JPWO2019131505A1 - 糸状菌細胞に対するタンパク質導入法およびその成果物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、目的タンパク質およびマンニトールなどの浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法、目的タンパク質およびマンニトールなどの浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法、ならびにゲノム編集に用いられるタンパク質およびマンニトールなどの浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作製方法を提供する。
Description
本発明は、糸状菌の育種に関する。詳細には、本発明は、糸状菌細胞へのタンパク質の導入方法、タンパク質導入糸状菌の作製方法、ゲノム編集糸状菌の作製方法などに関する。
担子菌を含む糸状菌への電気穿孔法による遺伝子導入については多くの報告があるが、再現性や導入効率が低く、また種によって導入条件が大きく異なっていた。遺伝子導入とは別に、糸状菌にタンパク質を導入する試みもなされてきたが、これらの報告においてタンパク質はＤＮＡとともに導入されていた（特許文献１、非特許文献１、２）。しかもタンパク質の導入効率は低いものであった。
さらに、糸状菌細胞に一過的に導入されたタンパク質の安定性が低いという問題もあった。
Sato T. et al. Biosci Biotechnol Biochem, 62:2346-2350 (1998)
Thon MR et al. Mol Plant Microbe Interact, 13:1356-1365 (2000)
糸状菌細胞へのタンパク質導入効率を高める方法が望まれていた。さらに、遺伝子組み換え体でないゲノム編集糸状菌の作製が望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入したところ、高い効率でタンパク質が導入されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明は以下のものを提供する：
（１）目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法。
（２）電気穿孔後に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１）記載の方法。
（３）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１）または（２）記載の方法。
（４）塩類がアルカリ金属塩化物である（３）記載の方法。
（５）目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法。
（７）電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（６）記載の方法。
（８）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（６）または（７）記載の方法。
（９）塩類がアルカリ金属塩化物である（８）記載の方法。
（１０）目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、（６）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ゲノム編集に用いられるタンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作製方法。
（１２）電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１１）に記載の方法。
（１３）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１１）または（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）塩類がアルカリ金属塩化物である（１３）記載の方法。
（１）目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法。
（２）電気穿孔後に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１）記載の方法。
（３）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１）または（２）記載の方法。
（４）塩類がアルカリ金属塩化物である（３）記載の方法。
（５）目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法。
（７）電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（６）記載の方法。
（８）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（６）または（７）記載の方法。
（９）塩類がアルカリ金属塩化物である（８）記載の方法。
（１０）目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、（６）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ゲノム編集に用いられるタンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作製方法。
（１２）電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１１）に記載の方法。
