント、 例えば「ボックス」、制限部位
、又はコドンであって、特定の機能を有するものの核酸配列上の位置を意味する
。図に示される位置は、エレメントの開始の、当該核酸配列中の位置であって、
後者の読取の方向にあるもの、即ち5'->3‘の方向にあるものを意味する;

【００２０】 -「遺伝子組換え植物」とは、遺伝的 操作 技術により得られた植物 を意味し
、得られた植物全体、その子孫、及び当該植物の器官、例えば根、茎、及び葉で
あって、これらの技術で得られるものが含まれる。本発明の遺伝子組換え植物は
、異なるレベルの倍数性、特には多倍数性、二倍性、及び一倍性をとることがで
きる;

【００２１】 -「ムカゴ」とは、 植物細胞のクラスター又は会合を意味し、組織立っていて
もよく組織立っていなくてもよく、植物全体の再生を許容するもの、例えば外植
片、カリ（calli）、 茎、 葉、根、切穂、そして種子さえをも意味する。

【００２２】 本発明者らは、驚くべきことに、完全に既知のヌクレオチド配列の、小型サイ
ズの、クリーンな合成ベクター、 特にはバイナリープラスミドであって、前記
の不利な点を解消することを許容し、最もよく使用される既存のベクターのもの
よりも顕著に複製速度の速いものを提示するものの製造に成功した。更に本発明
者らは同時に、考慮する適用及びその使用環境に応じて使用することが簡便であ
り、従って、産生するポリペプチドをコードする、発現遺伝子の発現速度をより
良好に制御できるようにするものを選択することができるようにして一連のベク
ターを産生することに成功した。

【００２３】 更に、本発明のベクターの中のいくつかにおいては、それぞれの機能的エレメ
ント又は成分を、単純な酵素消化により単離することができる。

【００２４】 本発明の主題は従って、クリーンな合成ベクターであって、その機能性及び細
胞、特には植物細胞の遺伝子導入に不可欠なエレメントのみを含むものである。

【００２５】 好ましい 態様によれば、当該ベクターは、その機能性及び細胞の遺伝子導入
に不可欠であり、 操作可能に結合されるエレメントとして、以下のものを含む
。

【００２６】 -少なくとも 一の 核酸配列であって、少なくとも一の、第一の複製開始点、
好ましくはori RK2、そしてより好ましくは広い宿主範囲の、大腸菌のpRK２の少
なくとも一の ori V をコードするもの;

【００２７】 -少なくとも 一の 核酸配列であって、選択因子、好ましくは 抗生物質の耐性
遺伝子、 より好ましくは npt III 遺伝子であって、細菌にカナマイシン耐性を
付与するものをコードするもの;

【００２８】 -trfA 遺伝子座であって、少なくとも 一の 蛋白質を コードし、プラスミド
、好ましくは pRK2由来のもの、そして より好ましくは 蛋白質P285 及びP382を
コードするものの複製速度の増加を許容するもの。

【００２９】 より好ましい態様によれば、当該ベクターは、配列番号：01により同定される
核酸配列を含む。更により好ましくは、当該ベクターは、単一のプラスミドpMRT
1105であって、その核酸配列が、配列番号：01により同定されるものからなる。

【００３０】 他の好ましい態様によれば、当該ベクターには、少なくとも 一の核酸配列で
あって、第二の複製開始点、好ましくは大腸菌のori 、そして より好ましくはo
ri ColEIをコードするものが含まれる。より好ましくは当該ベクターは、核酸配
列であって、配列番号：02により同定されるものを含み、そして更により好まし
くは、当該ベクターは、単一のプラスミド pMRT1106であってその核酸配列が配
列番号：02により同定されるものからなる。

【００３１】 好ましくは、本発明による合成ベクターは、少なくとも 一の 核酸 配列であ
って、複数のユニークな 制限酵素部位（集合的に複数クローニング部位 (MCS)
とよばれるもの）からなる領域を含む。

【００３２】 好ましい態様によれば当該ベクターはまた、核酸配列であって、右側の境界RB
及び左側の境界LBを含んだT-ＤＮＡを含み、当該ベクターがバイナリープラス
ミドとして作用することを許容するものをコードするものが含まれる。

【００３３】 好ましくはMCSは、T-ＤＮＡの右側の境界RB の近傍に位置する。

【００３４】 他の好ましい態様によれば当該ベクターはまた、核酸配列であって、前記のT-
ＤＮＡの前記左側の境界 LBと前記右側の境界RBとの間に位置する、少なくとも
一の 発現 プロモータ 及び少なくとも一の転写 ターミネータをコードするもの
を含む。より好ましくは発現プロモータは、構成性プロモータ、 誘導性プロモ
ータ、 特異的プロモータからなる群より選択され、そして好ましくは、植物発
現プロモータより選択される。更により好ましくは、 発現プロモータは、35S C
aMVプロモータ、CaMVのep35S、 エンドウマメプラストシアニン遺伝子プロモー
タ、その「エンハンサー」領域、及び誘導体、コムギ 「高分子量 グルテニン」
(HMWＧ)プロモータ、 「キャッサバ葉脈モザイクウイルス」CsVMVプロモータ、
「ツユクサ黄色斑紋ウイルス」 CoYMVプロモータ、CsVMVプロモータ及びCoYMVプ
ロモータのキメラプロモータ、並びにこれらの誘導体からなる群より選択される
。

【００３５】 好ましくは発現ターミネータは、植物細胞中で機能的なターミネータより選択
され、そして好ましくは35S又はnosターミネータである。

【００３６】 更に他の好ましい態様によれば当該ベクターは、少なくとも一の 核酸配列で
あって、植物細胞中で機能的な選択因子をコードするもの、好ましくは少なくと
も一の酸配列であって、抗生物質の耐性遺伝子、及び／又は除草剤耐性遺伝子を
コードするものを含む。

【００３７】 選択因子をコードする配列は好ましくは、bar (ビアラフォス耐性)耐性遺伝子
又はpat(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ) 遺伝子をコードする
配列、あるいは耐性遺伝子 nptIIの変異体又は野生型 をコードする 配列である
。より好ましくは、選択因子をコードする核酸配列は、前記T-ＤＮＡの左側の境
界の近傍に位置する。

【００３８】 本発明の他の好ましい態様によれば当該ベクターは、少なくとも一の発現 カ
セットであって、発現される核酸配列に対して操作可能にして結合した発現促進
性核酸配列であって、産生されるポリペプチドをコードし、それ自身は転写終結
核酸配列に結合しているものを含む。好ましくは当該産生されるポリペプチドは
、酵素若しくは蛋白質、又は後者の誘導体であって、試験管内で、及び／又はヒ
トにおいて、及び／又は動物中において活性を有するものであり、当該活性には
、消化の、膵臓の、胆管の、抗-ウイルスの、抗-炎症の、 肺の、 抗菌の、栄養
の、 化粧の、構造の、血液の、心臓血管の、眼の、抗原の、免疫促進の、及び
大脳の、活性が含まれる。このような蛋白質の例としては例えば インスリン、
インターフェロン、 胃の、膵臓の又は胆汁のリパーゼ、エラスターゼ、例えば
α-1 抗トリプシン等の抗プロテアーゼ、例えばコラーゲン等の構造蛋白質、例
えばラクトフェリン等のトランスフェリン、例えばヘモグロビン等の血液由来の
蛋白質、 ヒトのアルブミン、及び血液補助因子、及び例えばスーパーオキシド
ディスムターゼ等の抗酸化物がある。

【００３９】 本発明の特に好ましい態様によれば当該ベクターは、二成分の形態で提示され
、線状又は環状のプラスミドであって、下記により同定される核酸配列からなる
群より選択される：配列番号：03、 配列番号：04、 配列番号：05、 配列番号
：06、 配列番号：07、 配列番号：08、 配列番号：09、配列番号：10、 配列番
号：11、 配列番号：12、 配列番号：13、 配列番号：14、 配列番号：15、 配
列番号：16、配列番号：17、 配列番号：18、 配列番号：19、 配列番号：20、
配列番号：21 及び配列番号：22。

【００４０】 特に有益な態様によれば、当該ベクターのそれぞれの機能的成分は、他の成分
とは独立に切断することができる。好ましくはそれぞれの機能的成分 は、第一
のユニークな制限部位及び第二のユニークな制限部位であって、l ベクター中に
存在するもののレベルにおいて、酵素的消化により、他の成分とは独立的に切断
することができる。

【００４１】 本発明の他の目的は、単離された核酸配列であって、 以下により同定される
核酸配列からなる群より選択される核酸配列に対応することを特徴とするもので
ある：配列番号：01、 配列番号：02、 配列番号：03、 配列番号：04、 配列番
号：05、配列番号：06、 配列番号：07、 配列番号：08、 配列番号：09、 配列
番号：10、 配列番号：11、 配列番号：12、配列番号：13、 配列番号：14、 配
列番号：15、 配列番号：16、 配列番号：17、 配列番号：18、 配列番号：19、
配列番号：20、 配列番号：21 及び配列番号：22。

【００４２】 本発明の更に別の目的は、例えば前出のベクター又は核酸配列を含む細胞であ
る。当該細胞は好ましくは、植物細胞である。

【００４３】 本発明の他の目的は、トランスジェニック植物であって、そのゲノムに例えば
前出のベクター又は核酸配列が安定に組み込まれたものである。当該植物は好ま
しくは、 双子葉類の種、 例えばジャガイモ、タバコ、ワタ、レタス、トマト、
メロン、キュウリ、エンドウマメ、セイヨウアブラナ、 アオゲイトウ、若しく
はヒマワリ、又は単子葉類の種、例えばコムギ、オオムギ、エンバク、イネ、若
しくは トウモロコシより選択される。

【００４４】 本発明の更に別の目的は、例えば前出のトランスジェニック植物のムカゴであ
る。当該ムカゴは好ましくは、種子である。

【００４５】 本発明の別の目的は、核酸配列、又は遺伝子であって、細胞内で産生されるポ
リペプチドをコードするものの発現方法であって、下記の工程からなることを特
徴とするものである: -細胞をベクター又は核酸配列、例えば 前出のもので形質転換する; -当該細胞を、産生させるポリペプチドをコードする核酸配列又は遺伝子の発現
を許容する条件下で培養する。 当該細胞は好ましくは、原核生物の又は真核生物の細胞である。より好ましくは
当該細胞は、微生物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、及び植物細胞からな
る群より選択される細胞である。更により好ましくは当該細胞は、植物細胞であ
る。

【００４６】 本発明の更に別の目的は、例えば前出のトランスジェニック植物又はムカゴを
得る方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするものである： -植物細胞を、請求項１乃至２４のいずれか一項に記載の核酸又はこれを含むベ
クターで形質転換する; -当該ベクター又は核酸配列が中に組み込まれた植物細胞を選択する; -形質転換されそして選択された植物細胞を、 キメラの又はトランスジェニック
植物全体の培養又は再生のいずれかにより増殖させる。

【００４７】 故に本発明の当該新規の合成ベクター、そして好ましくはバイナリープラスミ
ドは、当該ベクターの機能性及び遺伝子導入に不可欠な領域のみを有する。本発
明者は、これらが高い複製速度を有することを発見した。更にこれらは選択カセ
ットを左側の境界近傍に有するのみならず、まれな制限部位をその「ポリリンカ
ー」(複数クローニング部位)に有することができる。

【００４８】 以下、添付された図面を参照しつつ実施例で示された異なる実施態様の詳細な説
明によって、本発明はより理解されるであろうが、これによって制限されるもの
ではない。 図面において、略語は以下の意味を有する： −ori RK2：広いホスト範囲を有する大腸菌のpRK2のori V、コピー数が低い不安
定なRK2レプリコン； −ori ColEI：大腸菌のレプリコンColE1の開始点； −npt III遺伝子：カナマイシン耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼをコードする； −npt II遺伝子：カナマイシン耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼをコードする； −trfA：レプリコンの開始点に結合することにより、プラスミドの複製を増進す
る２つのタンパク質P285とP382の生産を可能にする、pRK2起原のtrfA遺伝子座（
１４８１ｂｐ）； −Tnos：nos（ノパリンシンテターゼ）ターミネーター； −Pnos： nos（ノパリンシンテターゼ）プロモーター； −LB：T-DNAの左側の境界； −RB：T-DNAの右側の境界； −MCS：複数クローニング部位、S:XXXはMCSの開始塩基の番号を示し、E:XXXはMC
Sの終止塩基の数を示し、リストは上の最初の制限部位で開始し、下の最後の制
限部位で終止し、５’＞３’の方向； −polyA 35S：転写終止（ポリアデニル化）シグナル； −ｇus遺伝子：βグルクロニダーゼをコードする遺伝子； −IA：イネのアクチンイントロン； −PA：イネのアクチンプロモーター； −Phmwｇ：コムギの「高分子量グルテニン」プロモーター； −bar（「ビアラホス耐性」）遺伝子：グルホシネート耐性を与える酵素ホスフ
ィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子； −ep35S：３５リボソームの「増進されたプロモーター」；

【００４９】 実施例 以下の詳細な説明で、制限酵素による酵素消化のすべては、供給者New Enｇlan
d Biolabsの推奨する方法に従って行った。「QIAquick Ｇel Extraction」及び
「QIAquick PCR Purification」キットによる精製は、供給者QIAＧENの推奨する
方法に従って行った。「Concert Rapid PCR Purification System」キットは、
供給者ＧIBCO NRL Life Technoloｇiesの教示に従って用いた。用いた「ＧeneAm
p PCR System 9700」サーモサイクラーは、Perkin Elmer Applied Biosystemsに
より市販されている。

【００５０】 実施例１ １． pMRT1105の合成 本発明のクリーンな合成ベクターは好ましくは、ミニマルプラスミドpMRT1105（
３５０８ｂｐ）の形状で、提供され、以下の要素を含む： −ori RK2：広いホスト範囲を有する大腸菌のpRK2のori V、コピー数が低い不安
定なRK2レプリコン（６４３ｂｐ）； −npt III遺伝子：カナマイシン耐性を与える（細菌の選択マーカー、１３３７
ｂｐ）； −trfA：レプリコンの開始点に結合することにより、プラスミドの複製を増進す
る２つのタンパク質P285とP382の生産を可能にする、pRK2からの起原のtrfA遺伝
子座（１４８１ｂｐ）。

【００５１】 プラスミドpMRT1105は、「ori RK2」と「npt IIIの一部」の重なる延長部分の
スプライシングにより得られた断片と、ＰＣＲ（「ポリメラーゼ連鎖反応」）増
幅により生産される「trfAの一部」に相当する断片と、酵素消化により単離され
た「trfAとnpt IIIの一部」とのアセンブリにより得られる。

【００５２】 １．１ 「ori RK2とnpt IIIの一部」を有する断片の合成 「ori RK2」（６４３ｂｐ）を有するAvrII-StuI断片（６５４ｂｐ）を、５nｇの
pBin19マトリックスＤＮＡから、２つのオリゴヌクレオチド： AvrII制限部位を含む、 「配列表」5' AACCTAＧＧAAAAＧACCＧAＧCＧCCTTTＧC 3' （配列番号２３） と、StuI制限部位を有する、 「配列表」5' CＧＧATTAATＧＧTAＧAAＧＧCCTTTCACＧＧＧAＧＧＧTTCＧAＧAAＧ
Ｇ 3' （配列番号２４） を各２０ｐモルずつ用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μＭ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＳＯ4ｐH９．１、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ4 、２Ｕ
のELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液５０
μｌ中で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR System
9700」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡを、９
４℃３０秒の変性ステージ、５５℃３０秒のハイブリダイゼーション、６８℃４
５秒の延長からなるサイクルに１５回供した。その後、最後のサイクルで、延長
を６８℃３分間続けた。４０μｌのＰＣＲ反応液に、１２．５Ｕのクレノーフラ
グメント（New Enｇland Biolabs）を、各１０ｍＭのｄＮＴＰｓ ２μｌの存在
下で作用させた。３７℃１０分間反応を行った。こうして処理されたＰＣＲ産物
をついで、ＴＢＥ緩衝液中（９０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ Ｎａ２−ＥＤ
ＴＡ、９０ｍＭホウ酸、ｐＨ８．０ ）の２％アガロースゲル電気泳動により単
離し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製した。ＤＮＡを３０μ
ｌのＨ2Ｏ中で回収した。

【００５３】 「nptIIIの一部」（３４４ｂｐ）を有するStuI-BstXI断片（３６３ｂｐ）を、２
つのオリゴヌクレオチド： StuI制限部位を含む、 「配列表」5' TＧAAAＧＧCCTTCTACCATTAATCCＧCＧATAAACCCAＧCＧAACC 3' （配列番号２５） と、BstXI制限部位を有する、 「配列表」 5' ATＧCATCCAAAATTTTＧＧTAＧAATTTACAAＧCTATAAＧＧTTATTＧTCCTＧＧＧ 3' （配列番号２６） を用いた以外は、「ori RK2」断片と同様に増幅し、処理した。

【００５４】 ついで「ori RK2」と「npt IIの一部」を有する２つの断片は、「ori RK2とnpt
IIIの部分」断片を得るために、重なる延長部分のスプライシングによりアセン
ブリさせた。これを行うために、オリゴヌクレオチド： 「配列表」5' AACCTAＧＧAAAAＧACCＧAＧCＧCCTTTＧC 3' （配列番号２３） 「配列表」5' ATＧCATCCAAAATTTTＧＧTAＧAATTTACAAＧCTATAAＧＧTTATTＧTCCTＧ
ＧＧ 3' （配列番号２６） を各２０ｐモルずつ用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μＭ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＳＯ４ ｐＨ９．１、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２
ＵのELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液５
０μｌ中で、「ori RK2」と「npt IIIの一部」に相当する処理されたＰＣＲ産物
の各７．５μｌから、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR
System 9700」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮ
Ａを、９４℃３０秒の変性ステージ、６２℃３０秒のハイブリダイゼーション、
６８℃４５秒の延長からなるサイクルに１５回供した。その後、最後のサイクル
で、延長を６８℃３分間継続した。４０μｌのＰＣＲ反応液を、ＴＢＥ緩衝液中
の１．５％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QIAquick Ｇel Extraction
」キットを用いて精製した。「ori RK2」と「npt IIIの一部」を有する断片に相
当するＤＮＡを３０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。次に、このＤＮＡ２７μｌを、B
stXIで、その後AvrIIで加水分解し、ついで「QIAquick Ｇel Extraction」キッ
トを用いて精製し、３０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。

