CN111349649B

CN111349649B - 一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用

Info

Publication number: CN111349649B
Application number: CN202010181807.5A
Authority: CN
Inventors: 沈祥陵; 吕阳; 王佩; 韩少鹏; 曾弓剑; 周超; 刘�文
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: Hubei Suogan Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2020-03-16
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-03-16
Also published as: JP2021145680A; CN111349649A

Abstract

本发明公开了一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用。本发明对双孢蘑菇序列进行分析，得到了人类同源U6启动子序列，并构建了能高效表达Cas9蛋白和gRNA的CRISPR/Cas9载体，建立了一套对双孢蘑菇基因进行精确编辑的基因编辑体系。本发明的试验结果表明，本发明所建立的双孢蘑菇基因编辑体系能够成功高效的对双孢蘑菇基因AbPPO4进行基因编辑。本发明所发明的基因编辑技术可以对双孢蘑菇的基因进行精确定向编辑，能够在双孢蘑菇的育种，改良和研究中得以运用。

Description

一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用

技术领域

本发明涉及一套用于双孢蘑菇的基因编辑系统及其应用。

背景技术

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又称白蘑菇、口蘑等，是世界上人工栽培最广泛、产量和消费量最大的食用菌，也是我国最大的出口创汇食用菌。双孢蘑菇子实体富含蛋白质以及18种氨基酸，其中8种是人体必需氨基酸，其味道鲜美，低脂低热，被冠以“植物肉”的美誉风靡世界。目前，根据国际蘑菇科学学会（The International Society for MushroomScience，ISMS）统计，双孢蘑菇是目前世界上栽培面积最广的蘑菇之一，全球双孢蘑菇的总产量为483万吨，其中我国双孢蘑菇产量为250.5万吨，位居世界第一，同时也占同期国内食用菌总产量的7.2%。国内食用菌产业主要以木腐菌为主，对木料的需求较大，造成了严重的环境压力也制约了行业的发展。双孢蘑菇可以利用秸秆等草本原料进行栽培，环境需求低，适合大规模工厂化生产，因此，双孢蘑菇的产业发展和推广在我国具有巨大的潜力。然而，我国双孢蘑菇产业现在正面临着大而不精的问题，产量大但单位产量距离国际水平仍有很大差距。其原因之一便是菌种质量不高，如何获得适应国内生产环境的优质菌种是双孢蘑菇产业中一个十分重要的问题。因此，开发双孢蘑菇育种相关技术就具有重要意义。

目前，在双孢蘑菇的育种方面，国内外主要都是采用杂交育种的方法对双孢蘑菇菌种进行改良，利用不育的同核体孢子进行杂交配对得到可育的异核体，以此筛选具有优良性状的杂交种。但双孢蘑菇产生独特的双孢担子，难以获得用于杂交的同核体孢子，因此限制了杂交育种在双孢蘑菇育种中的运用，并且杂交育种操作繁琐，生产周期长，定向性差，已经越来越难以满足现代双孢蘑菇的生产研发的需要。因此，利用基因编辑技术在基因组原位实现对基因的精确、定点、可遗传修饰，是目前双孢蘑菇进行遗传改良和育种的理想途径。

目前主要的基因编辑工具有三种，分别是锌指核酸酶技术（Zinc FingerNuclease Technology, ZFNs），转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR（Clustered regμLarlyinterspaced short palindromic repeats）基因编辑技术。其中TALENs和ZFNs技术需要构建复杂的识别蛋白，成本高昂，操作复杂，因此在大型真菌中难以广泛利用。而CRISPR/Cas9技术则只需合成一段与靶向DNA同源的20个碱基，插入这个载体并转入宿主细胞，转录所产生的gRNA就能介导Cas9蛋白切割宿主细胞的目标DNA，从而达到基因编辑的目的。近几年来，CRISPR/Cas9系统已成功应用于很多动物、植物和微生物遗传改良中，例如老鼠、线虫、斑马鱼、酵母、水稻、马铃薯等。在食用菌中，关于CRISPR/Cas9技术的应用仍未见成功报道，尤其是双孢蘑菇中未有CRISPR/Cas9技术的应，主要是因为以下几点问题：（1）缺乏有效的双孢蘑菇内源表达启动子，驱动gRNA和Cas9蛋白在双孢蘑菇菌丝内表达。（2）双孢蘑菇产生双孢担子，用传统的同源重组的方法通常不能得到纯合子，因此现有技术在双孢蘑菇育种方面有极大限制。（3）目前国内外还未有建立的双孢蘑菇的基因定点编辑技术。

发明内容

针对上述技术问题，本发明采用CRISPR/Cas9技术，经由RNA介导，无需构建复杂的识别蛋白具有简单方便、打靶精准度髙、构建成本低、对设计的多个位点进行定点编辑的各项优势。本研究探索了利用CRISPR/Cas9系统对双孢蘑菇基因组实施定点编辑的技术，搭建了双孢蘑菇基因组高效定点编辑的技术平台。