（１３）電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、（１１）または（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）塩類がアルカリ金属塩化物である（１３）記載の方法。
本発明によれば、糸状菌細胞へのタンパク質の導入効率が飛躍的に向上する。しかも、糸状菌の種類によって導入条件を大きく変化させる必要がない。すなわち、本発明のタンパク質導入方法は、複数の糸状菌種において汎用性が高く、再現性と導入効率が高い。本発明によれば、目的タンパク質の導入効率は約１０％を達成しうる。さらに本発明によれば、導入タンパク質を長時間安定化させることができる。導入蛋白が２４時間以上機能を保持することも可能である。これらの方法は簡単に実施することができる。さらに本発明は、上記方法を用いるタンパク質導入糸状菌の作製方法およびゲノム編集糸状菌の作成方法も提供する。本発明により得られるゲノム編集糸状菌は組み換え遺伝子を有しない糸状菌である。
本発明は、１の態様において、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法を提供する。
本発明は、別の態様において、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法を提供する。
本発明において、目的タンパク質は、糸状菌の細胞に導入されるべきタンパク質である。目的タンパク質の種類は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。例えば、中性タンパク質、酸性タンパク質、塩基性タンパク質であってもよい。タンパク質のサイズや形態も特に限定されない。タンパク質は天然のタンパク質であってもよく、遺伝子組換えや突然変異などにより改変されたものであってもよい。
糸状菌は、糸状の菌糸の形態で生活する微生物である。カビやキノコが糸状菌に含まれる。糸状菌のうち、子実体を作るものはキノコと呼ばれる。キノコの多くは担子菌門または子嚢菌門に属する。本発明において、糸状菌の種類は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。本発明にて用いる糸状菌としては、例えば子嚢菌類としてコウジカビ、クロコウジカビ、青カビ、クモノスカビ、ケカビ、アカパンカビなどが例示され、担子菌類としてシイタケ、マツタケ、シメジ、マイタケ、ナメコ、エノキタケ、ヒラタケ、ハラタケ、エリンギ、ツクリタケ、ヒトヨタケ、アガリクス、スエヒロタケなどが例示されるが、これらに限定されない。
電気穿孔法は公知の方法である。この方法は、電気パルスで細胞膜に孔をあけ、物質を導入する手法である。一般的には、電気穿孔法は、遺伝子を細胞に導入することによる形質転換に用いられる。キュベットと呼ばれる容器中の細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、遺伝子を細胞内部に送り込むことで、形質転換を行うことができる。本発明においては、遺伝子のかわりにタンパク質が導入される。細胞が糸状菌細胞である場合、一般的にはプロトプラスト化した細胞に対して電気穿孔法を行う。本発明において、キュベット体積、電極間距離、電圧、内部抵抗、キャパシタンス、パルス波形、パルス回数、バッファーの組成などの電気穿孔法の条件は、通常のプロトプラストを用いる遺伝子導入と同様または類似の条件であってもよい。当業者はこれらの条件を適宜選択し、決定することができる。様々な電気穿孔装置が市販されており、キュベット等の部品も様々なものが用意されているので、当業者はこれらを適宜選択して用いることができ、あるいは電気穿孔装置やその部品を作製することもできる。
本発明において、電気穿孔により目的タンパク質を糸状菌のプロトプラストに導入する。糸状菌のプロトプラストの作製方法は公知である。細胞壁溶解酵素を糸状菌の菌糸に作用させてプロトプラストを作製することができる。セルラーゼ、ヤタラーゼ、キチナーゼなどの様々な細胞壁溶解酵素が公知であり市販されている。当業者はこれらを適宜選択して使用することができる。
プロトプラストを電気穿孔に供する場合、目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中のプロトプラストに電気パルスをかける。一般的には、浸透圧調整剤として、ソルビトール、ショ糖、グルコースなどの糖類、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウムなどの塩類がバッファーに添加される。浸透圧調整剤の種類や使用濃度は公知である。本発明においては浸透圧調整剤としてマンニトール、ソルビトールなどの糖アルコールが好ましい。目的タンパク質およびマンニトールを含むバッファーを用いて電気穿孔を行った場合に、目的タンパク質の導入効率が高くなる。バッファー中のマンニトール濃度は糸状菌の種類、プロトプラストの性質などによって異なるが、当業者は容易に濃度を選択することができる。バッファー中のマンニトール濃度は、通常は約０．３Ｍ〜約０．８Ｍであるが、これらの濃度に限定されない。マンニトール以外の浸透圧調整剤がバッファーに含まれていてもよい。浸透圧調整剤以外のバッファー中の成分およびバッファーのｐＨなどの条件も当業者に公知であり、適宜選択することができる。