【００５５】 １．２ 「trfAの一部」を有する断片の合成 「trfAの一部」（２９５ｂｐ）を有するNdeI-AvrII断片（２９５ｂｐ）を２つの
オリゴヌクレオチド： NdeI部位の上流に位置する、 「配列表」5' ATCＧACＧAＧＧAAATCＧTCＧTＧCTＧTTTＧC 3' （配列番号２７） と、AvrII制限部位を有する、 「配列表」5' AAACCTAＧＧAAATＧCCAＧTAAAＧCＧCTＧＧC 3' （配列番号２８） を用いた以外は、「ori RK2」断片と同様に増幅し、処理した。ＰＣＲ増幅から
得られた「trfAの一部」に相当するＤＮＡ断片を「QIAquick Ｇel Extraction」
キットを用いて精製し、３０μｌのＨ2Ｏ中で回収し、AvrIIとNdeIにより加水分
解し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて再精製し、３０μｌのＨ2
Ｏ中で回収した。

【００５６】 １．３ 「trfAとnptIIIの一部」を有する断片の合成 「trfAとnptIIIの一部」（２１９６ｂｐ）を有するBstXI-NdeI断片（２１９６
ｂｐ）を９μｇのpBin19 DNAからBstIの酵素消化により単離し、「QIAquick Ｇe
l Extraction」キットを用いて精製し、ついでNdeIにより加水分解した。DNA断
片をついでＴＢＥ緩衝液中の０．９％アガロースゲル電気泳動により単離し、「
QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製し、３０μｌのＨ2Ｏ中で回収
した。

【００５７】 １．４ pMRT1105の取得 ３つの断片、「ori RK2とnpt IIIの一部」、「trfAとnptIIIの一部」、及び「
trfAの一部」をライゲーションした。これを行うために、「ori RK2とnpt IIIの
一部」と「trfAとnptIIIの一部」に相当する７．５μｌの消化断片と、「trfAの
一部」に相当する１１μｌの消化断片とを含む反応混合物を、SpeedVac AES1000
（SAVANT）を用いて濃縮して、８μｌとした。その後、１μｌのＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ×１０緩衝液（New Enｇland Biolabs）と４００単位のＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ酵素（New Enｇland Biolabs）を添加した。ライゲーションを、「ＧeneAmp
PCR System 9700」サーモサイクラー中で、３０℃３０秒と１０℃３０秒の２つ
のステージからなるサイクルの２００サイクルからなるＰＣＲ反応により行った
。細菌大腸菌 DH5αを、前もってコンピテントにして形質転換した（Hanahan、
１９８３）。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したLuria-Bertani培地（LB
、バクトトリプトン１０ｇ／ｌ。酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ、寒
天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．５）で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮ
Ａを、アルカリ溶解法（Birnboim及びDoly、１９７９）で抽出し、酵素消化と配
列決定で確認した。選択されて得られたプラスミドをpMRT1105（３５０８ｂｐ）
と名づけ、図１に示す。その完全な配列である配列番号１を配列表に示す。

【００５８】 ２． pMRT1106の合成 プラスミドpMRT1106（４０９８ｂｐ）は、大腸菌のレプリコンColE1の開始点
（「ori ColE1」）が加えられている点で、pMRT1105と異なる。 「ori ColE1」（５９０ｂｐ）を有する断片を、New Enｇland Biolabsにより市
販されているプラスミドpBR322から単離した。プラスミド（５μｇ）をNdeIによ
り消化し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製し、３０μｌのＴ
Ｅ緩衝液中（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．
０ ）中で回収した。こうして直線化されたプラスミドに、２０Ｕのクレノーフ
ラグメント（New Enｇland Biolabs）を、１２μｌの５００ｍMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５−５００ｍＭ ＭｇＣｌ2、６μｌの１Ｍジチオスレイトール、
各１０ｍMのｄＮＴＰｓ６μｌの存在下で、反応容量１２０μｌ、３７℃３０分
間作用させた。こうして処理された、直線化プラスミドを、「QIAquick Ｇel Ex
traction」キットを用いて精製し、３０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。ついで、Alw
NIで消化して「ori ColE1」を有する断片を単離し、「QIAquick Ｇel Extractio
n」キットを用いて精製し、６単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ New Enｇland
Biolabs ）を、１２μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ×１０緩衝液、４μｌの１
０ｍＭｄＮＴＰ、６μｌのＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌの存在下、１２０μｌの反応液中
で作用させた。３７℃３０分間反応を行った。ＤＮＡ断片をついで、ＴＢＥ緩衝
液中の１．２％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QIAquick Ｇel Extrac
tion」キットを用いて精製し、５０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。このＤＮＡ断片
をついで、StuIで消化したプラスミドpMRT1105（２μｇ）に挿入し、「QIAquick
Ｇel Extraction」キットを用いて精製し、５０単位のウシ腸アルカリンホスフ
ァターゼ（New Enｇland Biolabs）により、最終反応液１２０μｌ中、１２μｌ
の３×１０緩衝液（ New Enｇland Biolabs ）の存在下で、３７℃１時間脱リン
酸化し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製した。ＰＣＲ反応に
よるライゲーションを、１０ｎｇの消化された脱リン酸化ｐＭＲＴ１１０５プラ
スミドと「ori ColE1」を有する１００nｇのＤＮＡ断片を用いて、反応液１０μ
ｌ中で、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ×１０緩衝液（New Enｇland Biolabs）
と４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（New Enｇland Biolabs）の存在下で
行った。それは、「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー中で、１０℃
３０秒と３０℃３０秒の２つのステージからなるサイクルの１８０サイクルから
なる。細菌 大腸菌 DH5αを、前もってコンピテントにして形質転換した（Hana
han、１９８３）。得られたクローンの有効性を、細菌コロニーについて、２２
μｌのSuperMix PCR（ ＧIBCO BRL Life Technoloｇies ）の存在下、２４μｌ
の反応液中で、１０ｐモルの２つのオリゴヌクレオチド 「配列表」5' AACCTAＧＧAAAAＧACCＧAＧCＧCCTTTＧC 3' （配列番号２３） と「配列表」5' ATＧCATCCAAAATTTTＧＧTAＧAATTTACAAＧCTATAAＧＧTTATTＧTCCT
ＧＧＧ 3' （配列番号２６） を用いたＰＣＲテストにより確認した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR Sys
tem 9700」サーモサイクラー中で行った。９４℃、５分間の変性の後、ＤＮＡを
、９４℃３０秒の変性ステージ、６０℃３０秒のハイブリダイゼーション、７２
℃３０秒の延長からなるサイクルに３０回供した。その後、最後のサイクルで、
延長を７２℃７分間続けた。ＰＣＲ反応液をついで、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガ
ロースゲル電気泳動により単離した。配列「ori ColE1」の挿入は、約１．６ｋ
ｂｐ断片の存在により、目で確認した。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加し
たＬＢ培地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶
解法（Birnboim及びDoly、１９７９）で抽出し、酵素消化と配列決定で確認した
。選択されて得られたプラスミドをpMRT1106（４０９８ｂｐ）と名づけ、図２に
示す。その完全な配列である配列番号２を配列表に示す。

【００５９】 ３．pMRT1118の合成 プラスミドpMRT1118（５９７１ｂｐ）は、pMRT1106と、pMRT1106にクリーンな
転移DNA（T-DNA）が導入されている点で異なる。このクリーンなＴ−ＤＮＡは、
Aｇrobacterium tumefaciensノパリン株のプラスミドｐTiT37の右（RB）と左境
界（LB）の間に位置したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Aｇrobacteri
um tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子（nos、Depickerら、１９８２）
のプロモーターとターミネーターの制御下の変異nptII遺伝子発現カセット（Fri
schら、１９９５）からなる。

【００６０】 ３．1 「end nptII-Tnos-LB」を有する断片の合成 ３．１．１． LBを有する断片の取得 LB（１５１ｂｐ）を有するAvrII-SmaI断片（１７３ｂｐ）を、５nｇのpBin19マ
トリックスＤＮＡから、２つのオリゴヌクレオチド： AvrIIとAatIIの制限部位を含む、 「配列表」5' TTCCTAＧＧTTＧACＧTCTTCTＧATＧＧＧCTＧCCTＧTATCＧ 3' （配列番号２９） と、SmaI制限部位を有する、 「配列表」5' CCTATＧＧATATCCCCCＧＧＧＧＧATAＧCCCCAＧTACATTAAAAACＧTCC 3
' （配列番号３０） を各２０ｐモル用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μM、６０ｍM Ｔｒｉｓ−ＳＯ４
ｐＨ９．１、１８ｍM（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、２Ｕの
ELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液５０μ
ｌ中で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR System 97
00」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡを、９４
℃３０秒の変性ステージ、５５℃３０秒のハイブリダイゼーション、６８℃４５
秒の延長からなるサイクルに１５回供した。その後、最後のサイクルで、延長を
６８℃３分間続けた。４０μｌのＰＣＲ反応液に、１２．５Ｕのクレノーフラグ
メント（New Enｇland Biolabs）を、各１０ｍMのｄＮＴＰｓ２μｌの存在下で
作用させた。３７℃１０分間反応を行った。こうして処理されたＰＣＲ産物をつ
いで、ＴＢＥ緩衝液中の２％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QIAquick
Ｇel Extraction」キットを用いて精製した。ＤＮＡを５０μｌのＨ2Ｏ中で回
収した。

【００６１】 ３．１．２ nosターミネーター（Tnos）を有する断片の取得 nosターミネーター（２５６ｂｐ）を有するSmaI-BspEI断片（２８８ｂｐ）の取
得を２つのオリゴヌクレオチド： SmaI制限部位を含む、 「配列表」5'CTATCCCCCＧＧＧＧＧATATCCATAＧＧCCCＧATCTAＧTAACATAＧATＧAC
3' （配列番号３１） と、Bsp120I制限部位を有する、 「配列表」5' ＧCＧCACTTＧＧＧCCCATAＧCTCＧACＧAACＧATCＧTTCAAACATTTＧＧC
3' （配列番号３２） を用いた以外は、LBを有する断片と同様に増幅し、処理した。

【００６２】 ３．１．３． 「npt IIの末端」遺伝子（「end nptII」）を有する断片の取得 「end nptII」（２２１ｂｐ）を有する断片（２２１ｂｐ）の取得を２つのオリ
ゴヌクレオチド： Bsp120I制限部位を含む、 「配列表」5' TTCＧTCＧAＧCTATＧＧＧCCCAAＧTＧCＧCATCCCＧTＧＧＧCＧAAＧAA
CTC 3' （配列番号３３） と、BstBIの下流の、 「配列表」5' TTCTTＧACＧAＧTTCTTCTＧAＧCＧＧＧ 3' （配列番号３４） を用いた以外は、LBを有する断片と同様に増幅し、処理した。

【００６３】 ３．１．４．断片「end nptII−Tnos-LB」の取得 断片「LB」、「Tnos」、及び「end nptII」を、以下の２段階で、重なる延長部
分のスプライシングによりアセンブリした。 −断片「LB」と「Tnos」のアセンブリで断片「Tnos-LB」を得、 −断片「Tnos-LB」と「end nptII」のアセンブリで断片「end nptII-Tnos-LB」
を得る。

【００６４】 これを行うために、第１のＰＣＲ増幅を、「LB」及び「Tnos」に相当する、処理
されたＰＣＲ産物の各１０μｌから、オリゴヌクレオチド： 「配列表」5' TTCCTAＧＧTTＧACＧTCTTCTＧATＧＧＧCTＧCCTＧTATCＧ 3' （配列番号２９） と、「配列表」5' ＧCＧCACTTＧＧＧCCCATAＧCTCＧACＧAACＧATCＧTTCAAACATTT
ＧＧC 3' （配列番号３２） を各２０ｐモルずつ用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μＭ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＳＯ４ ｐＨ９．１、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、
２ＵのELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液
５０μｌ中で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR Sys
tem 9700」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡを
、９４℃４５秒の変性ステージ、６２℃４５秒のハイブリダイゼーション、６８
℃１分間の延長からなるサイクルに１５回供した。その後、最後のサイクルで、
延長を６８℃３分間続けた。４０μｌのＰＣＲ反応液に、１２．５Ｕのクレノー
フラグメント（New Enｇland Biolabs）を、各１０ｍＭのｄＮＴＰｓ２μｌの存
在下で作用させた。３７℃１０分間反応を行った。こうして処理された、断片「
Tnos-LB」（４７７ｂｐ）に相当するＰＣＲ産物をついで、ＴＢＥ緩衝液中の２
％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QIAquick Ｇel Extraction」キット
を用いて精製した。ＤＮＡを３０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。

【００６５】 第２のＰＣＲ増幅を、「end nptII」と「Tnos-LB」に相当する、処理されたＰＣ
Ｒ産物の各７μｌから、オリゴヌクレオチド： 「配列表」5' TTCCTAＧＧTTＧACＧTCTTCTＧATＧＧＧCTＧCCTＧTATCＧ 3' （配列番号２９） と、「配列表」5' TTCTTＧACＧAＧTTCTTCTＧAＧCＧＧＧ 3' （配列番号３４） を各２０ｐモルずつ用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μＭ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＳＯ４ｐＨ９．１、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２
ＵのELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液５
０μｌ中で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR Syste
m 9700」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡを、
９４℃４５秒の変性ステージ、６０℃４５秒のハイブリダイゼーション、６８℃
１分間の延長からなるサイクルに１５回供した。その後、最後のサイクルで、延
長を６８℃３分間続けた。この反応を、「end-nptII」と「Tnos-LB」に相当する
処理されたＰＣＲ産物について、３回反復する。ＰＣＲ反応液をついで、ＴＢＥ
緩衝液中の２％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QIAquick Ｇel Extrac
tion」キットを用いて精製した。「end nptII−Tnos-LB」に相当する、DNA断片
（６７２ｂｐ）を１００μｌのＨ2Ｏ中で回収した。次に、このＤＮＡ９５μｌ
を、AvrIIで加水分解し、ついで「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて
精製し、BstBIで加水分解し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精
製し、５０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。６３１ｂｐのAvrII-BstBIは配列「end np
tII−Tnos-LB」を有している。

【００６６】 ３．２．「nosプロモーター（Pnos）の末端とnptII遺伝子の開始」（「end Pnos
-st.nptII」）を有する断片の取得 「end Pnos-st.nptII」を有する断片（１０２３ｂｐ）を２つのオリゴヌクレオ
チド： 「配列表」5' ＧＧAATCＧAAATCTCＧTＧATＧＧCAＧＧ 3' （配列番号３９） と、「配列表」5' ATTATTＧCＧCＧTTCAAAAＧTCＧCC 3' （配列番号４０） を用い、ＤＮＡを、９４℃４５秒の変性ステージ、５５℃４５秒のハイブリダイ
ゼーション、６８℃１分の延長からなるサイクルに１５回供した以外は、LBを有
する断片と同様に増幅し、処理した。増幅は、pBin19 DNAの２試料について反復
した。

【００６７】 ３．３．断片「end Pnos−nptII−Tnos-LB」の取得 断片「end Pnos−st.nptII」及び「end nptII−Tnos-LB」を重なる延長部分のス
プライシングによりアセンブリさせ、断片「end Pnos−nptII−Tnos-LB」を作製
した。

【００６８】 これを行うために、PCR増幅を、「end Pnos−st.nptII」と「end nptII−Tnos-L
B」に相当する、処理されたＰＣＲ産物の各５μｌから、オリゴヌクレオチド： 「配列表」5' TTCCTAＧＧTTＧACＧTCTTCTＧATＧＧＧCTＧCCTＧTATCＧ 3' （配列番号２９） と、「配列表」5' ATTATTＧCＧCＧTTCAAAAＧTCＧCC 3' （配列番号４０） を各２０ｐモル用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μＭ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ
４ｐＨ９．１、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２Ｕの
ELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液５０μ
ｌ中で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR System 97
00」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡを、９４
℃４５秒の変性ステージ、５５℃４５秒のハイブリダイゼーション、６８℃１分
間の延長からなるサイクルに１５回供した。ついで、最後のサイクルで延長を６
８℃３分間継続した。この反応を、「end Pnos−st.nptII」と「end nptII−Tno
s-LB」に相当する処理されたPCR産物について、５回反復した。ＰＣＲ反応液を
ついで、ＴＢＥ緩衝液中の０．７％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QI
Aquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製した。断片「end Pnos−nptII−T
nos-LB」に相当するＤＮＡ断片（１６０８ｂｐ）を５０μｌのＨ２Ｏ中で回収し
た。次に、このＤＮＡに、６２．５Ｕのクレノーフラグメント（New Enｇland B
iolabs）を、１５μｌのクレノーフラグメント×１０緩衝液（New Enｇland Bio
labs）と各１０ｍＭのｄＮＴＰｓ１０μｌの存在下で作用させた。３７℃１０分
間反応を行った。こうして処理された、ＰＣＲ産物をついで、「QIAquick Ｇel
Extraction」キットを用いて精製し、５０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。

【００６９】 ３．４．「RB-MCS-st.Pnos」を有する断片の合成 ３．４．１ 「RBとマルチプルクローニング部位（MCS）」（「RB-MCS」）を有す
る断片の取得 「RB-MCS」を有する断片（２１０ｂｐ）を２つのオリゴヌクレオチド： KpnI、HindIII、EcoRI、及びXhoIの制限部位を有する、 「配列表」5' CＧＧTACCＧAAＧCTTTＧAATTCACTCＧAＧCAＧATTＧTCＧTTTCCCＧCC
3' （配列番号３５） と、AvrII及びAｇeIの制限部位を有する 「配列表」5' TATCCTAＧＧAACCＧＧTAAACCCTＧTＧＧTTＧＧCATＧC 3' （配列番号３６） を用いた以外は、LBを有する断片と同様に増幅し、処理した。

【００７０】 ３．４．２ 「複数クローニング部位（MCS）とnosプロモーター（Pnos）の開始
」（「MCS-st.Pnos」）を有する断片の取得 「MCS-st.Pnos」を有する断片（２０９ｂｐ）を２つのオリゴヌクレオチド： 「配列表」5' ATATＧAＧACTCTAATTＧＧATACCＧAＧＧＧＧ 3' （配列番号３７） と、 XhoI、 EcoRI、 HindIII、及びKpnIの制限部位を有する 「配列表」5' ＧCTCＧAＧTＧAATTCAAAＧCTTCＧＧTACCＧTTＧAAＧＧAＧCCACTCAＧ
CCＧ 3' （配列番号３８） を用いた以外は、LBを有する断片と同様に増幅し、処理した。

【００７１】 ３．４．３．「RB-MCS-st.Pnos」を有する断片の取得 断片「RB-MCS」及び「MCS-st.Pnos」を重なる延長部分のスプライシングにより
アセンブリさせ、断片「RB-MCS-st.Pnos」を作製した。