本发明再有一个目的是提供一种用于双孢蘑菇的基因编辑方法。

技术方案：为实现对双孢蘑菇进行基因编辑，本发明在第一方面提供了一种DNA基因组片段的基因编辑工具，为CRISPR/Cas9系统。所述CRISPR/Cas9系统包含一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体及针对目标DNA片段的一个或多个gRNA；将针对目标DNA片段的一个或多个gRNA编辑到用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体上。

本发明第二方面提供方了一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体为将双孢蘑菇U6启动子、双孢蘑菇GPD基因启动子，gRNA的核苷酸序列装载或替换到pRGEB32载体上，得到用于编辑双孢蘑菇基因的重组载体；所述双孢蘑菇U6启动子序列如SEQ ID NO:1所示。所述双孢蘑菇GPD基因启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。

为了简化基因编辑后目标菌丝的鉴定工作，在重组载体中还包含抗潮霉素基因。

本发明第三方面提供了用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体pAbGEB1在双孢蘑菇中进行基因编辑中的应用，CRISPR/Cas9载体转染双孢蘑菇菌丝，对双孢蘑菇菌丝的目的基因进行编辑，具体包括如下步骤：

（1）构建由CRISPR/Cas9介导的植双孢蘑菇基因编辑载体，然后将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌LBA4404，加入双孢蘑菇菌丝进行侵染；

（2）将侵染后的菌丝放置于含有乙酰丁香酮的CM培养基上进行培养；

（3）培养完成后得到的菌丝转移至含有潮霉素和特美汀的MMP初筛培养基进行初筛培养；

（4）将初筛培养得到的菌丝转接到含有潮霉素的MMP复筛培养基进行复筛；

（5）筛选转化阳性菌丝，获得定向编辑的双孢蘑菇突变菌丝；

（6）对生物细胞基因组中有效的编辑基因进行qRT-PCR分析。

将本发明的基因编辑工具对双孢蘑菇的AbPPO4基因进行编辑。即将上述CRISPR/Cas9载体转转化到双孢蘑菇菌丝内，对双孢蘑菇AbPPO4基因进行编辑。

本发明利用上述gRNA介导的CRISPR/Cas9载体，所述载体通过以下方法制得：以P _AbU6: gRNA scaffold元件替换pRGEB32中的Rice U3 promoter: gRNA scaffold元件；再将两个双孢蘑菇GPD基因启动子分别连接Cas9基因及抗潮霉素基因，最后将靶向目标基因的gRNA插入pAbGEB1中的双孢蘑菇U6启动子与gRNA scaffold之间。

所述的由CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体中，应用于CRISPR/Cas9载体的U6启动子。本发明鉴定出的双孢蘑菇U6启动子可以高效启动gRNA的转录。

所述的由CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体中，GPD基因启动子驱动Cas9表达。

所述的GPD基因启动子驱动Cas9表达是将扩增GPD启动子与权利要求9所得重组产物pAbGEB-V1分别进行Nco I和Sbf I双酶切，双酶切后的载体片段与启动子片段经连接得到新在载体pAbGEB-V2。

所述扩增GPD启动子是将克隆出的GDP启动子两端加上Nco I和Sbf I接头形成，引物为：

GPD-SbfI-F：GACCTGCAGGTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

GPD-NcoI-R：GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT。

所述的GPD基因启动子驱动潮霉素表达是将扩增GPD启动子与权利要求10所得重组产物pAbGEB-V2分别进行Hind III和XmaI双酶切，双酶切后的载体片段与启动子片段经连接得到新在载体pAbGEB1。

所述的新的GPD启动子是采用又一引物克隆GPD启动子，引物为：

GPD-HindIII-F：GCAAGCTTTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

GPD-XmaI-R：GATCCCGGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT。

所述双孢蘑菇基因编辑载体pAbGEB1进行Bsa I单酶切，同时将合成gRNA进行复性，并将复性gRNA与Bsa I单酶切的pAbGEB1进行连接，得到新的用于针对AbPPO4基因的载体pAbGEB1-AbPPO4；

AbPPO4 gRNA复性的引物为

AbPPO4 gRNA -F：ATTGCCGTTAAAGGAGGGATCGAT

AbPPO4 gRNA -R：AAACATCGATCCCTCCTTTAACGG。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供了一种基因编辑工具，可以对双孢蘑菇特定的基因进行基因编辑，具有较高的编辑效率；本发明提供了一种用于转录gRNA的双孢蘑菇U6启动子，这种启动子是在双孢蘑菇内获得的人类同源U6基因启动子，可以高效的启动gRNA的转录；本发明提供了一种可以特异定位AbPPO4基因的gRNA，可以靶向编辑AbPPO4基因。

所述的AbPPO4-gRNA为筛选一段与AbPPO4基因N端外显子上的特异DNA序列互补的DNA序列，其特征符合5’ -N(20)NGG的排列顺序，作为为目的基因的gRNA。上述AbPPO4-gRNA序列位于AbPPO4基因第三个外显子上，且序列是唯一的，其核苷酸序列为CCGTTAAAGGAGGGATCGAT

