WO2019131505A1 - 糸状菌細胞に対するタンパク質導入法およびその成果物 - Google Patents

糸状菌細胞に対するタンパク質導入法およびその成果物 Download PDF

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敬史 刑部
祐里子 刑部
茂夫 菅野
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国立大学法人徳島大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to the breeding of filamentous fungi.
  • the present invention relates to a method for introducing a protein into a filamentous fungal cell, a method for producing a protein-introduced filamentous fungus, a method for producing a genome editing filamentous fungus, and the like.
  • the inventors of the present invention have intensively studied to solve the above problems and introduce the target protein into the filamentous fungal protoplast by electroporation in a buffer containing the target protein and the osmotic pressure regulator. It has been found to be introduced, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following: (1) A method for introducing a protein into filamentous fungal cells, comprising introducing the target protein into protoplasts of filamentous fungus by electroporation in a buffer containing the target protein and an osmotic pressure regulator. (2) The method according to (1), further comprising treating the protoplast with a buffer containing a nitrogen source and an osmotic pressure regulator after electroporation. (3) The method according to (1) or (2), further comprising treating the protoplast with a buffer containing a salt and a tonicity modifier before performing electroporation. (4) The method according to (3), wherein the salt is an alkali metal chloride.
  • a method for producing a protein-introduced filamentous fungus which comprises introducing the objective protein into protoplasts of filamentous fungus by electroporation in a buffer containing a target protein and an osmotic pressure regulator, and then regenerating the protoplasts into mycelium.
  • the method according to (6) further comprising treating protoplasts with a buffer containing a nitrogen source and an osmotic pressure regulator after regeneration of the protoplasts before regeneration of the protoplasts.
  • a genome editing filamentous fungus comprising introducing the protein into filamentous fungal protoplasts by electroporation in a buffer containing a protein used for genome editing and an osmotic pressure regulator, and then regenerating the protoplasts into mycelia.
  • the efficiency of protein introduction into filamentous fungal cells is dramatically improved. Moreover, it is not necessary to greatly change the introduction conditions depending on the type of filamentous fungus. That is, the protein introduction method of the present invention is highly versatile in a plurality of filamentous fungal species, and has high reproducibility and introduction efficiency. According to the present invention, the introduction efficiency of the target protein can achieve about 10%. Furthermore, according to the present invention, the introduced protein can be stabilized for a long time. It is also possible that the introduced protein retains its function for more than 24 hours. These methods can be easily implemented. Furthermore, the present invention also provides a method for producing a protein introduced filamentous fungus and a method for producing a genome editing filamentous fungus using the above method. The genome editing filamentous fungus obtained by the present invention is a filamentous fungus having no recombinant gene.
  • FIG. 1 is a microscopic image of protoplasts derived from C. cinerea asexual spores. White lines indicate 500 ⁇ m.
  • FIG. 2 shows the fluorescence of GFP protein introduced into C. cinerea cells by electroporation.
  • FIG. 2a shows GFP fluorescence in cells observed by a cell analyzer JuLI (manufactured by Air Brown). White lines indicate 500 ⁇ m.
  • FIG. 2 b shows GFP fluorescence in C. cinerea cells observed with a confocal laser scanning microscope FV1200-IX83-F (manufactured by Olympus). White lines indicate 1 ⁇ m.
  • FIG. 3 shows the efficiency (mean value and standard deviation) of GFP protein introduction into C. cinerea cells by electroporation.
  • Condition 1 shows the GFP protein introduction efficiency when the experiment was performed under the conditions shown in Example 2.
  • Condition 2 shows the GFP protein introduction efficiency when the experiment was performed under condition 1 excluding electroporation pretreatment with lithium salt and post-electroporation with sorbitol and hydrolysed peptide.
  • FIG. 4 shows the results of GFP protein introduction into shiitake and matsutake protoplast cells.
  • FIG. 5 shows the preparation of GFP-expressing C. cinerea strains used for genome editing.
  • the left side of FIG. 5a shows pBluescript KS (+) vector (Agilent) KS (+) PAB containing p-aminobenzoic acid synthetase gene PAB (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 5a shows pUC57 vector pUC57_Pgpd2GFP containing a GFP gene expression cassette.
  • Pgapd2 represents a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 gene promoter (SEQ ID NO: 2) derived from Agaricus bisporus, and an int represents a glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 2 gene first exon derived from Agaricus bisporus , The first intron and the second exon (SEQ ID NO: 3), GFP represents the GFP gene from which ATG has been removed (SEQ ID NO: 4), Tab represents the heat shock protein 26 kDa gene terminator (SEQ ID NO: 5) from Agaricus bisporus ).
  • SEQ ID NO: 2 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 gene promoter
  • FIG. 5 b shows GFP fluorescence in hyphae of GFP-expressing line GFP- # 326 line obtained from C. cinerea # 326 line into which the plasmid vector shown in FIG. 5 a was introduced.
  • A shows the result of stereomicroscope observation of C. cinerea # 326 hyphae under visible light
  • B shows the result of stereomicroscope observation of C. cinerea # 326 hyphae under fluorescence.
  • C shows the result of stereomicroscope observation of GFP- # 326 strain hyphae under visible light
  • D shows the result of stereomicroscope observation of GFP- # 326 strain hyphae under fluorescence.
  • FIG. 6 shows a mutant sequence introduced by a CRISPR / Cas9 RNP complex targeting the GFP gene.
  • the underline indicates the target sequence and the box indicates the SpCas 9 PAM sequence.
  • a hyphen (-) indicates a base deletion and a black bold alphabet indicates a base insertion.
  • the number of inserted bases is indicated by + and the number of deletions is indicated by-.
  • the present invention provides, in one aspect, a method for introducing a protein into filamentous fungal cells, which comprises introducing the target protein into protoplasts of filamentous fungus by electroporation in a buffer containing the target protein and an osmotic pressure regulator. .
  • the present invention provides, in another aspect, protein transduction, which comprises introducing a protein of interest into filamentous fungal protoplasts by electroporation in a buffer containing the protein of interest and a tonicity modifying agent, and then regenerating the protoplasts into mycelium.
  • protein transduction comprises introducing a protein of interest into filamentous fungal protoplasts by electroporation in a buffer containing the protein of interest and a tonicity modifying agent, and then regenerating the protoplasts into mycelium.