【００７２】 これを行うために、PCR増幅を、「RB-MCS」及び「MCS-st.Pnos」に相当する、処
理されたＰＣＲ産物の各１２μｌから、オリゴヌクレオチド： 「配列表」5' ATATＧAＧACTCTAATTＧＧATACCＧAＧＧＧＧ 3' （配列番号３７） と、「配列表」5' TATCCTAＧＧAACCＧＧTAAACCCTＧTＧＧTTＧＧCATＧC 3' （配列番号３６） を各２０ｐモルずつ用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μＭ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＳＯ４ｐＨ９．１、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２
ＵのELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液５
０μｌ中で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR Syste
m 9700」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡを、
９４℃３０秒の変性ステージ、６０℃３０秒のハイブリダイゼーション、６８℃
４５秒の延長からなるサイクルに１５回供した。最後のサイクルで延長を６８℃
３分間継続した。この反応を、「RB-MCS」及び「MCS-st.Pnos」に相当する処理
されたPCR産物の残りの各３×１２μｌについて、反復した。ＰＣＲ反応液をつ
いで、ＴＢＥ緩衝液中の２％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QIAquick
Ｇel Extraction」キット（QIAＧEN）を用いて精製した。断片「RB-MCS-st.Pno
s」に相当するDNA断片（３９０ｂｐ）を１００μｌのＨ2Ｏ中で回収した。次に
、このＤＮＡ９５μｌを、AvrIIで加水分解し、ついで「QIAquick Ｇel Extract
ion」キットを用いて精製し、Bsu36iで消化し、「QIAquick Ｇel Extraction」
キットを用いて精製し、５０μｌのＨ2Ｏ中で回収した。２９５ｂｐのAvrII-Bsu
36Iは配列「 RB-MCS-st.Pnos」を有している。

【００７３】 ３．５．Ｔ−ＤＮＡの合成 断片「RB-MCS-st.Pnos」及び「end Pnos-nptII−Tnos-LB」を重なる延長部分の
スプライシングによりアセンブリさせ、Ｔ−ＤＮＡ（１８８３ｂｐ）に相当する
断片「RB-MCS-Pnos-nptII−Tnos-LB」を作製した。

【００７４】 これを行うために、PCR増幅を、「RB-MCS-st.Pnos」に相当する、処理されたＰ
ＣＲ産物の４μｌから、及び「end Pnos-nptII−Tnos-LB」に相当する、処理さ
れたＰＣＲ産物の５μｌから、オリゴヌクレオチド： 「配列表」5' TTCCTAＧＧTTＧACＧTCTTCTＧATＧＧＧCTＧCCTＧTATCＧ 3' （配列番号２９） と、「配列表」5' TATCCTAＧＧAACCＧＧTAAACCCTＧTＧＧTTＧＧCATＧC 3' （配列番号３６） を各２０ｐモルずつ用いて、ｄＮＴＰｓを各２００μＭ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＳＯ４ｐＨ９．１、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２
ＵのELONＧASE酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）の存在下、最終反応液５
０μｌ中で、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、「ＧeneAmp PCR Syste
m 9700」サーモサイクラー中で行った。９４℃、３分間の変性の後、ＤＮＡを、
９４℃４５秒の変性ステージ、５５℃４５秒のハイブリダイゼーション、６８℃
１分の延長からなるサイクルに１５回供した。最後のサイクルで延長を６８℃３
分間継続した。この反応を、「RB-MCS-st.Pnos」及び「end Pnos-nptII−Tnos-L
B」に相当する処理されたPCR産物について、１０回反復した。ＰＣＲ反応液をつ
いで、ＴＢＥ緩衝液中の０．８％アガロースゲル電気泳動により単離し、「QIAq
uick Ｇel Extraction」キットを用いて精製した。Ｔ−ＤＮＡに相当するＤＮＡ
断片（１８８３ｂｐ）を１００μｌのＨ2Ｏ中で回収した。次に、このＴ−ＤＮ
ＡをAvrIIで加水分解し（１８７３ｂｐ断片）、「QIAquick Ｇel Extraction」
キットを用いて精製し、Bsu36iで消化し、１００μｌのＨ2Ｏ中で回収した。

【００７５】 ３．６．ｐＭＲＴ１１１８ の作製 AvrIIで消化したＴ−ＤＮＡ断片を、脱リン酸化したｐＭＲＴ１１０６プラス
ミドのAvrII部位に導入し、バイナリープラスミドｐＭＲＴ１１１８（５９７１
ｂｐ）を作製した。

【００７６】 これを行うために、ｐＭＲＴ１１０６プラスミドＤＮＡ（５μｇ）を、AvrII
で消化し、「QIAquick PCR Purification」キットを用いて精製し、次いで、１
２μｌの３ｘ１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs） 存在下、１２０μｌの最
終反応培地中、５０ユニットの子ウシ腸管アルカリホスファターゼ（New Enｇla
nd Biolabs）を用いて、３７℃で１時間脱リン酸化し、ＴＢＥ緩衝液中０．６％
アガロースゲル電気泳動で分離し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用い
て精製し、前記条件下で子ウシの腸管アルカリホスファターゼ酵素により２回脱
リン酸化し、最終的に「QIAquick PCR Purification」キットを用いて精製して
、５０μｌの水に戻した。

【００７７】 消化し、脱リン酸化したｐＭＲＴ１１０６プラスミド３２．５ｎｇと、消化し
たＴ−ＤＮＡ 断片５０ｎｇを用い、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ１０倍緩衝液
（New Enｇland Biolabs）と４００ ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（New E
nｇland Biolabs）を含む１０μｌの反応培地中で、ＰＣＲ反応によるライゲー
ションを行った。ＰＣＲ反応は、「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラ
ー中で、１０℃３０秒間と３０℃３０秒間の２段階を１サイクルとして１８０サ
イクル行った。

【００７８】 予めコンピテントにしておいた細菌、大腸菌 ＤＨ５αを、形質転換させた（H
anahan, 1983）。カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地上で選択さ
れて得られたクローンのプラスミド ＤＮＡを、アルカリ溶解法（Birnboimおよ
びDoly, 1979）により抽出し、酵素消化および 配列決定によって検証した。選
択されて得られたプラスミド をｐＭＲＴ１１１８（図３）と称す。 完全な配列
の配列番号０３を配列表に示す。

【００７９】 ４．ｐＭＲＴ１１１９の合成 プラスミドｐＭＲＴ１１１９（６０１６ｂｐ）は、ｐＭＲＴ１１１８の多重ク
ローニング部位ＭＣＳにおいて、付加的なユニークな制限酵素部位が追加されて
いる点で、ｐＭＲＴ１１１８と異なる。

【００８０】 ４．１．付加的でユニークな制限酵素部位の作製 付加的でユニークな制限酵素部位（XbaI、SalI、PacI、BamHI、MluI、HpaI、
およびFseI）を、5'AＧCTTＧＧCCＧＧCCＧTTAACACＧCＧTＧＧATCCTTAATTAAＧTC
ＧACTCTAＧAＧ 3'（配列番号４１）と 5'AATTCTCTAＧAＧTCＧACTTAATTAAＧＧATC
CACＧCＧTＧTTAACＧＧCCＧＧCCA 3'（配列番号４２）の２つのオリゴデオキシヌ
クレオチド間におけるハイブリダイゼーションにより作製した。これを行うため
に、２つのオリゴデオキシヌクレオチド各５μｇを混合し、８５℃で１分間保持
した後、８０℃まで５分間急冷し、次いで、水浴中で６０℃まで緩やかに冷やし
、最終的に、水浴の外で環境温度まで温度を急速に下げた。

【００８１】 ４．２．ｐＭＲＴ１１１９の作製 バイナリープラスミドｐＭＲＴ１１１９（６０１６ｂｐ）は、ユニークな制限
酵素部位を有する配列を、ｐＭＲＴ１１１８プラスミドのHindIIIとEcoRI部位に
導入して作製する。

【００８２】 これを行うために、ｐＭＲＴ１１１８プラスミドＤＮＡ(５μｇ)を、HindIII
とEcoRIで二重に消化し、「QIAquick PCR Purification」キットを用いて消化し
、５０μｌの水に戻した。

【００８３】 消化したｐＭＲＴ１１１８プラスミド７５ｎｇと、ユニークな制限酵素部位を
有する断片（４．１．に記載）５００ｎｇを用い、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ
１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
酵素（New Enｇland Biolabs）を含む１０μｌの反応培地中で、ＰＣＲ反応によ
るライゲーションを行った。ＰＣＲ反応は、「ＧeneAmp PCR System 9700 」サ
ーモサイクラー中で、１０℃３０秒間と３０℃３０秒間の２段階を１８０サイク
ル行った。

【００８４】 予めコンピテントにしておいた細菌の大腸菌ＤＨ５αを、形質転換させた（Ha
nahan, 1983）。カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地上で選択
して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（Birnboimおよび
Doly, 1979）により抽出し、酵素消化および配列決定によって検証した。選択し
て得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１１９（図４）と称する。完全な配列の配列
番号０４を配列表に示す。

【００８５】 ５．ｐＭＲＴ１１２１の合成 プラスミドｐＭＲＴ１１２１（６０１７ｂｐ）は、アグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス（Ｐｎｏｓ）のノパリンシンターゼプロモーターと変異nptII遺伝
子との間に、ユニークな制限酵素部位であるBspE1を、ｐＭＲＴ１１１９へ挿入
することにより得られる。

【００８６】 BspE1部位は、ＰＣＲ増幅によって得られた２つの断片のスプライシングオー
バーラップ伸長による構築により挿入された。

【００８７】 ５．１．「nptII とBspE1 部位の部分」を有する断片の合成 「nptII とBspE1 部位の部分」を有する８９２ｂｐの断片は、２００μＭの各
ｄＮＴＰ、６０mMのトリス硫酸ｐＨ９．１、１８ｍＭの硫酸アンモニウム、１．
８ｍＭの硫酸マグネシウム、および２Ｕのエロンガーゼ（eLONＧase）酵素（ＧI
BCO BRL Life Technoloｇies）を含む最終反応培地５０μｌ中、各２０ピコモル
の２つの オリゴデオキシヌクレオチドの 5' ＧＧAATCＧAAATCTCＧTＧATＧＧCA
ＧＧ 3'（配列番号３９）とBspE1 部位を有する5' TAATCTＧCATCCＧＧATCTＧＧA
TCＧTTTCＧC 3'（配列番号４３）を用いて、５ｎｇのｐＢＩＮ１９マトリックス
ＤＮＡからＰＣＲで増幅させた。この反応を繰り返した。ＰＣＲ増幅反応は、
「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー中で行った。ＤＮＡは、９４℃
で３分間変性させた後、９４℃４５秒間の変性、５５℃４５秒間のハイブリダイ
ゼーション、および６８℃1 分間の伸長を１サイクルとする１５サイクルにかけ
た。次いで、最後のサイクルで、伸長を６８℃で３分間続けた。このようにして
得られたＰＣＲを、ＴＢＥ緩衝液中、２%アガロースゲル電気泳動により分離し
、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製した。ＤＮＡは、５０μｌ
の水に戻した。

【００８８】 ５．２．「BspE1部位−ＭＣＳ」を有する断片の合成 「BspE1部位−ＭＣＳ」を有する断片（２５０ｂｐ）を、５ｎｇのｐＭＲＴ１
１１８マトリックスＤＮＡから、各２０ピコモルの２つのオリゴデオキシヌクレ
オチドの5' ＧCTCＧAＧTＧAATTCAAAＧCTTCＧＧTACCＧTTＧAAＧＧAＧCCACTCAＧCC
Ｇ 3'（配列番号３８）とBspE1 部位を有する5' ACＧATCCAＧATCCＧＧATＧCAＧA
TTATTTＧＧ 3'（配列番号４４）を用いて、ＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲによる
増幅条件と、得られたＰＣＲ断片の処理条件は、５．１．で記載した通りである
。

【００８９】 ５．３．「nptII-ＭＣＳ側」を有する断片の合成 「nptII-ＭＣＳ側」を有する１１１７ｂｐの断片は、スプライシングオーバー
ラップ伸長による２つのＰＣＲ断片「nptII−BspE1部位の部分」と「BspE1部位
−ＭＣＳ」の構築により得られる。 これを行うために、２００μＭの各ｄＮＴＰ、６０ｍＭのトリス硫酸ｐＨ９．１
、１８ｍＭの硫酸アンモニウム、１．８ｍＭの硫酸マグネシウム、２Ｕのエロン
ガーゼ酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）を含む５０μｌの最終反応培地
中、各２０ピコモルの２つの オリゴデオキシヌクレオチドの5' ＧＧAATCＧAAAT
CTCＧTＧATＧＧCAＧＧ 3'（配列番号３９）と5' ＧCTCＧAＧTＧAATTCAAAＧCTTC
ＧＧTACCＧTTＧAAＧＧAＧCCACTCAＧCCＧ 3'（配列番号３８）を用いて、「nptII
−BspE1部位の部分」と「BspE1部位−ＭＣＳ」に相当する２つのＰＣＲ処理産物
から、ＰＣＲ増幅 を行った。この反応を４回繰り返した。ＰＣＲ増幅反応は、
「ＧeneAmp PCR system 9700」サーモサイクラー中で行った。ＤＮＡは、９４℃
で３分間変性させた後、９４℃４５秒間の変性、６２℃４５秒間のハイブリダイ
ゼーション、および６８℃１分間の伸長を１サイクルとする１５サイクルにかけ
た。次いで、最後のサイクルで、伸長を６８℃で７分間続けた。このようにして
得られたＰＣＲを、ＴＢＥ緩衝液中、１%アガロースゲル電気泳動により分離し
、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製した。ＤＮＡは、５０μｌ
の水に戻し、Bsu361とPstIにより消化し、ＴＢＥ緩衝液中、２%アガロースゲル
電気泳動にかけた。３１５ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、「QIAquick Ｇel Extrac
tion」キットを用いて精製した。

【００９０】 ５．４．ｐＭＲＴ１１２１の作製 BspE1部位を有する３１５ｂｐのＤＮＡ断片Bsu361−PstIを、バイナリープラ
スミドｐＭＲＴ１１１９のBsu361とPstI部位にライゲーションした。 プラスミドｐＭＲＴ１１１９は、Bsu361とPstIにより予め消化し、ＴＥＢ緩衝
液中、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、「QIAquick Ｇel Extraction」キッ
トを用いて精製した。ＤＮＡは５０μｌの水に戻し、１２μｌの３ｘ１０倍緩衝
液（New Enｇland Biolabs）を含む１２０μｌの最終反応培地中、５０ユニット
の子ウシ腸管アルカリホスファターゼ（New Enｇland Biolabs）を用い、３７℃
で１時間脱リン酸化し、「QIAquick PCR Purification」キットを用いて精製し
た。

【００９１】 消化し、脱リン酸化したｐＭＲＴ１１１９プラスミド１００ｎｇと、消化した
ＤＮＡ断片（３１５ｂｐ）３０ｎｇを用い、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ１０倍
緩衝液（New Enｇland Biolabs）と４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（
New Enｇland Biolabs）を含む１０μｌの反応培地中で、ＰＣＲ反応によるライ
ゲーションを行った。これは、「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー
中、１０℃３０秒間と３０℃３０秒間の２段階を１サイクルとする１８０サイク
ルからなる。予めコンピテントにしておいた細菌である大腸菌ＤＨ５αまたはＳ
ＣＳ１１０（ＤａｍおよびＤｃｍメチラーゼで異なる）を形質転換させた（Hana
han、1983）。カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地上で選択さ
れて得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法によって抽出し、
酵素消化および配列決定によって検証した。得られたプラスミドをｐＭＲＴ１１
２１（図５）と称する。その完全な配列の配列番号０５を配列表に示す。

【００９２】 ６．ｐＭＲＴ１１２１の合成 プラスミドｐＭＲＴ１１２１（６０１６ｂｐ）は、BｇlII制限酵素部位を復元
し、野生型nptII遺伝子を作製するための、変異 nptII 遺伝子における点変異を
ｐＭＲＴ１１１９へ導入して得る。

【００９３】 これを行うために、Michaelの方法（１９９４）に従い、直接的な突然変異誘
発により、BｇlII制限酵素部位をｐＭＲＴ１１１９の変異nptII遺伝子に復元さ
せた。

【００９４】 オリゴデオキシヌクレオチドの5' ATＧＧＧTCACＧACＧAＧATCTTCＧCCＧTCＧＧ
Ｇ 3'（配列番号４５）は、予め、３０μｌのＴ４キナーゼ１０倍緩衝液（Amers
ham）と３μｌの１００ｍＭのＡＴＰを含む３００μｌの最終反応培地中、９０
ユニットのＴ４キナーゼ（Amersham）を用いて、６００ピコモルの該オリゴデオ
キシヌクレオチドを３７℃で３０分間処理することにより、リン酸化させた。こ
のように処理したオリゴデオキシヌクレオチドは、「Qiaquick Removal Nucleot
ide」（QIAＧEN）キットを用い、製造元の指示に従い精製した。

【００９５】 次いで、ＰＣＲによるライゲーションを、４００μＭの各ｄＮＴＰ、１０μｌ
のＴａｑＤＮＡリガーゼ１０倍緩衝液（New Enｇland BioLabs）、５ユニットの
ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（New Enｇland BioLabs）、４０ユニットのＴａｑ
ＤＮＡリガーゼ（New Enｇland BioLabs）を含む１００μｌの最終反応培地中、
各２００ピコモルのオリゴデオキシヌクレオチドの5' ＧＧAATCＧAAATCTCＧTＧA
TＧＧCAＧＧ 3'（配列番号３９）、BｇlII制限酵素部位を含み、リン酸化された
5' ATＧＧＧTCACＧACＧAＧATCTTCＧCCＧTCＧＧＧ 3'（配列番号４５）、および5
' ATTATTＧCＧCＧTTCAAAAＧTCＧCC 3'（配列番号４０）を用いて、１０ｎｇのｐ
ＢＩＮ１９マトリックスから行った。ＰＣＲライゲーション反応は、「ＧeneAmp
PCR System 9700」サーモサイクラー中、以下の３つの連続する段階：９４℃５
分間の変性、５０℃１分間のハイブリダイゼーション、および６５℃４分間の伸
長の１サイクルからなる第１段階、９４℃３０秒間の変性、５０℃１分間のハイ
ブリダイゼーション、および６５℃４分間の伸長を１サイクルとする２８サイク
ルからなる第２段階、および、９４℃３０秒間の変性、５０℃１分間のハイブリ
ダイゼーション、そして６５℃１５分間の伸長の１サイクルからなる最後の段階
、を行うことによって行った。次いで、ＰＣＲ反応培地を、ＴＢＥ緩衝液中、０
．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを
用いて精製した。このように処理したＤＮＡ断片（１０２３ｂｐ）を、NcoIとPs
tIにより加水分解し、２％アガロースゲル電気泳動にかけた。３８３ｂｐのＤＮ
Ａ断片を分離し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製し、５０μ
ｌの水に戻し、ｐＭＲＴ１１１９ プラスミドのNcoIおよびPstI部位にライゲー
ションした。これを行うために、ｐＭＲＴ１１１９ プラスミド ＤＮＡを、NcoI
とPstIで消化し、０．８％アガロースゲルで精製した。プラスミドに相当する断
片を分離し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製し、次いで、１
２μｌの３ｘ１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs）を含む１２０μｌの最終反
応培地中、５０ユニットの子ウシ腸管アルカリホスファターゼ（New Enｇland B
iolabs）を用いて、３７℃で１時間、脱リン酸化し、最後に５０μｌの水に戻し
た。