作製したプロトプラストを電気穿孔に供する前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを前処理することが、タンパク質導入効率を上げるうえで好ましい。この処理を行う方法は特に限定されないが、例えば、プロトプラストを上記バッファー中に適当時間懸濁し、その後遠心分離等により洗浄してバッファーを除去してもよい。この処理に用いる塩類はいずれの種類のものであってもよいが、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩化物が好ましく、塩化リチウムがより好ましい。前処理に用いる塩類の種類および濃度は糸状菌の種類、プロトプラストの性質などによって異なるが、通常は約１０〜約４０ｍＭ、好ましくは約１２〜約３０ｍＭ、より好ましくは約１５〜約２５ｍＭであるが、これらの濃度に限定されない。この処理温度は室温であってもよく、例えば、約１５℃〜約３０℃であってもよいが、これらの温度に限定されない。前処理に用いる塩類の種類および濃度等の条件の選択は、当業者が簡単な試験を行うことにより容易になし得るものである。
従来は、目的タンパク質を糸状菌の細胞に導入するために核酸をキャリアーとして用いてきた。しかし、本発明においては、目的タンパク質をプロトプラストに導入する際に核酸をキャリアーとして導入してもよく、核酸をキャリアーとせずに導入してもよい。すなわち、本発明においては、目的タンパク質が核酸を伴わずに導入され得る。
目的タンパク質またはゲノム編集に用いられるタンパク質電気穿孔により導入した後、浸透圧調整剤を含む培地でプロトプラストを培養し、糸状菌の菌糸体を再生させることができる。様々な糸状菌のプロトプラストの培養条件および再生条件は公知であり、適宜選択し、決定することができる。本発明の上記方法によれば、タンパク質はプロトプラスト中に一過的に導入される。
電気穿孔により目的タンパク質を導入した後、プロトプラストを菌糸体に再生させる前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することが、導入されたタンパク質を安定化させ、タンパク質の導入効率を上げるうえで好ましい。この処理を行う方法は特に限定されないが、例えば、プロトプラストを上記バッファー中に適当時間懸濁し、その後遠心分離等により洗浄してバッファーを除去してもよい。このような処理により、導入されたタンパク質の機能を細胞中で２４時間以上維持することも可能である。バッファーに添加する窒素源は様々なものが公知であり、適宜選択して用いることができる。窒素源の例としては、アミノ酸、加水分解ペプチド、アンモニウム塩、硝酸塩などの塩類などが挙げられるが、これらに限定されない。窒素源の濃度（量）については適宜決定、選択できる。この処理温度は室温であってもよく、例えば、約１５℃〜約３０℃であってもよいが、これらの温度に限定されない。浸透圧調整剤に関しては上で説明したとおりである。
本発明の方法を用いて、ゲノム編集に用いられるタンパク質を糸状菌プロトプラストに導入することにより、組み換え遺伝子を有しないゲノム編集糸状菌の作成が可能となる。ゲノム編集に用いられるタンパク質としてはＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮなどが例示されるが、これらに限定されない。Ｃａｓ９を本発明の方法を用いて糸状菌プロトプラストに導入する場合は、ガイドＲＮＡとともに導入する。Ｃａｓ９とガイドＲＮＡの糸状菌プロトプラストへの導入は同時であってもよく、順次であってもよい（前後は問わない）。糸状菌プロトプラストへのガイドＲＮＡの導入方法は公知であり、電気穿孔法（例えばOzeki K, Kyoya F, Hizume K, Kanda A, Hamachi M, Nunokawa Y. (1994) Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Biosci Biotechnol Biochem, 58:2224-2227参照）、ＰＥＧ法（例えばBinninger DM, Skrzynia C, Pukkila PJ, Casselton LA. DNA-mediated transformation of the basidiomycete Coprinus cinereus. EMBO J, 6:835-840参照）、リポフェクション法（例えばChai R, Zhang G, Sun Q, Zhang M, Zhao S, Qiu L. (2013) Liposome-mediated mycelial transformation of filamentous fungi. Fungal Biol, 117:577-583参照）などが挙げられるが、これらに限定されない。ゲノム編集により所望の遺伝子を糸状菌にノックインさせる場合には、本発明の方法は、所望の遺伝子を挿入したベクター（ドナーベクター）を、ゲノム編集に用いられるタンパク質と一緒に糸状菌のプロトプラストに導入することをさらに含む。ゲノム編集に用いられるタンパク質とベクターの糸状菌プロトプラストへの導入は同時であってもよく、順次であってもよい（前後は問わない）。糸状菌プロトプラストへのベクターの導入方法は公知であり、電気穿孔法、ＰＥＧ法、リポフェクション法などが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、本発明は、もう１つの態様において、ゲノム編集に用いられるタンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作成方法を提供する。
タンパク質の導入の確認方法は公知であり様々な方法が知られている。例えば、目的タンパク質にＧＦＰなどの蛍光タンパク質が融合している場合は、蛍光顕微鏡を用いて確認を行うことができる。
本発明における目的タンパク質の糸状菌の細胞への導入効率は極めて高く、例えば約１〜約１０％であり得る。これらの値は、従来法を用いた場合の数倍〜１０倍以上である。
本発明においてタンパク質導入効率が非常に高いので、薬剤選抜を行わずに小数のコロニーを解析するだけで、目的タンパク質が導入された糸状菌およびゲノム編集糸状菌の取得・選別を行うことができる。
