JP5096743B2 - Rnaウイルス由来植物発現システム - Google Patents
Rnaウイルス由来植物発現システム Download PDFInfo
- Publication number
- JP5096743B2 JP5096743B2 JP2006538788A JP2006538788A JP5096743B2 JP 5096743 B2 JP5096743 B2 JP 5096743B2 JP 2006538788 A JP2006538788 A JP 2006538788A JP 2006538788 A JP2006538788 A JP 2006538788A JP 5096743 B2 JP5096743 B2 JP 5096743B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- sequence
- rna
- replicon
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8203—Virus mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
(i) 高収率、できる限り多くの植物組織及びその組織の多くの細胞における目的タンパク質の発現を含む;
(ii) 植物増殖に対するタンパク質発現の有害効果を妨げるため、目的のタンパク質又は産物の発現は、所望の時点で発現のスイッチを入れることができるように切換可能である必要がある;
(iii) 切換は、1つの植物の全ての組織又は細胞で同時に又はほとんど同時に発現のスイッチを入れることができ、それと同時に、植物の選択したグループ全ての植物、例えば植物の選択したロット全ての植物で同時に又はほとんど同時に発現のスイッチを入れることができる必要がある。典型的には、目的のタンパク質又は産物は、ある時点まで産物又はタンパク質を産生する各細胞に蓄積する。しかしながら、蓄積のあいだ、目的のタンパク質又は産物の収率又は品質が低下する傾向にある分解プロセスが高頻度で進む。したがって、発現スイッチを入れた後、目的の産物又はタンパク質を回収すべき最適な時点がある。この最適な時点は、1つの植物の全ての組織又は細胞、及び選択したロットの全ての植物において同時に到達し、全体的なプロセスを効率的且つ有益にする必要がある。
上記目的は、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なRNAレプリコンをコードする配列を有する異種DNAを細胞核に含有する、形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物によって達成され、RNAレプリコンをコードする配列は、
(i) 植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
(ii) RNAレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物RNAウイルスの配列に対応し、植物RNAウイルスの配列の選択された位置で、植物RNAウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮する。その相違は、相違を発揮しないRNAレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させることができる。植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞は、異種DNAで安定に形質転換されることが好ましい。
(a) 上で定義したとおりの異種DNAを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、及び
(b) 目的配列の発現を引き起こすこと、
を含む。
植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞は、異種DNAで安定に又は一過性に形質転換することができる。
(i) 植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列
(ii) 目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物RNAウイルスの配列の選択された位置で、植物RNAウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮する。その相違は、相違を発揮しないRNAレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させることができる。
(場合により安定に)形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物、及び核酸分子は、RNAレプリコンをコードする異種DNAを有する。RNAレプリコンをコードする配列は、
(i) 植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
(ii) RNAレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有する。
(i) 植物ウイルス(好ましくは植物RNAウイルス)の配列に由来する、レプリコンのレプリコン機能に関する配列、
(ii) 発現されるべき目的配列、
を含有し、アグロバクテリウム懸濁液は、計算された600nmの光学密度が高くても0.04、好ましくは高くても0.01、より好ましくは高くても0.004、最も好ましくは高くても0.001に相当するアグロバクテリウムの細胞濃度を有し、計算された光学密度は、それぞれ、600nmのODが1.0のアグロバクテリウム懸濁液の少なくとも25倍希釈、好ましくは少なくとも100倍希釈、より好ましくは少なくとも250倍希釈、最も好ましくは少なくとも1000倍希釈によって規定される。
驚くべきことに、本発明者らは、レプリコン機能に関する配列内で、植物イントロンを植物ウイルスRNAベクターのある領域に組み込み、潜在イントロンを除去又は置換することにより、宿主植物の細胞質におけるRNAレプリコンの出現効率を劇的に増加させることができる(少なくとも×102倍)ことを見出した。そのような効率増加は、少なくとも1つの容易に測定可能なパラメータ:例えば上昇したレプリコン形成頻度でベクターの複製を示す細胞の相対位置に反映された。こうしたRNAレプリコン形成の開始の最適化は、植物全体で目的配列の発現スイッチを同調して入れる能力をもたらし、非改変ベクターよりも短い時間で組換え目的タンパク質の収率の劇的な増加を生じた。
RNAウイルス:
1本鎖RNAウイルス:科:ブロモウイルス科、属:アルファモウイルス属、基準種:アルファルファモザイクウイルス、属:イラルウイルス属、基準種:タバコ条斑ウイルス、属:ブロモウイルス属、基準種:ブロムモザイクウイルス、属:ククモウイルス属、基準種:キュウリモザイクウイルス;
科:クロステロウイルス科、属:クロステロウイルス属、基準種:ビート黄斑ウイルス、属:クリニウイルス属、基準種:レタス伝染性黄斑ウイルス、科:コモウイルス科、属:コモウイルス属、基準種:ササゲモザイクウイルス、属:ファバウイルス属、基準種:ソラマメ壊疽ウイルス1、属:ネポウイルス属、基準種:タバコ輪点ウイルス;
科:ポティウイルス科、属:ポティウイルス属、基準種:ジャガイモYウイルス、属:ライモウイルス属、基準種:ライグラスモザイクウイルス、属:バイモウイルス属、基準種:オオムギ縞萎縮ウイルス;
科:セキウイルス科、属:セキウイルス属、基準種:パースニップyellow fleckウイルス、属:ワイカウイルス属、基準種:イネtungro sphericalウイルス;科:トンブスウイルス科、属:カルモウイルス属、基準種:カーネーション斑紋ウイルス、属:ダイアントウイルス属、基準種:カーネーション輪点ウイルス、属:マクロモウイルス属、基準種:トウモロコシchlorotic mottleウイルス、属:ネクロウイルス属、基準種:タバコ壊死ウイルス、属:トンブスウイルス属、基準種:トマトbushy stuntウイルス、
属が未分類の1本鎖RNAウイルス、属:カピロウイルス科、基準種:リンゴstem groovingウイルス;
属:カーラウイルス属、基準種:カーネーション潜在ウイルス;属:エナモウイルス属、基準種:エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属:フロウイルス属、基準種:土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属:ホルデイウイルス属、基準種:オオムギ斑葉モザイクウイルス、属:イダエオウイルス属、基準種:ラズベリーbushy dwarfウイルス;
属:ルテオウイルス属、基準種:オオムギ黄萎ウイルス;属:マラフィウイルス属、基準種:トウモロコシrayado finoウイルス;属:ポテクスウイルス属、基準種:ジャガイモXウイルス;属:ソベモウイルス属、基準種:Southern bean モザイクウイルス、属:テヌイウイルス属、基準種:イネ縞葉枯ウイルス、
属:トバモウイルス属、基準種:タバコモザイクウイルス、
属:トブラウイルス属、基準種:タバコ茎壊疽ウイルス、
属:トリコウイルス属、基準種:リンゴchlorotic leaf spotウイルス;属:ティモウイルス属、基準種:カブ黄斑モザイクウイルス;属:アンブラウイルス属、基準種:ニンジンmottleウイルス;マイナス1本鎖RNAウイルス:目:モノネガウイルス目、科:ラブドウイルス科、属:サイトラブドウイルス属、基準種:レタス壊死性黄変病ウイルス、属:ヌクレオラブドウイルス属、基準種:ジャガイモ黄萎病ウイルス;
マイナス1本鎖RNAウイルス:科:ブニヤウイルス科、属:トスポウイルス属、基準種:トマト黄化壊疽ウイルス;