【００９６】 ＰＣＲによるライゲーションを、消化し、脱リン酸化したｐＭＲＴ１１１９
プラスミドと、全ての消化、処理したＤＮＡ断片を用いて、１μｌのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs）および４００ユニットのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ酵素（New Enｇland Biolabs）を含む１０μｌの反応培地中で行っ
た。それは、「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー中、１０℃３０秒
間と３０℃３０秒間の２段階からなる１８０サイクルからなる。

【００９７】 予めコンピテントにしておいた細菌の大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた（Hana
han, 1983）。カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地上で選択さ
れて得られたクローンのプラスミド ＤＮＡを、アルカリ溶解法（Birnboimおよ
びDoly, 1979）によって溶解し、BｇlIIによる消化によりスクリーニングした。
選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、酵素消化および配列決定によって検
証した。選択して得られたプラスミドを、ｐＭＲＴ１１２１（６０１６ｂｐ）と
称する。それを図６に示し、その完全な 配列の 配列番号０６を配列表に示す。

【００９８】 ７．ｐＭＲＴ１１５５の合成 プラスミドｐＭＲＴ１１５５（６０１７ｂｐ）は、BspE1の存在によりｐＭＲ
Ｔ１１２１と異なる。

【００９９】 これを行うために、Bsu361とPstIにより、ｐＭＲＴ１１２１を消化し、ＴＥＢ
緩衝液中、１．２％アガロースゲル電気泳動し、「QIAquick Ｇel Extraction」
キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻し、BspE1部位を含む３１５ｂｐの挿
入断片を得た。

【０１００】 ベクター断片は、Bsu361とPstIによりｐＭＲＴ１１２１を消化し、ＴＥＢ緩衝
液中、１．２％アガロースゲル電気泳動し、「QIAquick Ｇel Extraction」キッ
トを用いて精製し、５０μｌの水に戻すことにより得た。その後、消化したｐＭ
ＲＴ１１２１を、１２μｌの３ｘ１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs）を含む
１２０μｌの最終培地中、５０ユニットの子ウシ腸管アルカホスファターゼ（Ne
w Enｇland Biolabs）により、３７℃で１時間脱リン酸化し、「QIAquick PCR P
urification」キットを用いて精製した。

【０１０１】 １μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs）と４００
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（New Enｇland Biolabs）を含む１０μｌの
反応培地中、１００ｎｇの 脱リン酸化し、消化したｐＭＲＴ１１２１プラスミ
ドと、５０ｎｇの消化したＤＮＡ断片（３１５ｂｐ）を用いて、ＰＣＲ反応によ
るライゲーションを行った。それは、「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイ
クラー中、１０℃３０秒間と３０℃３０秒間の２段階を１サイクルとする１８０
サイクルからなる。予めコンピテントにしておいた細菌の大腸菌ＤＨ５αもしく
はＳＣＳ１１０（ＤａｍとＤｃｍメチラーゼで異なる）を形質転換させた(Hanah
an, 1983)。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択して得
られたクローンのプラスミド ＤＮＡを、アルカリ溶解法により抽出し、酵素消
化と配列決定により検証した。得られた プラスミドをｐＭＲＴ１１５５（図７
）と称する。その完全な配列の配列番号０７を配列表に示す。

【０１０２】 ８．配列「ｅＰ３５Ｓ−Ｔ３５Ｓ」を含む基礎のバイナリープラスミドの作製 ８．１． ｐＭＲＴ１２０５の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０５（７５０３ｂｐ）は、変異nptII遺伝子の発現カ
セットと興味のある遺伝子をクローニングするための「二重の３５Ｓプロモータ
ー−３５Ｓターミネーター」配列（ｅＰ３５Ｓ−Ｔ３５Ｓ）を含む。それは、カ
リフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）のｅＰ３５Ｓプロモーターを、ｐＭＲ
Ｔ１１７５にクローニングすることにより得られる。ＣａＭＶのｅＰ３５Ｓプロ
モーターは、３５ＳプロモーターのＴＡＴＡエレメントの上流に位置する転写活
性化配列の重複に相当する（Kay等、1987）。プラスミドｐＭＲＴ１１７５（６
７６７ｂｐ）に関しては、カリフラワーモザイクウィルスのＴ３５ＳをｐＭＲＴ
１１２１にクローニングすることにより得られる。転写終結配列であるＣａＭＶ
のＴ５３Ｓは、３５Ｓ転写物を産生するカリフラワーモザイクウィルスの環状二
本鎖ＤＮＡ配列の3'における非翻訳領域に相当する（Franck等、1980）。

【０１０３】 ８．１．１．ｐＭＲＴ１１７５の作製 プラスミドｐＭＲＴ１１７５は、Ｔ３５Ｓに相当するEcoRI−XhoI挿入ＤＮＡ
断片を、大腸菌株ＳＣＳ１１０から産生されたベクターｐＭＲＴ１１２１のEcoR
IとXhoI部位にクローニングすることにより得られる。

【０１０４】 ｐＭＲＴ１１２１ベクター断片は、７μｇのｐＭＲＴ１１２１を、EcoRIとXho
Iで消化し、「QIAquick PCR Purification」キットを用いて精製し、５０μｌの
水で戻すことにより得られた。その後、消化されたｐＭＲＴ１１２１は、１２μ
ｌの３ｘ１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs）を含む１２０μｌの最終反応培
地中、５０ユニットの子ウシ腸管アルカリホスファターゼ（New Enｇland Biola
bs）を用いて、３７℃で１時間脱リン酸化し、"QIAquick PCR Purification"キ
ットを用いて精製し、５０μｌの水に戻した。

【０１０５】 Ｔ３５Ｓ（７５０ｂｐ）に相当するEcoRI−XhoI挿入ＤＮＡ断片（７５７ｂｐ
）は、プラスミドｐＪＩＴ６０由来のプラスミドｐＪＩＴ１６３（Ｇuerineauと
Mullineaux, 1993）を、EcoRIとXhoIで消化することにより得られた。次いで、
これらを、ＴＥＢ緩衝液中、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、「QIAquick
Ｇel Extraction」キットを用いて精製し、３０μｌの水に戻した。

【０１０６】 脱リン酸化し、 消化したｐＭＲＴ１１２１プラスミド８０ｎｇと、消化した
挿入ＤＮＡ断片８０ｎｇを用いて、ＰＣＲ反応によるライゲーションを前７で記
載した通りに行った。予めコンピテントにしておいた細菌の大腸菌ＤＨ５αを、
形質転換させた。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択さ
れて得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法により抽出し、酵
素消化と配列決定により検証した。得られたプラスミドを、ｐＭＲＴ１１７５（
６７６７ｂｐ）と称する。それを図８に示し、その完全な配列の配列番号０８を
配列表に示す。

【０１０７】 ８．１．２．ｐＭＲＴ１２０５の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０５は、ｅＰ３５Ｓに相当するKpnI−HindIII挿入Ｄ
ＮＡ断片を、ベクターｐＭＲＴ１１７５のKpnIとHindIII部位にクローニングす
ることにより得られる。

【０１０８】 ｐＭＲＴ１１７５ベクター断片は、４．１μｇのｐＭＲＴ１１７５を、KpnIと
HindIIIにより消化し、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用
いて精製し、１００μｌの水に戻すことにより得られた。その後、消化したｐＭ
ＲＴ１１７５を、１２μｌの３ｘ１０倍緩衝液（New Enｇland Biolabs）を含む
１２０μｌの最終反応培地中、５０ユニットの子ウシ腸管アルカリホスファター
ゼ（New Enｇland Biolabs）により、３７℃で１時間脱リン酸化し、「Concert
Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻し
た。

【０１０９】 ｅＰ３５Ｓ（７３５ｂｐ）に相当するKpnI−HindIII挿入ＤＮＡ断片（７４３
ｂｐ）は、プラスミドｐＪＩＴ６０由来のプラスミドｐＪＩＴ１６３（Ｇuerine
auとMullineaux, 1993）を、KpnIとHindIIIで消化することにより得られた。 次
いで、それらをＴＥＢ緩衝液中、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、"QIAquic
k Ｇel Extraction"キットを用いて精製し、３０μｌの水に戻した。

【０１１０】 脱リン酸化し、消化したｐＭＲＴ１１７５プラスミド４８ｎｇと、消化した挿
入ＤＮＡ断片３０ｎｇを用いて、ＰＣＲ反応によるライゲーションを前７に記載
した通りに行った。予めコンピテントにしておいた細菌の大腸菌ＤＨ５αを、形
質転換させた。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地上で選択して
得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法により抽出し、酵素消
化と配列決定により検証した。得られたプラスミドを、ｐＭＲＴ１２０５（７５
０３ｂｐ）と称する。それを図１９に示し、その完全な配列の配列番号１９を配
列表に示す。

【０１１１】 ８．２．ｐＭＲＴ１２０３の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０３（７５０３ｂｐ）は、野生型nptII遺伝子の発現
カセットと興味のある遺伝子をクローニングするための「二重の３５Ｓプロモー
ター−３５Ｓターミネーター」配列（ｅＰ３５Ｓ−Ｔ３５Ｓ）を含む。それは、
カリフラワーモザイクウィルスのｅＰ３５Ｓ プロモーターをｐＭＲＴ１１７６
にクローニングすることにより得られる。プラスミドｐＭＲＴ１１７６（６７６
７ｂｐ）は、カリフラワーモザイクウィルスのＴ３５Ｓを、ｐＭＲＴ１１５５に
クローニングすることにより得られる。ｅＰ３５ＳプロモーターとＴ３５Ｓター
ミネーターについては、８．１．に記載している。

【０１１２】 ８．２．１．ｐＭＲＴ１１７６の作製 プラスミドｐＭＲＴ１１７６は、Ｔ３５Ｓ（７５０ｂｐ）に相当するEcoRI−X
hoI挿入ＤＮＡ断片（７５７ｂｐ）を、大腸菌株ＳＣＳ１１０から産生されたベ
クターのEcoRIとXhoI部位にクローニングすることにより得られる。

【０１１３】 クローニングベクターを構成する６．３μｇのベクターｐＭＲＴ１１５５を消
化、処理した以外は、８．１．１．に記載した方法に従って、プラスミドｐＭＲ
Ｔ１１７６を得た。プラスミド ｐＭＲＴ１１７６（６７６７ｂｐ）を図９に示
し、その完全な配列の配列番号０９を配列表に示す。

【０１１４】 ８．２．２．ｐＭＲＴ１２０３の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０３は、ｅＰ３５Ｓ（７３５ｂｐ）に相当するKpnI−
HindIII挿入ＤＮＡ断片（７４３ｂｐ）を、ベクターｐＭＲＴ１１７６のKpnIとH
indIII部位にクローニングすることにより得られる。

【０１１５】 クローニングベクターを構成する、３．９μｇのベクターｐＭＲＴ１１７６を
消化、処理した以外は、８．１．２．に記載した方法に従って、プラスミドｐＭ
ＲＴ１２０３を得た。プラスミドｐＭＲＴ１２０３（７５０３ｂｐ）を、図１７
に示す。その完全な配列の配列番号１７を配列表に示す。 ９．配列「ｅＰ３５Ｓ−uidA−Ｔ３５Ｓ」を含むバイナリープラスミドの作製 これらのベクターは、タバコの形質転換に、それらを評価し、nptII遺伝子の
変異の発生率を決定するために用いた。 ９．１．ｐＭＲＴ１２０６の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０６（９３９０ｂｐ）は、変異nptII遺伝子の発現カ
セットとuidA 遺伝子（ｇus）の発現カセットを含む。それは、カリフラワーモ
ザイクウィルスのｅＰ３５Ｓプロモーターを、ｐＭＲＴ１１９６にクローニング
することにより得られる。プラスミドｐＭＲＴ１１９６（８６５４ｂｐ）は、ui
dA 遺伝子（Jefferson RA 等、1986）を、ｐＭＲＴ１１７５にクローニングする
ことにより得られる。 ９．１．１．ｐＭＲＴ１１９６の作製 プラスミドｐＭＲＴ１１９６は、uidA 遺伝子に相当する挿入ＤＮＡ断片（Sma
I−「SacI + Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ」）を、ベクターｐＭＲＴ１１７５の「Xb
aI + クレノウ」部位にクローニングすることにより得られる。 ｐＭＲＴ１１７５ベクター断片は、１０μｇのｐＭＲＴ１１７５をXbaIで消化し
、「QIAquick PCR Purification」キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻し
、１２μｌの５００ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、５００ｍＭ塩化マグネシウム、
６μｌの１M ジチオスレイトール、および６μｌの各１０ｍＭｄＮＴＰを含む１
２０μｌの反応容量中、２０ユニットのクレノウ断片（New Enｇland Biolabs）
により、３７℃で３０分間処理して得た。次いで、これを「QIAquick PCR Purif
ication」キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻した。このように消化、処
理したプラスミドｐＭＲＴ１１７５を、１２μｌの３ｘ１０倍緩衝液（New Enｇ
land Biolabs）を含む１２０μｌの最終反応培地中で、５０ユニットの子ウシ腸
管アルカリホスファターゼ（New Enｇland Biolabs）により、３７℃で１時間脱
リン酸化し、「QIAquick PCR Purification」キットを用いて精製し、５０μｌ
の水に戻した。

【０１１６】 uidA遺伝子（１．８ｋｂｐ）に相当する挿入ＤＮＡ断片（２μｇ）は、ｐＢＩ
２２１（Clontech社製）をSacIにより消化し、「QIAquick PCR Purification」
キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻して得た。その後、消化したｐＢＩ２
２１を、１２μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ１０倍緩衝液、４μｌの１０ｍＭｄ
ＮＴＰ、および６μｌのＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌを含む１２０μｌの反応培地中、６
ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（New Enｇland Biolabs）により、３７℃で
３０分間処理した。 このように処理したプラスミドｐＢＩ２２１を、「QIAquic
k PCR Purification」キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻した。最後に、
このように処理したｐＢＩ２２１を、SmaIにより消化した。この（「SacI + Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ」−SmaI）断片（１８８２ｂｐ）を、０．８％アガロース
ゲル電気泳動により分離し、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製
し、５０μｌの水に戻した。

【０１１７】 脱リン酸化し、消化したｐＭＲＴ１１７５プラスミド１５ｎｇと、消化した挿
入ＤＮＡ断片１００ｎｇを用い、ＰＣＲ反応によるライゲーションを７に記載し
た方法に従い行った。予めコンピテントにしておいた細菌の大腸菌ＤＨ５αを、
形質転換させた。カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地上で選択
して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法により抽出し、酵
素消化と配列決定により検証した。得られたプラスミドを、ｐＭＲＴ１１９６（
８６５４ｂｐ）と称する。それを図１４に示し、その完全な配列の配列番号１４
を配列表に示す。

【０１１８】 ９．１．２．ｐＭＲＴ１２０６の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０６（９３９０ｂｐ）は、ｅＰ３５Ｓ（７３５ｂｐ）
に相当するKpnI-HindIII挿入ＤＮＡ断片（７４３ｂｐ）を、ベクターｐＭＲＴ１
１９６のKpnIとHindIII部位にクローニングすることにより得られる。

【０１１９】 プラスミドｐＭＲＴ１２０６ は、クローニングベクターを構成する２μｇの
ｐＭＲＴ１１９６を消化、処理した以外は、８．１．２に記載した方法に従って
得られた。それを図２４に示し、その完全な配列の配列番号２４を配列表に示す
。

【０１２０】 プラスミドｐＭＲＴ１２０６は、Holsters等（１９７８）の方法に従い、直接
的な形質転換により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株に挿入した。

【０１２１】 ９．２．ｐＭＲＴ１２０４の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０４（９３９０ｂｐ）は、野生型nptII遺伝子の発現
カセットと、uidA遺伝子の発現カセットを含む。それは、カリフラワーモザイク
ウィルスのｅＰ３５Ｓプロモーターを、ｐＭＲＴ１１９２にクローニングするこ
とにより得られる。プラスミドｐＭＲＴ１１９２（８６５４ｂｐ）は、uidA遺伝
子をｐＭＲＴ１１７６にクローニングすることにより得られる。

【０１２２】 ９．２．１．ｐＭＲＴ１１９２の作製 プラスミドｐＭＲＴ１１９２は、uidA遺伝子に相当する挿入ＤＮＡ断片（SmaI
−「SacI + Ｔ４ＤＮＡ ポリメラーゼ」）を、ベクターｐＭＲＴ１１７６の「Xb
aI + クレノウ」部位にクローニングすることにより得られる。

【０１２３】 プラスミドｐＭＲＴ１１９２（８６５４ｂｐ）は、クローニングベクターがｐ
ＭＲＴ１１７６である以外は、９．１．２に記載した方法に従って得た。 それ
を図１１に示し、その配列の配列番号１１を配列表に示す。

【０１２４】 ９．２．２．ｐＭＲＴ１２０４の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２０４（９３９０ｂｐ）は、ｅＰ３５Ｓ（７３５ｂｐ）
に相当するKpnI-HindIII挿入ＤＮＡ断片（７４３ｂｐ）を、ベクターｐＭＲＴ１
１９２のKpnIとHindIII部位にクローニングすることにより得られる。

【０１２５】 プラスミドｐＭＲＴ１２０４は、クローニングベクターを構成する２μｇのベ
クターｐＭＲＴ１１９２を消化、処理した以外は、８．１．２．に記載した方法
に従って得た。それを図１８に示し、その完全な配列の配列番号１８を配列表に
示す。

【０１２６】 プラスミドｐＭＲＴ１２０４を、Holsters等（１９７８）の方法に従い、直接
的な形質転換により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４
に導入した。

【０１２７】 １０．bar遺伝を含むバイナリープラスミドの作製 最後のプラスミドは、 トウモロコシおよび／またはタバコの形質転換に、そ
れらを評価するために用いた。

【０１２８】 １０．１．ｐＭＲＴ１２１０の作製 プラスミドｐＭＲＴ１２１０（１０００３ｂｐ）は、bar遺伝子の発現カセッ
トとuidA遺伝子の発現カセットを含む。それは、uidA遺伝子の発現カセットを、
ｐＭＲＴ１１９５にクローニングすることにより得られる。プラスミドｐＭＲＴ
１１９５（６８６５ｂｐ）は、配列「イネアクチン遺伝子のイントロン１が続く
プロモーター」（McElroy D 等、1991）を、ｐＭＲＴ１１９１にクローニングす
ることにより得られる。プラスミドｐＭＲＴ１１９１（４８０５ｂｐ）は、ｐＭ
ＲＴ１１１９由来である。