本発明は、さらなる態様において、上で説明した本発明の方法を実施するために用いられるキットであって、下記バッファー（１）〜（３）の１つ以上を含むキットを提供する：
（１）電気穿孔を行う前に糸状菌のプロトプラストを処理するための、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファー、
（２）電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入するための、浸透圧調整剤を含むバッファー、
（３）電気穿孔を行った後に糸状菌のプロトプラストを処理するための、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファー。
該キットの使用に際して、目的タンパク質を（２）のバッファーに混合する。塩類、浸透圧調整剤および窒素源については上で説明したとおりである。通常、キットには取扱説明書が添付される。
（１）電気穿孔を行う前に糸状菌のプロトプラストを処理するための、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファー、
（２）電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入するための、浸透圧調整剤を含むバッファー、
（３）電気穿孔を行った後に糸状菌のプロトプラストを処理するための、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファー。
該キットの使用に際して、目的タンパク質を（２）のバッファーに混合する。塩類、浸透圧調整剤および窒素源については上で説明したとおりである。通常、キットには取扱説明書が添付される。
本明細書中の用語は、特に断らない限り、微生物学、生化学および遺伝学の分野において通常理解されている意味に解される。
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されるものではない。
実施例１．糸状菌のプロトプラスト調製
糸状菌として、ウシグソヒトヨタケ 変異株#326（Coprinopsis cinerea strain #326）（A43mut B43mut pab1-1)（Inada K, Morimoto Y, Arima T, Murata Y, Kamada T (2001) The clp1 gene of the mushroom Coprinus cinereus is essential for A-regulated sexual development. Genetics, 157:133-140）を用いた。C. cinereaのプロトプラストの調製は、既報を参考に行った (Binninger et al., 1987; Doernte and Kuees, 2012)。まず C. cinerea菌糸をＭＹＧ寒天培地（１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス、０．４％グルコース、１．５％寒天）１０枚に移植し、温度２８℃、暗所の条件下で１２日間培養した。一枚のシャーレにつき５ｍｌの滅菌水を加え、コンラージ棒で菌糸をこすることで、菌糸液を得た。この菌糸液を、ガーゼを詰めた５ ｍｌチップを通して無性胞子を得た。得られた無性胞子溶液を１０００×ｇ、５分間遠心し上清を捨てた後に、マンニトールおよびマレイン酸を含む洗浄バッファー液を加え，再度１０００×ｇ、５分間遠心を行い上清を捨てた。こうして得た無性胞子をｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ（シグマアルドリッチ社製）、キチナーゼ（シグマアルドリッチ社製）、マンニトールおよびマレイン酸を含むプロトプラスト作製用酵素液に懸濁し、２８℃で４時間反応させた。反応終了後、マンニトール、塩化カルシウムおよびマレイン酸を含む洗浄バッファー液を加えて６００×ｇ、１０分間で二回洗浄し、プロトプラストを得た。図１に調製されたプロトプラスト細胞の様子を示す。
糸状菌として、ウシグソヒトヨタケ 変異株#326（Coprinopsis cinerea strain #326）（A43mut B43mut pab1-1)（Inada K, Morimoto Y, Arima T, Murata Y, Kamada T (2001) The clp1 gene of the mushroom Coprinus cinereus is essential for A-regulated sexual development. Genetics, 157:133-140）を用いた。C. cinereaのプロトプラストの調製は、既報を参考に行った (Binninger et al., 1987; Doernte and Kuees, 2012)。まず C. cinerea菌糸をＭＹＧ寒天培地（１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス、０．４％グルコース、１．５％寒天）１０枚に移植し、温度２８℃、暗所の条件下で１２日間培養した。一枚のシャーレにつき５ｍｌの滅菌水を加え、コンラージ棒で菌糸をこすることで、菌糸液を得た。この菌糸液を、ガーゼを詰めた５ ｍｌチップを通して無性胞子を得た。得られた無性胞子溶液を１０００×ｇ、５分間遠心し上清を捨てた後に、マンニトールおよびマレイン酸を含む洗浄バッファー液を加え，再度１０００×ｇ、５分間遠心を行い上清を捨てた。こうして得た無性胞子をｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ（シグマアルドリッチ社製）、キチナーゼ（シグマアルドリッチ社製）、マンニトールおよびマレイン酸を含むプロトプラスト作製用酵素液に懸濁し、２８℃で４時間反応させた。反応終了後、マンニトール、塩化カルシウムおよびマレイン酸を含む洗浄バッファー液を加えて６００×ｇ、１０分間で二回洗浄し、プロトプラストを得た。図１に調製されたプロトプラスト細胞の様子を示す。