  • a method for producing a filamentous fungus is provided.
  • the target protein is a protein to be introduced into filamentous fungal cells.
  • the type of target protein is not particularly limited, and may be any type. For example, it may be a neutral protein, an acidic protein, or a basic protein.
  • the size and form of the protein are also not particularly limited.
  • the protein may be a naturally occurring protein or may be one modified by genetic recombination or mutation.
  • Filamentous fungi are microorganisms that live in the form of filamentous hyphae. Molds and mushrooms are included in filamentous fungi. Among filamentous fungi, those that make fruiting bodies are called mushrooms. Most of the mushrooms belong to Basidiomycota or Ascomycota. In the present invention, the type of filamentous fungus is not particularly limited, and any type may be used. As filamentous fungi to be used in the present invention, for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus niger, Aspergillus niger, Botrytis cinerea, etc.
  • Basidiomycetes shiitake mushroom, matsutake mushroom, shiitake mushroom, Meitake mushroom, Nameko, Enokitake mushroom, Hiratake mushroom , Eryngii, Tsukuritake, Hitogata, Agaricus, Suhirotake etc. are exemplified, but not limited thereto.
  • Electroporation is a known method. This method is a method in which pores are formed in a cell membrane by electric pulse and a substance is introduced. In general, electroporation is used for transformation by introducing genes into cells. Transformation can be carried out by applying electric pulses to the cell suspension in a container called a cuvette to make minute holes in the cell membrane and feeding the gene into the cell interior. In the present invention, a protein is introduced instead of a gene. When the cells are filamentous fungal cells, electroporation is generally performed on protoplasted cells. In the present invention, electroporation conditions such as cuvette volume, inter-electrode distance, voltage, internal resistance, capacitance, pulse waveform, number of pulses, buffer composition, etc.
  • the target protein is introduced into protoplasts of filamentous fungi by electroporation.
  • Methods for producing filamentous fungal protoplasts are known.
  • a cell wall lytic enzyme can be allowed to act on hyphal threads of filamentous fungi to produce protoplasts.
  • Various cell wall lytic enzymes such as cellulase, yatalase, chitinase are known and are commercially available. Those skilled in the art can appropriately select and use these.
  • the protoplasts in a buffer containing a target protein and an osmotic pressure regulator are electrically pulsed.
  • saccharides such as sorbitol, sucrose and glucose, and salts such as sodium chloride, calcium chloride and magnesium sulfate are added to the buffer as an osmotic pressure regulator.
  • the type and use concentration of the osmotic pressure regulator are known.
  • a sugar alcohol such as mannitol or sorbitol is preferred as the osmotic pressure regulator.
  • concentration of mannitol in the buffer varies depending on the type of filamentous fungus, the nature of protoplast, etc., one skilled in the art can easily select the concentration.
  • concentration of mannitol in the buffer is usually about 0.3 M to about 0.8 M, but is not limited to these concentrations.
  • Osmotic modifiers other than mannitol may be contained in the buffer.
  • Conditions in the buffer other than the osmotic pressure adjusting agent, such as components and buffer pH are known to those skilled in the art and can be appropriately selected.
  • protoplasts may be suspended in the above buffer for an appropriate time, and then washed by centrifugation or the like to remove the buffer.
  • the salts used for this treatment may be of any type, but alkali metal chlorides such as lithium, sodium and potassium are preferred, and lithium chloride is more preferred.
  • the type and concentration of salts used for pretreatment vary depending on the type of filamentous fungus, the nature of protoplasts, etc., but it is usually about 10 to about 40 mM, preferably about 12 to about 30 mM, more preferably about 15 to about 25 mM Not limited to these concentrations.
  • the processing temperature may be room temperature, for example, about 15 ° C. to about 30 ° C., but is not limited to these temperatures. Selection of conditions such as types and concentrations of salts used for pretreatment can be easily made by those skilled in the art by performing simple tests.
  • nucleic acids have been used as carriers to introduce target proteins into filamentous fungal cells.
  • the nucleic acid when the target protein is introduced into the protoplast, the nucleic acid may be introduced as a carrier, or the nucleic acid may be introduced without using the carrier. That is, in the present invention, the target protein can be introduced without a nucleic acid.
  • protoplasts After introduction by target protein or protein electroporation used for genome editing, protoplasts can be cultured in a medium containing an osmotic pressure regulator to regenerate mycelium of filamentous fungus.
  • the culture conditions and regeneration conditions of various filamentous fungal protoplasts are known and can be appropriately selected and determined. According to the above method of the invention, the protein is introduced transiently into the protoplast.
  • a buffer containing a nitrogen source and an osmotic pressure adjusting agent stabilizes the introduced protein, before the protoplast is regenerated into mycelia. It is preferable to increase the introduction efficiency.
  • the method for carrying out this treatment is not particularly limited, for example, protoplasts may be suspended in the above buffer for an appropriate time, and then washed by centrifugation or the like to remove the buffer. By such treatment, it is also possible to maintain the function of the introduced protein in cells for 24 hours or more.
  • Various nitrogen sources are known to be added to the buffer, and can be appropriately selected and used.
  • nitrogen sources include, but are not limited to, amino acids, hydrolysed peptides, ammonium salts, salts such as nitrates, and the like.
  • concentration (amount) of the nitrogen source can be appropriately determined and selected.
  • the processing temperature may be room temperature, for example, about 15 ° C. to about 30 ° C., but is not limited to these temperatures.
  • the osmotic pressure regulator is as described above.
  • a protein used for genome editing By introducing a protein used for genome editing into filamentous fungal protoplasts using the method of the present invention, it becomes possible to create a genome-editing filamentous fungus having no recombinant gene.
  • proteins used for genome editing include, but are not limited to, Cas9, Cpf1, ZNF, TALEN and the like.
  • Cas9 When Cas9 is introduced into filamentous fungal protoplasts using the method of the present invention, it is introduced together with the guide RNA.
  • the introduction of Cas9 and guide RNA into filamentous fungal protoplasts may be simultaneous or sequentially (before and after).
  • the method of the present invention is to introduce a vector (donor vector) into which the desired gene is inserted into protoplasts of filamentous fungus together with a protein used for genome editing. Further include doing.