所述的AbPPO4 gRNA为引物复性所得，引物为：

AbPPO4 gRNA -F：ATTGCCGTTAAAGGAGGGATCGAT

AbPPO4 gRNA -R：AAACATCGATCCCTCCTTTAACGG。

附图说明

图1为本发明中P _AbU6: gRNA scaffold元件的结构示意图。

图2为pRGEB32载体图。

图3为pAbGEB1载体图。

图4为突变AbPPO4基因阳性检测及基因相对表达量。

图5为双孢蘑菇U6基因启动子的PCR扩增电泳图。

图6为gRNA scaffold片段的PCR扩增电泳图。

图7为P _AbU6+gRNA scaffold片段的重叠PCR扩增电泳图。

图8为双孢蘑菇U6基因启动子（Sbf I/Hind III）的菌落PCR扩增电泳图。

图9为双孢蘑菇GPD6基因启动子的PCR扩增电泳图。

图10为 GPD基因启动子（Nco I/SbfI）的菌落PCR扩增电泳图。

图11为GPD基因启动子（Hind III-Xma I）菌落PCR扩增电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1、双孢蘑菇菌丝培养。

1.1培养基的配置

本发明使用的培养基包括：改良PDA培养基；基本培养基（MM）；诱导培养基（IM）；共培养培养基（CM）；筛选培养基（MMP）；LB培养基。培养基的配置：

改良的PDA培养基:使用电子天平精确称取2 g酵母提取物、2g蛋白胨、0.5g硫酸镁、1 g磷酸氢二钾、0.46g 磷酸二氢钾、20g葡萄糖、18g琼脂于烧杯中，加水至1 L搅拌均匀。

基本培养基(MM) :取10 mL K-buffer [262 g/L磷酸氢二钾，145 g/L磷酸二氢钾(pH 7.0)，20 mL M-N (30 g/L硫酸镁，15 g/L氯化钠)，1 mL 0.75%氯化钙，10 mL21.8%葡萄糖，10 mL 0.018%硫酸亚铁，5mL微量元素(100 mg/L硫酸锌，100mg/L硫酸铜，100 mg/L硼酸，100 mg/L硫酸锰，100 mg/L钼酸钠)，2.5 mL 20%硝酸铵于烧杯中，加水至1 L。

诱导培养基(IM) :取10mL K-buffer (pH7.0)，20 mLM-N, 1 mL 1%氯化钙，10 mL0.01 %硫酸亚铁，5mL微量元素，2.5 mL 20%硝酸铵，10mL 50%甘油，40 mL1mol/L2-吗啉乙磺酸，5mL2 mol/L葡萄糖，加水至1 L。

共培养培养基(CM) : IM加1.5%琼脂，但只加2.5 mL 2 mol/L glucose。

筛选培养基(MMP) :取10g麦芽糖，5g蛋白胨，2.093g3- (N-吗啡啉)丙磺酸于烧杯中，加蒸馏水定容到1L调pH为7.0。

LB培养基：取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。

1.2双孢蘑菇菌丝的接种

取保存的双孢蘑菇AS2796菌丝一管，使用接种环活化菌种于培养皿中，并在培养皿中培养10天左右，使用0.8mm的打孔器将菌丝块转接于新的PDA培养基中，每个培养皿接5个菌丝块。

1.3双孢蘑菇菌丝的获得

生长一周后，使用接种刀将菌丝刮下，转接于改良PDB培养基中，并于液体PDA中生长40天。

1.4 质粒DNA的提取

取含有质粒pRGEB32的大肠杆菌菌液少量，划线，37 C倒扣培养过夜，挑单菌落于6mL LB中，200 rprm.37 C培养过夜，菌液准备好之后，使用天根质粒提取试剂:盒按照下列步骤来提取:

（1）收集菌体：注意尽可能吸尽上清液。

（2）重悬菌体：使用涡旋振荡器尽可能将菌体混匀，如果混匀不彻底将造成下一步的裂解不充分使得提取浓度较低。

（3）裂解菌体：注意温和混匀避免剧烈混匀造成DNA打断，裂解后菌体溶液呈清亮黏稠状。

（4）沉淀蛋白质：加入试剂后立即轻柔混匀，否则将产生局部沉淀，沉淀后的蛋白质呈白色絮状，离心去除沉淀。

（5）吸附质粒：将上述上清液加入吸附柱，静置2 min (保证DNA与吸附膜的充分接触)，静置步骤可以提高提取浓度，后离心去除上清。

（6）两次漂洗：加入Buffer PW，静置2min，离心去除废液。去除漂洗液:离心1 min，并再重复。

（7）连续两次洗脱质粒：向吸附膜正中央滴加去离子水，室温静置2 min后离心，取1μL 检测浓度。

实施例2、转录gRNA及表达Cas9蛋白的载体构建

2.1人类同源U6基因启动子的获得

根据双孢蘑菇基因组的编码序列分析，通过BLAST比对获得双孢蘑菇中与人类U6基因同源的基因序列，找到唯一个与人类U6基因同源的双孢蘑菇基因序列，并将其命名为AbU6基因。然后将其转录起始位点之前500 bp序列取出，作为其启动子序列，并命名为P _AbU6，序列如SEQ ID NO:1所示。