実施例２．電気穿孔法によるC. cineraプロトプラストへのタンパク質導入
C. cinereaプロトプラスト懸濁液（細胞数１×１０８細胞）に塩化リチウム溶液を加え、室温で３０分間静置した後、６００×ｇ、５分間遠心して上清を除去した。プロトプラスト細胞に、氷冷したＧＦＰタンパク質（アブカム社製）、マンニトールおよび塩化マグネシウム含有電気穿孔用溶液を加え、電気穿孔用試料とした。電気穿孔用試料を２ｍｍ幅キュベットに移し、Gene Pulser X cell（バイオラッド社製）にて、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗２００Ω、電圧を９００Ｖの条件で減衰波の電気パルスを与えた。通電後直ちに、氷冷したアミノ酸あるいは加水分解ペプチド、ソルビトール、塩化カルシウムおよびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）含有電気穿孔処理後溶液を加え６００×ｇ、５分間の遠心を二回繰り返し、未導入のＧＦＰタンパク質を洗浄した。洗浄後のプロトプラスト懸濁液を、９６マイクロウェルオプティカルボトムプレートに移し、２８℃、暗所にて培養した。培養開始３時間後から経時的にＧＦＰ蛍光の観察を、セルアナライザーJuLI（エアブラウン社製）を用いて行った。ＧＦＰタンパク質の導入によるＧＦＰ蛍光を発するC. cinerea細胞数は、画像処理ソフトImageJ (Version 1.48、National Institutes of Health、Bethesda、MD)を用いて計測した。図２ａにＧＦＰタンパク質が導入されたプロトプラスト細胞の様子を示す。また、C. cinerea細胞内のＧＦＰ蛍光を観察するために、共焦点レーザー走査型顕微鏡FV1200-IX83-F（オリンパス社製） を用いた。倍率１０倍で、ＴＤＩフィルター（明視野）で露光時間８００ｍｓ、ＥＧＦＰ フィルター（５０７ｎｍ）で露光時間７４０ｍｓの条件にて焦点を合わせ、さらに倍率を２０倍〜１００倍まで変化させることで観察を行った（図２ｂ）。セルアナライザーJuLI（エアブラウン社製）を用いて、ＧＦＰ蛍光を発するC.cinerea細胞数を計測し導入効率を計測した結果、上記条件下（条件１）において導入効率は７％であり、一方、従前、遺伝子導入法に用いられてきた方法として、条件１からリチウム塩による電気穿孔前処理なし、ソルビトールおよび加水分解ペプチドによる電気穿孔後処理なしの条件下（条件２）において導入効率は０．５％であり、本発明の方法によるタンパク質導入効率は１０倍以上の改善をもたらした（図３）。
C. cinereaプロトプラスト懸濁液（細胞数１×１０８細胞）に塩化リチウム溶液を加え、室温で３０分間静置した後、６００×ｇ、５分間遠心して上清を除去した。プロトプラスト細胞に、氷冷したＧＦＰタンパク質（アブカム社製）、マンニトールおよび塩化マグネシウム含有電気穿孔用溶液を加え、電気穿孔用試料とした。電気穿孔用試料を２ｍｍ幅キュベットに移し、Gene Pulser X cell（バイオラッド社製）にて、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗２００Ω、電圧を９００Ｖの条件で減衰波の電気パルスを与えた。通電後直ちに、氷冷したアミノ酸あるいは加水分解ペプチド、ソルビトール、塩化カルシウムおよびトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）含有電気穿孔処理後溶液を加え６００×ｇ、５分間の遠心を二回繰り返し、未導入のＧＦＰタンパク質を洗浄した。洗浄後のプロトプラスト懸濁液を、９６マイクロウェルオプティカルボトムプレートに移し、２８℃、暗所にて培養した。培養開始３時間後から経時的にＧＦＰ蛍光の観察を、セルアナライザーJuLI（エアブラウン社製）を用いて行った。ＧＦＰタンパク質の導入によるＧＦＰ蛍光を発するC. cinerea細胞数は、画像処理ソフトImageJ (Version 1.48、National Institutes of Health、Bethesda、MD)を用いて計測した。図２ａにＧＦＰタンパク質が導入されたプロトプラスト細胞の様子を示す。また、C. cinerea細胞内のＧＦＰ蛍光を観察するために、共焦点レーザー走査型顕微鏡FV1200-IX83-F（オリンパス社製） を用いた。倍率１０倍で、ＴＤＩフィルター（明視野）で露光時間８００ｍｓ、ＥＧＦＰ フィルター（５０７ｎｍ）で露光時間７４０ｍｓの条件にて焦点を合わせ、さらに倍率を２０倍〜１００倍まで変化させることで観察を行った（図２ｂ）。セルアナライザーJuLI（エアブラウン社製）を用いて、ＧＦＰ蛍光を発するC.cinerea細胞数を計測し導入効率を計測した結果、上記条件下（条件１）において導入効率は７％であり、一方、従前、遺伝子導入法に用いられてきた方法として、条件１からリチウム塩による電気穿孔前処理なし、ソルビトールおよび加水分解ペプチドによる電気穿孔後処理なしの条件下（条件２）において導入効率は０．５％であり、本発明の方法によるタンパク質導入効率は１０倍以上の改善をもたらした（図３）。
実施例３．電気穿孔法によるシイタケおよびマツタケプロトプラストへのタンパク質導入