【０１２９】 １０．１．１．ｐＭＲＴ１１９１の作製 プラスミドｐＭＲＴ１１９１（４８０５ｂｐ）は、nosプロモーターと変異npt
II遺伝子配列が欠失している点で、ｐＭＲＴ１１１９と異なる。

【０１３０】 それは、１０μｇのｐＭＲＴ１１１９をＢｓｐ１２０Ｉで消化し、「QIAquick
PCR Purification」キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻して得られた。
その後、消化されたｐＭＲＴ１１１９と[sic]を、KpnIで加水分解し、「QIAquic
k PCR Purification」キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻し、１２μｌの
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０倍緩衝液、４μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、および６μ
ｌの1ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む１２０μｌの反応培地中、６ユニットのＴ４ＤＮ
Ａ ポリメラーゼ（New Enｇland Biolabs）で処理した。この反応は、３７℃で
３０分間行った。次いで、ベクター断片を、０．８％アガロースゲル電気泳動に
かけ、「QIAquick Ｇel Extraction」キットを用いて精製し、５０μｌの水に戻
した。

【０１３１】 このように処理されたプラスミド３０ナノグラムを、ＰＣＲ反応によるライゲ
ーション（７に記載の方法）により再度ライゲーションした。

【０１３２】 得られたプラスミドを、pMRT1191と称した。これは図１０に示されており、そ
の完全な配列である配列番号：１０は、配列表に記載されている。

【０１３３】 10.1.2. ｐＭＲＴ１２０１の取得 プラスミドｐＭＲＴ１２０１（７９４３ｂｐ）は、ｐＵＣ１９のEcoRIおよびH
indIII部位に挿入されたｕｉｄＡ発現カセットを有するプラスミドｐＵＣ１９-
Ｐｈｍｗｇ-ＩＡ-ｕｉｄＡ-Ｔｎｏｓ（New Enｇland Biolabsから市販）から単
離されたｕｉｄＡ遺伝子の発現カセットを挿入した点で、ｐＭＲＴ１１９１とは
異なる。このプラスミドは、連続的クローニングから得られる。配列「ｕｉｄＡ
遺伝子−ｎｏｓターミネーター」に対応するフラグメントを、「EcoRIとその後
のクレノウ断片の作用」およびSmaIによる連続的切断により、ｐＢＩ２２１△Sa
cI（＝ScaI部位がSacI切断とその後のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの作用により除
去されて、ライゲーションされたｐＢＩ２２１（Clontech））から単離した。単
離および精製されたフラグメントを、ｐＵＣ１９(Clontech)の「SmaI−［SphI＋
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ］」部位に挿入して、プラスミドｐＵＣ１９-ｕｉｄＡ
-Ｔｎｏｓを得た。その後、ｐＵＣ１９−ｕｉｄａ−ＴｎｏｓのBstBI−HindIII
フラグメントを、BstBI部位を含む５’AＧＧCATTＧＧTTTCＧAAＧCＧ３’（配列
番号：４６）と５’TACＧCCAAＧCTTＧＧCAATTCC３’（配列番号：４７）の二つ
のオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、ｐＵＣ１９−ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓマト
リックスからＰＣＲで増幅させたフラグメント（１０５４ｂｐ）の切断により得
られたBstBI−HindIIIフラグメントで置換することによって、Ｔｎｏｓの３’部
位に再形成されたEcoRI部位を除去した。得られたプラスミドを、ｐＵＣ１９−
ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓ△EcoRIと称した。次いで、ｕｉｄＡ遺伝子の開始コドンの
レベルにNcoI部位を導入するために、４４０ｐｂフラグメントを、NcoI部位とSm
aI部位とを含む５’AATACCCＧＧＧACCATＧＧTCCＧTCCTＧTAＧ３’（配列番号：
４８）とSnaBIの下流側に位置する５’ATAＧTCTＧCCAＧTTCAＧTTCＧTTＧ３’（
配列番号：４９）の二つのオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、ｐＵＣ１９−
ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓ△EcoRIマトリックスからＰＣＲで増幅させた。SmaIとSnaBI
によって切断されたＰＣＲフラグメントを、ｐＵＣ１９−ｕｉｄＡ −Ｔｎｏｓ△EcoRIに挿入して、存在するSmaI−SnaBIフラグメントを置換した。
得られたプラスミドを、ｐＵＣ１９−NcoI−ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓと称した。その
後、EcoRI−SmaIフラグメントによって保有される、Ｐｈｍｗｇプロモーター［
高分子量グルテニン(Hiｇh Molecular Weiｇht Ｇlutenin), Andersonら(1989)
］を、ｐＵＣ１９−NcoI−ｕｉｄＡ−ＴｎｏｓのEcoRIおよびSmaI部位に導入し
て、プラスミドｐＵＣ１９−Ｐｈｍｗｇ−ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓを生じた。最後に
、イネアクチン遺伝子のイントロン１（ＩＡ、EcoRV−SmaIフラグメント）は、
プラスミドｐＡｃｔ１−Ｆ６に由来し（McElroy Dら,1991）、これ自身は、ＩＡ
を含むEcoRV−SmaIフラグメントの両側における制限部位の付加により修飾され
ている。ＩＡを有するSmaI−NcoIフラグメントをｐＡＣｔ１−Ｆ６から単離して
、ｐＵＣ１９−Ｐｈｍｗｇ−ｕｉｄＡ−ＴｎｏｓのSmaIおよびNcoI部位に挿入し
て、プラスミドｐＵＣ１９−Ｐｈｍｗｇ−ＩＡ−ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓを生成した
。使用した技術は、本願において上述したものである。

【０１３４】 ｐＭＲＴ１１９１ベクターフラグメントを、EcoRIによる２μｇのpMRT1191の
切断、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いた精製、その
後、１２０μｌの反応容量中で、３７℃で、３０分間、１２μｌの５００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、６μｌの１Ｍ ジチオ
トレイトール、６μｌの１０ｍＭ 各ｄＮＴＰの存在下で、２０ユニットのクレ
ノウ断片（New Enｇland Biolabs）の作用、「Concert Rapid PCR Purification
System」キットを用いた精製、および、５０μｌのＨ２Ｏ中への回収により得
た。その後、切断および処理されたｐＭＲＴ１１９１を、１２μｌの３ｘ１０バ
ッファー（New Enｇland Biolabs）の存在下で１２０μｌの最終的な反応媒質に
おいて、３７℃で１時間、５０ユニットのウシ腸内アルカリホスファターゼ（Ne
w Enｇland Biolabs）を用いて脱リン酸化し、「Concert Rapid PCR Purificati
on System」キットを用いて精製し、５０μｌのＨ２Ｏ中に回収した。

【０１３５】 ｕｉｄＡ遺伝子の発現カセットに相当する挿入ＤＮＡフラグメント（２μｇ）
、すなわち、小麦“高分子量グルテニン”プロモーターに続くイネアクチン遺伝
子のイントロン１およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Aｇrobacteriu
m tumefaciens)のノパリンシンターゼターミネーターのコントロール下に配置さ
れたｕｉｄＡ遺伝子を、ｐＵＣ１９−Ｐｈｍｗｇ−ＩＡ−ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓの
ScaIによる切断（ｐＵＣ１９に存在する部位）、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精
製”キットを用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、HindIIIによる切断、“Ｑ
ＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”キットを用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、
１２０μｌの反応容量中で、３７℃で、３０分間、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、６μｌの１Ｍ ジチオトレ
イトール、６μｌの１０ｍＭ 各ｄＮＴＰの存在下で、２０ユニットのクレノウ
断片（New Enｇland Biolabs）による処理、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”
キットを用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、およびEcoRIによる切断によっ
て得た。その後、挿入ＤＮＡフラグメントを０．８％アガロースゲル電気泳動に
より単離し、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出”キットを用いて精製し、上述の
ようにクレノウ断片を作用させ、５０μｌのＨ２Ｏに回収した。

【０１３６】 ７において上述したように、ＰＣＲ反応によるライゲーションを、１０ｎｇの
脱リン酸化切断ｐＭＲＴ１１９１プラスミドと１００ｎｇの切断および処理され
た挿入ＤＮＡフラグメントを用いて行った。予め反応性とされた細菌、大腸菌Ｄ
Ｈ５αをトランスフォームした。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ
培地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法に
よって抽出し、酵素的切断および配列決定により確認した。得られたプラスミド
を、ｐＭＲＴ１２０１と称した（７９４３ｂｐ）。これは図１５に示されており
、その完全な配列である配列番号：１５を配列表に記載した。

【０１３７】 10.1.3. ｐＭＲＴ１２１０の取得 プラスミドｐＭＲＴ１２１０（１０００３ｂｐ）は、Komariら（１９９６）に
より記載されたｐＳＢ１２から誘導されるｐＳＢ１２−Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂａｒ
−Ｔｎｏｓから単離された配列“イネアクチン遺伝子−ｂａｒ遺伝子が後に続く
プロモーター”（Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂａｒ）が挿入されている点で、ｐＭＲＴ１
２０１とは異なる。プラスミドｐＳＢ１２−Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂａｒ−Ｔｎｏｓ
は、ＬＢ側のXhoI部位が削除されたｐＳＢ１２のSmaI部位およびBspDI部位への
、ｐＤＭ３０２から単離された発現カセット「Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂａｒ−Ｔｎｏ
ｓ」（ＢｓｐＤＩ−「XhoI＋クレノウ」フラグメント）のクローニングから得ら
れる。プラスミドｐＤＭ３０２は、Ｗｕ Ｒ．の研究室で作製され、Promeｇa社
から市販されているプラスミドｐＳＰ７２の発現カセット「Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂ
ａｒ−Ｔｎｏｓ」を含む。

【０１３８】 ｐＭＲＴ１２０１ベクターフラグメントは、HpaIによる２μｇのｐＭＲＴ１２
０１の切断、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いた精製
、および、９８μｌのＨ２Ｏ中への回収により得た。その後、切断されたｐＭＲ
Ｔ１２０１を、１２μｌの３ｘ１０バッファー（New Enｇland Biolabs）の存在
下で１２０μｌの最終的な反応媒質において、３７℃で１時間、５０ユニットの
ウシ腸内アルカリホスファターゼ（New Enｇland Biolabs）を用いて脱リン酸化
し、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製し、５０
μｌのＨ２Ｏ中に回収した。

【０１３９】 “Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂａｒ”（２．１ｋｂｐ）に相当する挿入ＤＮＡフラグメ
ント（２μｇ）を、ｐＢＩＯＳ２７３のXbaIによる切断、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ
ＰＣＲ精製”キットを用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、１２０μｌの反応
容量中で、３７℃で、３０分間、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．５−５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、６μｌの１Ｍ ジチオトレイトール、６μｌの
１０ｍＭ 各ｄＮＴＰの存在下で、２０ユニットのクレノウ断片（New Enｇland
Biolabs）による処理により得た。挿入ＤＮＡフラグメントを０．８％アガロー
スゲル電気泳動により単離し、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”キットを用い
て精製し、５０μｌのＨ２Ｏに回収した。

【０１４０】 ７において上述したように、ＰＣＲ反応によるライゲーションを、６０ｎｇの
脱リン酸化切断ｐＭＲＴ１２０１プラスミドと１００ｎｇの切断および処理され
た挿入ＤＮＡフラグメントを用いて行った。予め反応性とされた細菌、大腸菌Ｄ
Ｈ５αをトランスフォームした。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ
培地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法に
よって抽出し、酵素的切断および配列決定により確認した。得られたプラスミド
を、ｐＭＲＴ１２１０と称した。これは図２１に示されており、その完全な配列
である配列番号：２１を配列表に記載した。

【０１４１】 このプラスミドｐＭＲＴ１２１０を、Holstersら(1978)の方法に従って直接的
トランスフォーメーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢ
Ａ４４０４（ｐＳＢ１）［Komari Tら, 1996］および株ＬＢＡ４４０４に導入し
た。

【０１４２】 10.1.4. ｐＭＲＴ１１９３の取得 バイナリープラスミドｐＭＲＴ１１９３を、10.1.2.に記載したｐＵＣ１９-Ｐ
ｈｍｗｇ-ＩＡ-ｕｉｄＡ-Ｔｎｏｓから単離された配列「Ｐｈｍｗｇ−ＩＡ−ｕ
ｉｄＡ−Ｔｎｏｓ」を有する「EcoRI-［HindIII＋クレノウ断片作用］」フラグ
メントの、ｐＭＲＴ１１１９のEcoRIと［XhoI＋クレノウフラグメント作用］部
位に、クローニングすることによって得た。

【０１４３】 これを行うために、ｐＭＲＴ１１１９ベクターフラグメントを、XhoIによる１
０μｇのｐＭＲＴ１１１９の切断、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”キットを
用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、１２０μｌの反応容量中で、３７℃で、
３０分間、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５−５００ｍＭ
ＭｇＣｌ２、６μｌの１Ｍ ジチオトレイトール、６μｌの１０ｍＭ 各ｄＮＴＰ
の存在下で、２０ユニットのクレノウ断片（New Enｇland Biolabs）による処理
により得た。次いで、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”キットを用いた精製とE
coRIによる切断を行った。処理されたベクターフラグメントを０．８％アガロー
スゲル電気泳動により単離し、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”キットを用い
て精製し、５０μｌのＨ２Ｏに回収した。その後、切断されたｐＭＲＴ１１１９
を、１２μｌの３ｘ１０バッファー（New Enｇland Biolabs）の存在下で１２０
μｌの最終的な反応媒質において、３７℃で１時間、５０ユニットのウシ腸内ア
ルカリホスファターゼ（New Enｇland Biolabs）を用いて脱リン酸化し、“ＱＩ
Ａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”キットを用いて精製し、５０μｌのＨ２Ｏ中に回収
した。

【０１４４】 ｕｉｄＡ遺伝子の発現カセットに相当する挿入ＤＮＡフラグメント（２μｇ）
、すなわち、小麦“高分子量グルテニン”プロモーターに続くイネアクチン遺伝
子のイントロン１およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Aｇrobacteriu
m tumefaciens)のノパリンシンターゼターミネーターのコントロール下に配置さ
れたｕｉｄＡ遺伝子を、ｐＵＣ１９−Ｐｈｍｗｇ−ＩＡ−ｕｉｄＡ−Ｔｎｏｓの
ScaIによる切断（ｐＵＣ１９に存在する部位）、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精
製”キットを用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、HindIIIによる切断、“Ｑ
ＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”キットを用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、
１２０μｌの反応容量中で、３７℃で、３０分間、１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、６μｌの１Ｍ ジチオトレ
イトール、６μｌの１０ｍＭ 各ｄＮＴＰの存在下で、２０ユニットのクレノウ
断片（New Enｇland Biolabs）による処理、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製”
キットを用いた精製、５０μｌのＨ２Ｏに回収、およびEcoRIによる切断によっ
て得た。その後、挿入ＤＮＡフラグメントを０．８％アガロースゲル電気泳動に
より単離し、“ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出”キットを用いて精製し、５０μ
ｌのＨ２Ｏに回収した。

【０１４５】 ７において上述したように、ＰＣＲ反応によるライゲーションを、２０ｎｇの
脱リン酸化切断ｐＭＲＴ１１１９プラスミドと１００ｎｇの切断および処理され
た挿入ＤＮＡフラグメントを用いて行った。予め反応性とされた細菌、大腸菌Ｄ
Ｈ５αをトランスフォームした。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ
培地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法に
よって抽出し、酵素的切断および配列決定により確認した。得られたプラスミド
を、ｐＭＲＴ１１９３と称した（９１４３ｂｐ）。これは図１２に示されており
、その完全な配列である配列番号：１２を配列表に記載した。

【０１４６】 10.2. ｐＭＲＴ１１９５の取得 プラスミドｐＭＲＴ１１９５（６８５７ｂｐ）は、配列“イネアクチン遺伝子
のイントロン１−ｂａｒ遺伝子が後に続くプロモーター”（Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂ
ａｒ）が挿入されている点で、ｐＭＲＴ１１９１とは異なる。ベクターｐＭＲＴ
１１９１を、Bsp120IおよびKpnIで切断し、その後に酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させ、脱リン酸化したが、再リゲートされていないものが、10.1.1.に
記載したように得られた。

【０１４７】 10.1.3.に記載されているように、“Ｐａｃｔ−ＩＡ−ｂａｒ”（２．１ｋｂ
ｐ）に相当する挿入ＤＮＡフラグメントを得た。

【０１４８】 ７において上述したように、ＰＣＲ反応によるライゲーションを、２０ｎｇの
脱リン酸化切断ｐＭＲＴ１１９１プラスミドと１００ｎｇの切断および処理され
た挿入ＤＮＡフラグメントを用いて行った。予め反応性とされた細菌、大腸菌Ｄ
Ｈ５αをトランスフォームした。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ
培地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法に
よって抽出し、酵素的切断および配列決定により確認した。得られたプラスミド
を、ｐＭＲＴ１１９５と称した。これは図１３に示されており、その完全な配列
である配列番号：１３を配列表に記載した。

【０１４９】 10.3. ｐＭＲＴ１２０２の取得 プラスミドｐＭＲＴ１２０２（５６１４ｂｐ）は、大腸菌株ＳＣＳ１１０にお
いて産生されたｐＭＲＴ１１２１から単離されたアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスのノパリン合成（Ｐｎｏｓ）プロモーターで、配列“Ｐａｃｔ−ＩＡ”
が置換されている点でｐＭＲＴ１１９５と相違する。

【０１５０】 ｐＭＲＴ１１９５ベクターフラグメント（２μｇ）を、PstIで切断し、「Conc
ert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製し、９８μｌのＨ２
Ｏ中に回収し、１２μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼｘ１０バッファー、４μｌの
１０ｍＭ ｄＮＴＰおよび６μｌのＢＳＡ １ｍｇ／ｍｌの存在下で１２０μｌの
反応媒質において、６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（New Enｇland Biola
bs）の作用により処理した。この反応を３７℃で３０分間行った。このベクター
フラグメントを、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いた
精製、５０μｌのＨ２Ｏ中への回収、HindIIIでの切断、０．８％アガロースゲ
ル電気泳動による単離、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを
用いた精製、９８μｌのＨ２Ｏ中への回収を行った。その後、切断および処理さ
れたｐＭＲＴ１１９５を、１２μｌの３ｘ１０バッファー（New Enｇland Biola
bs）の存在下で１２０μｌの最終的な反応媒質において、３７℃で１時間、５０
ユニットのウシ腸内アルカリホスファターゼ（New Enｇland Biolabs）を用いて
脱リン酸化し、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精
製し、５０μｌのＨ２Ｏ中に回収した。