2本鎖RNAウイルス:科:パーティティウイルス科、属:アルファクリプトウイルス属、基準種:シロツメクサcrypticウイルス1、属:ベータクリプトウイルス属、基準種:シロツメクサcrypticウイルス2、科:レオウイルス科、属:フィジーウイルス属、基準種:フィジー病ウイルス、属:ファイトレオウイルス属、基準種:創傷 腫瘍ウイルス、属:オリザウイルス属、基準種:イネragged stuntウイルス;
未分類ウイルス:
ゲノム:1本鎖RNA、種:ニンニクウイルスA、B、C、D、種:grapevine fleckウイルス、種:トウモロコシwhite lineモザイクウイルス、種:オリーブ潜在ウイルス2、種:ourmia メロンウイルス、種:ペラルゴニウムzonate spotウイルス。
本発明を用いて植物若しくは植物細胞で発現し得る目的タンパク質、その断片(機能性又は非機能性)、及びそれらの人工的誘導体には、限定されるものではないが、以下が含まれる:デンプン修飾酵素(デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素II、顆粒結合性デンプン合成酵素)、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ADPグルコース ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌glgAタンパク質、MAPK4及び相同分子種、窒素同化/代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、2Sアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ/インテグラーゼ(FLP、Cre、Rリコンビナーゼ、Int、SSVIインテグラーゼR、インテグラーゼφC31、又はその活性断片又は変異体)、オイル修飾酵素(脂肪酸デサチュラーゼ、エロンガーゼなどのような)、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Sca M5(ダイズ カルモジュリン)、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素(E2)融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維(traits altering fiber)、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素(Bt2毒素、殺虫性結晶タンパク質(ICP)、CryIC毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど)、昆虫特異的毒素AaIT、セルロース分解酵素、acidothermus celluloticus由来のE1セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−6−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、HMG−CoA レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア ヘルビコラ リコピン合成酵素、ACCオキシダーゼ、pTOM36にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ(ketohydrolase)、アセトアセチルCoA レダクターゼ、PHB(ポリヒドロキシブタノエート)合成酵素、ポリヒドロキシアルカノエートの合成に関与する酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、FA9、非高等植物フィトエン合成酵素、pTOM5にコードされるタンパク質、ETR(エチレン受容体)、色素体ピルビン酸 リン酸 ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール 2,3−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナAGL15タンパク質、フルクトース 1,6−ビホスファターゼ(FBPアーゼ)、AMV RNA3、PVYレプリカーゼ、PLRVレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、CMVコートタンパク質、TMVコートタンパク質、ルテオウイルス レプリカーゼ、MDMVメッセンジャーRNA、変異ジェミニウイルス レプリカーゼ、カリホルニアウンベルラリア C12:0選択性アシル−ACPチオエステラーゼ、植物C10又はC12:0選択性アシル−ACPチオエステラーゼ、C14:0選択性アシル−ACPチオエステラーゼ(luxD)、植物合成酵素因子A、植物合成酵素因子B、D6−不飽和化酵素、脂肪酸の生合成及び修飾、例えば植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームβ酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−CoAオキシダーゼ、3−ケトアシル−CoA チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−CoA−カルボキシラーゼ、など;5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸合成酵素(EPSP)、ホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ(BAR、PAT)、CP4タンパク質、ACCデアミナーゼ、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を付与するDHPS遺伝子、細菌ニトリラーゼ、2,4−D モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素(ALS、AHAS)、ポリガラクツロナーゼ、Taqポリメラーゼ、細菌ニトリラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、DNA及びRNAリガーゼ、DNA及びRNAポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ(Dnase及びRNase)、ホスファターゼ、トランスフェラーゼなどを含めた細菌又はファージに由来する他の多くの酵素など。
以下の実施例は本発明を具体的に説明するために提示される。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、修飾及び改変がなされ得る。
アブラナ科植物感染性トバモウイルス(cr−TMV;Dorokhovら、1994、FEBS Lett.350、5−8)及びカブ葉脈−clearingウイルス(TVCV;Larteyら、1994、Arch.Virol.138、287−298)のクローン化cDNAを、モスクワ大学、ロシアのAtabekov教授から得た。いくつかのクローニング工程で緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含有するウイルスベクターを作製した。得られた構築体、pICH8543(図6A)は:シロイヌナズナ アクチン2プロモーター(ACT2、参考文献 Anら、1996、GenBank受託番号AB026654、bp57962〜58748)由来の787bp断片、TVCVの5’端(GenBank受託番号BRU03387、bp1〜5455)、cr−TMV(GenBank受託番号Z29370、bp5457〜5677、コートタンパク質CPの開始コドンを除去するため、チミン5606がシトシンに変異している)の断片、「taa tcg ata act cga g」配列、合成GFP(sGFP)遺伝子、cr−TMV 3’非翻訳領域(3’NTR;GenBank受託番号Z29370、bp6078〜6312)、及び最後にノパリン合成酵素(Nos)ターミネーターを順番に含有する。断片全体を、CarbR pBIN19由来バイナリーベクターであるpICBV10のT−DNAの左の境界(LB)と右の境界(RB)とのあいだにクローン化した。pICH8543で、アグロバクテリウム株GV3101を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。3dpiで出現したGFP蛍光の焦点は、増殖してコンフルエントになった。驚くべきことに、GFPを発現する多くの独立した焦点によって検出されたように、浸潤領域の大部分の細胞が、ウイルス複製及び移行により、最終的にGFPを発現したとしても、細胞のある画分のみがウイルス複製を開始した。35Sプロモーターの制御下でGFP遺伝子を有するベンサミアナタバコ葉の浸潤は、浸潤領域のほとんど全ての細胞でGFP発現をもたらすため(図示していない)、限定要因は植物細胞へのDNA送達ではないことが明らかになった。