  • the introduction of the protein and vector used for genome editing into filamentous fungal protoplasts may be simultaneous or sequential (before and after).
  • Methods for introducing vectors into filamentous fungal protoplasts are known and include, but are not limited to, electroporation, PEG method, lipofection method and the like.
  • the present invention in another aspect, introduces the protein into filamentous fungal protoplasts by electroporation in a buffer containing proteins used for genome editing and an osmotic pressure regulator, and then regenerates the protoplasts into mycelium.
  • a method of producing a genome editing filamentous fungus comprising:
  • Methods for confirming the introduction of a protein are known, and various methods are known. For example, when a fluorescent protein such as GFP is fused to a target protein, confirmation can be performed using a fluorescent microscope.
  • the introduction efficiency of the target protein of the present invention into cells of filamentous fungi can be extremely high, for example, about 1 to about 10%. These values are several times to ten times or more as compared with the conventional method.
  • the protein introduction efficiency is very high, it is possible to obtain and select filamentous fungi into which a target protein has been introduced and genome editing filamentous fungi by analyzing a few colonies without drug selection.
  • the present invention provides, in a further aspect, a kit for use in carrying out the method of the present invention described above, which kit comprises one or more of the following buffers (1) to (3): (1) a buffer containing salts and a tonicity modifier, for treating filamentous fungal protoplasts prior to electroporation; (2) A buffer containing an osmotic pressure-adjusting agent for introducing a target protein into protoplasts of filamentous fungi by electroporation (3) A buffer containing a nitrogen source and an osmotic pressure adjustment agent for treating filamentous fungal protoplasts after electroporation.
  • the target protein is mixed in the buffer of (2).
  • the salts, the osmotic pressure regulator and the nitrogen source are as described above.
  • the kit usually comes with an instruction manual.
  • Example 1 Preparation of protoplasts of filamentous fungi
  • Bovine pseudocarpus mutant strain # 326 Coprinopsis cinerea strain # 326) (A43mut B43mut pab1-1) (Inada K, Morimoto Y, Arima T, Murata Y, Kamada T (2001)
  • the clp1 gene of the mushroom Coprinus cinereus is essential for A-regulated sexual development. Genetics, 157: 133-140) was used.
  • the preparation of protoplasts of C. cinerea was carried out by referring to the previous report (Binninger et al., 1987; Doernte and Kuees, 2012). At first, C.
  • cinerea mycelium was transplanted to 10 sheets of MYG agar medium (1% malt extract, 0.4% yeast extract, 0.4% glucose, 1.5% agar), at a temperature of 28 ° C., in the dark It was cultured for 12 days.
  • Mycelial fluid was obtained by adding 5 ml of sterile water to a single petri dish and rubbing the mycelium with a condenser rod. The mycelial solution was passed through a 5 ml chip filled with gauze to obtain asexual spores.
  • a washing buffer solution containing mannitol and maleic acid was added, and centrifugation was again performed for 5 minutes at 1000 ⁇ g and the supernatant was discarded.
  • the asexual spores thus obtained were suspended in an enzyme solution for protoplast preparation containing lysing enzymes (manufactured by Sigma Aldrich), chitinase (manufactured by Sigma Aldrich), mannitol and maleic acid, and reacted at 28 ° C. for 4 hours. After completion of the reaction, a washing buffer solution containing mannitol, calcium chloride and maleic acid was added and washed twice at 600 ⁇ g for 10 minutes to obtain protoplasts. The appearance of the protoplast cells prepared is shown in FIG.
  • Example 2 Protein transfer to C. cinera protoplasts by electroporation
  • the C. cinerea protoplast suspension (cell number 1 ⁇ 10 8 cells) was added with a lithium chloride solution and allowed to stand at room temperature for 30 minutes, then 600 ⁇ g for 5 minutes The supernatant was removed by centrifugation. Ice-cold GFP protein (manufactured by Abcam), mannitol and a magnesium chloride-containing solution for electroporation were added to protoplast cells to prepare a sample for electroporation.
  • the sample for electroporation was transferred to a 2 mm wide cuvette, and a Gene Pulser X cell (manufactured by Bio-Rad) was used to apply an electric pulse of attenuation wave under the conditions of a capacitor capacity of 25 ⁇ F, a resistance of 200 ⁇ and a voltage of 900 V.
  • a solution after electroporation containing ice-cold amino acids or hydrolysed peptides, sorbitol, calcium chloride and Tris-HCl buffer (pH 7.5), repeat centrifugation twice at 600 ⁇ g for 5 minutes, not introduced Was washed out.
  • the washed protoplast suspension was transferred to a 96 microwell optical bottom plate and cultured at 28 ° C. in the dark. Three hours after the initiation of culture, observation of GFP fluorescence was conducted with time using a cell analyzer JuLI (manufactured by Air Brown). The number of C. cinerea cells emitting GFP fluorescence by the introduction of the GFP protein was measured using the image processing software ImageJ (Version 1.48, National Institutes of Health, Bethesda, MD). FIG. 2a shows the state of protoplast cells into which the GFP protein has been introduced. In addition, in order to observe GFP fluorescence in C.
  • cinerea cells a confocal laser scanning microscope FV1200-IX83-F (manufactured by Olympus) was used. Observation was performed by focusing on conditions of exposure time of 800 ms with TDI filter (bright field) and exposure time of 740 ms with EGFP filter (507 nm) at 10 ⁇ magnification, and further changing magnification from 20 ⁇ to 100 ⁇ ( Figure 2b). As a result of measuring the number of C.
  • the introduction efficiency is 7% under the above condition (condition 1), while As the method which has been used for gene transfer method, the efficiency of introduction is 0.5 under conditions 1 to no electroporation pretreatment with lithium salt, and after electroporation post treatment with sorbitol and hydrolysed peptide (condition 2). %, And the protein introduction efficiency according to the method of the present invention resulted in a 10-fold or more improvement (FIG. 3).
  • Example 3 Protein Introduction into Shiitake and Matsutake Protoplasts by Electroporation
  • GFP protein introduction into cells of shiitake (Lentinula edodes) and matsutake (Tricholoma matsutake) which are fungi other than C. cinerea was carried out.
  • the operating conditions were according to the above-mentioned C. cinerea protoplast preparation and GFP protein introduction method.
  • FIG. 4 shows the state of fluorescence by the GFP protein introduced into shiitake and matsutake protoplasts.