本発明の実施例として、C.cinerea以外の菌類であるシイタケ（Lentinula edodes）およびマツタケ（Tricholoma matsutake）の細胞へのＧＦＰタンパク質導入実験を行った。実施条件は、上述 C. cinereaプロトプラスト調製およびＧＦＰタンパク質導入法に従った。図４にシイタケおよびマツタケプロトプラストへ導入したＧＦＰタンパク質による蛍光の様子を示す。
本発明の実施例として、C.cinerea以外の菌類であるシイタケ（Lentinula edodes）およびマツタケ（Tricholoma matsutake）の細胞へのＧＦＰタンパク質導入実験を行った。実施条件は、上述 C. cinereaプロトプラスト調製およびＧＦＰタンパク質導入法に従った。図４にシイタケおよびマツタケプロトプラストへ導入したＧＦＰタンパク質による蛍光の様子を示す。
実施例４．ゲノム編集糸状菌の作製
電気穿孔法による菌類プロトプラストへのタンパク質導入について、応用実施例の一形態として、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９のタンパク質-ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ； ＲＮＰ）複合体導入によるゲノム編集を行った。
電気穿孔法による菌類プロトプラストへのタンパク質導入について、応用実施例の一形態として、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９のタンパク質-ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ； ＲＮＰ）複合体導入によるゲノム編集を行った。
（１）ＧＦＰ発現C.cinerea系統の作製
ゲノム編集の標的としてＧＦＰ遺伝子を用いるため、人為標的配列を含むC.cinerea系統の作出を行った。図５ａに示す、C.cinerea #326のｐ-アミノ安息香酸による栄養要求性マーカーであるｐ-アミノ安息香酸合成酵素遺伝子（ＰＡＢ）（配列番号：１）を含むＫＳ（＋）ＰＡＢベクター、およびＧＦＰ遺伝子発現カセットを含むｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰベクターをそれぞれ作製し、C.cinerea #326の形質転換を行った。プラスミドＤＮＡの導入および形質転換体の作製はBinningerらの方法（Binninger DM, Skrzynia C, Pukkila PJ, Casselton LA. DNA-mediated transformation of the basidiomycete Coprinus cinereus. EMBO J, 6:835-840）に従い、ＫＳ（＋）ＰＡＢベクターおよびｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰベクターを共導入したプロトプラストは、ｐ-アミノ安息香酸を含まない選抜培地で選択した。得られた系統のうち、蛍光実体顕微鏡下において安定にＧＦＰ発現が認められたC.cinerea #326系統をＧＦＰ-＃３２６株と名付け、ゲノム編集実験に用いた（図５ｂ）。
ゲノム編集の標的としてＧＦＰ遺伝子を用いるため、人為標的配列を含むC.cinerea系統の作出を行った。図５ａに示す、C.cinerea #326のｐ-アミノ安息香酸による栄養要求性マーカーであるｐ-アミノ安息香酸合成酵素遺伝子（ＰＡＢ）（配列番号：１）を含むＫＳ（＋）ＰＡＢベクター、およびＧＦＰ遺伝子発現カセットを含むｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰベクターをそれぞれ作製し、C.cinerea #326の形質転換を行った。プラスミドＤＮＡの導入および形質転換体の作製はBinningerらの方法（Binninger DM, Skrzynia C, Pukkila PJ, Casselton LA. DNA-mediated transformation of the basidiomycete Coprinus cinereus. EMBO J, 6:835-840）に従い、ＫＳ（＋）ＰＡＢベクターおよびｐＵＣ５７＿Ｐｇｐｄ２ＧＦＰベクターを共導入したプロトプラストは、ｐ-アミノ安息香酸を含まない選抜培地で選択した。得られた系統のうち、蛍光実体顕微鏡下において安定にＧＦＰ発現が認められたC.cinerea #326系統をＧＦＰ-＃３２６株と名付け、ゲノム編集実験に用いた（図５ｂ）。
（２）ＧＦＰ発現C.cinerea系統を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集
ゲノム編集としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用い、ＧＦＰ-＃３２６株のゲノムに導入されたＧＦＰ遺伝子を標的とした。標的となる配列は、５'-ＧＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＧｃｇｇ-３'（小文字はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す）（配列番号：６）をデザインした（図６ａ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｇＲＮＡ（標的配列を含む；配列番号：７）は、Guide-it（登録商標） sgRNA In Vitro Transcription and Screening System（タカラバイオ社製）を用いて、インビトロＲＮＡ合成を行った。３００ｎｇ〜５００ｎｇの標的配列を含むｇＲＮＡと、２μｇ〜３μｇのGuide-it（登録商標） Recombinant Cas9（タカラバイオ社製）を混合させた後、３７℃、５分間のインキュベートによりＲＮＰ複合体を形成させた。