【０１５１】 “Ｐｎｏｓ”に対応する挿入ＤＮＡフラグメントを、ｐＭＲＴ１１２１のBspE
I切断、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製し、９
８μｌのＨ２Ｏ中に回収し、１２０μｌの反応容量中で、３７℃で、３０分間、
１２μｌの５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５−５００ｍＭ ＭｇＣｌ２
、６μｌの１Ｍ ジチオトレイトール、６μｌの１０ｍＭ 各ｄＮＴＰの存在下で
、２０ユニットのクレノウ断片（New Enｇland Biolabs）による処理、「Concer
t Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製し、５０μｌのＨ２Ｏ
中に回収し、HindIIIにより切断して得た。Ｐｎｏｓ（２０９ｂｐ）を有する挿
入ＤＮＡフラグメント（２１９ｂｐ）を２％アガロースゲル電気泳動により単離
し、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製し、５０
μｌのＨ２Ｏ中に回収した。

【０１５２】 ７において上述したように、ＰＣＲ反応によるライゲーションを、４８ｎｇの
脱リン酸化切断ｐＭＲＴ１１９５プラスミドと５６ｎｇの切断および処理された
挿入ＤＮＡフラグメントを用いて行った。予め反応性とされた細菌、大腸菌ＤＨ
５αをトランスフォームした。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培
地で選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法によ
って抽出し、酵素的切断および配列決定により確認した。得られたプラスミドを
、ｐＭＲＴ１２０２と称した。これは図１６に示されており、その完全な配列で
ある配列番号：１６を配列表に記載した。

【０１５３】 10.4. ｐＭＲＴ１２１２の取得 プラスミドｐＭＲＴ１２１２（８９８７ｂｐ）は、ｂａｒ遺伝子によりｎｐｔ
ＩＩ遺伝子が置換されている点でｐＭＲＴ１２０６と相違する。

【０１５４】 これを行うために、ｐＭＲＴ１２０６ベクターフラグメントを、Bsu36Iによる
２μｇのｐＭＲＴ１２０６の切断、「Concert Rapid PCR Purification System
」キットを用いて精製し、５０μｌのＨ２Ｏ中に回収し、AatIIによる切断によ
り得た。Bsu36IとAatIIによる切断により、「パート（part） Ｐｎｏｓ ｎｐｔ
ＩＩ Ｔｎｏｓ ＬＢ」に対応するフラグメントのベクターの欠失を引き起こす。
切断されたベクターフラグメントを１％アガロースゲル電気泳動で処理し、「Co
ncert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製し、９８μｌのＨ
２Ｏ中に回収した。この切断および処理されたベクターフラグメントを、１２μ
ｌの３ｘ１０バッファー（New Enｇland Biolabs）の存在下で１２０μｌの最終
的な反応媒質において、３７℃で１時間、５０ユニットのウシ腸内アルカリホス
ファターゼ（New Enｇland Biolabs）を用いて脱リン酸化し、「Concert Rapid
PCR Purification System」キットを用いて精製し、５０μｌのＨ２Ｏ中に回収
した。

【０１５５】 パート（part） Ｐｎｏｓ ｂａｒ Ｔｎｏｓ ＬＢ」（１．２ｋｂｐ）に対応す
る挿入ＤＮＡフラグメントを、２μｇのｐＭＲＴ１２０２のBsu36Iによる切断、
Concert Rapid PCR Purification Systemキットを用いた精製、４０μｌのＨ２
Ｏ中に回収、AatIIによる切断、１％アガロースゲル電気泳動で処理、Concert R
apid PCR Purification Systemキットを用いて精製、５０μｌのＨ２Ｏ中に回収
することにより得た。

【０１５６】 ７において上述したように、ＰＣＲ反応によるライゲーションを、１００ｎｇ
の脱リン酸化切断ｐＭＲＴ１２０６プラスミド５０ｎｇの切断された挿入ＤＮＡ
フラグメントを用いて行った。予め反応性とされた細菌、大腸菌ＤＨ５αをトラ
ンスフォームした。カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地で選択さ
れた、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法によって抽出し
、酵素的切断および配列決定により確認した。得られたプラスミドを、ｐＭＲＴ
１２１２と称した。これは図２２に示されており、その完全な配列である配列番
号：２２を配列表に記載した。

【０１５７】 １１．細菌において産生された合成ベクターの評価 大腸菌株ＤＨ５αから得られたプラスミドの収量を調べた。

【０１５８】 Ｉ非バイナリー合成プラスミド プラスミドｐＭＲＴ１１０５、ｐＭＲＴ１１０６またはｐＭＲＴ１１０５−or
i ＣｏｌＥ１を有する組み換え細菌の一次培養を、３７℃で１６時間、５０ｍｇ
／ｌのカナマイシンを添加した１０ｍｌのＬＢ培地において、５００ｍｌの各“
グリセロールストック”から調製した。その後、５００ｍｌの各一次培養を、３
７℃で２３時間、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加した１００ｍｌのＬＢにお
いて培養した。ｐＭＲＴ１１０６については、二つの培養を調製し、一方はクロ
ラムフェニコールを添加せず、他方には、７時間培養した後に４０ｍｇ／ｌのク
ロラムフェニコールを添加した。この培養物を５０００ｇで１０分間遠心した。
プラスミドＤＮＡを、“QIAFilter Plasmid Midiキット”(QIAＧEN)を用いて製
造元の推奨に従って抽出し、分光光度計を用いて定量した。得られたプラスミド
の量は、ｐＭＲＴ１１０５、ｐＭＲＴ１１０６、クロラムフェニコールで処理し
たｐＭＲＴ１１０６およびｐＭＲＴ１１０５ ori ＣｏｌＥ１（ori ＣｏｌＥ１
がｐＭＲＴ１１０６とは逆の配向で挿入されたプラスミドｐＭＲＴ１１０５）の
それぞれについて、１０ｍｇ、５０．６ｍｇ、８６．２ｍｇおよび９．８ｍｇと
調べられた。これらの結果は、合成プラスミドが大腸菌において複製されること
、正しい配向で複製基点“ori ＣｏｌＥ１”が存在すること（“ori ＲＫ２”に
近い“ori ＣｏｌＥ１”のNdeI部位）が収率を５倍に増加させるが、“ori Ｃｏ
ｌＥ１”の逆の配向のものについては何の効果も示さないこと、クロラムフェニ
コール処理が、さらに１．６倍の増加を与えることを示す。

【０１５９】 11.2. 合成バイナリープラスミド 合成バイナリープラスミドｐＭＲＴ１１１８とｐＭＲＴ１１１９を、コントロ
ールのｐＢｉｎ１９とｐＢＩＯＣ４と比較して評価する。プラスミドｐＢＩＯＣ
４は、ｐＧＡ４９２ ｃａｔ遺伝子の実際に全てのコード配列が欠失し、かつ、H
indIII部位がEcoRI部位に変換されているという点で、ｐＧＡ４９２（An,1986）
と相違する。これは、SacIとScaIによる二重切断後、酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ(New Enｇland Biolabs)の作用、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼｘ１０バッファ
ー(Amersham)および２．５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)の存在下で
、１０μｌの反応媒質中で、１４℃で１６時間、修飾されたプラスミド（２０ｎ
ｇ）をライゲーションすることによって得られた。予め反応性とされた細菌、大
腸菌ＤＨ５αをトランスフォームした(Hanahan, 1983)。１２ｍｇ／ｌのテトラ
サイクリンで選択された、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶
解法（BirnboimとDoly, 1979）によって抽出し、酵素的切断により分析した。選
別されたクローンのプラスミドＤＮＡのHindIII部位を、リン酸化したHindIII−
EcoRIアダプター（Strataｇene）を用いて、EcoRI部位へと変更した。これを行
うために、選択されたクローンの５００ｎｇのプラスミドＤＮＡをHindIIIで切
断し、製造元の推奨に従ってウシ腸内アルカリホスファターゼ（Boehrinｇer Ma
nnheim）で脱リン酸化し、１５００ｎｇのHindIII−EcoRIアダプターＤＮＡ、０
．１容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、および２．５容量の無水エタノ
ールの存在下で、−８０℃で３０分間共沈殿(coprecipitate)させた。１２００
０ｇで３０分間遠心させた後、沈殿したＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾
燥させ、８μｌのＨ２Ｏに回収し、６５℃に１０分間保持し、上述したようにラ
イゲートした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼとの６５℃で１０分間インキュベート後、ラ
イゲーション反応混合物を、EcoRIで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動
で精製し、電気的に抽出し、無水エタノールで沈殿させ、１２０００ｇで３０分
間遠心し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ライゲートし、大腸菌株ＤＨ
５αに導入し、上述したように処理した。

【０１６０】 上記プラスミドを有する組み換え細菌の一次培養を、３７℃で１６時間、１２
ｍｇ／ｌのテトラサイクリンで選別されたｐＢＩＯＣ４を除いて、５０ｍｇ／ｌ
のカナマイシンを添加した１０ｍｌのＬＢ培地で、５００ｍｌの各“グリセロー
ルストック”から調製した。その後、２５０ｍｌの各一次培養を、３７℃で、２
３時間、適切な抗生物質を添加した１００ｍｌのＬＢで培養した。この培養を、
５０００ｇで１０分間遠心した。プラスミドＤＮＡを、製造元の推奨に従って“
QIAFilter Plasmid Midi キット”(QIAＧEN)を用いて抽出し、分光光度計を用い
て定量的に調べた。得られたプラスミドの量は、ｐＭＲＴ１１１８、ｐＭＲＴ１
１１９、ｐＢｉｎ１９およびｐＢＩＯＣ４のそれぞれに対して、９４．２ｍｇ、
１１３ｍｇ、３７．２ｍｇおよび４５．６ｍｇであった。

【０１６１】 これらの結果は、合成バイナリープラスミドが大腸菌で複製されること、ｐＭ
ＲＴ１１１９の収率が、ｐＢｉｎ１９およびｐＢＩＯＣ４コントロールに対して
、それぞれ、３倍および２．５倍に増大することを示す。

【０１６２】 さらに、これらの合成プラスミドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
株ＬＢＡ４４０４において複製される。

【０１６３】 12. トランスジェネシスによる合成プラスミドの評価 12.1. タバコのトランスフォーメーション 12.1.1. タバコの安定なトランスフォーメーション タバコ（Nicotiana tabacum L. var. PBD6）のトランスフォーメーションを、
６週目のタバコ種苗から単離した葉を、in vitroで、Horschら（1985）に記載さ
れた方法に従って、組み換えアグロバクテリウムを用いて感染させることにより
行った。

【０１６４】 全てのin vitro培養物を、光強度が２００μE.m-2.s-1であり、光周期は１６
時間明／８時間暗であり、温度が２５℃である、調節された環境チャンバーで調
製した。

【０１６５】 最初の共培養段階を除いて、再生、発達および発根段階を、細菌発育阻止、す
なわち４００ｍｇ／ｌのアウグメンチン(auｇmentin)および選択剤すなわち２０
０または１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを加えた異なる選択培地で行った。

【０１６６】 種々の段階および用いた培地は以下の通り： 終濃度が６ｍＭでＣａＣｌ２を添加し、かつ、適切な抗生物質を添加した５ｍ
ｌの２ＹＴ（バクト-トリプトン １０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）培地においてアグロバクテリウムを２８℃で４８時間一
次培養した後に、２８℃で一晩、ＣａＣｌ２と抗生物質を添加した１０ｍの２Ｙ
Ｔ培地で培養した。培養を３０００ｇで１０分間遠心し、細菌を１０ｍｌの液体
ＭＳ３０（ショ糖３０ｇ／ｌを添加した、ｐＨ５．７の、SIＧMAから市販されて
いる４．４ｇ／ｌのＭ０４０４）中に再懸濁した。

【０１６７】 約１ｃｍ２のin vitroにおける種苗の葉の外植片を、ＭＳ３０液で２０分間、
１／１０に希釈されたアグロバクテリウムの懸濁液と接触させることによって共
培養を行った。このように処理された外植片を、フィルターペーパーで急速に乾
燥させ、調節された環境チャンバーにおいて４８時間、固体共培養培地（ＣＭ）
（ＭＳ３０、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／ｌ、インドール-３酢酸
（ＡＮＡ）０．１ｍｇ／ｌ、寒天 ８ｇ／ｌ）に配置した。

【０１６８】 処理された外植片を、固体の再生培地（固体ＣＭ、アウグメンチン４００ｍｇ
／ｌ、カナマイシン２００ｍｇ／ｌ）に移した。外植片を、２週間後に同じ培地
に移植した。

【０１６９】 二週間後に、苗条(shoots)を固体発生培地（Ｍ０４０４ ４．４ｇ／ｌ、SIＧM
Aから市販、ショ糖２０ｇ／ｌを含む、ｐＨ５．７（液体ＭＳ２０）、アウグメ
ンチン４００ｍｇ／ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｌ、寒天８ｇ／ｌ）に移植し
た。

【０１７０】 二週間後に、トランスフォームした種苗を発生培地と同じ固体の発根培地に移
植した。発根は２ないし３週間かかり、その後、種苗を１０日間、Ｇｉｆｆｙポ
ットにおいて成長チャンバーに移し（光周期１６時間明／８時間暗、２３℃、７
０％相対湿度）、温室に移した。

【０１７１】 12.1.2. タバコのトランスフォーメーションに用いた合成プラスミドの評価 合成バイナリープラスミドｐＭＲＴ１１１８またはコントロールバイナリープ
ラスミドｐＢｉｎ１９を含む組み換えアグロバクテリウム（アグロバクテリウム
・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４）を、タバコNikotiana tabacum L. var.
PBD6をトランスフォームするために用いた。

【０１７２】 この結果は、選択剤（カナマイシン）の存在下で発生する種苗の生育および数
が、試験した二つのバイナリープラスミドに関して類似することを示した。これ
らの観察は、合成バイナリープラスミドがタバコのトランスジェネシスにおいて
完全に機能的であることを示唆する。

【０１７３】 12.2. トウモロコシのトランスフォーメーション 12.2.1. トウモロコシカルス（calli）の遺伝的トランスフォーメーション トウモロコシの遺伝的トランスフォーメーションは、いずれの方法（エレクト
ロポレーション、アグロバクテリウム、ミクロファイバー、粒子銃）を用いる場
合であっても、全体的な植物を再生する能力を維持した、急速な分裂において未
分化の細胞を使用することが一般的に必要である。この種の細胞は、トウモロコ
シの脆い胚形成カルス（タイプIIと称される）を形成する。

【０１７４】 これらのカルスを、Armstronｇ（Maize handbook, 1994, Freelinｇ MとWalbo
t V (eds), pp 665-671）に記載された方法および培地を用いて、ＨＩ、IIまた
は（Ａ１８８ｘＢ７３）という遺伝子型の未成熟胚から得た。こうして得られた
カルスを、出発培地で２週間毎に連続的二次培養を行うことによって、増殖およ
び維持した。

【０１７５】 種苗を、Vainら(1989)に記載された方法を用いて、細胞のホルモンおよび浸透
圧平衡を変更することによってこれらのカルスから再生した。これらの植物を交
雑または自家受粉可能な温室で強化した。

【０１７６】 12.2.2. 粒子銃を用いたトウモロコシの遺伝的トランスフォーメーション トランスフォーメーションに必要な細胞系統の産生および再生は、12.2.1.に
記載した。

【０１７７】 遺伝的トランスフォーメーションのために粒子銃を用いる方法は、Finerら(19
92)に記載されている。ターゲット細胞は、１０ないし２０ｍｍ２の表面積を備
えたカルスフラグメントである。これらのフラグメントを、ボンバード前に、４
時間にわたって、０．２Ｍのマンニトールと０．２Ｍのソルビトールを加えた出
発培地に配置した。

【０１７８】 タングステン粒子（Ｍ１０）とトランスフォーメーションプラスミドとを、Kl
ein(1987)に記載されたプロトコールに従って共沈殿させた。かくして被覆され
た粒子を、Finerら(1992)のプロトコールに従って粒子銃を用いてターゲット細
胞に発射した。

【０１７９】 ボンバードしたカルスを、２７℃で暗室に配置した。２４時間後、最初の二次
培養を行い、その後、トランスフォームしたカルスのみを選別する適切な選択剤
を添加した出発培地で３ヶ月間２週間毎に二次培養を行った。これらのカルスを
、12.2.1.に記載したように、トランスフォームした種苗を再生するために選択
剤の存在下で生育させた。得られた種苗を、強化して、交雑または自家受粉可能
な温室に移した。

【０１８０】 12.2.3. アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるトウモロコシの遺伝的
トランスフォーメーション 使用した技術は、Ishidaら(1996)に記載されている。１．０ないし１．２ｍｍ
の長さの未成熟胚（受粉から９ないし１４日後）を、ＬＳ−ｉｎｆ培地で洗浄し
、Ishidaら(1996)に記載されているように調製したアグロバクテリウムの懸濁液
に浸し、３０秒間ボルテックスし、周囲温度で５分間インキュベートした。この
ように処理した未成熟胚をＬＳ−ＡＳ培地で２５℃の暗室で３日間培養し、暗室
において、２５℃で２週間、５ｍｇ／ｌのホスフィノトリシンと２５０ｍｇ／ｌ
のセフォタキシムを添加したＬＳＤ１．５培地に移し、最後に、暗室において、
２５℃で３週間、１０ｍｇ／ｌのホスフィノトリシンと２５０ｍｇ／ｌのセフォ
タキシムを添加したＬＳＤ１．５培地に移した。かくして生成されたタイプＩカ
ルスを単離し、断片化し、暗室において、２５℃で３週間、１０ｍｇ／ｌのホス
フィノトリシンと２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムを添加したＬＳＤ１．５培地
に移した。増殖したタイプＩカルスを単離し、５ｍｇ／ｌのホスフィノトリシン
と２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムを添加したＬＳＺ培地に移して、２ないし３
週間にわたって２５℃で１６時間明／８時間暗の光周期に処理した。再生した種
苗を、１／２ＬＳＦ培地に移して、１〜２週間にわたって２５℃で１６時間明／
８時間暗の光周期に処理し、成長チャンバーおよび温室に移した。

【０１８１】 13.遺伝子発現のベクターバックボーンの作用 安定にトランスフォームしたタバコ植物を、野生型ｎｐｔＩＩ遺伝子を有する
合成バイナリープラスミドｐＭＲＴ１２０４（１６植物）および変位ｎｐｔＩＩ
遺伝子を有するｐＭＲＴ１２０６（１２植物）について、また、さらに、野生型
ｎｐｔＩＩ遺伝子を備え、かつ、発現カセット“Ｐ３５Ｓ−ｕｉｄＡ−ポリＡｎ
ｏｓ”を含むプラスミドｐＢｉｎ１９に対応するClontechから市販されているコ
ントロールベクターｐＢＩ１２１（１１植物）について得た。 該合成ベクターバックボーンの影響及びそのコントロールの影響は、５Prime−
＞3 Primeによって販売されるNPTII ELISAキットを用い、タンパク質抽出物のEL
ISA分析によって評価された。この分析は、可溶性抽出タンパク質の量（ミリグ
ラム、mｇ）に関して、生成されたNPTIIタンパク質の数量化（マイクログラム、
μｇ）を可能にした。 前記タンパク質は、液体窒素中にて、タバコ葉の粉末から「Tris-HCl 25mM pH
7.8；フェニルメチルスルホニルフルオライド１mM」緩衝液中に抽出された。１
００００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離後、上澄みに含まれる抽出された可溶性
タンパク質は、Bradfordの方法（タンパク質−色素結合の原理を利用した、マイ
クログラム量のタンパク質の迅速且つ高感度な検出方法。Anal. Biochem. (1976
) 72, 248-254）に従って測定された。 ELISA数量化に用いられた抗体は、コーティングNPTIIタンパク質を特異的に認
識するウサギポリクローナル抗体、及び、NPTIIタンパク質検出用ビオチン化抗N
PTII抗体であった。