  • KS (+) PAB vector comprising p-aminobenzoic acid synthetase gene (PAB) (SEQ ID NO: 1), which is an auxotrophic marker for C. cinerea # 326 by p-aminobenzoic acid shown in FIG. 5a, and PUC57_Pgpd2GFP vector containing a GFP gene expression cassette was respectively produced, and transformation of C. cinerea # 326 was performed.
  • PAB p-aminobenzoic acid synthetase gene
  • KS Protoplasts co-transfected with (+) PAB vector and pUC57_Pgpd2GFP vector were selected in a selection medium not containing p-aminobenzoic acid.
  • C. cinerea # 326 line in which GFP expression was stably recognized under a fluorescent stereomicroscope was named GFP- # 326 line, and was used for genome editing experiment (FIG. 5 b).
  • the CRISPR / Cas9 system was used as genome editing to target the GFP gene introduced into the genome of the GFP- # 326 strain.
  • the target sequence was designed as 5'-GTTGGGGTCTTTTCTCAGGGcgg-3 '(lower case indicates the PAM sequence of SpCas 9) (SEQ ID NO: 6) (Fig. 6a).
  • the CRISPR / Cas9 gRNA (including the target sequence; SEQ ID NO: 7) was subjected to in vitro RNA synthesis using Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening System (Takara Bio Inc.).
  • RNP complex After mixing 300 ng to 500 ng of gRNA containing the target sequence with 2 ⁇ g to 3 ⁇ g of Guide-it® Recombinant Cas 9 (manufactured by Takara Bio Inc.), RNP complex is formed by incubation at 37 ° C. for 5 minutes.
  • the Protoplasts were prepared from the GFP- # 326 strain according to the method of Example 1, and the RNP complex was introduced according to the conditions 1 of Example 2.
  • the RNP complex-introduced protoplasts were adjusted in cell concentration and coated at 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 cells per MYG agar medium plate to promote division from protoplast cells and hyphal growth.
  • the boiling method is a method for preparing mycelium-derived genomic DNA by suspending the mycelium scrap in 100 ⁇ L of TE with a platinum loop and reacting it at 96 ° C. for 10 minutes with a PCR thermal cycler.
  • GFP — 50F 5′-TCGAGCTGGACGGCGACGTAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 8) and T26_R1: 5′-GACGACCAAGAAAGCTAAACTCGCAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 9) were designed to amplify the GFP gene.
  • the PCR reaction was carried out using KOD FX Neo (Toyobo Co., Ltd.) according to the reaction protocol recommended by the manufacturer.
  • the obtained PCR fragment was subjected to Sanger sequencing by Big Dye (registered trademark) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), and mutation analysis on the PCR fragment was performed.
  • proteins can be efficiently transiently introduced into fungal cells and functioned using the method of the present invention. It was also shown that the method of the present invention facilitates the acquisition of functionally modified fungal cells that do not result in genetic recombination.
  • the present invention can be used in the field of breeding and research of filamentous fungi.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the C. cinerea p-aminobenzoic acid synthetase genome gene.
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 2 gene promoter derived from Agaricus bisporus.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 2 gene first exon, first intron and second exon from Agaricus bisporus.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of the GFP gene from which ATG encoding translation initiation methionine has been removed.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of heat shock protein 26 kDa gene terminator from Agaricus bisporus.
  • SEQ ID NO: 6 shows the target sequence of CRISPR / Cas9 designed on GFP.
  • SEQ ID NO: 7 shows the base sequence of guide RNA containing the target sequence.
  • SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of PCR primer GFP_50F.
  • SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of PCR primer T26_R1.

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Abstract

本発明は、目的タンパク質およびマンニトールなどの浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法、目的タンパク質およびマンニトールなどの浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法、ならびにゲノム編集に用いられるタンパク質およびマンニトールなどの浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作製方法を提供する。

Description

糸状菌細胞に対するタンパク質導入法およびその成果物
　本発明は、糸状菌の育種に関する。詳細には、本発明は、糸状菌細胞へのタンパク質の導入方法、タンパク質導入糸状菌の作製方法、ゲノム編集糸状菌の作製方法などに関する。
　担子菌を含む糸状菌への電気穿孔法による遺伝子導入については多くの報告があるが、再現性や導入効率が低く、また種によって導入条件が大きく異なっていた。遺伝子導入とは別に、糸状菌にタンパク質を導入する試みもなされてきたが、これらの報告においてタンパク質はＤＮＡとともに導入されていた（特許文献１、非特許文献１、２）。しかもタンパク質の導入効率は低いものであった。
　さらに、糸状菌細胞に一過的に導入されたタンパク質の安定性が低いという問題もあった。
日本国特許第５４２４３０１号明細書
Sato T. et al. Biosci Biotechnol Biochem, 62:2346-2350 (1998) Thon MR et al. Mol Plant Microbe Interact, 13:1356-1365 (2000)
　糸状菌細胞へのタンパク質導入効率を高める方法が望まれていた。さらに、遺伝子組み換え体でないゲノム編集糸状菌の作製が望まれていた。
　本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入したところ、高い効率でタンパク質が導入されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　したがって、本発明は以下のものを提供する：
　（１）目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法。
　（２）電気穿孔後に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１）記載の方法。
　（３）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１）または（２）記載の方法。
　（４）塩類がアルカリ金属塩化物である（３）記載の方法。

　（５）目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
　（６）目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法。
　（７）電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（６）記載の方法。
　（８）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（６）または（７）記載の方法。
　（９）塩類がアルカリ金属塩化物である（８）記載の方法。
　（１０）目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、（６）～（９）のいずれかに記載の方法。
　（１１）ゲノム編集に用いられるタンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作製方法。
　（１２）電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１１）に記載の方法。
　（１３）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１１）または（１２）のいずれかに記載の方法。
　（１４）塩類がアルカリ金属塩化物である（１３）記載の方法。
　本発明によれば、糸状菌細胞へのタンパク質の導入効率が飛躍的に向上する。しかも、糸状菌の種類によって導入条件を大きく変化させる必要がない。すなわち、本発明のタンパク質導入方法は、複数の糸状菌種において汎用性が高く、再現性と導入効率が高い。本発明によれば、目的タンパク質の導入効率は約１０％を達成しうる。さらに本発明によれば、導入タンパク質を長時間安定化させることができる。導入蛋白が２４時間以上機能を保持することも可能である。これらの方法は簡単に実施することができる。さらに本発明は、上記方法を用いるタンパク質導入糸状菌の作製方法およびゲノム編集糸状菌の作成方法も提供する。本発明により得られるゲノム編集糸状菌は組み換え遺伝子を有しない糸状菌である。
図１は、C. cinerea無性胞子由来のプロトプラストの顕微鏡像である。白線は５００μｍを示す。 図２は、電気穿孔法によりC. cinerea細胞に導入したＧＦＰタンパク質の蛍光を示す。図２ａは、 セルアナライザーJuLI（エアブラウン社製）により観察した細胞内のＧＦＰ蛍光を示す。白線は５００μｍを示す。図２ｂは、共焦点レーザー走査型顕微鏡FV1200-IX83-F (オリンパス社製)により観察したC. cinerea細胞内のＧＦＰ蛍光を示す。白線は１μｍを示す。 図３は、電気穿孔法によるC. cinerea細胞へのＧＦＰタンパク質導入効率（平均値および標準偏差）を示す。条件１は、実施例２に示した条件で実験を行った場合のＧＦＰタンパク質導入効率を示す。条件２は、条件１からリチウム塩による電気穿孔前処理および、ソルビトールおよび加水分解ペプチドによる電気穿孔後処理を除いた条件で実験を行った場合のＧＦＰタンパク質導入効率を示す。 図４は、シイタケおよびマツタケプロトプラスト細胞へのＧＦＰタンパク質導入結果を示す。 図５は、ゲノム編集に用いたＧＦＰ発現C.cinerea系統の作製について示す。図５ａの左側は、ｐ-アミノ安息香酸合成酵素遺伝子ＰＡＢ（配列番号：１）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ（＋）ベクター（Agilent社製）　ＫＳ（＋）ＰＡＢを示す。　ＫＳ（＋）ＰＡＢの構造中、白抜き枠はC.cinerea由来のＰＡＢ遺伝子を含むゲノム配列を示し、黒枠はＰＡＢ遺伝子のコード領域を示す。図５ａの右側は、ＧＦＰ遺伝子発現カセットを含むｐＵＣ５７ベクター　ｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰを示す。ｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰの構造中、Ｐｇａｐｄ２はAgaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子プロモーター（配列番号：２）を示し、ｉｎｔはAgaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子第一エキソン、第一イントロンおよび第二エキソン（配列番号：３）を示し、ＧＦＰはＡＴＧを取り除いたＧＦＰ遺伝子（配列番号：４）を示し、ＴａｂはAgaricus bisporus由来熱ショックタンパク質２６ｋＤａ遺伝子ターミネーター（配列番号：５）を示す。図５ｂは、図５ａに示すプラスミドベクターを導入したC.cinerea #326系統より得られたＧＦＰ発現系統 ＧＦＰ－＃３２６系統の菌糸におけるＧＦＰ蛍光を示す。Ａは可視光下のC.cinerea #326系統菌糸の実体顕微鏡観察の結果を示し、Ｂは蛍光下のC.cinerea #326系統菌糸の実体顕微鏡観察の結果を示す。Ｃは可視光下のＧＦP-＃３２６系統菌糸の実体顕微鏡観察の結果を示し、Ｄは蛍光下のＧＦＰ-＃３２６系統菌糸の実体顕微鏡観察の結果を示す。 図６は、ＧＦＰ遺伝子を標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ＲＮＰ複合体により導入された変異配列を示す。下線は標的配列を示し、枠内はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す。ハイフン（－）は塩基欠失を、黒色太文字アルファベットは塩基挿入を示す。図の右側に、塩基の挿入数を＋で、欠失数を－で示す。