実施例１の方法に従い、ＧＦＰ-＃３２６株からプロトプラストを調製し、実施例２の条件１に従い、ＲＮＰ複合体の導入を行った。ＲＮＰ複合体を導入したプロトプラストは、細胞濃度を調整し、一枚のＭＹＧ寒天培地プレートあたり１ｘ１０３〜１ｘ１０４細胞となるように塗布し、プロトプラスト細胞からの分裂と菌糸への生育を促した。５〜７日間の培養後、培地上の菌糸コロニーをＭＹＧ寒天培地を入れた６ウェルプレートに移植し、ランダムに選んだ２２０の単独コロニーを分離した。分離したコロニーはさらに菌糸の生育を一週間程度促した後、各菌糸コロニーから煮沸法によりゲノムＤＮＡを調製した。煮沸法とは、白金耳により菌糸の一掻きを１００μＬのＴＥに懸濁し、ＰＣＲサーマルサイクラーにより９６℃、１０分間反応させることにより菌糸由来のゲノムＤＮＡを調製する方法である。調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＦＰ遺伝子を増幅するためにＧＦＰ＿５０Ｆ：５'-ＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡ-３'（配列番号：８）およびＴ２６＿Ｒ１：５'-ＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＡＡＡＣＴＣＧＣＡＡＴ-３'（配列番号：９）を設計した。ＰＣＲ反応は、KOD FX Neo（東洋紡社製）を用い、メーカー推奨の反応プロトコールに従って行った。得られたＰＣＲ断片は、Big Dye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりサンガーシーケンスを行い、ＰＣＲ断片上の変異解析を行った。シーケンス解析の結果、２２０コロニーのうち、２コロニー由来のゲノムＤＮＡにおいて、ＧＦＰ遺伝子上にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ導入による変異が検出された（図６）。一方、実施例２に示す条件２を用いたＲＮＰ導入を実施し、導入後にランダムに選んだ５００コロニーについてシーケンス解析を行ったが、ＧＦＰ遺伝子上に変異は見出されなかった。
ゲノム編集としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用い、ＧＦＰ-＃３２６株のゲノムに導入されたＧＦＰ遺伝子を標的とした。標的となる配列は、５'-ＧＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＧｃｇｇ-３'（小文字はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す）（配列番号：６）をデザインした（図６ａ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｇＲＮＡ（標的配列を含む；配列番号：７）は、Guide-it（登録商標） sgRNA In Vitro Transcription and Screening System（タカラバイオ社製）を用いて、インビトロＲＮＡ合成を行った。３００ｎｇ〜５００ｎｇの標的配列を含むｇＲＮＡと、２μｇ〜３μｇのGuide-it（登録商標） Recombinant Cas9（タカラバイオ社製）を混合させた後、３７℃、５分間のインキュベートによりＲＮＰ複合体を形成させた。実施例１の方法に従い、ＧＦＰ-＃３２６株からプロトプラストを調製し、実施例２の条件１に従い、ＲＮＰ複合体の導入を行った。ＲＮＰ複合体を導入したプロトプラストは、細胞濃度を調整し、一枚のＭＹＧ寒天培地プレートあたり１ｘ１０３〜１ｘ１０４細胞となるように塗布し、プロトプラスト細胞からの分裂と菌糸への生育を促した。５〜７日間の培養後、培地上の菌糸コロニーをＭＹＧ寒天培地を入れた６ウェルプレートに移植し、ランダムに選んだ２２０の単独コロニーを分離した。分離したコロニーはさらに菌糸の生育を一週間程度促した後、各菌糸コロニーから煮沸法によりゲノムＤＮＡを調製した。煮沸法とは、白金耳により菌糸の一掻きを１００μＬのＴＥに懸濁し、ＰＣＲサーマルサイクラーにより９６℃、１０分間反応させることにより菌糸由来のゲノムＤＮＡを調製する方法である。調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＦＰ遺伝子を増幅するためにＧＦＰ＿５０Ｆ：５'-ＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡ-３'（配列番号：８）およびＴ２６＿Ｒ１：５'-ＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＡＡＡＣＴＣＧＣＡＡＴ-３'（配列番号：９）を設計した。ＰＣＲ反応は、KOD FX Neo（東洋紡社製）を用い、メーカー推奨の反応プロトコールに従って行った。得られたＰＣＲ断片は、Big Dye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりサンガーシーケンスを行い、ＰＣＲ断片上の変異解析を行った。シーケンス解析の結果、２２０コロニーのうち、２コロニー由来のゲノムＤＮＡにおいて、ＧＦＰ遺伝子上にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ導入による変異が検出された（図６）。一方、実施例２に示す条件２を用いたＲＮＰ導入を実施し、導入後にランダムに選んだ５００コロニーについてシーケンス解析を行ったが、ＧＦＰ遺伝子上に変異は見出されなかった。
以上、本発明の方法を用いて、菌類細胞に効率的にタンパク質を一過的に導入し、機能させることができることが示された。本発明の方法により、遺伝子組換えとならない機能改変菌類細胞の取得が容易に行えることも示された。