【０１８２】 図２３に示される分析結果は： ・野生型nptII遺伝子カセット及び異なるプラスミドバックボーンについて、合
成バイナリープラスミドpMRT1204で得られるNPTIIの量が、オリジナルのpBIN19
バイナリープラスミドで得られる量よりも６．７倍大きく、これが該合成ベクタ
ーの効果を証明していること、 ・異なるnptII遺伝子すなわち野生型及び変異nptIIを有するが同一のプラスミド
バックボーン、すなわち、合成バイナリープラスミドpMRT1204及びpMRT1206につ
いて、野生型遺伝子において得られるNPTIIの量が、変異nptII遺伝子について得
られる量とは、１．２倍異なること、 を示している。

【０１８３】 １４．pMRT1334の合成 プラスミドpMRT1334（9688 bp）は、pMRT1206のnptII発現カセットを、pBIN19
のnptII発現カセットによって置き換えることによって得られた。

【０１８４】 pMRT1206から誘導されたベクター断片は、１０μｇのpMRT1206をKpnIで消化す
ることによって得られ、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを
用いて精製され、そして、５０μｇの水に取り込まれた。それから、消化された
pMRT1206は、１２μlのT4 10× DNAポリメラーゼ緩衝液、４μlの１０mM dNTP及
び６μlの１mｇ/ml BSAが存在する１２０μlの反応混合物中で、６単位のT4 DNA
ポリメラーゼ（New Enｇland Biolabs）の作用を受けた。その反応は、３７℃で
３０分間行われた。消化され、このように処理されたpMRT1206ベクターは、「Co
ncert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製され、５０μlの水
に取り込まれ、それから、AflIIで消化された。pMRT1206から誘導されたベクタ
ー断片は、１％アガロースゲルでの電気泳動によって単離され、「Concert Rapi
d PCR Purification System」を用いて精製され、５０μlの水に取り込まれた。

【０１８５】 前記nptII発現カセットに対応するDNA挿入断片DraI−AflII（１．５kbp）は、
９μｇのpBIN19プラスミドをDraI及びAflIIで消化することによって得られた。
それから、該断片は、TEB緩衝液中１％アガロースゲルで電気泳動を受け、「Con
cert Rapid PCR Purification System」を用いて精製され、５０μlの水に取り
込まれた。

【０１８６】 そのPCR連結反応は、２μlのT4 10× DNAリガーゼ緩衝液（Epicentre Technol
oｇies）、２μlの２．５mM ATP及び４単位のT4 DNAリガーゼ緩衝液（Epicentre
Technoloｇies）が存在する２０μlの反応混合物中で、pMRT1206から誘導され
た１００nｇのプラスミド断片、及び、１００nｇのDNA挿入断片DraI−AflIIを用
いて行われた。該反応は、それぞれが２つの段階を含んだ１８０サイクルからな
り、第１段階は「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー内に１０℃で３
０秒間、第２段階は「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー内に３０℃
で３０秒間であった。

【０１８７】 前に調製したコンピテントなEscherichia coli ＤＨ５α細菌が形質転換され
た（Hanahan, 1983）。カナマイシン（５０mｇ/l）を補充したLB培地上で選択さ
れ、得られたクローンのプラスミドDNAは、アルカリ法に従って抽出され、そし
て、酵素消化及び配列決定によって確認された。得られたプラスミドは、pMRT13
34と命名した（図２４）。その完全な配列は、配列表中の配列番号：５０である
。

【０１８８】 １５．pMRT1335の合成 プラスミドpMRT1335（１５２０８bp）は、対照ベクターであり、pMRT1206から
単離された発現カセット「ep35S-ｇus(uidA)-polyA35S」をpBIN19に挿入するこ
とによって得られる。

【０１８９】 １３μｇのpBIN19プラスミドが、EcoRIで消化され、「Concert Rapid PCR Pur
ification System」を用いて精製され、５０μlの水に取り込まれた。それから
、前に消化されたpBIN19は、１２μlの500mM pH 7.5 Tris-HCl 500mM MｇCl2、
６μlの１Ｍジチオスレイトール、それぞれ６μlの10mM dNTPが存在する１２０
μlの反応容量中で、３７℃で６０分間、２０単位のKlenow断片（New Enｇland
Biolabs）の作用を受けた。消化されたpBIN19ベクターは、「Concert Rapid PCR
Purification System」を用いて精製され、５０μｌの水に取り込まれ、それか
ら、KpnIで消化された。このようにして生成されたベクター断片は、１％アガロ
ースゲルで電気泳動を受け、「Concert Rapid PCR Purification System」を用
いて精製され、５０μlの水に取り込まれた。

【０１９０】 「ep35S-ｇus-polyA35S」（３．５kbp）発現カセットに対応するDNA挿入断片
は、１０μｇのプラスミドpMRT1206をXhoIで消化することによって得られ、「Co
ncert Rapid PCR Purification System」を用いて精製され、５０μlの水に取り
込まれ、引き続いて、１２μlの500mM pH 7.5 Tris-HCl 500mM MｇCl2、６μlの
１Ｍジチオスレイトール、それぞれ６μlの10mM dNTPが存在する１２０μlの反
応容量中で、３７℃で６０分間、２０単位のKlenow断片（New Enｇland Biolabs
）の作用を受け、それから、「Concert Rapid PCR Purification System」を用
いて精製され、５０μlの水に取り込まれ、それから、KpnIで消化された。この
ようにして生成したDNA挿入断片は、TEB緩衝液中１％アガロースゲルで電気泳動
によって単離され、「Concert Rapid PCR Purification System」を用いて精製
され、５０μlの水に取り込まれた。

【０１９１】 前記PCR連結反応は、２μlのT4 10× DNAリガーゼ緩衝液（Epicentre Technol
oｇies）、２μlの２．５mM ATP及び４単位のT4 DNAリガーゼ（Epicentre Techn
oloｇies）が存在する２０μlの反応混合物中で、１００nｇの処理済みpBIN19、
及び、以前に調製された１００nｇのDNA挿入断片を用いて行われた。該反応は、
それぞれが２つの段階を含む１８０サイクルからなり、第１段階は「ＧeneAmp P
CR System 9700」サーモサイクラー内に１０℃で３０秒間、第２段階は「ＧeneA
mp PCR System 9700」サーモサイクラー内に３０℃で３０秒間であった。

【０１９２】 以前に調製したコンピテントなEscherichia coli ＤＨ５α細菌が形質転換さ
れた（Hanahan, 1983）。カナマイシン（５０mｇ/l）を補充したLB培地上で選択
され、得られたクローンのプラスミドDNAは、アルカリ法に従って抽出され、そ
して、酵素消化及び配列決定によって確認された。得られたプラスミドは、pMRT
1335と命名した（図２５）。その完全な配列は、配列表中の配列番号：５１であ
る。

【０１９３】 １６．pMRT1336の合成 プラスミドpMRT1336（９２８５bp）は、PCT特許出願PCT/IB00/00370に記載さ
れるプラスミドpMRT1322から単離されたプロモーターMPr1165（６１０bp）の、p
MRT1196への挿入から生じるものであり、その関連部分が参照としてこの記載に
取り込まれる。

【０１９４】 １０μｇのpMRT1196プラスミドが、KpnIで消化され、「Concert Rapid PCR Pu
rification System」を用いて精製され、５０μlの水に取り込まれ、そしてHpaI
で再消化された。このように処理されたベクター断片は、１％アガロースゲルで
電気泳動を受け、「Concert Rapid PCR Purification System」を用いて精製さ
れ、５０μlの水に取り込まれた。

【０１９５】 前記プロモーターMPr1165（０．５kbp）を生じるDNA挿入断片は、KpnIで消化
されたpMRT1322プラスミド１０μｇから得られ、「Concert Rapid PCR Purifica
tion System」を用いて精製され、５０μlの水に取り込まれ、そしてHpaIで再消
化された。こうして生成したDNA挿入断片は、TEB緩衝液中１％アガロースゲルで
電気泳動にかけ、「Concert Rapid PCR Purification System」を用いて精製さ
れ、５０μlの水に取り込まれた。

【０１９６】 そのPCR連結反応は、２μlのT4 10× DNAリガーゼ緩衝液（Epicentre Technol
oｇies）、２μlの２．５mM ATP及び４単位のT4 DNAリガーゼ（Epicentre Techn
oloｇies）が存在する２０μlの反応容量中で、１００nｇのベクター断片、及び
、上で調製された、プロモーターMPr1165を有するDNA挿入断片１００nｇを用い
て行われた。該反応は、それぞれが２つの段階を含む１８０サイクルからなり、
第１段階は「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー内に１０℃で３０秒
間、第２段階は「ＧeneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー内に３０℃で３
０秒間であった。

【０１９７】 前に調製したコンピテントなEscherichia coli ＤＨ５α細菌が形質転換され
た（Hanahan, 1983）。カナマイシン（５０mｇ/l）を補充したLB培地上で選択さ
れ、得られたクローンのプラスミドDNAは、アルカリ法に従って抽出され、そし
て、酵素消化及び配列決定によって確認された。得られたプラスミドは、pMRT13
36と命名した（図２６）。その完全な配列は、配列表中の配列番号：５２である
。 プラスミドpMRT1322は、プロモーターMPr1165をpMRT1176へ挿入することによっ
て得られた。１０μｇのpMRT1176プラスミドが、XbaI及びEcoRIで消化され、「C
oncert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製され、５０μlの
水に取り込まれ、１２μlの３×１０緩衝液（New Enｇland Biolabs）が存在す
る１２０μlの最終反応容量中において、３７℃で１時間、５０単位の子ウシ腸
アルカリホスファターゼ（New Enｇland Biolabs）で脱リン酸化され、そして、
「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用いて精製され、それか
ら、５０μlの水に取り込まれた。プロモーターMPr1165に対応するDNA挿入断片
は、１０nｇのpMRT1240マトリックスDNAから、PCR増幅によって得られた。ここ
では、製造業者の指示に従って、それぞれ２０pmolの２つのオリゴデソキシヌク
レオチド（XbaI部位を有する5’ AＧCTCTAＧAＧCTＧCCTＧCAＧCACTAＧTATCC 3’
（SEQ.ID53）、及びEcoRI部位を有する5’ CＧＧAATTCＧＧCCTCTAＧＧTTＧTTＧT
ＧTTＧ 3’（SEQ.ID54））を使用し、Platinum Taq polymerase Hiｇh Fidelity
酵素（ＧIBCO BRL Life Technoloｇies）を使用した。そのPCR増幅反応は、「Ｇ
eneAmp PCR System 9700」サーモサイクラー内で行われた。９４℃、２分間の変
性後、該DNAは２５サイクルを課された。ここで、各サイクルは、９４℃で４５
秒間の変性過程、５５℃で４５秒間のハイブリダイゼーション及び６８度で４５
秒間のエロンゲーションを含む。最終サイクルでは、伸長は６８℃で３分間続け
られた。得られたPCR生成物は、TBE緩衝液中１．５％アガロースゲルで電気泳動
によって単離され、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを用い
て精製され、それから、５０μlの水に取り込まれた。該PCR生成物は、それから
、XbaI及びEcoRIで消化され、「Concert Rapid PCR Purification System」キッ
トを用いて精製され、５０μlの水に取り込まれた。そのPCR連結反応は、前に記
載したように、８０nｇのpMRT1176ベクター断片、及び、MPr1165プロモーターを
有するDNA挿入断片１１０nｇを用いて行われた。前に調製したコンピテントなEs
cherichia coli ＤＨ５α細菌が形質転換された（Hanahan, 1983）。カナマイシ
ン（５０mｇ/l）を補充したLB培地上で選択され、得られたクローンのプラスミ
ドDNAは、アルカリ法に従って抽出され、そして、酵素消化及び配列決定によっ
て確認された。得られたプラスミドは、pMRT1322と命名した。

【０１９８】 プラスミドｐＭＲＴ１２４０は、製造業者の指示に従いＨｉｎｄＩＩＩ部位及
びＢａｍＨＩの、クレノーフラグメント（New Enｇland Biolabs）処理により、
プラスミドｐＭＲＴ１２３４へのＤＮＡ断片の挿入によって得た。ＤＮＡ挿入断
片は、ＰｓｔＩ二重消化及びＢａｍＨＩ消化に引き続いて、ＰＣＴ特許出願ＰＣ
Ｔ／ＩＢ００／００３７０号（参照のため、関連部分については本明細書に取り
込むこととする）に記載の通り、プラスミドｐＭＲＴ１１６５に、Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（New Enｇland Biolabs）を製造業者の指示に従って作用させて、
得たＬ５プロモーターフラグメントであった。

【０１９９】 プラスミドｐＭＲＴ１２３４は、既に公開された特許出願公開公報第ＷＯ９８
／５０５４３号に記載のようにして、プラスミドｐＨＭＷＧ−ＩＡ−ＰＳＳｐ−
Ｌｆから単離されたヒトラクトフェリンをコードするｃＤＮＡに対応する、ＤＮ
Ａ挿入断片ＥｃｏＲＩの、ｐＭＲＴ１１７５のＥｃｏＲＩ部位への挿入によって
得た。

【０２００】 １７．ｐＭＲＴ１３３７の合成 プラスミドｐＭＲＴ１３３７（８２８９ｂｐ）は、ｐＭＲＴ１２０５への、ｐ
ＢＩＮｍ−ｇｆｐ５−ＥＲから単離されたｇｆｐ遺伝子の挿入によって得られた
が、これは、Haseloff J et Siemerinｇ KR. 1998, "The uses of ｇreen fluor
escent protein in plants", in Ｇreen fluorescent protein: Strateｇies, a
pplications and protocols (Chalfie M et Kain S, eds, Wiley, pp 191-220)
に記載されている。

【０２０１】 １０μｇのプラスミドｐＭＲＴ１２０５を、ＥｃｏＲＩで消化し、「Concert
Rapid PCR Purification System」キットを使用して精製し、５０μlの水中に取
り、反応容積１２０μl中にある、１２μlの５００mM ｐＨ７．５ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ５００mM ＭｇＣｌ２、６μlの１Mジチオスレイトール、各６μlの１０mM
ｄＮＴＰの存在下で、20ユニットのクレノーフラグメント（New Enｇland Biola
bs）を作用させ、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを使用し
て精製し、５０μlの水中に取った後、ＢａｍＨＩで消化した。こうして処理し
たベクターの断片を１％アガロースゲルで電気泳動させ、「Concert Rapid PCR
Purification System」キットを使用して精製し、５０μlの水中に取った。

【０２０２】 ｇｆｐ遺伝子を担持するＤＮＡ挿入断片（０．７ｋｂｐ）は、ＳａｃＩで消化
した、１０μｇのプラスミドｐＢＩＮｍ−ｇｆｐ５−ＥＲから得て、「Concert
Rapid PCR Purification System」キットを使用して精製し、５０μlの水中に取
り出し、１２μlのＴ４ １０ｘ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、４μlの１０mM ｄ
ＮＴＰ及び６μlの1mｇ/ml ＢＳＡの存在下で、６ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（New Enｇland Biolabs）を、１２０μlの反応容積で作用させることに
よって得た。該反応を、３７℃にて３０分間行った。こうして処理したプラスミ
ドｐＢＩＮｍ−ｇｆｐ５−ＥＲを、「Concert Rapid PCR Purification System
」キットを使用して精製し、５０μlの水中に取り、ＢａｍＨＩで消化した。こ
うして生成させたＤＮＡ挿入フラグメントを、ＴＥＢ緩衝液中、１％アガロース
ゲルでゲル電気泳動させ、「Concert Rapid PCR Purification System」キット
を使用して精製し、５０μlの水中に取った。

【０２０３】 ＰＣＲ連結反応を、２μlのＴ４ １０ｘ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Epicentre
Technoloｇies）、２μlの２．５mM ＡＴＰ及び４ユニットのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Epicentre Technoloｇies）の存在下で、１００nｇのｐＭＲＴ１２０５ベク
ター断片及び、上記のように調製した、ｇｆｐ遺伝子を担持する１００nｇのＤ
ＮＡ挿入断片を反応容積２０μlで用いて行った。該反応は、「ＧeneAmp PCR Sy
stem 9700」サーモサイクラー内で、各々が１０℃にて３０秒間の第一段階、３
０℃にて３０秒間の第二段階の２段階を含む、１８０サイクルが含まれていた。

【０２０４】 予め調製したコンピテントな大腸菌ＤＨ５αバクテリアを、形質転換させた（
Hanahan, 1983）。カナマイシン（50mｇ/l）を追加したＬＢ培地上で選択して、
得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ法に従って抽出し、酵素消化
及び配列決定によって検証した。得られたプラスミドは、ｐＭＲＴ１３３７と命
名された（図２７）。その全配列を、SEQ.ID55.として配列表に記載する。

【０２０５】 １８．pＭＲＴ１３４１の合成 プラスミドｐＭＲＴ１３４１（１４０８ｂｐ）は、ｐＭＲＴ１３３５由来の「
ep35S-ｇus-polyA35S」発現カセットの、ｐＭＲＴ１３３７から単離された発現
カセット「ep35S-ｇfp-polyA35S」による置き換えにより得られる。

【０２０６】 １０μｇのプラスミドｐＭＲＴ１３３５を、ＡｇｅＩ及びＫｐｎＩによって消
化した。こうして消化されたベクター断片を、０．８％アガロースゲルで電気泳
動して単離し、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを使用して
精製し、５０μlの水中に取った。

【０２０７】 発現カセット「ep35S-ｇfp-polyA35S」に対応するＤＮＡ挿入フラグメント（
２．４ｋｂｐ）は、１０μｇのプラスミドｐＭＲＴ１３３７をＸｈｏＩで消化す
ることによって得、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを使用
して精製し、５０μlの水中に取り、１２μlの５００mM ｐＨ７．５ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ５００mM ＭｇＣｌ２、６μlの１Mジチオスレイトール、各々６μlの１
０mM ｄＮＴＰの存在下、反応容積１２０μl中で、20ユニットのクレノーフラグ
メント（New Enｇland Biolabs）を、３７℃にて３０分間作用させ、次に「Conc
ert Rapid PCR Purification System」キットを使用して精製し、５０μlの水中
に取り、最後にＫｐｎＩで消化した。こうして調製したＤＮＡ挿入断片を、ＴＥ
Ｂ緩衝液中の０．８％アガロースゲル電気泳動によって単離し、「Concert Rapi
d PCR Purification System」キットを使用して精製し、５０μlの水中に取り、
ＡｇｅＩで消化し、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを使用
して精製し、５０μlの水中に再度取った。