　本発明は、１の態様において、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法を提供する。
　本発明は、別の態様において、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法を提供する。
　本発明において、目的タンパク質は、糸状菌の細胞に導入されるべきタンパク質である。目的タンパク質の種類は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。例えば、中性タンパク質、酸性タンパク質、塩基性タンパク質であってもよい。タンパク質のサイズや形態も特に限定されない。タンパク質は天然のタンパク質であってもよく、遺伝子組換えや突然変異などにより改変されたものであってもよい。
　糸状菌は、糸状の菌糸の形態で生活する微生物である。カビやキノコが糸状菌に含まれる。糸状菌のうち、子実体を作るものはキノコと呼ばれる。キノコの多くは担子菌門または子嚢菌門に属する。本発明において、糸状菌の種類は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。本発明にて用いる糸状菌としては、例えば子嚢菌類としてコウジカビ、クロコウジカビ、青カビ、クモノスカビ、ケカビ、アカパンカビなどが例示され、担子菌類としてシイタケ、マツタケ、シメジ、マイタケ、ナメコ、エノキタケ、ヒラタケ、ハラタケ、エリンギ、ツクリタケ、ヒトヨタケ、アガリクス、スエヒロタケなどが例示されるが、これらに限定されない。
　電気穿孔法は公知の方法である。この方法は、電気パルスで細胞膜に孔をあけ、物質を導入する手法である。一般的には、電気穿孔法は、遺伝子を細胞に導入することによる形質転換に用いられる。キュベットと呼ばれる容器中の細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、遺伝子を細胞内部に送り込むことで、形質転換を行うことができる。本発明においては、遺伝子のかわりにタンパク質が導入される。細胞が糸状菌細胞である場合、一般的にはプロトプラスト化した細胞に対して電気穿孔法を行う。本発明において、キュベット体積、電極間距離、電圧、内部抵抗、キャパシタンス、パルス波形、パルス回数、バッファーの組成などの電気穿孔法の条件は、通常のプロトプラストを用いる遺伝子導入と同様または類似の条件であってもよい。当業者はこれらの条件を適宜選択し、決定することができる。様々な電気穿孔装置が市販されており、キュベット等の部品も様々なものが用意されているので、当業者はこれらを適宜選択して用いることができ、あるいは電気穿孔装置やその部品を作製することもできる。
　本発明において、電気穿孔により目的タンパク質を糸状菌のプロトプラストに導入する。糸状菌のプロトプラストの作製方法は公知である。細胞壁溶解酵素を糸状菌の菌糸に作用させてプロトプラストを作製することができる。セルラーゼ、ヤタラーゼ、キチナーゼなどの様々な細胞壁溶解酵素が公知であり市販されている。当業者はこれらを適宜選択して使用することができる。
　プロトプラストを電気穿孔に供する場合、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中のプロトプラストに電気パルスをかける。一般的には、浸透圧調整剤として、ソルビトール、ショ糖、グルコースなどの糖類、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウムなどの塩類がバッファーに添加される。浸透圧調整剤の種類や使用濃度は公知である。本発明においては浸透圧調整剤としてマンニトール、ソルビトールなどの糖アルコールが好ましい。目的タンパク質およびマンニトールを含むバッファーを用いて電気穿孔を行った場合に、目的タンパク質の導入効率が高くなる。バッファー中のマンニトール濃度は糸状菌の種類、プロトプラストの性質などによって異なるが、当業者は容易に濃度を選択することができる。バッファー中のマンニトール濃度は、通常は約０．３Ｍ～約０．８Ｍであるが、これらの濃度に限定されない。マンニトール以外の浸透圧調整剤がバッファーに含まれていてもよい。浸透圧調整剤以外のバッファー中の成分およびバッファーのｐＨなどの条件も当業者に公知であり、適宜選択することができる。
　作製したプロトプラストを電気穿孔に供する前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを前処理することが、タンパク質導入効率を上げるうえで好ましい。この処理を行う方法は特に限定されないが、例えば、プロトプラストを上記バッファー中に適当時間懸濁し、その後遠心分離等により洗浄してバッファーを除去してもよい。この処理に用いる塩類はいずれの種類のものであってもよいが、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩化物が好ましく、塩化リチウムがより好ましい。前処理に用いる塩類の種類および濃度は糸状菌の種類、プロトプラストの性質などによって異なるが、通常は約１０～約４０ｍＭ、好ましくは約１２～約３０ｍＭ、より好ましくは約１５～約２５ｍＭであるが、これらの濃度に限定されない。この処理温度は室温であってもよく、例えば、約１５℃～約３０℃であってもよいが、これらの温度に限定されない。前処理に用いる塩類の種類および濃度等の条件の選択は、当業者が簡単な試験を行うことにより容易になし得るものである。
　従来は、目的タンパク質を糸状菌の細胞に導入するために核酸をキャリアーとして用いてきた。しかし、本発明においては、目的タンパク質をプロトプラストに導入する際に核酸をキャリアーとして導入してもよく、核酸をキャリアーとせずに導入してもよい。すなわち、本発明においては、目的タンパク質が核酸を伴わずに導入され得る。
　目的タンパク質またはゲノム編集に用いられるタンパク質電気穿孔により導入した後、浸透圧調整剤を含む培地でプロトプラストを培養し、糸状菌の菌糸体を再生させることができる。様々な糸状菌のプロトプラストの培養条件および再生条件は公知であり、適宜選択し、決定することができる。本発明の上記方法によれば、タンパク質はプロトプラスト中に一過的に導入される。
　電気穿孔により目的タンパク質を導入した後、プロトプラストを菌糸体に再生させる前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することが、導入されたタンパク質を安定化させ、タンパク質の導入効率を上げるうえで好ましい。この処理を行う方法は特に限定されないが、例えば、プロトプラストを上記バッファー中に適当時間懸濁し、その後遠心分離等により洗浄してバッファーを除去してもよい。このような処理により、導入されたタンパク質の機能を細胞中で２４時間以上維持することも可能である。バッファーに添加する窒素源は様々なものが公知であり、適宜選択して用いることができる。窒素源の例としては、アミノ酸、加水分解ペプチド、アンモニウム塩、硝酸塩などの塩類などが挙げられるが、これらに限定されない。窒素源の濃度（量）については適宜決定、選択できる。この処理温度は室温であってもよく、例えば、約１５℃～約３０℃であってもよいが、これらの温度に限定されない。浸透圧調整剤に関しては上で説明したとおりである。
　本発明の方法を用いて、ゲノム編集に用いられるタンパク質を糸状菌プロトプラストに導入することにより、組み換え遺伝子を有しないゲノム編集糸状菌の作成が可能となる。ゲノム編集に用いられるタンパク質としてはＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮなどが例示されるが、これらに限定されない。Ｃａｓ９を本発明の方法を用いて糸状菌プロトプラストに導入する場合は、ガイドＲＮＡとともに導入する。Ｃａｓ９とガイドＲＮＡの糸状菌プロトプラストへの導入は同時であってもよく、順次であってもよい（前後は問わない）。糸状菌プロトプラストへのガイドＲＮＡの導入方法は公知であり、電気穿孔法（例えばOzeki K, Kyoya F, Hizume K, Kanda A, Hamachi M, Nunokawa Y. (1994) Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Biosci Biotechnol Biochem, 58:2224-2227参照）、ＰＥＧ法（例えばBinninger DM, Skrzynia C, Pukkila PJ, Casselton LA. DNA-mediated transformation of the basidiomycete Coprinus cinereus. EMBO J, 6:835-840参照）、リポフェクション法（例えばChai R, Zhang G, Sun Q, Zhang M, Zhao S, Qiu L. (2013) Liposome-mediated mycelial transformation of filamentous fungi. Fungal Biol, 117:577-583参照）などが挙げられるが、これらに限定されない。ゲノム編集により所望の遺伝子を糸状菌にノックインさせる場合には、本発明の方法は、所望の遺伝子を挿入したベクター（ドナーベクター）を、ゲノム編集に用いられるタンパク質と一緒に糸状菌のプロトプラストに導入することをさらに含む。ゲノム編集に用いられるタンパク質とベクターの糸状菌プロトプラストへの導入は同時であってもよく、順次であってもよい（前後は問わない）。糸状菌プロトプラストへのベクターの導入方法は公知であり、電気穿孔法、ＰＥＧ法、リポフェクション法などが挙げられるが、これらに限定されない。