本発明は、糸状菌の育種や研究の分野などにおいて利用可能である。
配列番号：１は、C. cinereaのｐ−アミノ安息香酸合成酵素ゲノム遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号：２は、Agaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号：３は、Agaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子第一エキソン、第一イントロンおよび第二エキソンの塩基配列を示す。
配列番号：４は、翻訳開始メチオニンをコードするＡＴＧを取り除いたＧＦＰ遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号：５は、Agaricus bisporus由来熱ショックタンパク質２６ｋＤａ遺伝子ターミネーターの塩基配列を示す。
配列番号：６は、ＧＦＰ上にデザインしたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列を示す。
配列番号：７は、標的配列を含むガイドＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：８は、ＰＣＲプライマー ＧＦＰ＿５０Ｆの塩基配列を示す。
配列番号：９は、ＰＣＲプライマー Ｔ２６＿Ｒ１の塩基配列を示す。
配列番号：２は、Agaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号：３は、Agaricus bisporus由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子第一エキソン、第一イントロンおよび第二エキソンの塩基配列を示す。
配列番号：４は、翻訳開始メチオニンをコードするＡＴＧを取り除いたＧＦＰ遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号：５は、Agaricus bisporus由来熱ショックタンパク質２６ｋＤａ遺伝子ターミネーターの塩基配列を示す。
配列番号：６は、ＧＦＰ上にデザインしたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列を示す。
配列番号：７は、標的配列を含むガイドＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：８は、ＰＣＲプライマー ＧＦＰ＿５０Ｆの塩基配列を示す。
配列番号：９は、ＰＣＲプライマー Ｔ２６＿Ｒ１の塩基配列を示す。
Claims (14)
- 目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入することを含む、糸状菌細胞へのタンパク質導入方法。
- 電気穿孔後に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１記載の方法。
- 電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１または２記載の方法。
- 塩類がアルカリ金属塩化物である請求項３記載の方法。
- 目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
- 目的タンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに目的タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、タンパク質導入糸状菌の作製方法。
- 電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項６記載の方法。
- 電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項６または７記載の方法。
- 塩類がアルカリ金属塩化物である請求項８記載の方法。
- 目的タンパク質が核酸を伴わずに導入される、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
- ゲノム編集に用いられるタンパク質および浸透圧調整剤を含むバッファー中で電気穿孔法により糸状菌のプロトプラストに前記タンパク質を導入し、次いでプロトプラストを菌糸体に再生させることを含む、ゲノム編集糸状菌の作製方法。
- 電気穿孔後、プロトプラストの再生前に、窒素源および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１１記載の方法。
- 電気穿孔を行う前に、塩類および浸透圧調整剤を含むバッファーにてプロトプラストを処理することをさらに含む、請求項１１または１２のいずれか１項記載の方法。
- 塩類がアルカリ金属塩化物である請求項１３記載の方法。
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| SCI. REP., 2017.04.28, VOL.7, 1260, JPN6019010364, ISSN: 0004925709 * |
| 日本きのこ学会２５周年記念大会要旨集, 2014, P.105 (1P-41), JPN6019010362, ISSN: 0004925708 * |
| 日本植物学会第８０回大会研究発表記録, 2016, P.240 (P-1709), JPN6019010357, ISSN: 0005058290 * |
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