2.2 双孢蘑菇高表达U6启动子的克隆

引物为：

U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

U6-R：ACCGAGACCTCGGTCTCTCAATAGTTAACAGCGTGGATC

PCR体系为：高保真酶2μL；引物各2 μL；水35 μL；DNA模板2 μL；PCR buffer 5 μL；dNTP 2 μL。

PCR反应条件为：预变性95 ℃，3min；变性95 ℃，20s；退火56 ℃，20s；延伸72℃，30s；共35个循环；最后延伸5min。

所获片段进行纯化。

2.3 双孢蘑菇高表达启动子GPD启动子的克隆

双孢蘑菇GPD启动子序列如SEQ ID NO:2所示。

引物为：

Pgpd-F: TAGGATCCTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

Pgpd-R：GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

PCR体系为：高保真酶2μL；引物各2 μL；水33 μL；模板各2 μL；PCR buffer 5 μL；dNTP 2 μL。

PCR反应条件为：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，20 s；退火58 ℃，20 s；延伸72℃，30 s；共35个循环；最后延伸5min。如图5所示双孢蘑菇U6基因启动子的PCR扩增电泳图。

2.4 gRNA scaffold片段的获得

所述的gRNA scaffold序列如SEQ ID NO:3所示。

引物为：

BsaI-U6-F：GAGAGACCGAGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATA

gRNA-HindIII-R：TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG

PCR反应条件为：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，20 s；退火60 ℃，20 s；延伸72℃，20 s；共35个循环；最后延伸5min。如图6所示的gRNA scaffold片段的PCR扩增电泳图。

2.5 连接gRNA scaffold和双孢蘑菇U6启动子，将双孢蘑菇U6启动子P _AbU6与gRNAscaffold进行重叠PCR获得P _AbU6: gRNA scaffold元件

将2.2纯化得到的P _AbU6（双孢蘑菇U6启动子）片段与2.4纯化得到gRNA scaffold片段等比例混合，并利用重叠PCR进行二次PCR扩增。所用引物为：

U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

gRNA-HindIII-R：TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG

PCR反应条件为：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，20 s；退火60 ℃，20 s；延伸72℃，30 s；共35个循环；最后延伸5min。如图7所示的P _AbU6+gRNA scaffold片段的重叠PCR扩增电泳图。

2.6 替换pRGEB32原有Rice U3 promoter: gRNA scaffold元件

对pRGEB32载体进行Sbf I和Hind III的双酶位点酶切，同时对2.5的扩增产物进行Sbf I和Hind III的双酶位点酶切，酶切产物与pRGEB32载体酶切产物进行重组，即将P _AbU6: gRNA scaffold元件替换pRGEB32中的Rice U3 promoter: gRNA scaffold元件，得到新的载体命名为pAbGEB-V1。

酶切体系：Sbf I和Hind III各1 μL，buffer 2 μL，片段 5 μg，加ddH₂O至50 μL。

酶切条件：37 ℃ 反应 4小时，跑胶回收酶切目标片段。连接反应以后利用菌落PCR进行筛选。如图8所示的双孢蘑菇U6基因启动子（Sbf I/Hind III）的菌落PCR扩增电泳图。

2.7 为扩增GPD启动子

在2.3中克隆出的GDP高效启动子两端加上Nco I和Sbf I接头，形成扩增产物。

GPD-SbfI-F：GACCTGCAGGTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

GPD-NcoI-R：GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

PCR体系为：高保真酶2μL；引物各2 μL；水33 μL；模板2 μL；PCR buffer 5 μL；dNTP 2 μL。

PCR反应条件为：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，20 s；退火56 ℃，20 s；延伸72℃，1 min；共35个循环；最后延伸5min。如图9所示的双孢蘑菇GPD6基因启动子的PCR扩增电泳图。

2.8在pRGEB32中插入GPD启动子

对2.6中得到的载体进行Nco I和Sbf I双酶切，将2.7中得到的PCR片段也进行NcoI和Sbf I双酶切。将两个片段进行连接，即将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V1载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子替换pAbGEB-V1载体中的Pubi10启动子，得到新的载体命名为pAbGEB-V2。

酶切体系：Sbf I和Nco I各1 μL，buffer 2 μL，片段 5 ug，加ddH₂O至50 μL。

酶切条件：37 ℃ 反应 4小时，跑胶回收酶切目标片段。连接反应以后利用菌液PCR进行筛选。如图10所示的GPD基因启动子（Nco I/SbfI）的菌落

PCR扩增电泳图。

2.9替换抗潮霉素基因启动子

设计新的引物克隆GPD启动子，引物为：

GPD-HindIII-F：GCAAGCTTTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

GPD-XmaI-R：GATCCCGGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

PCR反应条件为：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，20 s；退火58 ℃，20 s；延伸72℃，1 min；共35个循环；最后延伸5min。

对得到的片段进行Hind III和XmaI双酶切，将2.8中得到的载体也进行Hind III和XmaI双酶切。将两个片段进行连接。即将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V2载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入抗潮霉素基因（HygR）之前，得到用于编辑双孢蘑菇基因的重组载体，即为CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，并命名新载体为pAbGEB1。