　したがって、本発明は、もう１つの態様において、ゲノム編集に用いられるタンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作成方法を提供する。
　タンパク質の導入の確認方法は公知であり様々な方法が知られている。例えば、目的タンパク質にＧＦＰなどの蛍光タンパク質が融合している場合は、蛍光顕微鏡を用いて確認を行うことができる。
　本発明における目的タンパク質の糸状菌の細胞への導入効率は極めて高く、例えば約１～約１０％であり得る。これらの値は、従来法を用いた場合の数倍～１０倍以上である。
　本発明においてタンパク質導入効率が非常に高いので、薬剤選抜を行わずに小数のコロニーを解析するだけで、目的タンパク質が導入された糸状菌およびゲノム編集糸状菌の取得・選別を行うことができる。
　本発明は、さらなる態様において、上で説明した本発明の方法を実施するために用いられるキットであって、下記バッファー（１）～（３）の１つ以上を含むキットを提供する：
　（１）電気穿孔を行う前に糸状菌のプロトプラストを処理するための、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファー、
　（２）電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入するための、浸透圧調整剤を含むバッファー、
　（３）電気穿孔を行った後に糸状菌のプロトプラストを処理するための、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファー。
　該キットの使用に際して、目的タンパク質を（２）のバッファーに混合する。塩類、浸透圧調整剤および窒素源については上で説明したとおりである。通常、キットには取扱説明書が添付される。
　本明細書中の用語は、特に断らない限り、微生物学、生化学および遺伝学の分野において通常理解されている意味に解される。
　以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されるものではない。
　実施例１．糸状菌のプロトプラスト調製 
　糸状菌として、ウシグソヒトヨタケ 変異株#326（Coprinopsis cinerea strain #326）（A43mut B43mut pab1-1)（Inada K, Morimoto Y, Arima T, Murata Y, Kamada T (2001) The clp1 gene of the mushroom Coprinus cinereus is essential for A-regulated sexual development. Genetics, 157:133-140）を用いた。C. cinereaのプロトプラストの調製は、既報を参考に行った (Binninger et al., 1987; Doernte and Kuees, 2012)。まず C. cinerea菌糸をＭＹＧ寒天培地（１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス、０．４％グルコース、１．５％寒天）１０枚に移植し、温度２８℃、暗所の条件下で１２日間培養した。一枚のシャーレにつき５ｍｌの滅菌水を加え、コンラージ棒で菌糸をこすることで、菌糸液を得た。この菌糸液を、ガーゼを詰めた５　ｍｌチップを通して無性胞子を得た。得られた無性胞子溶液を１０００×ｇ、５分間遠心し上清を捨てた後に、マンニトールおよびマレイン酸を含む洗浄バッファー液を加え，再度１０００×ｇ、５分間遠心を行い上清を捨てた。こうして得た無性胞子をｌｙｓｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅｓ（シグマアルドリッチ社製）、キチナーゼ（シグマアルドリッチ社製）、マンニトールおよびマレイン酸を含むプロトプラスト作製用酵素液に懸濁し、２８℃で４時間反応させた。反応終了後、マンニトール、塩化カルシウムおよびマレイン酸を含む洗浄バッファー液を加えて６００×ｇ、１０分間で二回洗浄し、プロトプラストを得た。図１に調製されたプロトプラスト細胞の様子を示す。
　実施例２．電気穿孔法によるC. cineraプロトプラストへのタンパク質導入
　C. cinereaプロトプラスト懸濁液（細胞数１×１０８細胞）に塩化リチウム溶液を加え、室温で３０分間静置した後、６００×ｇ、５分間遠心して上清を除去した。プロトプラスト細胞に、氷冷したＧＦＰタンパク質（アブカム社製）、マンニトールおよび塩化マグネシウム含有電気穿孔用溶液を加え、電気穿孔用試料とした。電気穿孔用試料を２ｍｍ幅キュベットに移し、Gene Pulser X cell（バイオラッド社製）にて、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗２００Ω、電圧を９００Ｖの条件で減衰波の電気パルスを与えた。通電後直ちに、氷冷したアミノ酸あるいは加水分解ペプチド、ソルビトール、塩化カルシウムおよびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）含有電気穿孔処理後溶液を加え６００×ｇ、５分間の遠心を二回繰り返し、未導入のＧＦＰタンパク質を洗浄した。洗浄後のプロトプラスト懸濁液を、９６マイクロウェルオプティカルボトムプレートに移し、２８℃、暗所にて培養した。培養開始３時間後から経時的にＧＦＰ蛍光の観察を、セルアナライザーJuLI（エアブラウン社製）を用いて行った。ＧＦＰタンパク質の導入によるＧＦＰ蛍光を発するC. cinerea細胞数は、画像処理ソフトImageJ (Version 1.48、National Institutes of Health、Bethesda、MD)を用いて計測した。図２ａにＧＦＰタンパク質が導入されたプロトプラスト細胞の様子を示す。また、C. cinerea細胞内のＧＦＰ蛍光を観察するために、共焦点レーザー走査型顕微鏡FV1200-IX83-F（オリンパス社製）　を用いた。倍率１０倍で、ＴＤＩフィルター（明視野）で露光時間８００ｍｓ、ＥＧＦＰ　フィルター（５０７ｎｍ）で露光時間７４０ｍｓの条件にて焦点を合わせ、さらに倍率を２０倍～１００倍まで変化させることで観察を行った（図２ｂ）。セルアナライザーJuLI（エアブラウン社製）を用いて、ＧＦＰ蛍光を発するC.cinerea細胞数を計測し導入効率を計測した結果、上記条件下（条件１）において導入効率は７％であり、一方、従前、遺伝子導入法に用いられてきた方法として、条件１からリチウム塩による電気穿孔前処理なし、ソルビトールおよび加水分解ペプチドによる電気穿孔後処理なしの条件下（条件２）において導入効率は０．５％であり、本発明の方法によるタンパク質導入効率は１０倍以上の改善をもたらした（図３）。
　実施例３．電気穿孔法によるシイタケおよびマツタケプロトプラストへのタンパク質導入
　本発明の実施例として、C.cinerea以外の菌類であるシイタケ（Lentinula edodes）およびマツタケ（Tricholoma matsutake）の細胞へのＧＦＰタンパク質導入実験を行った。実施条件は、上述 C. cinereaプロトプラスト調製およびＧＦＰタンパク質導入法に従った。図４にシイタケおよびマツタケプロトプラストへ導入したＧＦＰタンパク質による蛍光の様子を示す。
実施例４．ゲノム編集糸状菌の作製
　電気穿孔法による菌類プロトプラストへのタンパク質導入について、応用実施例の一形態として、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９のタンパク質-ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；　ＲＮＰ）複合体導入によるゲノム編集を行った。