NetgeneIIサーバープログラム(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)を用いてpICH4351に由来するRNAレプリコンの配列を解析し、選択的スプライシングイベントを誘発するかもしれないいくつかのイントロン様配列特徴に気づいた。そのような特徴の1つは、RdRPの初めにある0.6kbのウリジンに富んだ領域(GenBank受託番号BRU03387のヌクレオチド827〜1462に相当する)である(図2A)。この領域は、pICH14833では、PCRで変異させた、54ヌクレオチド置換によってオリジナル配列とは異なる配列に置換した(配列番号2として付録に示した配列;図3を参照されたい)。52ヌクレオチドを置換し、Tに富んだ配列をよりGCに富んだ配列に置換した。RdRPタンパク質配列が変化しないように、全てのヌクレオチド置換をサイレントにした。変異断片は、それぞれ推定の潜在スプライスドナー及びアクセプター部位を除去するために導入した2つのヌクレオチド置換も含有する(位置829及び1459;GenBank受託番号BRU03387に対する座標)。これらの変異の効果を試験するために、得られたクローンpICH15466(図6A)を、pICH10745(トランスの移行タンパク質)とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させた。浸潤後8日に、pICH15466で浸潤させた領域においてGFP発現細胞数に10倍の増加が観察された(pICH14833と比較して、図7)。これは、ウイルスアンプリコンからのイントロン様配列の除去は、望ましくない選択的スプライシングイベントを妨げ、ウイルス複製をより効率的に開始させることを示唆する。pICH15466とpICH10745との共浸潤は、非改変レプリコンと類似の速度で改変レプリコンの細胞間移行をもたらす。これは、RNA配列の改変はウイルスベクターの細胞間移行に影響しなかったことを示している。
第2の潜在的に問題のある領域は、MPサブゲノムプロモーターに相当する(図2B)。この領域は非常にTに富んでおり、イントロン配列に非常に似ている。結果として、イントロン予測プログラムによって配列近傍に多くの潜在スプライスドナー及びアクセプター部位が予測される。残念なことに、サブゲノムプロモーター機能に影響を及ぼすことなくこの領域に修飾を容易に行うことができない。サブゲノムプロモーターに関し、全領域を完全に変異させ、MP発現の予測される喪失を補うためにトランスでMPを提供することにした。また、この構築体からMPは発現しないため、目的遺伝子の発現の駆動に必要なCPサブゲノムプロモーターを含有する3’配列以外は、MP配列の大部分を削除することにした。したがって、pICH14833(GenBank受託番号BRU03387のbp4584〜5455)中の383bp断片を297bpの変異させた断片(配列番号3)で置換した。得られた構築体pICH15900(図6A)を、pICH10745とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させた。興味深いことに、pICH14833で浸潤させた葉領域と比較して、複製を開始する細胞数の莫大な増加を検出した。浸潤葉領域から調製したGFP発現プロトプラストを計数することによって、この修飾は、非改変pICH14833と比較して、ウイルス複製を開始する細胞数を80〜100倍増加させると概算している。pICH15900を、pICH10745(p35S−MP発現カセット)とともに共浸潤させたところ、細胞間移行によるGFP蛍光の増加を検出した。しかしながら、たとえ細胞間移行がなくとも、多くの細胞は既にGFPを発現していたので、この増加は非常に限られたものであった。pICH15900を含有するアグロバクテリウム懸濁液の1000倍希釈(600nmの計算されたODがおよそ0.004に相当する)を、pICH10745を含有する5倍希釈したアグロバクテリウム懸濁液(600nmの計算されたODがおよそ0.8に相当する)とともに共浸潤させたところ、GFP発現焦点を分離させた。蛍光焦点は、pICH14833を用いて得られた対照焦点と同様に明るく、同じサイズであった。これは、pICH15900の改変とMPのトランスでの送達とは、複製レベル、目的遺伝子の発現及び細胞間移行に関し、レプリコンの機能性を落とさないことを示している。同一構築体(pICH14933及びpICH15900、pICH10745とともにか又は伴わない)を、タバコ葉に共浸潤させた。pICH15900における改変は、ベンサミアナタバコと同様に、複製を開始する細胞数を増加させた(pICH14833と比較して)。
ウイルスプロレプリコン配列へのイントロンの付加が、複製開始頻度を上昇させるかどうかについて試験した。それぞれ3つの異なるシロイヌナズナ イントロンをRdRPの2つの異なる領域に含有する、pICH15025及びpICH15034の2つの構築体を作製した(図6A)。イントロンをRdRPの中央に含有するように、pICH15025をデザインした。一方、pICH15034は、イントロンを、MPサブゲノムプロモーターの上流である、RdRPの3’端に含有する。イントロンをPCRでシロイヌナズナ ゲノムDNAから増幅させ、所定のイントロン/エクソン接合部位に重複するプライマーを用いてPCRでウイルス配列に組み込んだ。イントロン含有断片を、AvaI−HindIII断片(付録の配列番号4)として、pICH14833にサブクローニングしてpICH15025を作製し、又はPstI−NcoI断片(付録の配列番号5)としてサブクローニングしてpICH15034を作製した。
1つの構築体でイントロン様の特徴を除去し、追加のイントロンを付加することにより、2つのタイプの改変がウイルス複製の開始の向上に寄与できることを示した。変異したMPサブゲノムプロモーター領域を含有するpICH15499の6イントロンをpICH15900へサブクローニングした。得られたクローンpICH15860(図6B)を、ベンサミアナタバコ葉に浸潤させ、およそ50%〜90%のGFPを発現する全てのプロトプラストの範囲内でいずれの親クローンよりも顕著によく働くことを見出した(図7)。最高性能の構築体は、イントロンをRdRP領域、及び改変MPサブゲノムプロモーター領域に含有する(pICH16191、図7C)。全く改変していないクローンと比較すると、これは、80〜300倍の増加を示した。また、この構築体をMP発現構築体(pICH10745)とともに共浸潤させ、改変が細胞間移行又は複製を傷つけないことを見出した。
2つの異なるシロイヌナズナ イントロンをRdRPの初めに挿入し、クローンpICH15477を得た(付録にこの領域の配列を配列番号6として示す)。この領域の配列は、イントロンの付加前に既に非常に「エクソン様」にみえる(例えば潜在スプライス部位をもたずにGCに富んでいる)。この構築体でウイルス複製開始の改善はみられなかった。したがって、全てのイントロン付加がウイルスベクターの改善をもたらすわけではないであろう。イントロンの挿入又は変異のために選択された位置は重要なパラメータであるようである。例えば、MPサブゲノムプロモーターのように問題のある構造近傍の領域で作製される全てのイントロンの挿入又はヌクレオチド置換は、大きく改善されたが、既に「エクソン様」の配列へのイントロンの挿入は改善されなかった。
初めに、制限酵素AvrIIによる消化、フィリング及び再連結によって、MPにフレームシフトを作製した。次に、2つのイントロンをMPに挿入した。得られたクローンpICH16422(図6B)をベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。機能性ウイルスレプリコンを含有する細胞数に約100倍の増加が検出された。
pICH15499からKpnI−EcoRlI断片をpICH8543へサブクローニングした。得られたクローン16700(図6B)は、RdRPに6イントロンを有する完全なウイルスベクターを含有した。このクローンをベンサミアナタバコ葉に浸潤させ、効率的に複製を開始させた。また、このクローンは、トランスでのMPの付加を要することなく細胞間移行可能であった。
また、イントロン含有ウイルスベクター構築体をトランスジェニック植物に安定に形質転換することが可能である。植物生長を阻害する有害なウイルス複製を避けるために、不活性クローン(プロレプリコン)を、アンチセンス方向で存在するベクターの一部を有することによって作製することができる(図8)。反転断片の先端での組換え部位及びイントロン配列の組込みは、適切なリコンビナーゼを用いることによって、この断片を正しい方向に「反転」させることができる。組換え部位はレプリコンからスプライシングによって完全に排除されるであろう。プロレプリコン中のイントロンは、組換え及び転写後、効率的な複製開始を可能にする。1つの特定の例では、組換え部位は目的遺伝子内でプロレプリコンの下流に位置する。このような立体配置は、組み換え前の遺伝子発現を妨げる。組換えが、RdRP内及びプロモーターの上流のような、プロレプリコンの他の領域に位置する他の立体配置が考えられる。組換え部位のイントロン配列は、組換えをレプリコンから完全に除去することを可能にする有益性を有するが、先に記載したように、ウイルス複製効率も上昇させる。
選択した植物RNAウイルスのRNAプロファイルを、十分に特徴付けられた植物遺伝子(AtDMC1)のものとともに、NetgeneIIサーバープログラム(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)を用いて解析した。図9に示すAtDMC1のRNAプロファイルは、cDNAとゲノムDNAの配列を比較することによって先に同定した14イントロン(丸で囲んでいる)の存在を明確に反映している。2つの植物ウイルスのRNAプロファイルは、それらを植物核環境におくとRNAの安定性に問題を引き起こし得る領域を有することは明らかである(図10、11を参照されたい)。ブロムモザイクウイルス、TMVの異なる株、そして他の多くのもののような植物RNAウイルスのいくつかの他の代表的なもののRNAプロファイルについて解析した(示していない)。それらの全ては、DNA前駆体として植物細胞に送達された場合、植物RNAウイルスに基づいたレプリコン形成の効率を落としかねない、潜在的に問題のある領域を有している。