酶切体系：Hind III和XmaI各1 μL，buffer 2 μL，片段 5 ug，加ddH₂O至50 μL。

酶切条件：37 ℃ 反应 4小时，跑胶回收酶切目标片段。连接反应以后利用菌液PCR进行筛选。如图11所示的GPD基因启动子（Hind III/XmaI）的菌落PCR扩增电泳图。

将双孢蘑菇基因编辑载体pAbGEB1进行Bsa I单酶切，同时将合成gRNA进行复性，并将复性gRNA与Bsa I单酶切的pAbGEB1进行连接。得到新的用于针对AbPPO4基因的载体pAbGEB1-AbPPO4。

AbPPO4 gRNA复性的引物为

AbPPO4 gRNA -F：ATTGCCGTTAAAGGAGGGATCGAT

AbPPO4 gRNA -R：AAACATCGATCCCTCCTTTAACGG。

实施例3、双孢蘑菇AbPPO4基因突变转化阳性菌丝的获取

3.1农杆菌的获取：

3.1.1 .农杆菌LBA4404感受态细胞制备：

（1）取四种农杆菌菌株LBA4404，划线后于28 C培养箱中培养30h，为了保证无杂菌污染挑单菌落进行培养过夜。

（2）取10μL作为种子菌液扩大培养至OD600等于0.5 (约27h) 。

（3）将菌液冰浴30 min，期间预冷离心机，随后离心去上清液，倒扣于吸水纸上吸干培养液。

（4）使用预冷的25 mL、0.1 mol/L的CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴20 min。

（5）4 C、4000rpm调件下离心10min，弃上清。

（6）加入预冷的CaCl₂与甘油混合液1 mL ( 300 μL 50%的甘油+700μL 0. 143mol/L的CaCl₂) 。

（7）100 pμL每支分装并做好标记后液氮速冻置于-80 C冰箱备用。

3.1.2. 农杆菌LBA4404转化

（1）取上述制备好的农杆菌感受态细胞各一支，解冻加入实施例2制备载体1μL。

（2）冰浴30min，液氮速冻5 min。

（3）用镊子从液氮中取出EP管后37C水浴5min，冰上复苏2min。

（4）在超净工作台中加入LB 600 μL。

（5）摇床震荡培养5-6 h.

（6）从摇床中取出菌液涂布于含有利福平（50 mg/L）、卡那霉素（100 mg/L）、潮霉素（20 mg/L）的LB固体培养基中，30h后菌落PCR检测阳性菌落。

（7）挑取阳性单菌落于1mL含有步骤（6）的三种抗生素的LB中震荡培养20h，加入50%的甘油1mL，摇匀保存于-80℃备用。

3.2双孢蘑菇的农杆菌遗传转化

（1）挑取3.1.2单菌落于含有利福平（50 mg/L）和卡那霉素（100 mg/L）的MM液体培养基中（使用空的农杆菌作为对照，摇菌于含有利福平的MM培养基中）。

（2）待菌液OD600达到0.8时，6 000 r/min离心5min。

（3）将菌体重悬于含有100μmmol/L乙酰丁香酮的IM诱导培养基中，28℃摇菌3h。

（4）取出实施例1培养的双孢蘑菇AS2796菌丝，过滤后置于研钵中，轻轻研磨3–5min。

（5）随后将菌丝转移至上述IM中，真空状态下浸染10min。

（6）浸染完成后，立即过滤将菌丝分成直径2mm左右的小团，并用滤纸吸干菌液，分散于含有100μmmol/L乙酰丁香酮的 CM培养基上。

（7）3-5d后转移至含有20mg/L潮霉素和150mg/L特美汀的MMP培养基进行培养初筛。

（8）14天后，将初筛获得的菌丝转接到含有50mg/L潮霉素的MMP培养基进行复筛。

3.3转化菌丝阳性检测

（1）从培养基中刮取菌丝提取基因组DNA作为模板进行PCR扩增。

（2）以抗潮霉素基因为模板进行筛选，所设计引物：

HygR-F：ATTTGTGTACGCCCGACAGT

HygR-R：CTCTCGGAGGGCGAAGAATC

PCR体系为：PCR酶mix 10 μL；引物各0.5 μL；ddH2O 8 μL；模板1 μL。

（3）所扩增结果利用琼脂糖凝胶电泳加以分析，其结果见图4的电泳图。其中1组和7组为阳性转化菌丝，其余为阴性转化菌丝。

3.4阳性菌丝基因表达分析

3.4.1 总RNA的提取

首先对实验中所用物品使用DEPC水进行去RNA酶处理并灭菌，灭菌后的研钵置于-80 C冰箱备用，注意实验中全程配戴手套与口罩，避免RNA酶的参与造成降解。本发明使用购买自Takara的RNA isoplus * (代码: 9108)试剂来提取双孢蘑菇的总RNA.具体操作在原产品操作说明的基础上有所改进:

（1）磨样，将保存样品置于含有液氮的研钵中研磨10-15min,使蘑菇样品尽量研;磨充分，避免残留的完整细胞释放RNA酶，研磨过程要保持液氮持续存在，允许挥发不许变干。

（2）将研磨粉末快速加入1 mL iso plus溶液中，充分震荡后静置15min，于4 C13000g条件下离心15 min.