　（１）ＧＦＰ発現C.cinerea系統の作製
　ゲノム編集の標的としてＧＦＰ遺伝子を用いるため、人為標的配列を含むC.cinerea系統の作出を行った。図５ａに示す、C.cinerea #326のｐ-アミノ安息香酸による栄養要求性マーカーであるｐ-アミノ安息香酸合成酵素遺伝子（ＰＡＢ）（配列番号：１）を含むＫＳ（＋）ＰＡＢベクター、およびＧＦＰ遺伝子発現カセットを含むｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰベクターをそれぞれ作製し、C.cinerea #326の形質転換を行った。プラスミドＤＮＡの導入および形質転換体の作製はBinningerらの方法（Binninger DM, Skrzynia C, Pukkila PJ, Casselton LA. DNA-mediated transformation of the basidiomycete Coprinus cinereus. EMBO J, 6:835-840）に従い、ＫＳ（＋）ＰＡＢベクターおよびｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰベクターを共導入したプロトプラストは、ｐ-アミノ安息香酸を含まない選抜培地で選択した。得られた系統のうち、蛍光実体顕微鏡下において安定にＧＦＰ発現が認められたC.cinerea #326系統をＧＦＰ-＃３２６株と名付け、ゲノム編集実験に用いた（図５ｂ）。
　（２）ＧＦＰ発現C.cinerea系統を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集
　ゲノム編集としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用い、ＧＦＰ-＃３２６株のゲノムに導入されたＧＦＰ遺伝子を標的とした。標的となる配列は、５'-ＧＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＧｃｇｇ-３'（小文字はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す）（配列番号：６）をデザインした（図６ａ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｇＲＮＡ（標的配列を含む；配列番号：７）は、Guide-it（登録商標） sgRNA In Vitro Transcription and Screening System（タカラバイオ社製）を用いて、インビトロＲＮＡ合成を行った。３００ｎｇ～５００ｎｇの標的配列を含むｇＲＮＡと、２μｇ～３μｇのGuide-it（登録商標） Recombinant Cas9（タカラバイオ社製）を混合させた後、３７℃、５分間のインキュベートによりＲＮＰ複合体を形成させた。実施例１の方法に従い、ＧＦＰ-＃３２６株からプロトプラストを調製し、実施例２の条件１に従い、ＲＮＰ複合体の導入を行った。ＲＮＰ複合体を導入したプロトプラストは、細胞濃度を調整し、一枚のＭＹＧ寒天培地プレートあたり１ｘ１０３～１ｘ１０４細胞となるように塗布し、プロトプラスト細胞からの分裂と菌糸への生育を促した。５～７日間の培養後、培地上の菌糸コロニーをＭＹＧ寒天培地を入れた６ウェルプレートに移植し、ランダムに選んだ２２０の単独コロニーを分離した。分離したコロニーはさらに菌糸の生育を一週間程度促した後、各菌糸コロニーから煮沸法によりゲノムＤＮＡを調製した。煮沸法とは、白金耳により菌糸の一掻きを１００μＬのＴＥに懸濁し、ＰＣＲサーマルサイクラーにより９６℃、１０分間反応させることにより菌糸由来のゲノムＤＮＡを調製する方法である。調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＦＰ遺伝子を増幅するためにＧＦＰ＿５０Ｆ：５'-ＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡ-３'（配列番号：８）およびＴ２６＿Ｒ１：５'-ＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＡＡＡＣＴＣＧＣＡＡＴ-３'（配列番号：９）を設計した。ＰＣＲ反応は、KOD FX Neo（東洋紡社製）を用い、メーカー推奨の反応プロトコールに従って行った。得られたＰＣＲ断片は、Big Dye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりサンガーシーケンスを行い、ＰＣＲ断片上の変異解析を行った。シーケンス解析の結果、２２０コロニーのうち、２コロニー由来のゲノムＤＮＡにおいて、ＧＦＰ遺伝子上にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ＲＮＰ導入による変異が検出された（図６）。一方、実施例２に示す条件２を用いたＲＮＰ導入を実施し、導入後にランダムに選んだ５００コロニーについてシーケンス解析を行ったが、ＧＦＰ遺伝子上に変異は見出されなかった。
　以上、本発明の方法を用いて、菌類細胞に効率的にタンパク質を一過的に導入し、機能させることができることが示された。本発明の方法により、遺伝子組換えとならない機能改変菌類細胞の取得が容易に行えることも示された。
　本発明は、糸状菌の育種や研究の分野などにおいて利用可能である。
　配列番号：１は、C. cinereaのｐ－アミノ安息香酸合成酵素ゲノム遺伝子の塩基配列を示す。
　配列番号：２は、Agaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
　配列番号：３は、Agaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子第一エキソン、第一イントロンおよび第二エキソンの塩基配列を示す。
　配列番号：４は、翻訳開始メチオニンをコードするＡＴＧを取り除いたＧＦＰ遺伝子の塩基配列を示す。
　配列番号：５は、Agaricus bisporus由来熱ショックタンパク質２６ｋＤａ遺伝子ターミネーターの塩基配列を示す。
　配列番号：６は、ＧＦＰ上にデザインしたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列を示す。
　配列番号：７は、標的配列を含むガイドＲＮＡの塩基配列を示す。
　配列番号：８は、ＰＣＲプライマー　ＧＦＰ＿５０Ｆの塩基配列を示す。
　配列番号：９は、ＰＣＲプライマー　Ｔ２６＿Ｒ１の塩基配列を示す。

Claims (14)

  1. 　目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法。
  2. 　電気穿孔後に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１記載の方法。
  3. 　電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１または２記載の方法。
  4. 　塩類がアルカリ金属塩化物である請求項３記載の方法。
  5. 　目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法。
  7. 　電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項６記載の方法。
  8. 　電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項６または７記載の方法。
  9. 　塩類がアルカリ金属塩化物である請求項８記載の方法。
  10. 　目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、請求項６～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　ゲノム編集に用いられるタンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作製方法。
  12. 　電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１１記載の方法。
  13. 　電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１１または１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 　塩類がアルカリ金属塩化物である請求項１３記載の方法。
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