変異させた領域(pICH15466に記載)及び16イントロン(pICH15860の6イントロン、pICH16422の2イントロン、及び追加の8イントロンを含む)を含有する完全に最適化した構築体を作製した。要約すれば、この構築体は以下の位置に挿入されたイントロンを含有する(TVCV配列に対して示す、GenBank受託番号BRU03387):ヌクレオチド209、ヌクレオチド828、ヌクレオチド1169、ヌクレオチド1378、ヌクレオチド1622、ヌクレオチド1844、ヌクレオチド2228、ヌクレオチド2589、ヌクレオチド2944、ヌクレオチド3143、ヌクレオチド3381、ヌクレオチド3672、ヌクレオチド3850、ヌクレオチド4299、ヌクレオチド5287、ヌクレオチド5444。
配列番号1(pICH14833のNcoI−EcoRI断片):
ヌクレオチド1〜25:左の境界(反対鎖)、
ヌクレオチド86〜1484:Nosプロモーター−NPTIIコード配列−Nosターミネーター(反対鎖上)、
ヌクレオチド1506〜1552:AttP 組換え部位(反対鎖)、
ヌクレオチド1553〜1599:イントロン5’部分(反対鎖)、
ヌクレオチド1600〜2022:TVCV RdRP 5’端(反対鎖)、
ヌクレオチド2023〜2809:シロイヌナズナ アクチン2プロモーター(反対鎖)、
ヌクレオチド2836〜2903:AttB組換え部位、
ヌクレオチド2904〜2959:イントロン3’部分、
ヌクレオチド2960〜7991:TVCV RdRP 3’部分−MP5’部分、
ヌクレオチド7992〜8168:cr−TMV MP 3’端、
ヌクレオチド8248〜8967:GFPコード配列、
ヌクレオチド8961〜9215:cr−TMV 3’非翻訳領域、
ヌクレオチド9234〜9497:Nosターミネーター、
ヌクレオチド9549〜9473:T−DNA右境界(反対鎖):
Claims (33)
- 転写プロモーターに機能可能に連結されているRNAレプリコンをコードする配列を有する異種DNAを細胞核に含有する、安定に形質転換された植物、植物の部分、又は植物細胞培養物であって、RNAレプリコンをコードする配列は、
(i) RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列、及び
(ii) RNAレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、レプリコン機能に関する配列のA/Uに富んだ位置の近傍若しくはその中で1以上の核イントロンの挿入を含み、ここにおいて、A/Uに富んだ位置は、少なくとも55%のA/U含量を有する少なくとも長さ20ヌクレオチドの配列ストレッチ、又は純粋にA/Uを含有する配列の列の6〜19ヌクレオチドの配列ストレッチである、前記植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。 - 植物の全ての細胞核が異種DNAを含有する、請求項1に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
- 異種DNAが細胞核の染色体に含有される、請求項1又は2に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
- 植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の全ての細胞が、核染色体に異種DNAを含有する、請求項3に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
- 植物RNAウイルスがトバモウイルスである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
- 植物RNAウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項5に記載の植物、植物の部分、又は植物細胞培養物。
- 植物の部分が種子である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の植物の部分。
- 植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法であって:(a) 転写プロモーターに機能可能に連結されているRNAレプリコンをコードする配列を有する異種DNAを細胞核に含有する植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を準備すること、ここで、RNAレプリコンをコードする配列は、
(i)RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列、
(ii)目的配列
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、レプリコン機能に関する配列のA/Uに富んだ位置の近傍若しくはその中で1以上の核イントロンの挿入を含み、ここにおいて、A/Uに富んだ位置は、少なくとも55%のA/U含量を有する少なくとも長さ20ヌクレオチドの配列ストレッチ、又は純粋にA/Uを含有する配列の列の6〜19ヌクレオチドの配列ストレッチである;及び
(b) 目的配列を発現させること、
を含む前記方法。 - 異種DNAが核染色体に安定に組み込まれている、請求項8に記載の方法。
- 目的配列が目的タンパク質をコードし、工程(b)は目的タンパク質の発現を引き起こすこと含む、請求項8又は9に記載の方法。
- 目的タンパク質の発現が、植物、植物の部分、又は植物細胞において所望の産物の産生をもたらす、請求項10に記載の方法。
- 工程(b)が、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に部位特異的リコンビナーゼを提供することを含む、請求項8〜11のいずれか1項に記載方法。
- 部位特異的リコンビナーゼが、リコンビナーゼをコードするベクターの一過性トランスフェクションによって提供される、請求項12に記載の方法。
- 部位特異的リコンビナーゼが、誘導性又は発生的に調節されたプロモーターの制御下において核染色体に安定にコードされ、工程(b)が、調節されたプロモーターの誘導を含む、請求項12に記載の方法。
- リコンビナーゼが、CRE、フリッパーゼ、リゾルベース、FLP、SSV1にコードされるインテグラーゼ、Rリコンビナーゼ、φC31インテグラーゼ、Intiインテグラーゼ、φ80、P22、P2、186、及びP4 リコンビナーゼ、Tn3リゾルベース、Hinリコンビナーゼ、Cinリコンビナーゼ、大腸菌XerC及びXerDリコンビナーゼ、バチルス・チューリンゲンシス リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 異種DNA、又はRNAレプリコンをコードする配列が、誘導性又は発生的に調節された転写プロモーターに連結されている、請求項7〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 誘導性又は発生的に調節されたプロモーターが、化学的に誘導性のプロモーターである、請求項16に記載の方法。
- 工程(a)における準備が、異種DNAを含有する核酸分子による植物、植物の部分、又は植物細胞の形質転換を含む、請求項7〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)における準備が、異種DNAを含有する核酸分子による植物、植物の部分、又は植物細胞培養物の細胞の一過性形質転換を含む、請求項7〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)がアグロバクテリウム介在形質転換によって行われる、請求項7〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)が、異種DNAで安定に形質転換されたトランスジェニック植物の作製を含む、請求項7〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1で定義したとおりの異種DNAで核染色体を安定に形質転換したトランスジェニック植物を作製する方法であって、植物、又は植物の部分を異種DNAを含有するベクターで形質転換し、核染色体に異種DNAを含有する植物の組織を選択し、そしてトランスジェニック植物を組織から再生することを含む、前記方法。
- 植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を一過性に発現させる方法であって:植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、転写プロモーターに機能可能に連結されているRNAレプリコンをコードする配列を有する異種DNAで形質転換させることを含み、RNAレプリコンをコードする配列は、
(i) RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列、
(ii) 目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、レプリコン機能に関する配列のA/Uに富んだ位置の近傍若しくはその中で1以上の核イントロンの挿入を含み、ここにおいて、A/Uに富んだ位置は、少なくとも55%のA/U含量を有する少なくとも長さ20ヌクレオチドの配列ストレッチ、又は純粋にA/Uを含有する配列の列の6〜19ヌクレオチドの配列ストレッチである、前記方法。 - 形質転換が、異種DNAを含有するT−DNAによるアグロバクテリウム介在一過性形質転換によって実施される、請求項23に記載の方法。
- 形質転換が、タバコ植物の茎及び/又は全ての葉のアグロ浸潤によって実施される、請求項23又は24に記載の方法。
- 全ての細胞核が異種DNAを含有する、請求項7〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 位置が、