（3）取上清750μL加入200μ氯仿，剧烈震荡摇匀，此时溶液呈现粉红色乳状，静置10min，继续于离心15min，此时溶液分为三层，RNA位于无色的上清液中。

（4）吸取350μL，加500μL异丙醇，混匀静置10min，离心10min后可在EP管壁肉眼看到白色RNA.

（5）最后用75%乙醇洗涤两次，洗涤时需将EP管壁上的RNA全部刮下，悬浮于75%乙醇中，4℃13000g 条件下离心5min,室温干燥至RNA呈现半透明状，使用DEPC水溶解RNA，置于-80 C冰箱备用。

RNA质量的检测:RNA提取完成后首先使用NANODROP2000来对提取的RNA进行浓度、纯度以及降解程度的检测，取1 pL DEPC水调零且仪器读取数据稳定后开始检测，分别记录浓度值、260 与230 比值、260 与280比值，纯净的RNA260/230为2.5，260/280 为2.0，检测结果越接近表明纯度越高，260/280 比值大于2.2提示RNA降解，小于1.8 提示杂质较高需进行纯化处理。其次对提取RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳降解程度和污染分析，所用的电泳条件为电压180 V、电流150mA、时间15min，完美的电泳条带为三条带，从大到小分别为28S、18S、5S，其中28S条带亮度为18S的2.7倍，而5S条带越亮表明降解越严重。最后使用Agilent 2100 ( Agilent Technologies，CA，USA) 准确检测RNA完整性。

3.4.2 反转录cDNA的合成

使用上述步骤提取出来的总RNA，利用逆转录试剂盒完成xDNA第一链的合成，所使用的反应体系如下：

反应体系：5×RT Buffer 8μL；RNase Inhibitor 0.5 μL；10mM dNTP Mix 2μL；RNA模板 8μL；Oligo（dT）₁₈Primer 2 μL；M-MLV 0.5μL；DEPC-ddH₂O 19 μL。

反应程序设计：70℃加热10min，42℃温浴75min，75℃加热10min。

3.5AbPPO4基因相对表达量分析

通过所设计的AbPPO4基因引物进行qRT-PCR分析，并对其结果进行分析。试剂选择宝生物的SYBR Premix Ex Taq TM II（Tli RNase H Plus）试剂盒。其结果如图4柱状图所示。

AbPPO4 RTF：CCCTGCCCAAGACCTCCTCT

AbPPO4 RTR：TGGTACTACCGTCAGCAGCAAAGT

反应体系：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10μL；引物各0.5μL；cDNA 2 μL；ddH₂O 7μL。

反应程序设计：94℃预热3min；高温94℃ 10s解旋，58℃低温退火10s，72℃中延伸10s，该步进行40个循环；72℃延伸10min。

根据图4凝胶电泳所示的结果可以发现，在12株农杆菌转化菌丝中，1组和7组检测为阳性转化，其余组均为阴性转化菌丝，农杆菌转化阳性率约为16.7%。同时。同时，根据图4的AbPPO4基因相对表达量检测结果分析，发现所有阳性转化菌丝中AbPPO4基因相对表达量显著下降。而阴性转化菌丝AbPPO4基因相对表达量没有出现下降的现象。表明阳性转化菌丝AbPPO4基因序列发生了突变，说明本发明所设计的基因编辑体系对AbPPO4基因成功进行了编辑。在阳性转化菌丝中均发生了基因突变，突变效率达到了100%，说明本发明所提供基因编辑体系标记效率较高。

本发明中针对靶向识别序列互补配对的DNA序列为如图1所示，使用的双孢蘑菇U6启动子序列如图2所示，插入的高效GPD基因启动子序列如图3所示。这两种启动子能高效表达Cas9蛋白和gRNA，使其在设计的靶标位点进行定点精准编辑。说明本发明设计的双孢蘑菇基因编辑体系可以高效编辑双孢蘑菇AbPPO4等一系列基因，并且编辑效率非常高，具有广阔的应用前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

序列表

<110>三峡大学

<120>一种双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用

<160>总数目20

<210>1

<211>473

<212>DNA

<213>人工序列

<223>双孢蘑菇U6启动子

<400>1

TACCCCGTGTATGATTGGTACGCGGATTATAGAAAATGCGGTGATCCTACTGTATCTCAGATCTTCTTCACTTCGGCATGTTGGAATCTGGTCCAAGTTCTGGACCAAAGGGGTAATGAATGGGCTATCAAAGCCCTACGCAAAGCAACCGGTAGGAACGAGGCGGTGGGGTCGATGTGTTGGCTATATGGTATGGCGGTGGTGTCGTCCTCCGCAAGGTTTAGCCCGACAATGCTCCACAGTGTCGCCTAGAAACGAGATACCGGAGACAAGCTAGAAGTGCGATTTTTTCATACAGAAAGCAGGGACAGATTGTAGCGAAATGAAACGAAACGAATACGGCGCAGCACGTTAGTTGCCAGCAAACGAGTGTCAGCAAAGTGATCCTTAATCAATCACGTGATGGTACCCCGCGGGCTGAACAAAAATCAAAACTTGTTTGCATGTGAACAGATCCACGCTGTTAACTATTG