【０２０８】 ＰＣＲ連結反応は、２μlのＴ４ １０ｘ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Epicentre
Technoloｇies）、２μlの２．５mM ＡＴＰ及び４ユニットのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Epicentre Technoloｇies）の存在下で、反応容積２０μl中でｐＭＲＴ１３
３５由来の１００nｇのベクターフラグメント及び、上記のように調製した、１
００nｇのＤＮＡ挿入断片について行った。該反応は、「ＧeneAmp PCR System 9
700」サーモサイクラー内で、各々が１０℃にて３０秒間の第一段階、３０℃に
て３０秒間の第二段階の２段階を含む、１８０サイクルが含まれていた。

【０２０９】 予め調製したコンピテントな大腸菌ＤＨ５αバクテリアを、形質転換させた（
Hanahan, 1983）。カナマイシン（50mｇ/l）を追加したＬＢ培地上で選択して得
られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ法に従って抽出し、酵素消化及
び配列決定によって検証した。得られたプラスミドは、ｐＭＲＴ１３４１と命名
された（図２８）。その全配列を、SEQ.ID56.として配列表に記載する。

【０２１０】 １９．ｐＭＲＴ１３４２の合成 プラスミドｐＭＲＴ１３４２（１５０７７ｂｐ）は、ｐＭＲＴ１３３５由来の
発現カセット「ep35S-ｇus-polyA35S」の、ｐＭＲＴ１３３６から単離された発
現カセット「L5-ｇus-polyA35S」による置き換えによって得られる。

【０２１１】 １０μｇのプラスミドｐＭＲＴ１３３５を、ＡｇｅＩ及びＫｐｎＩによって消
化した。こうして消化されたベクター断片を、０．８％アガロースゲル電気泳動
によって単離し、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを使用し
て精製し、５０μlの水中に取った。

【０２１２】 発現カセット「L5-ｇus-polyA35S」に対応するＤＮＡ挿入フラグメント（３．
４ｋｂｐ）は、１０μｇのプラスミドｐＭＲＴ１３３６のＸｈｏＩで消化するこ
とによって得、「Concert Rapid PCR Purification System」キットを使用して
精製し、５０μlの水中に取り、これに、１２μlの５００mM ｐＨ７．５ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ５００mM ＭｇＣｌ２、６μlの１Mジチオスレイトール、各６μlの
１０mM ｄＮＴＰの存在下、反応容積１２０μl中にある、20ユニットのクレノー
フラグメント（New Enｇland Biolabs）を、３７℃にて３０分間作用させ、次に
「Concert Rapid PCR Purification System」キットを使用して精製し、５０μl
の水中に取り、最後にＫｐｎＩで消化した。こうして調製したＤＮＡ挿入断片を
、ＴＥＢ緩衝液中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって単離し、「Conc
ert Rapid PCR Purification System」キットを使用して精製し、５０μlの水中
に取り出し、ＡｇｅＩで消化し、上記のようにキットを使用して精製し、５０μ
lの水中に再度取った。

【０２１３】 ＰＣＲ連結反応は、２μlのＴ４ １０ｘ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Epicentre
Technoloｇies）、２μlの２．５mM ＡＴＰ及び４ユニットのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Epicentre Technoloｇies）の存在下で、ｐＭＲＴ１３３５由来の１００nｇ
のベクター断片及び、上記のように調製した１００nｇのＤＮＡ挿入断片につい
て、２０μlの反応混合物中で行った。該反応には、「ＧeneAmp PCR System 970
0」サーモサイクラー内で、各々が１０℃にて３０秒間の第一段階、３０℃にて
３０秒間の第二段階の２段階を含む、１８０サイクルが含まれていた。

【０２１４】 予め調製したコンピテントな大腸菌ＤＨ５αバクテリアを、形質転換させた（
Hanahan, 1983）。カナマイシン（50mｇ/l）を追加したＬＢ培地上で選択して、
得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ法に従って抽出し、酵素消化
及び配列決定によって検証した。得られたプラスミドは、ｐＭＲＴ１３４２と命
名した（図２９）。その全配列を、SEQ.ID57.として配列表に記載する。

【０２１５】 ２０．組換えアグロバクテリアの製造 バイナリープラスミドを、Holsters et al. [Holsters M., Dewaele D., Depi
cker A., Messenf E., Van Montaｇu M. et Schell J. (1978). Transfection a
nd transformation of Aｇrobacterium tumefaciens. Mol. Ｇen. Ｇenet. 136,
181-187.] によって記載の技術に従って、アグロバクテリウムツメファシエン
スLBA4404菌株に転移させた。リファンピシン（50mｇ/l）を追加したＬＢ培地上
で選択して、得られたクローンのプラスミドＤＮＡは、細胞再懸濁緩衝液中にリ
ゾチーム（25mｇ/ml）を添加して改変させた、アルカリ法に従って抽出した。得
られたプラスミドは、酵素消化によって分析した。得られたアグロバクテリアク
ローンを、植物遺伝子形質転換に使用した。

【０２１６】

【参考文献】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、参照pMRT1105により同定され、３５０８塩基対の長さを
有する、プラスミドの形状の、本発明の好ましいミニマルベクターをスキームで
示す。

【図２】 図２は、参照pMRT1106により同定され、４０９８塩基対の長さを
有する、プラスミドの形状の、図１のベクターの変異体のスキームチャートを示
す。

【図３】 図３は、参照pMRT1118により同定され、５９７１塩基対の長さを
有し、抗生物質に対する耐性のための選択カセットコードと、複数クローニング
部位（MCS）を含むT-DNAを含む、バイナリープラスミドの形状の、本発明の好ま
しいベクターをスキームチャートを示す。

【図４】 図４は、複数クローニング部位（MCS）が他のユニーク部位を含
み、ベクターが６０１６塩基対の長さを有する、バイナリープラスミドの形状の
、参照pMRT1119により同定される、図３のベクターの好ましい実施態様を示す。

【図５】 図５は、参照pMRT1121（６０１７塩基対）により同定される、バ
イナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を示す
。

【図６】 図６は、参照pMRT1122（６０１６塩基対）により同定される、バ
イナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を示す
。

【図７】 図７は、参照pMRT1155（６０１７塩基対）により同定される、バ
イナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を示す
。

【図８】 図８は、参照pMRT1175（６７６７塩基対）により同定される、バ
イナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を示す
。

【図９】 図９は、参照pMRT1176（６７６７塩基対）により同定される、バ
イナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を示す
。

【図１０】 図１０は、参照pMRT1191（４８０５塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１１】 図１１は、参照pMRT1192（８６５４塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１２】 図１２は、参照pMRT1193（９１４３塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１３】 図１３は、参照pMRT1195（６８６５塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１４】 図１４は、参照pMRT1196（８６５４塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１５】 図１５は、参照pMRT1201（７９４３塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１６】 図１６は、参照pMRT1202（５６１４塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１７】 図１７は、参照pMRT1203（７５０３塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１８】 図１８は、参照pMRT1204（９３９０塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図１９】 図１９は、参照pMRT1205（７５０３塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図２０】 図２０は、参照pMRT1206（９３９０塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図２１】 図２１は、参照pMRT1210（１０００３塩基対）により同定され
る、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様
を示す。

【図２２】 図２２は、参照pMRT1212（８９８７塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターの他の好ましい実施態様を
示す。

【図２３】 図２３は、既知のベクターシステムに対する、本発明の合成ベ
クターのタンパク質発現能力の比較をグラフで示す。

【図２４】 図２４は、参照pMRT1334（９６８８塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターのさらなる実施態様を示す
。

【図２５】 図２５は、参照pMRT1335（１５２０８塩基対）により同定され
る、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターのさらなる実施態様を示
す。

【図２６】 図２６は、参照pMRT1336（９２８５塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターのさらなる実施態様を示す
。

【図２７】 図２７は、参照pMRT1337（８２８９塩基対）により同定される
、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターのさらなる実施態様を示す
。

【図２８】 図２８は、参照pMRT1341（１４１０８塩基対）により同定され
る、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターのさらなる実施態様を示
す。

【図２９】 図２８は、参照pMRT1342（１５０７７塩基対）により同定され
る、バイナリープラスミドの形状の、本発明のベクターのさらなる実施態様を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD10 4B024 AA08 CA04 CA05 DA01 EA04 FA02 FA06 FA07 GA11 HA01 4B065 AA88X AA88Y AB01 BA02 CA53

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 その機能性、及び細胞、特に植物細胞の遺伝子導入に不可欠
   なエレメントのみを含む、クリーンな合成ベクターであって、以下のものを、そ
   の機能性及び細胞の遺伝子導入に不可欠なエレメントに操作可能なようにして結
   合させて含むベクター： -少なくとも一の核酸配列であって、 少なくとも 一の第一の複製開始点、好ま
   しくは ori RK2、より好ましくは少なくとも 一の、 広い宿主範囲の、大腸菌の
   pRK2 のori Vをコードするもの; -少なくとも 一の核酸配列であって、選択因子、好ましくは抗生物質の耐性遺伝
   子、より好ましくはnpt III 遺伝子であってカナマイシン耐性を細菌に付与する
   ものをコードするもの; -trfA遺伝子座であって、 プラスミド、好ましくはpRK2由来のものの複製速度の
   増加を許容する少なくとも一の蛋白質コードするもの、より好ましくは蛋白質P2
   85及びP382をコードするもの。
2. 【請求項２】 配列番号：01で同定される核酸配列を含むことを特徴とする
   、請求項１に記載のクリーンな合成ベクター。
3. 【請求項３】 その核酸配列が、配列番号：01により同定される単純なプラ
   スミドpMRT1105からなることを特徴とする、請求項１又は２に記載のクリーンな
   合成ベクター。
4. 【請求項４】 少なくとも 一の核酸配列であって、第二の複製開始点、好
   ましくは大腸菌のori、より好ましくは ori ColEIをコードするものを含むこと
   を特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のクリーンな合成 ベクタ
   ー。
5. 【請求項５】 配列番号：02により同定される核酸配列を含むことを特徴と
   する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のクリーンな合成ベクター。
6. 【請求項６】 その核酸配列が、 配列番号：02により同定される単純なプ
   ラスミドpMRT1106からなることを特徴とする、請求項１乃至５の何れか一項に記
   載のクリーンな合成ベクター。
7. 【請求項７】 複数のユニークな制限酵素認識部位であって、集合的に 複
   数クローニング部位(MCS)と呼ばれるものを含む、少なくとも一の核酸配列から
   なる領域を含むことを特徴とする、請求項1乃至６のいずれか一項に記載のクリ
   ーンな合成ベクター。
8. 【請求項８】 核酸配列であって、右側の境界RB 及び左側の境界LBを含むT
   -ＤＮＡをコードし、当該ベクターがバイナリープラスミドとして機能すること
   を許容するものをも含むことを特徴とする、請求項1乃至７のいずれか一項に記
   載のクリーンな合成ベクター。
9. 【請求項９】 前記のMCS が、前記のT-ＤＮＡの右側の境界RBの近傍に位置
   することを特徴とする、請求項７又は８に記載のクリーンな合成ベクター。
10. 【請求項１０】 前記T-ＤＮＡの左側の境界LB及び右側の境界RBの間に位置
    する、少なくとも一の発現プロモータ、及び少なくとも一の転写ターミネータを
    コードする核酸配列をも含むことを特徴とする、請求項８に記載のクリーンな合
    成ベクター。
11. 【請求項１１】 前記の発現プロモータが、構成的プロモータ、 誘導性プ
    ロモータ、及び特異的プロモータからなる群より選択され、そして好ましくは植
    物発現プロモータより選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のクリー
    ンな合成ベクター。
12. 【請求項１２】 前記の発現プロモータが、35S CaMVプロモータ、CaMVのe
    p35S、エンドウマメプラストシアニン遺伝子プロモータ、 その「エンハンサー
    」及び由来する領域、コムギの「高分子量グルテニン」 (HMWＧ) プロモータ 、
    CsVMV 「キャッサバモザイクウイルス」プロモータ、 CoYMV「ツユクサ黄色モ
    ザイクウイルス」プロモータ、CsVMV及びCoYMVのプロモータのキメラプロモータ
    、そして これらの誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項
    １１に記載のクリーンな合成ベクター。
13. 【請求項１３】 前記の発現ターミネータ が、植物細胞中における機能的
    ターミネータより選択され、そして好ましくは35S又はnosターミネータであるこ
    とを特徴とする、請求項8乃至12のいずれか一項に記載のクリーンな合成ベクタ
    ー。
14. 【請求項１４】 少なくとも一の核酸配列であって、植物細胞中で機能的な
    選択因子をコードするもの、好ましくは少なくとも一の酸配列であって、抗生物
    質の耐性遺伝子をコードするもの、及び／又は除草剤 耐性遺伝子を含むことを
    特徴とする、請求項8乃至13のいずれか一項に記載のクリーンな合成ベクター。
15. 【請求項１５】 bar耐性 (ビアラフォス耐性)、又はpat(ホスフィノトリシ
    ンアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子をコードする配列を含むことを特徴とす
    る、請求項１４に記載のクリーンな合成ベクター。
16. 【請求項１６】 植物細胞中で機能的な前記の選択因子をコードする前記の
    核酸配列が、 nptII耐性遺伝子の変異体又は野生型をコードする配列であること
    を特徴とする、請求項１４に記載のクリーンな合成ベクター。
17. 【請求項１７】 前記の選択因子をコードする核酸配列が、前記のT-ＤＮＡ
    の左側の境界の近傍に位置することを特徴とする、請求項14、15、又は16のいず
    れか一項に記載のクリーンな合成ベクター。
18. 【請求項１８】 発現される核酸配列に操作可能なようにして結合された、
    発現促進性核酸配列を含み、産生されるポリペプチドをコードし、自身は転写終
    結核酸配列に結合している、少なくとも一の発現カセットを含むことを特徴とす
    る、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載のクリーンな合成 ベクター。
19. 【請求項１９】 前記の産生されるポリペプチドが、酵素、又は蛋白質、又
    は後者の誘導体であって、試験管内、及び／又はヒトにおいて、及び／又は動物
    において活性であり、当該活性が、消化の、膵臓の、胆管の、抗-ウイルスの、
    抗-炎症の、 肺の、 抗菌の、栄養の、 化粧の、構造の、血液の、心臓血管の、
    眼の、抗原の、免疫促進の、及び大脳の、活性を含むことを特徴とする、請求項
    １８に記載のクリーンな合成ベクター。
20. 【請求項２０】 二成分（バイナリー）の形態で存在し、線状又は環状のプ
    ラスミドであり、配列番号：03、 配列番号：04、 配列番号：05、 配列番号：0
    6、 配列番号：07、 配列番号：08、 配列番号：09、配列番号：10、 配列番号
    ：11、 配列番号：12、 配列番号：13、 配列番号：14、 配列番号：15、 配列
    番号：16、配列番号：17、 配列番号：18、 配列番号：19、 配列番号：20、 配
    列番号：21 及び配列番号：22で同定される核酸配列からなる群より選択される
    ことを特徴とする、請求項8乃至19のいずれか一項に記載のベクター。
21. 【請求項２１】 それぞれの機能的成分が、他の成分とは独立的に切断でき
    ることを特徴とする、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載のクリーンな合成
    ベクター。
22. 【請求項２２】 lベクター中に存在する、第一のユニークな制限部位、及
    び第二のユニークな制限部位のレベルで酵素的に消化することにより、それぞれ
    の機能的成分が、他の成分とは独立的に切断できることを特徴とする、請求項２
    １に記載のクリーンな合成ベクター。
23. 【請求項２３】 配列番号：01、 配列番号：02、 配列番号：03、 配列番
    号：04、 配列番号：05、 配列番号：06、 配列番号：07、配列番号：08、 配列
    番号：09、 配列番号：10、 配列番号：11、 配列番号：12、 配列番号：13、
    配列番号：14、配列番号：15、 配列番号：16、 配列番号：17、 配列番号：18
    、 配列番号：19、 配列番号：20、 配列番号：21 及び配列番号：22により同定
    される核酸配列からなる群より選択される核酸配列に一致することを特徴とする
    、単離された核酸配列。
24. 【請求項２４】 ゲノム内に、 請求項１乃至２３のいずれか一項に記載の
    ベクター又は核酸配列が、安定に組み込まれた、遺伝子組換え植物。
25. 【請求項２５】 双子葉植物の種、例えば ジャガイモ、タバコ、 ワタ、レ
    タス、トマト、 メロン、キュウリ、エンドウ、セイヨウアブラナ、アオゲイト
    ウ、若しくはヒマワリ、又は単子葉植物の種、例えばコムギ、オオムギ、エンバ
    ク、イネ、又はトウモロコシより選択されることを特徴とする、請求項２４に記
    載の遺伝子組換え植物。
26. 【請求項２６】 請求項２４又は２５に記載の遺伝子組換植物のムカゴ。
27. 【請求項２７】 種子であることを特徴とする、請求項２６に記載の遺伝子
    組換植物のムカゴ。
28. 【請求項２８】 請求項1乃至23のいずれか一項に記載のベクター又は核酸
    配列を含む細胞。
29. 【請求項２９】 植物細胞であることを特徴とする、請求項２８に記載の細
    胞。
30. 【請求項３０】 産生されるポリペプチドをコードする核酸配列、又は遺伝
    子を細胞内で発現する方法であって、 -細胞を請求項1 乃至23のいずれか一項のベクター又は核酸配列で形質転換する; -核酸配列又は遺伝子であって、産生されるポリペプチドをコードするものの発
    現を許容する条件下で、前記細胞を培養する ことからなる工程を含むことを特徴とする方法。
31. 【請求項３１】 前記の細胞が、原核生物又は真核生物の細胞であることを
    特徴とする、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記の細胞が、微生物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、 動物
    細胞、及び植物細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３０又
    は３１に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記の細胞が、植物細胞であることを特徴とする、請求項
    ３０乃至３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 【請求項３４】 -植物細胞を請求項1 乃至23のいずれか一項の核酸配列、
    又はこれを含むベクターで形質転換する; -前記ベクター又は前記核酸配列が中に組み込まれた植物細胞を選択する; -キメラの又は遺伝子組換えの植物全体を培養又は再生することにより、形質転
    換及び選択された植物細胞を増殖する； ことからなる工程を含むことを特徴とする、請求項２４又は２５に記載の遺伝子
    組換植物 、又は請求項２６に記載のムカゴを得るための方法。