(A)植物、植物の部分、又は植物細胞培養物を、1以上のイントロンの挿入を欠失している以外は請求項7で定義したとおりの異種DNAで形質転換し、
(B)植物、植物の部分、又は植物細胞培養物における工程(A)の異種DNAに由来するRNAについてRT−PCRを実施してRT−PCR産物の配列を決定し、そして
(C)RT−PCR産物の配列において、望ましくないスプライシングを導く望ましくないスプライシングイベントの位置として選択された位置を同定すること、
によって同定される、請求項7〜26のいずれか1項に記載の方法。 - 植物RNAウイルスがトバモウイルスである、請求項8〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 植物RNAウイルスがタバコモザイクウイルである、請求項8〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 植物、植物の部分、又は植物細胞培養物が2以上の異なる異種DNAを含有する方法であって、2つの異なる目的タンパク質が共発現する2つの異なるRNAレプリコンの形成を含む、請求項8〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 植物、植物の部分、又は植物細胞培養物に、2つの異なる、請求項8で定義したとおりの異種DNAが提供され、それにより、2つの異なる目的配列が発現する、請求項8〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 転写プロモーターに機能可能に連結されているRNAレプリコンをコードするDNA配列を含有する核酸分子であって、RNAレプリコンをコードする配列は、
(i) RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列、
(ii) RNAレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物RNAウイルスの配列に相当し、植物RNAウイルスの配列のA/Uに富んだ位置の近傍若しくはその中で1以上の核イントロンの挿入を含み、ここにおいて、A/Uに富んだ位置は、少なくとも55%のA/U含量を有する少なくとも長さ20ヌクレオチドの配列ストレッチ、又は純粋にA/Uを含有する配列の列の6〜19ヌクレオチドの配列ストレッチである、前記核酸分子。 - 転写プロモーターに機能可能に連結されているRNAレプリコンをコードするDNA配列を含有する核酸分子であって、RNAレプリコンをコードする配列は、
(i) RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、植物RNAウイルスの配列に由来する、RNAレプリコンのレプリコン機能に関する配列、
(ii) RNAレプリコンから発現されるべき目的配列、
を含有し、それにより、レプリコン機能に関する配列は、植物RNAウイルスの配列に相当し、植物RNAウイルスの配列のA/Uに富んだ位置の近傍若しくはその中で1以上の核イントロンの挿入を含み、ここにおいて、A/Uに富んだ位置は、少なくとも55%のA/U含量を有する少なくとも長さ20ヌクレオチドの配列ストレッチ、又は純粋にA/Uを含有する配列の列の6〜19ヌクレオチドの配列ストレッチであり;
ここで、RNAレプリコンをコードするDNA配列は、
(a) プロモーターとDNA配列とのあいだの機能可能な連結を排除する配列ブロックによって、RNAレプリコンをコードするDNA配列とプロモーターとを分離し、ここで、配列ブロックは組換え部位に隣接し、それにより、組換え部位を認識するリコンビナーゼによって配列ブロックを切り出すことができること;又は
(b) プロモータ及びプロモーター部分より選択される転写に必要な配列部分を、反転方向で組換え部位に連接して有し、それにより、リコンビナーゼによって配列部分を正しい方向に反転して戻すことができること
によって、転写プロモーターに機能可能に連結可能にされる、前記核酸分子。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EPPCT/EP03/12530 | 2003-11-10 | ||
PCT/EP2003/012530 WO2006012906A1 (en) | 2003-11-10 | 2003-11-10 | Rna virus-derived plant expression system |
EP04016012.9 | 2004-07-07 | ||
EP04016012 | 2004-07-07 | ||
PCT/EP2004/012743 WO2005049839A2 (en) | 2003-11-10 | 2004-11-10 | Rna virus-derived plant expression system |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010211319A Division JP2011024591A (ja) | 2003-11-10 | 2010-09-21 | Rnaウイルス由来植物発現システム |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007510423A JP2007510423A (ja) | 2007-04-26 |
JP5096743B2 true JP5096743B2 (ja) | 2012-12-12 |
Family
ID=34621451
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006538788A Active JP5096743B2 (ja) | 2003-11-10 | 2004-11-10 | Rnaウイルス由来植物発現システム |
JP2010211319A Pending JP2011024591A (ja) | 2003-11-10 | 2010-09-21 | Rnaウイルス由来植物発現システム |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010211319A Pending JP2011024591A (ja) | 2003-11-10 | 2010-09-21 | Rnaウイルス由来植物発現システム |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10287602B2 (ja) |
EP (2) | EP1682667B1 (ja) |
JP (2) | JP5096743B2 (ja) |
AT (1) | ATE469231T1 (ja) |
CA (1) | CA2541294C (ja) |
DE (1) | DE602004027403D1 (ja) |
DK (1) | DK1682667T3 (ja) |
ES (1) | ES2346224T4 (ja) |
IL (1) | IL173859A (ja) |
WO (1) | WO2005049839A2 (ja) |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2531125T3 (es) | 2003-02-03 | 2015-03-10 | Ibio Inc | Sistema para la expresión de genes en plantas |
BRPI0410562B8 (pt) | 2003-05-22 | 2021-05-25 | Fralunhofer Usa Inc | proteína de veículo e seu método de produção em uma planta, ácido nucleico isolado, vetor de expressão e célula hospedeira |
EP1564295A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-08-17 | Icon Genetics AG | RNA virus-derived plant expression system |
EP1616959A1 (en) | 2004-07-07 | 2006-01-18 | Icon Genetics AG | Biological safe transient protein expression in plants |
BRPI0614475B8 (pt) | 2005-08-03 | 2021-05-25 | Fraunhofer Usa Inc | polipeptídeo, anticorpo, ácido nucleico, vetores, célula hospedeira, composição e processos de produção de anticorpo |
EP1764414A1 (en) | 2005-09-17 | 2007-03-21 | Icon Genetics AG | Plant viral particles comprising a plurality of fusion proteins consisting of a plant viral coat protein, a peptide linker and a recombinant protein and use of such plant viral particles for protein purification |
WO2008060669A2 (en) | 2006-04-21 | 2008-05-22 | Dow Agrosciences Llc | Vaccine for avian influenza and methods of use |