<210>2

<211>271

<212>DNA

<213>人工序列

<223>双孢蘑菇GPD基因启动子

<400>2

TAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGATTGAAAGTTCAGTACGTTTTTAACAATAGAGCATTTTCGAGGCTTGCGTCATTCTGTGTCAGGCTAGCAGTTTATAAGCGTTGAGGATCTAGAGCTGCTGTTCCCGCGTCTCGAATGTTCTCGGTGTTTAGGGGTTAGCAATCTGATATGATAATAATTTGTGATGACATCGATAGTACAAAAACCCCAATTCCGGTCACATCCACCATCTCCGTTTTCTCCCATCTACACACAACAAGCTCATCGCC

<210>3

<211>157

<212>DNA

<213>人工序列

<223>gRNA scaffold

<400>3

AGAGACCGAGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGAAGCTT

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>双孢蘑菇AbPPO4基因gRNA

<400>4

CCGTTAAAGGAGGGATCGAT

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物U6-F

<400>5

GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物U6-R

<400>6

ACCGAGACCTCGGTCTCTCAATAGTTAACAGCGTGGATC

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物Pgpd-F

<400>7

TAGGATCCTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物Pgpd-R

<400>8

GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物BsaI-U6-F

<400>9

GAGAGACCGAGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATA

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物gRNA-HindIII-R

<400>10

TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物GPD-SbfI-F

<400>11

GACCTGCAGGTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物GPD-NcoI-R

<400>12

GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物GPD-HindIII-F

<400>13

GCAAGCTTTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物GPD-XmaI-R

<400>14

GATCCCGGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物AbPPO4 gRNA -F

<400>15

ATTGCCGTTAAAGGAGGGATCGAT

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物AbPPO4 gRNA -R

<400>16

AAACATCGATCCCTCCTTTAACGG。

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物HygR-F

<400>17

ATTTGTGTACGCCCGACAGT

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物HygR-R

<400>18

CTCTCGGAGGGCGAAGAATC

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物AbPPO4 RTF

<400>19

CCCTGCCCAAGACCTCCTCT

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物AbPPO4 RTR

<400>20

TGGTACTACCGTCAGCAGCAAAGT

序列表

<110>三峡大学

<120>一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用

<160>总数目20

<210>1

<211>473

<212>DNA

<213>人工序列

<223>双孢蘑菇U6启动子

<400>1

TACCCCGTGTATGATTGGTACGCGGATTATAGAAAATGCG

GTGATCCTACTGTATCTCAGATCTTCTTCACTTCGGCATGTT

GGAATCTGGTCCAAGTTCTGGACCAAAGGGGTAATGAATG

GGCTATCAAAGCCCTACGCAAAGCAACCGGTAGGAACGAG

GCGGTGGGGTCGATGTGTTGGCTATATGGTATGGCGGTGG

TGTCGTCCTCCGCAAGGTTTAGCCCGACAATGCTCCACAGT

GTCGCCTAGAAACGAGATACCGGAGACAAGCTAGAAGTGC

GATTTTTTCATACAGAAAGCAGGGACAGATTGTAGCGAAAT

GAAACGAAACGAATACGGCGCAGCACGTTAGTTGCCAGCA

AACGAGTGTCAGCAAAGTGATCCTTAATCAATCACGTGATG

GTACCCCGCGGGCTGAACAAAAATCAAAACTTGTTTGCATG

TGAACAGATCCACGCTGTTAACTATTG

<210>2

<211>271

<212>DNA

<213>人工序列

<223>双孢蘑菇GPD基因启动子

<400>2

TAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGATTGAAAGTTCAGTACGT

TTTTAACAATAGAGCATTTTCGAGGCTTGCGTCATTCTGTG

TCAGGCTAGCAGTTTATAAGCGTTGAGGATCTAGAGCTGC

TGTTCCCGCGTCTCGAATGTTCTCGGTGTTTAGGGGTTAGC

AATCTGATATGATAATAATTTGTGATGACATCGATAGTACA

AAAACCCCAATTCCGGTCACATCCACCATCTCCGTTTTCTCC

CATCTACACACAACAAGCTCATCGCC

<210>3

<211>157

<212>DNA

<213>人工序列

<223>gRNA scaffold

<400>3

AGAGACCGAGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT

TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCA

CCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG

TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGAAGCTT

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>双孢蘑菇AbPPO4基因gRNA

<400>4

CCGTTAAAGGAGGGATCGAT

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物U6-F

<400>5

GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物U6-R

<400>6

ACCGAGACCTCGGTCTCTCAATAGTTAACAGCGTGGATC

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物Pgpd-F

<400>7

TAGGATCCTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物Pgpd-R

<400>8

GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物BsaI-U6-F

<400>9

GAGAGACCGAGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATA

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物gRNA-HindIII-R

<400>10

TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物GPD-SbfI-F

<400>11

GACCTGCAGGTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物GPD-NcoI-R

<400>12

GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物GPD-HindIII-F

<400>13

GCAAGCTTTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物GPD-XmaI-R

<400>14

GATCCCGGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物AbPPO4 gRNA -F

<400>15

ATTGCCGTTAAAGGAGGGATCGAT

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物AbPPO4 gRNA -R

<400>16

AAACATCGATCCCTCCTTTAACGG。

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物HygR-F

<400>17

ATTTGTGTACGCCCGACAGT

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物HygR-R

<400>18

CTCTCGGAGGGCGAAGAATC

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>正向引物AbPPO4 RTF

<400>19

CCCTGCCCAAGACCTCCTCT

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>反向引物AbPPO4 RTR

<400>20

TGGTACTACCGTCAGCAGCAAAGT

Claims

1.一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体的构建步骤包括如下：

（1）将双孢蘑菇U6启动子P _AbU6与gRNA scaffold进行重叠PCR获得P _AbU6: gRNA scaffold元件；

（2）以pRGEB32载体为骨架，将P _AbU6: gRNA scaffold元件替换pRGEB32中的Rice U3promoter: gRNA scaffold元件，得到新的载体命名为pAbGEB-V1；

（3）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V1载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子替换pAbGEB-V1载体中的Pubi10启动子，得到新的载体命名为pAbGEB-V2；

（4）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V2载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入抗潮霉素基因HygR之前，得到用于编辑双孢蘑菇基因的重组载体，即为CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，并命名新载体为pAbGEB1；

双孢蘑菇U6启动子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述的双孢蘑菇U6启动子是与人类U6基因同源的双孢蘑菇U6基因启动子序列进行再克隆所得的序列，所述克隆过程中引物序列为：

U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

U6-R：ACCGAGACCTCGGTCTCTCAATAGTTAACAGCGTGGATC；

所述双孢蘑菇GPD基因启动子的序列如SEQ ID NO:2所示，所述的双孢蘑菇GPD基因启动子为双孢蘑菇启动子GPD启动子再克隆所得的序列，所述克隆过程中引物序列为：

Pgpd-F: TAGGATCCTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

Pgpd-R：GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT ；

gRNA scaffold 扩增引物：

BsaI-U6-F：GAGAGACCGAGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATA

gRNA-HindIII-R：TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，双孢蘑菇U6启动子替换pRGEB32中的U3启动子具体步骤是将双孢蘑菇U6启动子片段与gRNA scaffold片段等比例混合，并利用重叠PCR进行二次PCR扩增，扩增后的产物进行Sbf I和Hind III的双酶位点酶切得到酶切产物；对pRGEB32载体进行Sbf I和Hind III的双酶位点酶切，酶切产物与pRGEB32载体酶切产物进行重组，得到重组载体pAbGEB-V1；

重叠PCR扩增引物：

U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATGATTGGTAC

gRNA-HindIII-R：TCAAGCTTCGCGCTAAAAACGGACTAG。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入pAbGEB-V1，具体步骤是将扩增GPD启动子片段进行Nco I和Sbf I双酶切，同时将得到的重组载体片段进行Nco I和Sbf I双酶切，将两酶切产物进行连接，得到新的载体pAbGEB-V2；

扩增GPD启动子中扩增引物为

GPD-SbfI-F：GACCTGCAGGTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

GPD-NcoI-R：GTCCATGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入pAbGEB-V2，具体步骤是将新的克隆GPD启动子进行Hind III和XmaI双酶切，同时将得到的pAbGEB-V2载体进行Hind III和XmaI双酶切，将两酶切产物进行连接所得，得到新的载体pAbGEB1；

扩增GPD启动子中扩增引物为

GPD-HindIII-F：GCAAGCTTTAACTAAGAGGTCCGCAAGTAGAT

GPD-XmaI-R：GATCCCGGGGGCGATGAGCTTGTTGTGT。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将双孢蘑菇基因编辑载体pAbGEB1进行BsaI单酶切，同时将合成gRNA进行复性，并将复性gRNA与Bsa I单酶切的pAbGEB1进行连接，得到新的用于靶向双孢蘑菇AbPPO4基因的载体pAbGEB1-AbPPO4；

AbPPO4 gRNA合成的引物为

AbPPO4 gRNA -F：ATTGCCGTTAAAGGAGGGATCGAT

AbPPO4 gRNA -R：AAACATCGATCCCTCCTTTAACGG。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体。

7.采用权利要求6所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体在双孢蘑菇中进行基因编辑中的应用，其特征在于，CRISPR/Cas9载体转化双孢蘑菇菌丝，对双孢蘑菇菌丝的目的基因进行编辑，具体包括如下步骤：

（1）构建由CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，然后将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌LBA4404，并对双孢蘑菇菌丝进行侵染；

（6）对双孢蘑菇基因组中有效的编辑基因菌丝进行PCR及qRT-PCR分析。