CN101395174B (zh) * | 2006-02-13 | 2014-03-19 | 艾比欧公司 | 人类乳头瘤病毒(hpv)抗原、疫苗组合物和相关方法 |
WO2007095304A2 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-23 | Fraunhofer Usa, Inc. | Production of foreign nucleic acids and polypeptides in plant systems |
ES2382179T3 (es) * | 2006-05-29 | 2012-06-06 | Icon Genetics Gmbh | Sistema de expresión inducible basado en virus de plantas |
WO2007137788A1 (en) * | 2006-05-29 | 2007-12-06 | Icon Genetics Gmbh | Plant virus-based inducible expression system |
WO2008094512A2 (en) | 2007-01-29 | 2008-08-07 | The Ohio Sate University Research Foundation | System for expression of genes in plants from a virus-based expression vector |
EP2154246B1 (en) | 2007-04-27 | 2017-03-29 | Japan Science and Technology Agency | Viral vector and use thereof |
WO2009009759A2 (en) | 2007-07-11 | 2009-01-15 | Fraunhofer Usa, Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
US8734803B2 (en) | 2008-09-28 | 2014-05-27 | Ibio Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
EP2483307A1 (en) | 2009-09-29 | 2012-08-08 | Fraunhofer USA, Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods |
EP2418283A1 (en) | 2010-08-07 | 2012-02-15 | Nomad Bioscience GmbH | Process of transfecting plants |
EP2584042A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-24 | Nomad Bioscience GmbH | Production, storage and use of cell wall-degrading enzymes |
EP2647715A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-09 | Nomad Bioscience GmbH | Agrobacterium for transient transfection of whole plants |
WO2013154233A1 (ko) * | 2012-04-12 | 2013-10-17 | 한국생명공학연구원 | Sycmv 유래의 재조합 바이러스 벡터 및 이의 용도 |
US20160002654A1 (en) * | 2013-02-20 | 2016-01-07 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acid molecule for expressing foreign gene in plant and method therefor |
EP2777711A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-09-17 | Icon Genetics GmbH | Her2/Neu cancer vaccine |
US20160097056A1 (en) | 2013-05-23 | 2016-04-07 | Nomad Bioscience Gmbh | Process of Providing Plants with Abiotic Stress Resistance |
EP3097783B1 (en) | 2015-05-26 | 2019-11-13 | Nomad Bioscience GmbH | Colicin m for the control of ehec |
EP3178313A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-14 | Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie | Gene and protein for the synthesis of oxidized zingiberene derivatives |
EP3372091A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-12 | Nomad Bioscience GmbH | Method of reducing contamination of an object with clostridium |
EP3378485A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-26 | Nomad Bioscience GmbH | Bacteriocins for control of salmonella enterica |
EP3456829A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Nomad Bioscience GmbH | Method of improving potexviral vector stability |
WO2019158653A1 (en) | 2018-02-15 | 2019-08-22 | Icon Genetics Gmbh | Immunogenic composition and vaccine for generating an immune response to norovirus |
WO2020182860A1 (en) | 2019-03-12 | 2020-09-17 | Icon Genetics Gmbh | Norovirus-like particles with improved stability |
CN114206371A (zh) | 2019-06-06 | 2022-03-18 | 诺麦生物科学有限公司 | 用于控制克雷伯氏菌属的克雷伯菌素 |
CN111349649B (zh) * | 2020-03-16 | 2020-11-17 | 三峡大学 | 一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用 |
WO2022012926A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-20 | Nomad Bioscience Gmbh | Products for oral consumption with reduced sugar content |
EP4387467A1 (en) | 2021-08-20 | 2024-06-26 | Nomad Bioscience GmbH | Sweetener blend comprising thaumatin and brazzein |
WO2023077118A1 (en) * | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Polynucleotides for modifying organisms |
WO2023141540A2 (en) * | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Polynucleotides for modifying organisms |
EP4248987A1 (en) | 2022-03-21 | 2023-09-27 | Nomad Bioscience GmbH | Chimeric bacteriocins and method for the control of pseudomonas |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH14313A (de) | 1897-03-13 | 1897-11-15 | Arthur Petzenbuerger | Stromzuführungsvorrichtung für elektrische Bahnen |
CH15499A (de) | 1897-11-24 | 1898-06-15 | Friedrich Scharpf | An Tischen, Stühlen etc. befestigbarer Schirm- oder Stockhalter aus Draht |
CH16888A (de) | 1898-04-22 | 1899-02-28 | M Bissinger Friedricih | Vorrichtung zur Förderung der Pökellake beim Einpökeln von Fleisch |
NL8300698A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
CA1280081C (en) | 1984-09-24 | 1991-02-12 | Calgene, Inc. | Plant cell microinjection technique |
US5100792A (en) | 1984-11-13 | 1992-03-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues |
US4795855A (en) | 1985-11-14 | 1989-01-03 | Joanne Fillatti | Transformation and foreign gene expression with woody species |
WO1987006614A1 (en) | 1986-04-30 | 1987-11-05 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles |
DE3786898T2 (de) | 1986-05-29 | 1994-02-10 | Calgene Inc | TRANSFORMATION UND EXPRESSION EINES FREMDEN GENS IN -i(BRASSICA) SPEZIES. |
AU7335187A (en) | 1986-06-10 | 1987-12-17 | Calgene, Inc. | Agrobacterium transformation of plant tissue |
DK240088A (da) | 1987-05-05 | 1988-11-06 | Sandoz Ag | Fremgangsmaade til transformation af et plantecellematerale |
US5840557A (en) * | 1987-07-21 | 1998-11-24 | Mogen International Nv | Method for producing seeds and plants thereof involving an in vitro step |
EP0317511A3 (de) | 1987-11-18 | 1991-10-16 | Ciba-Geigy Ag | Insektizide Baumwollpflanzenzellen |
US5977438A (en) | 1988-02-26 | 1999-11-02 | Biosource Technologies, Inc. | Production of peptides in plants as viral coat protein fusions |
US5316931A (en) | 1988-02-26 | 1994-05-31 | Biosource Genetics Corp. | Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes |
US5614395A (en) | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
US5955330A (en) | 1989-05-18 | 1999-09-21 | Research Corporation Technologies | Means for enhancing gene expression |
US6093554A (en) | 1989-10-03 | 2000-07-25 | Aveve N.V. | Genetics manipulations with recombinant DNA virus comprising sequences derived from RNA virus |
ATE130371T1 (de) | 1989-12-19 | 1995-12-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren und vorrichtung zur genetischen transformation von zellen. |
CA2036935A1 (en) | 1990-02-26 | 1991-08-27 | Paul Christou | Plant transformation process with early identification of germ line transformation events |
EP0558676B1 (en) | 1990-11-23 | 2000-04-19 | Plant Genetic Systems, N.V. | Process for transforming monocotyledonous plants |
US5384253A (en) | 1990-12-28 | 1995-01-24 | Dekalb Genetics Corporation | Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes |
US5187287A (en) | 1992-02-20 | 1993-02-16 | Arco Chemical Technology, L.P. | Lower alkylene oxide purification |
DK0637339T3 (da) | 1992-04-13 | 2001-12-03 | Syngenta Ltd | DNA-konstruktioner og planter, hvori de er inkorporeret |
AU4539593A (en) | 1992-06-23 | 1994-01-24 | South Dakota State University | Transformation of plants by direct injection of dna |
WO1994000977A1 (en) | 1992-07-07 | 1994-01-20 | Japan Tobacco Inc. | Method of transforming monocotyledon |
CA2152934A1 (en) * | 1992-12-30 | 1994-07-21 | Thomas H. Turpen | Viral amplification of recombinant messenger rna in transgenic plants |
US5981236A (en) | 1993-02-26 | 1999-11-09 | Calgene Inc | Geminivirus-based gene expression system |
GB9311593D0 (en) | 1993-06-04 | 1993-07-21 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
US5491076A (en) | 1993-11-01 | 1996-02-13 | The Texas A&M University System | Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector |
AU703124B2 (en) * | 1995-03-03 | 1999-03-18 | Syngenta Participations Ag | Control of gene expression in plants by receptor mediated transactivation in the presence of a chemical ligand |
CA2146712C (en) | 1995-04-10 | 2002-06-25 | Jas Singh | Cold induced promoter from winter brassica napus |
US5693512A (en) * | 1996-03-01 | 1997-12-02 | The Ohio State Research Foundation | Method for transforming plant tissue by sonication |
FI972293A (fi) | 1997-05-30 | 1998-12-01 | Joseph Atabekov | Useamman kuin yhden geenin yhteisekspressiomenetelmät |
EP0994957A1 (en) * | 1997-07-31 | 2000-04-26 | Sanford Scientific, Inc. | Transgenic plants using the tdc gene for crop improvement |
HUP0004222A3 (en) | 1997-10-24 | 2002-11-28 | Du Pont | Binary viral expression system in plants |
US6632980B1 (en) | 1997-10-24 | 2003-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Binary viral expression system in plants |
WO1999025855A1 (en) * | 1997-11-18 | 1999-05-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Mobilization of viral genomes from t-dna using site-specific recombination systems |
US6063985A (en) | 1998-01-28 | 2000-05-16 | The Rockefeller University | Chemical inducible promotor used to obtain transgenic plants with a silent marker |
JP2002537842A (ja) * | 1999-03-09 | 2002-11-12 | ラージ スケール バイオロジー コーポレイション | 外来の配列を発現するための多成分rnaベクター系 |
DE10121283B4 (de) | 2001-04-30 | 2011-08-11 | Icon Genetics GmbH, 80333 | Verfahren und Vektoren zur Amplifikation oder Expression von gewünschten Nucleinsäuresequenzen in Pflanzen |
NZ514547A (en) * | 2001-09-28 | 2004-10-29 | Duncan Stanley | Plastid alph-amylase protein and nucleic acids encoding same and methods for altering the starch content of a plant |
WO2002097080A2 (en) | 2002-04-30 | 2002-12-05 | Icon Genetics Ag | Amplification vectors based on trans-splicing |
MXPA06003715A (es) | 2003-11-10 | 2006-06-23 | Icon Genetics Ag | Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn. |
-
2004
- 2004-11-10 ES ES04797791T patent/ES2346224T4/es active Active
- 2004-11-10 JP JP2006538788A patent/JP5096743B2/ja active Active
- 2004-11-10 DK DK04797791.3T patent/DK1682667T3/da active
- 2004-11-10 EP EP04797791A patent/EP1682667B1/en active Active
- 2004-11-10 DE DE602004027403T patent/DE602004027403D1/de active Active
- 2004-11-10 WO PCT/EP2004/012743 patent/WO2005049839A2/en active Application Filing
- 2004-11-10 AT AT04797791T patent/ATE469231T1/de active
- 2004-11-10 CA CA2541294A patent/CA2541294C/en active Active
- 2004-11-10 EP EP10000553.7A patent/EP2184363B1/en active Active
-
2006
- 2006-02-21 IL IL173859A patent/IL173859A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-09-21 JP JP2010211319A patent/JP2011024591A/ja active Pending
-
2016
- 2016-01-05 US US14/988,092 patent/US10287602B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2541294C (en) | 2013-06-25 |
US10287602B2 (en) | 2019-05-14 |
ES2346224T4 (es) | 2011-06-01 |
EP2184363B1 (en) | 2013-08-28 |
ES2346224T3 (es) | 2010-10-13 |
CA2541294A1 (en) | 2005-06-02 |
EP1682667B1 (en) | 2010-05-26 |
JP2007510423A (ja) | 2007-04-26 |
EP2184363A1 (en) | 2010-05-12 |
ATE469231T1 (de) | 2010-06-15 |
DK1682667T3 (da) | 2010-08-23 |
DE602004027403D1 (de) | 2010-07-08 |
JP2011024591A (ja) | 2011-02-10 |
WO2005049839A2 (en) | 2005-06-02 |
US20160208276A1 (en) | 2016-07-21 |
IL173859A (en) | 2012-06-28 |
EP1682667A2 (en) | 2006-07-26 |
IL173859A0 (en) | 2006-07-05 |
WO2005049839A3 (en) | 2005-11-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5096743B2 (ja) | Rnaウイルス由来植物発現システム | |
CA2571029C (en) | Biologically safe transient protein expression in plants | |
JP5172828B2 (ja) | 植物ウイルスに基づいた誘導性発現システム | |
US8597950B2 (en) | Two-component RNA virus-derived plant expression system | |
MXPA03008667A (es) | Procedimientos y vectores para la amplificacion o expresion de secuencias de acido nucleico de interes en plantas. | |
EP1339859A2 (en) | Processes and vectors for producing transgenic plants | |
AU2004291658B2 (en) | RNA virus-derived plant expression system | |
JP2008505622A (ja) | 植物における生物学的に安全な一過性のタンパク質発現 | |
US9267143B2 (en) | RNA virus-derived plant expression system | |
JP2006526984A (ja) | ハイブリッド種子における目的産物の安全な産生 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070720 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20080901 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100422 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100721 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100728 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100820 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100827 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100921 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110818 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111117 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111125 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111219 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111227 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120118 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120125 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120220 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120823 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120921 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5096743 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150928 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |