WO2020075399A1 - 植物細胞の核内へのタンパク質導入法 - Google Patents
植物細胞の核内へのタンパク質導入法 Download PDFInfo
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Definitions
- the osmotic pressure of the buffer affects the efficiency of substance introduction into cells by protein transduction.
- the osmotic pressure of the buffer depends on conditions such as cell type and buffer composition, but is usually about 50 mOsm / kg to about 1000 mOsm / kg, preferably about 100 mOsm / kg to about 600 mOsm. / Kg, more preferably about 150 mOsm / kg to about 400 mOsm / kg.
- the conductivity of the buffer can be adjusted by changing the concentration of electrolyte in the buffer. For example, the conductivity of the buffer can be adjusted by diluting or concentrating the cell culture medium as needed.
- the osmotic pressure of the buffer can be adjusted by changing the concentration of salts and saccharides in the buffer. These techniques are known.
- E. coli was used in a lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 10 mM imidazole, 1 mM benzylsulfonyl fluoride, 1 mM dithiothreitol, pH 8.0). Dissolved. Subsequently, the protein was adsorbed on a nickel NTA column, and impurities were removed using a washing buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 20 mM imidazole, pH 8.0).
- Example 5 (1) Construction of Reporter Cell
- SSA single-strand annealing
- glucuronidase glucuronidase
- a reporter cell expressing a GUS ( ⁇ -glucuronidase: glucuronidase) gene was constructed. Specifically, 1.8 kb from the upstream of the GUS gene, the recognition sequence of ZFA36 (GAAGCTGGT), and 0.8 kb from the downstream of the GUS gene were introduced into pCAMBIA1305.2 (Marker Gene).
- Example 4 (2) Introduction by electroporation method
- the protein prepared in Example 4 was introduced by electroporation method.
- T87-GUUS (ZFA36) cells an attempt was made to introduce a final concentration of 0.1-2 ⁇ M ZF-ND1 and ZF-FokI into T87 cells having a cell wall by an electroporation method.
- NEPA21 Type II sold by Neppagene was used, and Example 1.
- A It carried out on the conditions of (6). Electroporation was performed using Opti-MEMI buffer, and GUS activity was evaluated 2 days later. As a result, as shown in FIG. 9, when electroporation was performed using Opti-MEMI, a large number of cells expressed GUS.
- Example 6 Construction of Reporter Plant Individual Wild type Arabidopsis thaliana was cultivated to a flowering state, and transformation was carried out by a floral dip method using a culture solution of Agrobacterium GV3101 strain retaining pCambiaN-xGxGUS. The transformed plant was cultivated in a medium containing hygromycin, and individuals showing green fluorescence of GFP were selected. This plant individual was named At-xGxGUS.
- SEQ ID NO: 3 is the base sequence of a primer for amplifying GFP fragment.
- SEQ ID NO: 4 is the base sequence of a primer for amplifying GFP fragment.
- SEQ ID NO: 5 is the base sequence of a primer for obtaining a genomic DNA amplification product.
- SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of ZF (ZFL1) -ND1.
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Abstract
エレクトロポレーションまたはプロテイントランスダクションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法、ならびに該方法を用いることを特徴とする、ゲノム編集またはゲノム改変方法。
Description
本発明は、植物細胞の核内へのタンパク質導入方法、および該方法を用いたゲノム改変方法等に関する。
ゲノムＤＮＡは生命の設計図とも呼ばれ、ゲノムＤＮＡ配列を改変することによって、様々な生物を育種する手法が知られている。古典的な手法として、ファージ由来のＣｒｅリコンビナーゼという組換え酵素を用いたゲノム改変方法が知られている。Ｃｒｅリコンビナーゼを一過的に発現させることにより、２つの異なるＤＮＡ配列上に位置するｌｏｘＰ配列を認識して、配列を組換えることが可能である。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムは、ハエ、マウス、ヒト細胞等の様々な生物種において利用されており、ゲノム配列上に挿入された遺伝子発現の調節等に利用されている。植物においても遺伝子発現解析の分野において利用されているが、植物においては遺伝子を一過的に発現させることが難しいため、Ｃｒｅの報告例は限定的であった（非特許文献１等）。また、近年報告されているゲノム編集酵素（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）においても、一過的な導入によるゲノム改変方法が報告されており（非特許文献２等）、植物の遺伝子解析や育種分野において、このような材料を導入する手法が重要であると考えられている。また、ゲノム編集技術においては、発現ベクターの導入により人工ヌクレアーゼを長期間発現させることによる副作用が問題視されており、一定期間後に人工ヌクレアーゼの発現を停止させることが望ましい。
植物における物質（特にタンパク質）の導入法としては、いくつかの手法が開発されている。１つ目は、生物学的な手法として、アグロバクテリウム（ライゾビウム属）を用いた導入法であり、最も広く活用されている。アグロバクテリウムが植物に感染し、アグロバクテリウム内に存在するＴｉプラスミドを植物ゲノムに組込むという性質を利用して、Ｔｉプラスミドを遺伝子工学的に改変することによって、改変遺伝子を植物内に導入しようとするものである。特定のアグロバクテリウムと植物種の組み合わせによっては、効率よく導入できる。２つ目の手法としては、物理的な導入方法が挙げられ、遺伝子を付着させた微粒子を高速で打ち込むパーティクルボンバートメント法やガラス繊維を擦り付けることによって導入するウィスカー法が報告されている。３つ目の手法としては、セルラーゼやペクチナーゼ等の酵素を用いて植物細胞壁を除去したプロトプラストを作成し、ＰＥＧを用いて細胞膜融合を誘導するプロトプラスト－ＰＥＧ法である。また、４つ目の手法として、導入するタンパク質にＣＰＰ等のタグをつけて植物個体へ導入した事例が報告されている（非特許文献３等）。
動物細胞においては、ゲノム改変技術の応用を見据えて、タンパク質酵素を一過的に導入する手法が開発されてきた。報告例としてはそれほど多くはないものの、Ｃｒｅタンパク質等のゲノム改変酵素、あるいはＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質等のゲノム編集酵素を核内に導入する手法が報告されている（非特許文献４等）。
Gilbertson L. Trends Biotechnol. 21, 550-555 (2003)
Gaj T. et al., Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013)
Chang M. et al., Plant Cell Physiol. 46(3), 482-488 (2005)
Liu J. et al., Nat. Protoc. 10, 1842-1859 (2015)
しかしながら、植物細胞では細胞壁があるため、植物における物質導入法は、動物細胞における物質導入法と異なり、いくつかの手法に限られてきた。
上記の植物における物質導入法は、いずれにおいても欠点が存在する。例えば、アグロバクテリウムによる手法では、植物種によっては導入効率の高い菌株が存在しない。また、パーティクルボンバートメント法では、機器コスト及びランニングコストが高い。これら方法においては、目的とするタンパク質のみを植物に導入することは報告されていない。また、プロトプラスト－ＰＥＧ法では、植物細胞壁を除去したことにより、植物体へ再生できる効率が極めて低い。さらに、ＣＰＰ等のタグをつけて植物個体へ導入する方法では、ＣＰＰを蛍光蛋白質や薬剤耐性タンパク質などのマーカータンパク質との融合した場合、当該融合タンパク質の一部が細胞間隙等に移行することにより、植物細胞内（細胞質ゾル内および核内）に導入されていなくとも、当該マーカータンパク質の活性が検出されてしまうことがあるという欠点があった。
植物における物質導入において、約３０年も昔の技術であるアグロバクテリウムを用いる手法が未だに広く用いられているのが現状である。このような状況下において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入できることを証明した事例はない。したがって、本発明が解決すべき課題は、細胞壁を有する植物細胞の核内に目的のタンパク質を効率よく導入でき、かつ、目的のタンパク質が導入された植物細胞が植物体に再生することが可能な手法を開発することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、エレクトロポレーション（Electroporation）およびプロテイントランスダクション（Protein transduction）（直接導入）という２つのアプローチを用いることにより、細胞壁を有する植物細胞の核内に目的のタンパク質を効率よく導入でき、かつ、目的のタンパク質が導入された植物細胞が植物体に再生することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明は下記のものを提供する：
（１）エレクトロポレーションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法。
（１）エレクトロポレーションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法。
（２）下記の条件下：
ポアリング電圧が約１２０Ｖ／ｃｍ～約１２００Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約１ｍｓ～約１００ｍｓ、
バッファーの導電率が約０．１Ｓ／ｍ～約４．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．１μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる、（１）記載の方法。
ポアリング電圧が約１２０Ｖ／ｃｍ～約１２００Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約１ｍｓ～約１００ｍｓ、
バッファーの導電率が約０．１Ｓ／ｍ～約４．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．１μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる、（１）記載の方法。
（３）ポアリング電圧が約３００Ｖ／ｃｍ～約７５０Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約２ｍｓ～約７５ｍｓ
である、（２）記載の方法。
ポアリング時間が約２ｍｓ～約７５ｍｓ
である、（２）記載の方法。
（４）タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭである、（２）または（３）記載の方法。
（５）バッファーとしてイーグル最小必須培地またはその改変培地を用いる、（２）～（４）のいずれか記載の方法。
（６）バッファーとしてＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉを用いる、（５）項記載の方法。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変酵素を導入することを特徴とする、ゲノム改変方法。
（８）（１）～（６）のいずれかに記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集酵素を導入することを特徴とする、ゲノム編集方法。
（９）プロテイントランスダクションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法。
（１０）下記の条件下：プロテイントランスダクションが、下記条件：
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．２μＭ～約２００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる、（９）記載の方法。
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．２μＭ～約２００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる、（９）記載の方法。
（１１）タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭである、（１０）記載の方法。
（１２）（９）～（１１）のいずれかに記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変酵素を導入することを特徴とする、ゲノム改変方法。
（１３）（９）または（１１）のいずれかに記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集酵素を導入することを特徴とする、ゲノム編集方法。
本発明によれば、細胞壁を有する植物細胞の核内に、容易かつ安価にタンパク質を直接導入することができる。本発明によれば、Ｃｒｅタンパク質等のゲノム改変酵素をタンパク質として細胞壁を有する植物細胞の核内に導入することにより、ゲノム改変を行うことができる。このようなゲノム改変方法を用いて、Ｃｒｅタンパク質を植物細胞に導入することにより、ｌｏｘＰ間に位置する人工ヌクレアーゼ及び／又は薬剤耐性遺伝子を除去することも可能である。さらに本発明によれば、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質等のゲノム編集酵素をタンパク質として細胞壁を有する植物細胞の核内に導入することにより、ゲノム編集を行うことができる。このようなタンパク質を細胞に導入するゲノム編集方法においては、遺伝子を細胞に導入するゲノム編集方法と異なり、人工ヌクレアーゼを長期間発現させることや、遺伝子のゲノムへの組み込みによる副作用の問題がない。
本発明は、１の態様において、エレクトロポレーションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法を提供する。
植物細胞の細胞壁は公知である。その主骨格はセルロース微線維である。本発明において、細胞壁を有する植物細胞は、その全体が細胞壁で覆われた植物細胞であり、細胞壁をその一部に有する植物細胞は除外される。本発明のこの態様において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質がエレクトロポレーション法によって導入される。
導入されるタンパク質はいずれのタンパク質であってもよい。タンパク質の種類やサイズ等に制限はない。
エレクトロポレーションは、電気パルスで細胞膜に孔をあけ物質を導入するという公知の手法である。今回、本発明者らによって、特定の定条件下でエレクトロポレーションを行うことにより、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入できることが初めて明らかにされた。
様々なエレクトロポレーション用の装置が知られ、市販されている。当業者は、これらの装置から適切なものを選択し、本発明に使用することができる。当業者は、エレクトロポレーション用の装置を自作することもできる。
本発明におけるエレクトロポレーションの条件について以下に説明する。ポアリング電圧が低いと穿孔が不十分となり、タンパク質の導入効率が低下する。ポアリング電圧が高いと細胞に対するダメージが大きくなる。本発明において、ポアリング電圧は、植物の種類やバッファーなどの条件にもよるが、通常は約１２０Ｖ／ｃｍ～約１２００Ｖ／ｃｍ、好ましくは約３００Ｖ／ｃｍ～約７５０Ｖ／ｃｍ、より好ましくは約４００Ｖ／ｃｍ～約６５０Ｖ／ｃｍである。
ポアリング時間が短いと穿孔が不十分となり、タンパク質の導入効率が低下する。ポアリング時間が長いと細胞に対するダメージが大きくなる。本発明において、ポアリング時間は、植物の種類やバッファーなどの条件にもよるが、通常は、約１ｍｓ～約１００ｍｓ、好ましくは約２ｍｓ～約７５ｍｓ、より好ましくは約１０ｍｓ～約５０ｍｓである。
一般に、ポアリング電圧が高い場合にはポアリング時間を短くし、ポアリング電圧が低い場合にはポアリング時間を長くすることで、タンパク質の導入効率を上げることができる。当業者は、簡単な試験により適切なポアリング電圧およびポアリング時間を決定することができる。
ポアリングパルスは１回であってもよく、複数回であってもよい。好ましくは、電気パスルを２～９回またはそれ以上かける。
所望により、上記ポアリングパルスを植物細胞に印加したのち、トランスファーパルスを印加してもよい。トランスファーパルスの電圧は、通常、約２０Ｖ／ｃｍ～約１００Ｖ／ｃｍ、好ましくは約３０Ｖ／ｃｍ～約７０Ｖ／ｃｍ程度である。トランスファーパルスのパルス幅は、通常約１ｍｓ～約１００ｍｓ、好ましくは約２０ｍｓ～約８０ｍｓである。トランスファーパルスのパルス間隔は、通常約１ｍｓ～約１００ｍｓ、好ましくは約２０ｍｓ～約８０ｍｓである。パルス回数は通常１～３０回、好ましくは１０～３０回である。これらのトランスファーパルスの条件は、細胞の種類、バッファーの種類、エレクトロポレーション装置などの条件に応じて、当業者が適宜選択、変更することができる。
エレクトロポレーションのための電気パルスの形状は特に限定されないが、エクスポネンシャルパルスおよびスクエアパルスが例示される。ポアリング時間は、エクスポネンシャルパルスの場合は、電圧が設定電圧（初期電圧）の３７％にまで減少するのに要する時間であり、スクエアパルスの場合は設定パルス長がポアリング時間である。
本発明のエレクトロポレーションに使用するバッファーについては特に制限はなく、様々な種類のバッファーを使用することができる。バッファーの例としては、塩類を含む水溶液、例えばＰＢＳ（phosphate buffered saline）など、糖類を含む水溶液、細胞培養用培地などが挙げられるが、これらに限定されない。市販のエレクトロポレーション用のバッファーを用いてもよい。本発明のバッファーとして、好ましくはＰＢＳ、より好ましくはイーグル最小必須培地またはその改変培地、さらに好ましくはＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ等の培地は、無機塩類だけでなく、アミノ酸やビタミンといった細胞内に存在する数多くの有機物を含有しており、これらの成分が細胞毒性の低減およびエレクトロポレーション効率の向上に寄与すると考えられる。
バッファーの導電率および浸透圧は、エレクトロポレーションによる細胞への物質導入効率に影響する。本発明のエレクトロポレーションにおいて、バッファーの導電率は、細胞の種類やバッファーの組成などの条件にもよるが、通常は、約０．１Ｓ／ｍ～約４．０Ｓ／ｍ、好ましくは約０．３Ｓ／ｍ～約３．０Ｓ／ｍ、より好ましくは約０．６Ｓ／ｍ～約２．０Ｓ／ｍである。また本発明において、バッファーの浸透圧は、細胞の種類やバッファーの組成などの条件にもよるが、通常は、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。バッファーの導電率は、バッファー中の電解質の濃度を変化させることによって調節することができる。例えば、必要に応じて細胞培養用培地を希釈または濃縮することによって、バッファーの導電率を調節することができる。バッファーの浸透圧は、バッファー中の塩類や糖類の濃度を変化させることによって調節することができる。これらの手法は公知である。
バッファー中の細胞に導入されるタンパク質の濃度は、通常は、約０．０１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約０．１μＭ～約１００μＭ、より好ましくは約０．５μＭ～約１００μＭである。タンパク質の濃度は１００μＭ以上であってもよい。タンパク質の濃度が高いほど、核内に導入されるタンパク質は増加するが、タンパク質の種類や溶解度、タンパク溶液の粘性などを考慮する必要がある。当業者は、使用するタンパク質、植物細胞、バッファー等に応じて適切なタンパク質濃度を選択することができる。
したがって、本発明の上記態様の１つの具体例において、
ポアリング電圧が約１２０Ｖ／ｃｍ～約１２００Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約１ｍｓ～約１００ｍｓ、
バッファーの導電率が約０．１Ｓ／ｍ～約４．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．１μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる。かかる条件下において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を効率良く導入することができる。
ポアリング電圧が約１２０Ｖ／ｃｍ～約１２００Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約１ｍｓ～約１００ｍｓ、
バッファーの導電率が約０．１Ｓ／ｍ～約４．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．１μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる。かかる条件下において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を効率良く導入することができる。
本発明の上記態様の好ましい具体例において、下記の条件下：
ポアリング電圧が約３００Ｖ／ｃｍ～約７５０Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約２ｍｓ～約７５ｍｓ、
バッファーの導電率が約０．３Ｓ／ｍ～約３．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる。
ポアリング電圧が約３００Ｖ／ｃｍ～約７５０Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約２ｍｓ～約７５ｍｓ、
バッファーの導電率が約０．３Ｓ／ｍ～約３．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる。
エレクトロポレーションによる細胞への物質導入効率において、ポアリング電圧とポアリング時間は相関があり、両者の積は、約２５００ｍｓ・Ｖ～約２５０００ｍｓ・Ｖであることが好ましい。
本発明の上記態様の特に好ましい具体例において、下記の条件下：
ポアリング電圧とポアリング時間の積が約２５００ｍｓ・Ｖ～約２５０００ｍｓ・Ｖ、
バッファーの導電率が約０．６Ｓ／ｍ～約２．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約１μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる。
ポアリング電圧とポアリング時間の積が約２５００ｍｓ・Ｖ～約２５０００ｍｓ・Ｖ、
バッファーの導電率が約０．６Ｓ／ｍ～約２．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約１μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる。
かかる条件下において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質をさらに効率良く導入することができる。
本発明のエレクトロポレーションを用いる上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変用酵素を導入してもよい。したがって、本発明のさらなる態様において、上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変酵素を導入することを特徴とする、ゲノム改変方法が提供される。例えば、上記方法を用いて、Ｃｒｅタンパク質等のゲノム改変酵素をタンパク質として細胞壁を有する植物細胞の核内に導入することにより、ゲノム改変を行うことができる。このようなゲノム改変方法を用いて、Ｃｒｅタンパク質を植物細胞に導入することにより、ｌｏｘＰ間に位置する部位を除去してもよい。
本発明のエレクトロポレーションを用いる上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集用酵素を導入してもよい。したがって、本発明のさらなる態様において、上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集酵素を導入することを特徴とする、ゲノム編集方法が提供される。ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して、所望の標的遺伝子を改変する技術である。ゲノム編集用酵素（ヌクレアーゼ）としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などが多く使用されている。本発明によれば、ゲノム編集用酵素をタンパク質として植物細胞の核内に導入できるので、人工ヌクレアーゼを長期間発現させることによる副作用の問題がない。
本発明は、もう１つの態様において、プロテイントランスダクションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法を提供する。
プロテイントランスダクションは、特殊な装置や試薬を用いることなく、自発的にタンパク質が細胞内に取り込まれる現象を利用したものである。プロテイントランスダクションは、哺乳動物細胞ではいくつかの報告例が存在する。今回、本発明者らによって、特定の定条件下でプロテイントランスダクションを行うことにより、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入できることが初めて明らかにされた。
本発明において、プロテイントランスダクションによる細胞壁を有する植物細胞核内へのタンパク質の導入は、細胞を含むバッファーに導入すべきタンパク質を添加してから一定時間後に、細胞を取り出して培養することにより行うことができる。例えば、植物細胞の培養物に一定濃度のタンパク質を添加し、一定時間静置後に細胞を洗浄し、再び培養することにより、タンパク質の導入を行うことができる。
本発明のこの態様の方法により導入されるタンパク質はいずれのタンパク質であってもよい。タンパク質の種類やサイズ等に制限はない。
本発明におけるプロテイントランスダクションの条件について以下に説明する。プロテイントランスダクションに使用するバッファーについては特に制限はなく、様々な種類のバッファーを使用することができる。バッファーの例としては、塩類を含む水溶液、例えばＰＢＳ（phosphate buffered saline）など、糖類を含む水溶液、細胞培養用培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
バッファーの浸透圧はプロテイントランスダクションによる細胞への物質導入効率に影響する。本発明のプロテイントランスダクションにおいて、バッファーの浸透圧は、細胞の種類やバッファーの組成などの条件にもよるが通常は、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。バッファーの導電率は、バッファー中の電解質の濃度を変化させることによって調節することができる。例えば、必要に応じて細胞培養用培地を希釈または濃縮することによって、バッファーの導電率を調節することができる。バッファーの浸透圧は、バッファー中の塩類や糖類の濃度を変化させることによって調節することができる。これらの手法は公知である。
本発明のプロテイントランスダクションにおいて、タンパク質の濃度は、通常、約０．１μＭ～約５００μＭ、好ましくは約０．２μＭ～約２００μＭ、より好ましくは約０．５μＭ～約１００μＭである。タンパク質の濃度が高いほど、核内に導入されるタンパク質は増加するが、タンパク質の種類や溶解度、タンパク質を溶解したバッファーの浸透圧や粘性などを考慮する必要がある。当業者は、使用するタンパク質、植物細胞、バッファー等に応じて適切なタンパク質濃度を選択することができる。
したがって、本発明の上記態様の１つの具体例において、下記の条件下：
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．２μＭ～約２００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる。かかる条件下において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を効率良く導入することができる。
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．２μＭ～約２００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる。かかる条件下において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を効率良く導入することができる。
本発明の上記態様の好ましい具体例において、下記の条件下：
バッファーの浸透圧が約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．２μＭ～約２００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる。
バッファーの浸透圧が約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．２μＭ～約２００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる。
本発明の上記態様の特に好ましい具体例において、下記の条件下：
バッファーの浸透圧が約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる。
バッファーの浸透圧が約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる。
かかる条件下において、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質をさらに効率良く導入することができる。
本発明のプロテイントランスダクションを用いる上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変用酵素を導入してもよい。したがって、本発明のさらなる態様において、上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変酵素を導入することを特徴とする、ゲノム改変方法が提供される。例えば、上記方法を用いて、Ｃｒｅタンパク質等のゲノム改変酵素をタンパク質として細胞壁を有する植物細胞の核内に導入することにより、ゲノム改変を行うことができる。このようなゲノム改変方法を用いて、Ｃｒｅタンパク質を植物細胞に導入することにより、ｌｏｘＰ間に位置する部位を除去してもよい。
本発明のプロテイントランスダクションを用いる上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集用酵素を導入してもよい。したがって、本発明のさらなる態様において、上記方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集酵素を導入することを特徴とする、ゲノム編集方法が提供される。ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して、所望の標的遺伝子を改変する技術である。ゲノム編集用酵素（ヌクレアーゼ）としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などが多く使用されている。本発明によれば、ゲノム編集用酵素をタンパク質として直接植物細胞の核内に導入できるので、人工ヌクレアーゼを長期間発現させることによる副作用の問題がない。
本発明における細胞壁を有する植物細胞の核内へのタンパク質導入を調べるために、本発明者らは、酵素活性を有するタンパク質を植物細胞に導入し、核内でのみ発揮する酵素活性を観測する手法を開発した。具体的には、酵素タンパク質としてＣｒｅリコンビナーゼを選択し、核内でのみ発揮する酵素活性としてＤＮＡ組換え反応を利用することとした。植物の核ゲノムＤＮＡ中にｌｏｘＰ配列を２ヶ所挿入し、Ｃｒｅリコンビナーゼによって組換え反応が生じると、レポーター遺伝子が発現する植物細胞株を樹立した。この細胞株を用いて、タンパク質を種々の方法で導入した場合に、レポーター遺伝子の発現量により、その導入効率を検証した。上記手法ではＣｒｅリコンビナーゼを用いて検証したが、このタンパク質に限定するものではなく、例えばゲノム編集酵素などを用いてもよい。
核内へのタンパク質導入を証明する手法としては、（１）蛍光ラベルしたタンパク質を植物細胞に何らかの手法で導入し、その蛍光を顕微鏡等で観測する手法、および（２）酵素活性を有するタンパク質を植物細胞に何らかの手法で導入し、その酵素活性を直接観測する手法も考えられる。しかし、いずれも不十分と考えられる。上記（１）の手法が不十分である理由は、（ｉ）植物細胞内には葉緑体などのオルガネラや蛍光性の生体分子が存在しているため、バックグラウンドの蛍光と区別することが困難であるため、および（ｉｉ）植物細胞内にはプロテアーゼが存在することから、目的タンパク質と蛍光ラベルとが切り離された結果、蛍光シグナルが必ずしも目的タンパク質の局在を示しているわけではないためである。上記（２）の手法が不十分である理由は、植物細胞には種々のオルガネラ、細胞膜もしくは細胞の間隙が存在するので、導入された酵素タンパク質がこうした核内以外の場所でも酵素反応を発揮する場合、核内での導入を立証できないためである。本発明者らが開発した上記手法には、手法（１）、（２）にあるような欠点がない。
したがって、本発明は、さらなる態様において、核ゲノムＤＮＡ中に、外部から導入されたタンパク質と特異的に反応する部位を有する植物細胞株を用いて、該タンパク質の核内への導入を調べる方法を提供する。上記特異的反応が生じた場合に特定のタンパク質が発現し、該発現を外部から検出できるような機構を核ゲノムＤＮＡ中に設けておいてもよい。上記方法において、外部から導入されるタンパク質の例として、Ｃｒｅリコンビナーゼなどのゲノム改変酵素、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。外部から導入されるタンパク質は融合タンパク質であってもよく、例えばＣｒｅリコンビナーゼなどのゲノム改変酵素と別のタンパク質との融合タンパク質、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集酵素と別のタンパク質との融合タンパク質などであってもよい。
上記態様の１具体例として、Ｃｒｅリコンビナーゼと被験タンパク質との融合タンパク質を上記植物細胞株に導入し、レポーター遺伝子の発現を調べることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内への被験タンパク質の導入を調べる方法がある。
また、上記方法に使用する植物細胞株も本発明により提供される。その１具体例として、核ゲノムＤＮＡ中にｌｏｘＰ配列が挿入されており、Ｃｒｅリコンビナーゼによって核内で組換え反応が生じた場合にレポーター遺伝子が発現する、細胞壁を有する植物細胞株がある。
本明細書中の用語は、特に断らない限り、生化学、生物学、植物学等の分野において通常に理解されている意味に解される。以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
［実施例１］
Ａ．実験方法および材料
（１）Ｃｒｅタンパク質の調製
実験に使用した試薬は特に記載のない限り、富士フィルム和光純薬（日本、大阪）から購入した。エレクトロポレーションに用いるＣｒｅタンパク質は、６アミノ酸長のヒスチジンタグ及びシミアンウイルス４０由来の核局在化シグナルをＮ末端に付加したＣｒｅ遺伝子をコードするプラスミドｐＥＴ－ＨＮＣｒｅを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、発現させることで作製した。以下に大腸菌を用いた発現、及びタンパク質精製の詳細な手順を示す。形質転換した大腸菌を３７℃で３時間振盪培養した後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、タンパク質の発現を誘導した。さらに２．５時間振盪培養した後、大腸菌を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化ベンジルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ８．０）を用いて溶解した。続いてニッケルＮＴＡカラムにＣｒｅタンパク質を吸着させ、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて夾雑物を除いた。Ｃｒｅタンパク質の溶出は溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて行った。溶出したＣｒｅタンパク質はゲルろ過クロマトグラフィーＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ ＨＲ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ合衆国、イリノイ）及び緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ７．４）を用いて精製し、液体窒素を用いて瞬時に凍結した後、－８０℃で保存した。エレクトロポレーションに使用する際にはＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ グルコース）を用いて透析した。
Ａ．実験方法および材料
（１）Ｃｒｅタンパク質の調製
実験に使用した試薬は特に記載のない限り、富士フィルム和光純薬（日本、大阪）から購入した。エレクトロポレーションに用いるＣｒｅタンパク質は、６アミノ酸長のヒスチジンタグ及びシミアンウイルス４０由来の核局在化シグナルをＮ末端に付加したＣｒｅ遺伝子をコードするプラスミドｐＥＴ－ＨＮＣｒｅを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、発現させることで作製した。以下に大腸菌を用いた発現、及びタンパク質精製の詳細な手順を示す。形質転換した大腸菌を３７℃で３時間振盪培養した後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、タンパク質の発現を誘導した。さらに２．５時間振盪培養した後、大腸菌を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化ベンジルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ８．０）を用いて溶解した。続いてニッケルＮＴＡカラムにＣｒｅタンパク質を吸着させ、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて夾雑物を除いた。Ｃｒｅタンパク質の溶出は溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて行った。溶出したＣｒｅタンパク質はゲルろ過クロマトグラフィーＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ ＨＲ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ合衆国、イリノイ）及び緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ７．４）を用いて精製し、液体窒素を用いて瞬時に凍結した後、－８０℃で保存した。エレクトロポレーションに使用する際にはＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ グルコース）を用いて透析した。
（２）プラスミドの作製
ｐＲＩ２０１（タカラバイオ、日本、滋賀）からプライマー（ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧ（配列番号：１）及びＴＣＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＡ（配列番号：２））、ならびにＰＣＲ法を用いてＮＯＳプロモーターを増幅し、生成されたＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで部分的に切断処理したｐＣａｍｂｉａ－１３０５．２（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アメリカ、オレゴン）にＩｎＦｕｓｉｏｎ（タカラバイオ）を用いてクローニングし、ｐＣａｍｂｉａＮ－ＧＵＳとした。さらにｐｃＤＮＡＦＲＴｘＥ２ＣｘｍＥｍをテンプレートとし、プライマー（ＧＧＡＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＴＣＡＣＡＣＡＡＡＡＣ（配列番号：３）及びＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡ（配列番号：４））を用いてＰＣＲ法で２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたＧＦＰ断片を増幅し、ＮｃｏＩで切断処理をしたｐＣａｍｂｉａＮ－ＧＵＳにＩｎＦｕｓｉｏｎ（タカラバイオ）を用いてクローニングし、ｐＣａｍｂｉａＮ－ｘＧｘＧＵＳとした。
ｐＲＩ２０１（タカラバイオ、日本、滋賀）からプライマー（ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧ（配列番号：１）及びＴＣＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＡ（配列番号：２））、ならびにＰＣＲ法を用いてＮＯＳプロモーターを増幅し、生成されたＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで部分的に切断処理したｐＣａｍｂｉａ－１３０５．２（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アメリカ、オレゴン）にＩｎＦｕｓｉｏｎ（タカラバイオ）を用いてクローニングし、ｐＣａｍｂｉａＮ－ＧＵＳとした。さらにｐｃＤＮＡＦＲＴｘＥ２ＣｘｍＥｍをテンプレートとし、プライマー（ＧＧＡＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＴＣＡＣＡＣＡＡＡＡＣ（配列番号：３）及びＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡ（配列番号：４））を用いてＰＣＲ法で２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたＧＦＰ断片を増幅し、ＮｃｏＩで切断処理をしたｐＣａｍｂｉａＮ－ＧＵＳにＩｎＦｕｓｉｏｎ（タカラバイオ）を用いてクローニングし、ｐＣａｍｂｉａＮ－ｘＧｘＧＵＳとした。
（３）細胞培養
理研バイオリソースセンター（日本、茨城）より譲渡されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｔ８７細胞株をＮＴ１培地（３０ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ｘ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｓ、２μＭ ２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＫＯＨを用いてｐＨ５．８に調整済）を用いて２２℃及び光照射下で振盪培養した。細胞を維持するために、１週間に１度１５倍希釈で継代を行った。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＧＶ３１０１株は５０μｇ／ｍＬ リファンピシン及び３０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシンを添加したＬＢ培地（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ、ダルムシュタット）を用いて２８℃で振盪培養した。形質転換は５０μｇ／ｍＬ リファンピシン、３０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ培地（Ｍｅｒｃｋ）中でＴ－ＤＮＡをエレクトロポレーションすることで作製した。Ｔ８７細胞に対する感染実験には、形質転換したＧＶ３１０１細胞を５０μｇ／ｍＬ リファンピシン、３０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ培地（Ｍｅｒｃｋ）中で一晩振盪培養し、Ｂ５培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１ｘ Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｓ、１μＭ １－ナフタレン酢酸）で３回洗浄し、ＯＤ６００値が０．６になるようにＢ５培地で懸濁したものを用いた。
理研バイオリソースセンター（日本、茨城）より譲渡されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｔ８７細胞株をＮＴ１培地（３０ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ｘ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｓ、２μＭ ２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＫＯＨを用いてｐＨ５．８に調整済）を用いて２２℃及び光照射下で振盪培養した。細胞を維持するために、１週間に１度１５倍希釈で継代を行った。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＧＶ３１０１株は５０μｇ／ｍＬ リファンピシン及び３０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシンを添加したＬＢ培地（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ、ダルムシュタット）を用いて２８℃で振盪培養した。形質転換は５０μｇ／ｍＬ リファンピシン、３０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ培地（Ｍｅｒｃｋ）中でＴ－ＤＮＡをエレクトロポレーションすることで作製した。Ｔ８７細胞に対する感染実験には、形質転換したＧＶ３１０１細胞を５０μｇ／ｍＬ リファンピシン、３０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ培地（Ｍｅｒｃｋ）中で一晩振盪培養し、Ｂ５培地（３０ｇ／Ｌ スクロース、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１ｘ Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｓ、１μＭ １－ナフタレン酢酸）で３回洗浄し、ＯＤ６００値が０．６になるようにＢ５培地で懸濁したものを用いた。
（４）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いたＴ８７細胞の形質転換
形質転換を行う２日前からＴ８７細胞をＢ５培地で振盪培養した。充填細胞容積３０μＬのＴ８７細胞に対して、ＯＤ６００値０．６のＧＶ３１０１形質転換体の懸濁液を終濃度２００μＭのアセトシリンゴンとともに感染させた。２日間振盪培養した後、ＧＶ３１０１を除去するためにＴ８７細胞を２００μｇ／ｍＬ セフォタキシムを含むＢ５培地で３回洗浄し、同培地中で３日間振盪培養を続けた。
形質転換を行う２日前からＴ８７細胞をＢ５培地で振盪培養した。充填細胞容積３０μＬのＴ８７細胞に対して、ＯＤ６００値０．６のＧＶ３１０１形質転換体の懸濁液を終濃度２００μＭのアセトシリンゴンとともに感染させた。２日間振盪培養した後、ＧＶ３１０１を除去するためにＴ８７細胞を２００μｇ／ｍＬ セフォタキシムを含むＢ５培地で３回洗浄し、同培地中で３日間振盪培養を続けた。
（５）Ｔ８７レポーター細胞の構築
上述の方法で形質転換を行った後、Ｔ８７細胞を終濃度２００μｇ／ｍＬのセフォタキシム及び２０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＣＩＭ寒天培地（０．６％ 寒天、３０ｇ／Ｌ スクロース、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１ｘ Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｓ、１μＭ １－ナフタレン酢酸、ＫＯＨを用いてｐＨを５．７に調整済）に播種し、２週間培養した。強い緑色蛍光を示す単一コロニーを選択し、終濃度１０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＮＴ１培地に移し、Ｔ８７細胞と同様の条件で振盪培養した。本細胞株をＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞と呼ぶこととした。
上述の方法で形質転換を行った後、Ｔ８７細胞を終濃度２００μｇ／ｍＬのセフォタキシム及び２０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＣＩＭ寒天培地（０．６％ 寒天、３０ｇ／Ｌ スクロース、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１ｘ Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｓ、１μＭ １－ナフタレン酢酸、ＫＯＨを用いてｐＨを５．７に調整済）に播種し、２週間培養した。強い緑色蛍光を示す単一コロニーを選択し、終濃度１０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＮＴ１培地に移し、Ｔ８７細胞と同様の条件で振盪培養した。本細胞株をＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞と呼ぶこととした。
（６）エレクトロポレーション
１－５日前にＮＴ１培地に継代したＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞をエッペンチューブに回収し、エレクトロポレーション用のバッファー（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ）、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＮＴ１培地、またはＢ５培地）を用いて１回洗浄した。氷上にて充填細胞容積２０μＬ分のＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を２００μＬの各図に示した濃度のＣｒｅタンパク質を含むエレクトロポレーション用バッファーで懸濁し、電極間隔が４ｍｍのキュベット電極（ネッパジーン、日本、千葉）に入れた。特に記載のない限り、電圧１５０Ｖ（３７５Ｖ／ｃｍ）、パルス幅１０ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓのポアーリングパルスを５回、電圧２０Ｖ（５０Ｖ／ｃｍ）、パルス幅５０ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓのトランスファーパルスを２０回の条件でエレクトロポレーションを行った。またエレクトロポレーションの装置にはＮＥＰＡ２１ Ｔｙｐｅ ＩＩ（ネッパジーン）を使用した。エレクトロポレーション後すぐに２ｍＬのＮＴ１培地で細胞を回収・洗浄し、再度ＮＴ１培地で懸濁して振盪培養に供した。
１－５日前にＮＴ１培地に継代したＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞をエッペンチューブに回収し、エレクトロポレーション用のバッファー（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ）、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＮＴ１培地、またはＢ５培地）を用いて１回洗浄した。氷上にて充填細胞容積２０μＬ分のＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を２００μＬの各図に示した濃度のＣｒｅタンパク質を含むエレクトロポレーション用バッファーで懸濁し、電極間隔が４ｍｍのキュベット電極（ネッパジーン、日本、千葉）に入れた。特に記載のない限り、電圧１５０Ｖ（３７５Ｖ／ｃｍ）、パルス幅１０ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓのポアーリングパルスを５回、電圧２０Ｖ（５０Ｖ／ｃｍ）、パルス幅５０ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓのトランスファーパルスを２０回の条件でエレクトロポレーションを行った。またエレクトロポレーションの装置にはＮＥＰＡ２１ Ｔｙｐｅ ＩＩ（ネッパジーン）を使用した。エレクトロポレーション後すぐに２ｍＬのＮＴ１培地で細胞を回収・洗浄し、再度ＮＴ１培地で懸濁して振盪培養に供した。
（７）プロトプラストの作製
Ｔ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を４００ｍＭ マンニトールで洗浄し、プロトプラスト化酵素溶液（２０ｍＭ ＭＥＳ、４００ｍＭ マンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５％（ｗ／ｖ）Ｏｎｏｚｕｋａ ＲＳ（Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ドイツ、ハイデルベルク）、０．２５％（ｗ／ｖ）マセロザイム Ｒ－１０（ヤクルト薬品工業）ＮａＯＨを用いてｐＨを５．７に調整済）で懸濁した。本細胞懸濁液２２℃、暗所で４時間振盪培養した後、半容量の２００ｍＭ ＣａＣｌ２を添加することで酵素反応を停止させ、プロトプラストを回収した。
Ｔ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を４００ｍＭ マンニトールで洗浄し、プロトプラスト化酵素溶液（２０ｍＭ ＭＥＳ、４００ｍＭ マンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５％（ｗ／ｖ）Ｏｎｏｚｕｋａ ＲＳ（Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ドイツ、ハイデルベルク）、０．２５％（ｗ／ｖ）マセロザイム Ｒ－１０（ヤクルト薬品工業）ＮａＯＨを用いてｐＨを５．７に調整済）で懸濁した。本細胞懸濁液２２℃、暗所で４時間振盪培養した後、半容量の２００ｍＭ ＣａＣｌ２を添加することで酵素反応を停止させ、プロトプラストを回収した。
（８）エバンスブルー染色
生細胞の細胞膜は透過せず、死細胞の膜のみを透過する性質を持つエバンスブルーを用いて、エレクトロポレーション１時間後に細胞毒性を評価した。細胞を水で１回洗浄した後、０．０５％（ｗ／ｖ）のエバンスブルー染色液を用いて室温で１５分間染色した。染色後水で１回以上洗浄し、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用いてエバンスブルーを抽出した。本抽出液の５９５ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ ＯＮＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定することで、細胞毒性を定量した。
生細胞の細胞膜は透過せず、死細胞の膜のみを透過する性質を持つエバンスブルーを用いて、エレクトロポレーション１時間後に細胞毒性を評価した。細胞を水で１回洗浄した後、０．０５％（ｗ／ｖ）のエバンスブルー染色液を用いて室温で１５分間染色した。染色後水で１回以上洗浄し、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用いてエバンスブルーを抽出した。本抽出液の５９５ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ ＯＮＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定することで、細胞毒性を定量した。
（９）ＧＵＳ染色
ＧＵＳタンパク質の発現を可視化するために、細胞を０．５ｍｇ／ｍＬのＸ－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、イギリス、バークシャー）を含む染色用緩衝液（２０％（ｗ／ｖ）メタノール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．０）に浸漬し、３７℃で３０分間染色した。染色後、上清を７０％（ｗ／ｖ）エタノールに置換することで反応を停止させ、位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本、東京）を用いて染色画像を取得した。
ＧＵＳタンパク質の発現を可視化するために、細胞を０．５ｍｇ／ｍＬのＸ－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、イギリス、バークシャー）を含む染色用緩衝液（２０％（ｗ／ｖ）メタノール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．０）に浸漬し、３７℃で３０分間染色した。染色後、上清を７０％（ｗ／ｖ）エタノールに置換することで反応を停止させ、位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本、東京）を用いて染色画像を取得した。
（１０）蛍光基質を用いたＧＵＳ活性測定
エレクトロポレーション後２日間振盪培養した細胞をＫＯＨでｐＨ７．０に調整したＮＴ１培地で１回洗浄した。充填細胞容積５μＬ分の細胞を終濃度１０μＭの６－クロロ－４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－クルクロニド（ＣＭＵＧ、Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ、イギリス、チェシャ―）を含む１００μＬのＮＴ１培地（ｐＨ７．０）に懸濁し、９６－ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。蛍光強度は３５５ｎｍの光で励起した際の４６０ｎｍの蛍光をＷａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ）を用いて測定した。さらにＧＵＳ活性を標準化するためにエレクトロポレーションに用いた細胞と同量の細胞におけるクロロフィル量の定量を実施した。クロロフィルは充填細胞容積５μＬ分の細胞を５０μＬのＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミドに４℃及び暗条件で６時間浸漬することにより抽出した。本抽出液の６４６ｎｍ及び６６４ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ ＯＮＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定し、先行研究（Porra, R. J. et al., Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 975, 384-394 (1989)）と同様の手法でクロロフィル量を算出した。さらに１分間当たりの蛍光強度の増加量をクロロフィルａ及びｂの重量（μｇ）で割ることで、標準ＧＵＳ活性を算出した。
エレクトロポレーション後２日間振盪培養した細胞をＫＯＨでｐＨ７．０に調整したＮＴ１培地で１回洗浄した。充填細胞容積５μＬ分の細胞を終濃度１０μＭの６－クロロ－４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－クルクロニド（ＣＭＵＧ、Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ、イギリス、チェシャ―）を含む１００μＬのＮＴ１培地（ｐＨ７．０）に懸濁し、９６－ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。蛍光強度は３５５ｎｍの光で励起した際の４６０ｎｍの蛍光をＷａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ）を用いて測定した。さらにＧＵＳ活性を標準化するためにエレクトロポレーションに用いた細胞と同量の細胞におけるクロロフィル量の定量を実施した。クロロフィルは充填細胞容積５μＬ分の細胞を５０μＬのＮ、Ｎ－ジメチルホルムアミドに４℃及び暗条件で６時間浸漬することにより抽出した。本抽出液の６４６ｎｍ及び６６４ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ ＯＮＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定し、先行研究（Porra, R. J. et al., Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 975, 384-394 (1989)）と同様の手法でクロロフィル量を算出した。さらに１分間当たりの蛍光強度の増加量をクロロフィルａ及びｂの重量（μｇ）で割ることで、標準ＧＵＳ活性を算出した。
（１１）ゲノミックＰＣＲ
エレクトロポレーション後２日間振盪培養した細胞をゲノムＤＮＡ抽出液（２５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に浸漬し、９８℃で１０分間処理することでゲノムＤＮＡを抽出した。さらに本溶液に半量の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）を添加し、遠心後上清を採取し、これをゲノムＤＮＡ溶液とした。本ＤＮＡをテンプレートとし、レポーターカセットを標的とするプライマー（ＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣ（配列番号：５）及びＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号：６））及びＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｖｅｒ．３（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した。さらにゲルをＧｅｌＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、アメリカ合衆国、カリフォルニア）で染色した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アメリカ合衆国、カリフォルニア）を用いて撮影した。Ｃｒｅタンパク質による相同組換え効率は下記の計算式を用いて算出した。
エレクトロポレーション後２日間振盪培養した細胞をゲノムＤＮＡ抽出液（２５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に浸漬し、９８℃で１０分間処理することでゲノムＤＮＡを抽出した。さらに本溶液に半量の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）を添加し、遠心後上清を採取し、これをゲノムＤＮＡ溶液とした。本ＤＮＡをテンプレートとし、レポーターカセットを標的とするプライマー（ＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣ（配列番号：５）及びＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＡＧ（配列番号：６））及びＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｖｅｒ．３（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した。さらにゲルをＧｅｌＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、アメリカ合衆国、カリフォルニア）で染色した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、アメリカ合衆国、カリフォルニア）を用いて撮影した。Ｃｒｅタンパク質による相同組換え効率は下記の計算式を用いて算出した。
相同組換え効率（％）＝１００×（ａ／（ａ＋ｂ））
ａ、ｂはそれぞれ、相同組換えされたＤＮＡ増幅産物のバンド強度及び相同組換えされていないＤＮＡ増幅産物のバンド強度を表す。
ａ、ｂはそれぞれ、相同組換えされたＤＮＡ増幅産物のバンド強度及び相同組換えされていないＤＮＡ増幅産物のバンド強度を表す。
（１２）統計解析
全ての測定値は標準誤差付きの平均値を示す。
全ての測定値は標準誤差付きの平均値を示す。
Ｂ．結果
（１）Ｔ８７レポーター細胞の作製
Ｃｒｅリコンビナーゼが細胞内に導入されたかどうかを検証するために、レポーター細胞、Ｔ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を樹立した。本細胞を作製するためにプロモーター、ｌｏｘＰ配列、ＧＦＰ遺伝子、転写終結シグナル、ｌｏｘＰ配列、ＧＵＳ遺伝子を順番にコードするｐＣａｍｂｉａＮ－ｘＧｘＧＵＳを形質転換したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを作製し、Ｔ８７細胞に感染させることで上述のレポーターカセットをゲノムＤＮＡに組み込んだ。Ｃｒｅリコンビナーゼが本細胞株の核内に導入され、２箇所のｌｏｘＰ配列間で相同組換えが起こると、発現するタンパク質がＧＦＰからＧＵＳに切り替わる（図１）。ＧＵＳの発現は青色の染色試薬であるＸ－Ｇｌｕｃや蛍光基質であるＣＭＵＧを用いて容易に可視化・検出することが可能であるため、ＧＵＳタンパク質の検出によりＣｒｅリコンビナーゼの核内への導入及び相同組換え活性を評価することができる。
（１）Ｔ８７レポーター細胞の作製
Ｃｒｅリコンビナーゼが細胞内に導入されたかどうかを検証するために、レポーター細胞、Ｔ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を樹立した。本細胞を作製するためにプロモーター、ｌｏｘＰ配列、ＧＦＰ遺伝子、転写終結シグナル、ｌｏｘＰ配列、ＧＵＳ遺伝子を順番にコードするｐＣａｍｂｉａＮ－ｘＧｘＧＵＳを形質転換したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを作製し、Ｔ８７細胞に感染させることで上述のレポーターカセットをゲノムＤＮＡに組み込んだ。Ｃｒｅリコンビナーゼが本細胞株の核内に導入され、２箇所のｌｏｘＰ配列間で相同組換えが起こると、発現するタンパク質がＧＦＰからＧＵＳに切り替わる（図１）。ＧＵＳの発現は青色の染色試薬であるＸ－Ｇｌｕｃや蛍光基質であるＣＭＵＧを用いて容易に可視化・検出することが可能であるため、ＧＵＳタンパク質の検出によりＣｒｅリコンビナーゼの核内への導入及び相同組換え活性を評価することができる。
（２）エレクトロポレーション法を用いたＴ８７細胞に対するＣｒｅリコンビナーゼの導入
樹立したＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を用いて、細胞壁を有する状態のＴ８７細胞に対してエレクトロポレーション法によるＣｒｅリコンビナーゼの導入を試みた。エレクトロポレーションにはネッパジーン社より販売されているＮＥＰＡ２１ Ｔｙｐｅ ＩＩを使用した。ＰＢＳやＮＴ１培地、Ｂ５培地やＯｐｔｉ－ＭＥＭＩなど様々なバッファーを用いてエレクトロポレーションを行い、１時間後に細胞毒性の評価を、２日後にＧＵＳ活性の評価を行った。その結果、図２に示すように、ＮＴ１培地ないしＢ５培地を用いてエレクトロポレーションした場合には、ほとんどの細胞においてＧＵＳの発現が観察されてなかった。ＰＢＳを用いてエレクトロポレーションした場合にはＮＴ１培地やＢ５培地を用いた場合と比較して多くの細胞がＧＵＳを発現していたが、非常に高い細胞毒性が観察された。一方で驚くべきことに、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩを用いてエレクトロポレーションした場合、細胞毒性がほとんど観察されないにも関わらず、非常に多くの細胞がＧＵＳを発現していた。本実験から、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩを用いてエレクトロポレーションを行うことで、細胞壁を有するＴ８７細胞に対するＣｒｅリコンビナーゼの導入が達成された。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉは無機塩だけでなく、アミノ酸やビタミンといった細胞内に存在する数多くの有機物を含有しており、これらの成分が細胞毒性の低減及びエレクトロポレーション効率の向上に寄与していると考えられる。
樹立したＴ８７－ｘＧｘＧＵＳ細胞を用いて、細胞壁を有する状態のＴ８７細胞に対してエレクトロポレーション法によるＣｒｅリコンビナーゼの導入を試みた。エレクトロポレーションにはネッパジーン社より販売されているＮＥＰＡ２１ Ｔｙｐｅ ＩＩを使用した。ＰＢＳやＮＴ１培地、Ｂ５培地やＯｐｔｉ－ＭＥＭＩなど様々なバッファーを用いてエレクトロポレーションを行い、１時間後に細胞毒性の評価を、２日後にＧＵＳ活性の評価を行った。その結果、図２に示すように、ＮＴ１培地ないしＢ５培地を用いてエレクトロポレーションした場合には、ほとんどの細胞においてＧＵＳの発現が観察されてなかった。ＰＢＳを用いてエレクトロポレーションした場合にはＮＴ１培地やＢ５培地を用いた場合と比較して多くの細胞がＧＵＳを発現していたが、非常に高い細胞毒性が観察された。一方で驚くべきことに、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩを用いてエレクトロポレーションした場合、細胞毒性がほとんど観察されないにも関わらず、非常に多くの細胞がＧＵＳを発現していた。本実験から、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩを用いてエレクトロポレーションを行うことで、細胞壁を有するＴ８７細胞に対するＣｒｅリコンビナーゼの導入が達成された。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉは無機塩だけでなく、アミノ酸やビタミンといった細胞内に存在する数多くの有機物を含有しており、これらの成分が細胞毒性の低減及びエレクトロポレーション効率の向上に寄与していると考えられる。
なお、各培地の導電率（Ｓ／ｍ）及び浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、以下の通りである。
［導電率（Ｓ／ｍ）］
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ：１．１１
ＰＢＳ：１．１８
ＮＴ１：０．５４
Ｂ５：０．３４
［浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）］
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ：２８５
ＰＢＳ：２８１
ＮＴ１：２０３
Ｂ５：１６８
（３）ポアリングパルスの各条件がエレクトロポレーション効率に与える影響
エレクトロポレーションによる外来物質の導入効率は、ポアリングパルスの電気的条件に大きく依存することが知られている。そこでＮＥＰＡ２１ ＴｙｐｅＩＩを用いて、ポアリングパルスの各条件（電圧、パルス幅、パルス数）を変化させたときのエレクトロポレーション効率を評価した。なお、本実験における電圧の１００Ｖは２５０Ｖ／ｃｍに相当し、１５０Ｖは３７５Ｖ／ｃｍに相当し、２００Ｖは５００Ｖ／ｃｍに相当し、２５０Ｖは６２５Ｖ／ｃｍに相当する。本実験ではＣＭＵＧを用いてＧＵＳ活性を評価することで、間接的にエレクトロポレーション効率を評価した。その結果、ポアリングパルスの電圧増加依存的に、ＧＵＳ活性が増大する様子が観察された（図３ａ）。またパルス幅についても同様に、パルス幅の増加依存的にＧＵＳ活性が増大した（図３ｂ）。一方でパルス数を変化させた場合には、パルス数依存的なＧＵＳ活性の変化はほとんど観察されなかった（図３ｃ）。これらの実験結果から、細胞壁を有する植物細胞に対してタンパク質をエレクトロポレーションする場合、ポアリングパルスの電圧及びパルス幅が重要であり、電圧ないしパルス幅、もしくはその両方を増加させることでより多くのタンパク質を導入可能であることが明らかとなった。
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ：１．１１
ＰＢＳ：１．１８
ＮＴ１：０．５４
Ｂ５：０．３４
［浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）］
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ：２８５
ＰＢＳ：２８１
ＮＴ１：２０３
Ｂ５：１６８
（３）ポアリングパルスの各条件がエレクトロポレーション効率に与える影響
エレクトロポレーションによる外来物質の導入効率は、ポアリングパルスの電気的条件に大きく依存することが知られている。そこでＮＥＰＡ２１ ＴｙｐｅＩＩを用いて、ポアリングパルスの各条件（電圧、パルス幅、パルス数）を変化させたときのエレクトロポレーション効率を評価した。なお、本実験における電圧の１００Ｖは２５０Ｖ／ｃｍに相当し、１５０Ｖは３７５Ｖ／ｃｍに相当し、２００Ｖは５００Ｖ／ｃｍに相当し、２５０Ｖは６２５Ｖ／ｃｍに相当する。本実験ではＣＭＵＧを用いてＧＵＳ活性を評価することで、間接的にエレクトロポレーション効率を評価した。その結果、ポアリングパルスの電圧増加依存的に、ＧＵＳ活性が増大する様子が観察された（図３ａ）。またパルス幅についても同様に、パルス幅の増加依存的にＧＵＳ活性が増大した（図３ｂ）。一方でパルス数を変化させた場合には、パルス数依存的なＧＵＳ活性の変化はほとんど観察されなかった（図３ｃ）。これらの実験結果から、細胞壁を有する植物細胞に対してタンパク質をエレクトロポレーションする場合、ポアリングパルスの電圧及びパルス幅が重要であり、電圧ないしパルス幅、もしくはその両方を増加させることでより多くのタンパク質を導入可能であることが明らかとなった。
（４）タンパク質濃度がエレクトロポレーション効率に与える影響
ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質のような外来性の生体材料を細胞内に導入する場合、これらの材料の濃度が非常に重要である。そこで植物細胞に対するタンパク質のエレクトロポレーション系においても、タンパク質の濃度がエレクトロポレーション効率に与える影響を評価した。Ｃｒｅリコンビナーゼの濃度を０．０１μＭから５μＭまで変化させてエレクトロポレーションを行い、２日後にＧＵＳを発現する細胞の割合を評価したところ、図４に示すようにＣｒｅリコンビナーゼの濃度依存的にＧＵＳ発現細胞が増加する様子が観察された。また蛍光測定を用いてＧＵＳ活性を評価したところ、ＧＵＳ染色の結果と同様に、Ｃｒｅリコンビナーゼの濃度依存的にＧＵＳ活性が増大する様子が観察された（図４）。また、Ｃｒｅリコンビナーゼ濃度を０．２μＭから０．５μＭに増やした際に、顕著にＧＵＳ発現が増大した（図４）。これらの実験結果から、タンパク質の濃度は植物細胞に対するタンパク質のエレクトロポレーション系においても非常に重要な要素であり、効率的にタンパク質を導入するためにはタンパク質濃度を０．５μＭ以上にする必要があることが明らかとなった。また、ＨＮＣｒｅでは核局在シグナルがＣｒｅタンパク質に融合されているが、核局在シグナルの無いＨＣｒｅにおいても同様の条件下においてタンパク質が導入されていることを見出した（図４下）。したがって本手法は、植物細胞の核内にタンパク質を導入する手法として有効であることが明らかとなった。
ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質のような外来性の生体材料を細胞内に導入する場合、これらの材料の濃度が非常に重要である。そこで植物細胞に対するタンパク質のエレクトロポレーション系においても、タンパク質の濃度がエレクトロポレーション効率に与える影響を評価した。Ｃｒｅリコンビナーゼの濃度を０．０１μＭから５μＭまで変化させてエレクトロポレーションを行い、２日後にＧＵＳを発現する細胞の割合を評価したところ、図４に示すようにＣｒｅリコンビナーゼの濃度依存的にＧＵＳ発現細胞が増加する様子が観察された。また蛍光測定を用いてＧＵＳ活性を評価したところ、ＧＵＳ染色の結果と同様に、Ｃｒｅリコンビナーゼの濃度依存的にＧＵＳ活性が増大する様子が観察された（図４）。また、Ｃｒｅリコンビナーゼ濃度を０．２μＭから０．５μＭに増やした際に、顕著にＧＵＳ発現が増大した（図４）。これらの実験結果から、タンパク質の濃度は植物細胞に対するタンパク質のエレクトロポレーション系においても非常に重要な要素であり、効率的にタンパク質を導入するためにはタンパク質濃度を０．５μＭ以上にする必要があることが明らかとなった。また、ＨＮＣｒｅでは核局在シグナルがＣｒｅタンパク質に融合されているが、核局在シグナルの無いＨＣｒｅにおいても同様の条件下においてタンパク質が導入されていることを見出した（図４下）。したがって本手法は、植物細胞の核内にタンパク質を導入する手法として有効であることが明らかとなった。
（５）ゲノミックＰＣＲを用いた相同組換え効率の評価
図５に示すように、レポーターカセット中の２箇所のｌｏｘＰ配列を含む領域をＰＣＲで増幅することで、Ｃｒｅリコンビナーゼの相同組換え効率を算出した。その結果、エレクトロポレーション法を用いて５μＭのＣｒｅリコンビナーゼを導入することで、全レポーターカセットのうち７９．４％で相同組換えが起こっていることが明らかとなった。本実験結果から、少なくとも７９．４％の細胞にＣｒｅリコンビナーゼが導入されており、本法は細胞壁を有する植物細胞に対してタンパク質を導入する上で非常に効率的な手法であることが示された。
図５に示すように、レポーターカセット中の２箇所のｌｏｘＰ配列を含む領域をＰＣＲで増幅することで、Ｃｒｅリコンビナーゼの相同組換え効率を算出した。その結果、エレクトロポレーション法を用いて５μＭのＣｒｅリコンビナーゼを導入することで、全レポーターカセットのうち７９．４％で相同組換えが起こっていることが明らかとなった。本実験結果から、少なくとも７９．４％の細胞にＣｒｅリコンビナーゼが導入されており、本法は細胞壁を有する植物細胞に対してタンパク質を導入する上で非常に効率的な手法であることが示された。
（６）ゲノム編集の検証
さらに、Ｃａｓ９タンパク質が核内に送達され、ゲノム編集できるかどうかを検証した。シロイヌナズナ内在性のＡＤＨ１遺伝子に対して、２種類のガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質を混合した後、上記と同様にエレクトロポレーションした。２種類のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質が同時にゲノムＤＮＡを切断すると、１９４ｂｐの欠失が生じる。エレクトロポレーション後のゲノムＤＮＡを回収して、ＰＣＲを行なったところ、期待通りの欠失が生じていることが確認された（図６）。
さらに、Ｃａｓ９タンパク質が核内に送達され、ゲノム編集できるかどうかを検証した。シロイヌナズナ内在性のＡＤＨ１遺伝子に対して、２種類のガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質を混合した後、上記と同様にエレクトロポレーションした。２種類のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質が同時にゲノムＤＮＡを切断すると、１９４ｂｐの欠失が生じる。エレクトロポレーション後のゲノムＤＮＡを回収して、ＰＣＲを行なったところ、期待通りの欠失が生じていることが確認された（図６）。
［実施例２］
上記の実施例では、エレクトロポレーションにより、細胞膜や細胞壁に物理的な細孔をあけることによって導入を試みた。本実施例では、特殊な装置や試薬を用いることなく、タンパク質をプロテイントランスダクションにより核内に直接導入した実験について述べる。
上記の実施例では、エレクトロポレーションにより、細胞膜や細胞壁に物理的な細孔をあけることによって導入を試みた。本実施例では、特殊な装置や試薬を用いることなく、タンパク質をプロテイントランスダクションにより核内に直接導入した実験について述べる。
タンパク質を直接導入するため、細胞を含む培養培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）にタンパク質を特定の濃度（０．１～１０μＭ）で添加し、一定時間静置後に細胞を洗浄し、再び培養を開始した（２日間）。結果を図７に示す。タンパク質濃度が０．２μＭ以上において特に顕著なタンパク質導入が認められた。タンパク質を作用させる時間は、５分以上あれば良く、２時間程度でも問題なかった。これは、植物の核内にタンパク質を直接導入した、世界初の例である。
［実施例３］
本発明の方法（エレクトロポレーション、プロテイントランスダクション）および従来の方法（アグロバクテリウムによる感染）を比較した。エレクトロポレーションは実施例１に記載の方法に準じて行った。プロテイントランスダクションは実施例２に記載の方法に準じて行った。アグロバクテリウムによる感染は常法により行った。
本発明の方法（エレクトロポレーション、プロテイントランスダクション）および従来の方法（アグロバクテリウムによる感染）を比較した。エレクトロポレーションは実施例１に記載の方法に準じて行った。プロテイントランスダクションは実施例２に記載の方法に準じて行った。アグロバクテリウムによる感染は常法により行った。
結果を図８に示す。本発明の方法（エレクトロポレーション（図中、Ｅｌｅｃ．と表示）、プロテイントランスダクション（図中、ＤＩＶＥと表示））では組換え後の産物が多かったが、従来の方法（アグロバクテリウムによる感染（図中、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎと表示））では組換え後の産物が少なく、陰性対照（ＮＣ）と殆ど同じレベルであった。これらの結果から、本発明の方法は、短時間で植物細胞の核内にタンパク質を効率良く導入できることがわかった。
［実施例４］
（１）ＺＦ－ＮＤ１およびＺＦ－ＦｏｋＩの発現ベクターの構築
Ｎ末端にＨｉｓタグを含むｐＥＴ－ＭＣＳプラスミドのＸｈｏＩサイトおよびＳａｌＩサイトを切断し、ＺＦ－ＮＤ１断片を挿入した。ＺＦ－ＮＤ１断片には、各局在シグナルＮＬＳ、Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ（以下ＺＦと省略）、およびヌクレアーゼドメインＮＤ１を含む。ＺＦとしては、２種類の配列を認識するドメインを用いた。一つはＺＦＡ３６であり、１２塩基対のＤＮＡ配列ＧＡＡＧＣＴＧＧＴを認識する。もう一つはＺＦＬ１であり、１２塩基対のＤＮＡ配列ＣＡＡＧＧＡＧＡＣを認識する。したがって、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１、およびＺＦ（ＺＦＬ１）－ＮＤ１を発現するプラスミドとして、ｐＥＴ－ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）ＮＤ１、およびｐＥＴ－ＺＦ（ＺＦＬ１）ＮＤ１をそれぞれ作成した。
（１）ＺＦ－ＮＤ１およびＺＦ－ＦｏｋＩの発現ベクターの構築
Ｎ末端にＨｉｓタグを含むｐＥＴ－ＭＣＳプラスミドのＸｈｏＩサイトおよびＳａｌＩサイトを切断し、ＺＦ－ＮＤ１断片を挿入した。ＺＦ－ＮＤ１断片には、各局在シグナルＮＬＳ、Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ（以下ＺＦと省略）、およびヌクレアーゼドメインＮＤ１を含む。ＺＦとしては、２種類の配列を認識するドメインを用いた。一つはＺＦＡ３６であり、１２塩基対のＤＮＡ配列ＧＡＡＧＣＴＧＧＴを認識する。もう一つはＺＦＬ１であり、１２塩基対のＤＮＡ配列ＣＡＡＧＧＡＧＡＣを認識する。したがって、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１、およびＺＦ（ＺＦＬ１）－ＮＤ１を発現するプラスミドとして、ｐＥＴ－ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）ＮＤ１、およびｐＥＴ－ＺＦ（ＺＦＬ１）ＮＤ１をそれぞれ作成した。
上記プラスミドを基として、制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（以下ＦｏｋＩと省略）をＮＤ１の代わりに挿入したプラスミドである、ｐＥＴ－ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩおよびｐＥＴ－ＺＦ（ＺＦＬ１）－ＦｏｋＩをそれぞれ作成した。ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１、ＺＦ（ＺＦＬ１）－ＮＤ１、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩ、およびＺＦ（ＺＦＬ１）－ＦｏｋＩのアミノ酸配列を配列番号７～１０に示す。
（２）大腸菌におけるＺＦ－ＮＤ１タンパク質の発現および精製
ＺＦ－ＮＤ１またはＺＦ－ＦｏｋＩを発現するｐＥＴプラスミド、並びにｐＲＡＲＥ２（ストラタジーン社）を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地にて培養した。形質転換した大腸菌を３７℃でＯＤ（６００ｎｍにおける吸光度）が０．６になるまで培養した後、１８℃にて１時間培養した。イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、タンパク質の発現を誘導した。さらに１８℃にて１７時間振盪培養した後、大腸菌を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化ベンジルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ８．０）を用いて溶解した。続いてニッケルＮＴＡカラムにタンパク質を吸着させ、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて夾雑物を除いた。タンパク質の溶出は溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて行った。溶出したタンパク質の一部は、タンパク質収量の解析のために、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解させた。溶出したタンパク質はゲルろ過クロマトグラフィーＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ ＨＲ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ合衆国、イリノイ）及び緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、ｐＨ７．４）を用いて精製し、液体窒素を用いて瞬時に凍結した後、－８０℃で保存した。タンパク質収量の解析のため、イミダゾール溶出したタンパク質画分および、最終精製されたタンパク質をＳＤＳサンプルバッファーに溶解させてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより電気泳動を行なった。電気泳動の際には、既知濃度のＢＳＡタンパク質を別レーンに泳動し、ＰＡＧＥ後のゲルをクマシー染色して目的のタンパク質分子量のバンドをＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋により定量化し、タンパク質の分子量からタンパク質の収量を解析した。
ＺＦ－ＮＤ１またはＺＦ－ＦｏｋＩを発現するｐＥＴプラスミド、並びにｐＲＡＲＥ２（ストラタジーン社）を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地にて培養した。形質転換した大腸菌を３７℃でＯＤ（６００ｎｍにおける吸光度）が０．６になるまで培養した後、１８℃にて１時間培養した。イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、タンパク質の発現を誘導した。さらに１８℃にて１７時間振盪培養した後、大腸菌を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化ベンジルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ８．０）を用いて溶解した。続いてニッケルＮＴＡカラムにタンパク質を吸着させ、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて夾雑物を除いた。タンパク質の溶出は溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて行った。溶出したタンパク質の一部は、タンパク質収量の解析のために、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解させた。溶出したタンパク質はゲルろ過クロマトグラフィーＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ ＨＲ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ合衆国、イリノイ）及び緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、ｐＨ７．４）を用いて精製し、液体窒素を用いて瞬時に凍結した後、－８０℃で保存した。タンパク質収量の解析のため、イミダゾール溶出したタンパク質画分および、最終精製されたタンパク質をＳＤＳサンプルバッファーに溶解させてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより電気泳動を行なった。電気泳動の際には、既知濃度のＢＳＡタンパク質を別レーンに泳動し、ＰＡＧＥ後のゲルをクマシー染色して目的のタンパク質分子量のバンドをＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋により定量化し、タンパク質の分子量からタンパク質の収量を解析した。
［実施例５］
（１）レポーター細胞の構築
ＺＦ－ＮＤ１またはＺＦ－ＦｏｋＩの活性を評価するため、ＤＮＡ切断後のＳＳＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ： 一本鎖アニーリング）が誘導された場合に、完全長２．１ｋｂのＧＵＳ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ： グルクロニダーゼ）遺伝子が発現するレポーター細胞を構築した。具体的には、ＧＵＳ遺伝子の上流から１．８ｋｂ、ＺＦＡ３６の認識配列（ＧＡＡＧＣＴＧＧＴ）、およびＧＵＳ遺伝子の下流から０．８ｋｂをｐＣＡＭＢＩＡ１３０５．２（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ社）へ導入した。上記ＧＵＳ遺伝子の上流から１．８ｋｂ、およびＧＵＳ遺伝子の下流から０．８ｋｂは、５００ｂｐを共通配列（オーバーラップ領域）として有する。このベクターをアグロバクテリウムを介して、シロイヌナズナＴ８７培養細胞株（理化学研究所）へ形質転換し、樹立した細胞株をＴ８７－ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）とした。ＧＵＳの発現は青色の染色試薬であるＸ－Ｇｌｕｃを用いて容易に可視化・検出することが可能であるため、ＧＵＳタンパク質の検出によりＺＦ－ＮＤ１またはＺＦ－ＦｏｋＩの核内への導入及びＳＳＡ誘導活性を評価することができる。
（１）レポーター細胞の構築
ＺＦ－ＮＤ１またはＺＦ－ＦｏｋＩの活性を評価するため、ＤＮＡ切断後のＳＳＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ： 一本鎖アニーリング）が誘導された場合に、完全長２．１ｋｂのＧＵＳ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ： グルクロニダーゼ）遺伝子が発現するレポーター細胞を構築した。具体的には、ＧＵＳ遺伝子の上流から１．８ｋｂ、ＺＦＡ３６の認識配列（ＧＡＡＧＣＴＧＧＴ）、およびＧＵＳ遺伝子の下流から０．８ｋｂをｐＣＡＭＢＩＡ１３０５．２（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ社）へ導入した。上記ＧＵＳ遺伝子の上流から１．８ｋｂ、およびＧＵＳ遺伝子の下流から０．８ｋｂは、５００ｂｐを共通配列（オーバーラップ領域）として有する。このベクターをアグロバクテリウムを介して、シロイヌナズナＴ８７培養細胞株（理化学研究所）へ形質転換し、樹立した細胞株をＴ８７－ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）とした。ＧＵＳの発現は青色の染色試薬であるＸ－Ｇｌｕｃを用いて容易に可視化・検出することが可能であるため、ＧＵＳタンパク質の検出によりＺＦ－ＮＤ１またはＺＦ－ＦｏｋＩの核内への導入及びＳＳＡ誘導活性を評価することができる。
（２）エレクトロポレーション法による導入
実施例４において作成したタンパク質をエレクトロポレーション法により導入した。樹立したＴ８７－ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）細胞を用いて、細胞壁を有する状態のＴ８７細胞に対して、エレクトロポレーション法により、最終濃度０．１－２μＭのＺＦ－ＮＤ１およびＺＦ－ＦｏｋＩの導入を試みた。エレクトロポレーションにはネッパジーン社より販売されているＮＥＰＡ２１ Ｔｙｐｅ ＩＩを使用し、実施例１．Ａ．（６）の条件で実施した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩバッファーを用いてエレクトロポレーションを行い、２日後にＧＵＳ活性の評価を行った。その結果、図９に示すように、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩを用いてエレクトロポレーションした場合、非常に多くの細胞がＧＵＳを発現していた。
実施例４において作成したタンパク質をエレクトロポレーション法により導入した。樹立したＴ８７－ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）細胞を用いて、細胞壁を有する状態のＴ８７細胞に対して、エレクトロポレーション法により、最終濃度０．１－２μＭのＺＦ－ＮＤ１およびＺＦ－ＦｏｋＩの導入を試みた。エレクトロポレーションにはネッパジーン社より販売されているＮＥＰＡ２１ Ｔｙｐｅ ＩＩを使用し、実施例１．Ａ．（６）の条件で実施した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩバッファーを用いてエレクトロポレーションを行い、２日後にＧＵＳ活性の評価を行った。その結果、図９に示すように、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩを用いてエレクトロポレーションした場合、非常に多くの細胞がＧＵＳを発現していた。
（３）プロテイントランスダクション法による導入
実施例４で作成したタンパク質を用いて、プロテイントランスダクション法による導入を試みた。すなわち細胞壁を有するＴ８７－ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）を含む培養培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）に対して、最終濃度０．１－２μＭのＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１タンパク質もしくはＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩタンパク質を添加した後、１時間後に培養培地で洗浄し、３日間の培養を行なった。タンパク質を添加時には、プロテアーゼ処理等の生化学的な処理や、エレクトロポレーション等の物理化学的な処理は、まったく行っていない。したがって、タンパク質の自発的な取り込みを期待したものである。その結果、図１０に示すように、エレクトロポレーション法と比較して少ない割合ではあるが、プロテイントランスダクション法によりＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１タンパク質およびＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩタンパク質が取り込まれて、ゲノム編集可能であることが明らかとなった。プロテイントランスダクション法を用いた場合、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１の活性はＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩを比較して、同等もしくはそれ以上の活性であった。
実施例４で作成したタンパク質を用いて、プロテイントランスダクション法による導入を試みた。すなわち細胞壁を有するＴ８７－ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）を含む培養培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）に対して、最終濃度０．１－２μＭのＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１タンパク質もしくはＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩタンパク質を添加した後、１時間後に培養培地で洗浄し、３日間の培養を行なった。タンパク質を添加時には、プロテアーゼ処理等の生化学的な処理や、エレクトロポレーション等の物理化学的な処理は、まったく行っていない。したがって、タンパク質の自発的な取り込みを期待したものである。その結果、図１０に示すように、エレクトロポレーション法と比較して少ない割合ではあるが、プロテイントランスダクション法によりＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１タンパク質およびＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩタンパク質が取り込まれて、ゲノム編集可能であることが明らかとなった。プロテイントランスダクション法を用いた場合、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１の活性はＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩを比較して、同等もしくはそれ以上の活性であった。
［実施例６］
（１）レポーター植物個体の構築
野生型のシロイヌナズナを開花状態まで栽培し、ｐＣａｍｂｉａＮ－ｘＧｘＧＵＳを保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＶ３１０１株の培養液を用いて、フローラルディップ法により形質転換を行った。形質転換された植物体は、ハイグロマイシンを含む培地において栽培し、ＧＦＰの緑色蛍光を示す個体を選抜した。この植物個体をＡｔ－ｘＧｘＧＵＳと名付けた。
（１）レポーター植物個体の構築
野生型のシロイヌナズナを開花状態まで栽培し、ｐＣａｍｂｉａＮ－ｘＧｘＧＵＳを保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＶ３１０１株の培養液を用いて、フローラルディップ法により形質転換を行った。形質転換された植物体は、ハイグロマイシンを含む培地において栽培し、ＧＦＰの緑色蛍光を示す個体を選抜した。この植物個体をＡｔ－ｘＧｘＧＵＳと名付けた。
（２）プロテイントランスダクション法によるＣｒｅタンパク質の導入
プロテイントランスダクションは実施例２に記載の方法に準じて行った。シロイヌナズナＡｔ－ｘＧｘＧＵＳ株の種子をＭＳアガロース培地（１ｘ ＭＳ ｓａｌｔｓ， １ｘ ＭＳビタミン， １％ スクロース， ０．５％ ａｇａｒ）上にて発芽させ１週間後、一部の個体に対して２μＭのＣｒｅタンパク質溶液を１時間浸漬させた後、２日間培養を行い、ＧＵＳ染色を行った（実験ａ）。さらに一部の植物については根部分を切り出して根片とし、２μＭのＣｒｅタンパク質溶液を１時間浸漬させた後、ＣＩＭ培地にてカルス誘導を行った（実験ｂ）。１週間後、ＳＩＭ培地上にてシュート（茎とその上部組織）を誘導した。さらに２週間後、シュート片をＲＩＭ培地に移植して根を誘導した。一部の植物組織に対しては、この時点でＧＵＳ染色を行った（実験ｂ）。残りの植物組織に対しては、開花および結種まで栽培し、種子を取得した。この種子をＢ５アガロース培地上にて発芽させ１週間後、ＧＵＳ染色を行った（実験ｃ）。
プロテイントランスダクションは実施例２に記載の方法に準じて行った。シロイヌナズナＡｔ－ｘＧｘＧＵＳ株の種子をＭＳアガロース培地（１ｘ ＭＳ ｓａｌｔｓ， １ｘ ＭＳビタミン， １％ スクロース， ０．５％ ａｇａｒ）上にて発芽させ１週間後、一部の個体に対して２μＭのＣｒｅタンパク質溶液を１時間浸漬させた後、２日間培養を行い、ＧＵＳ染色を行った（実験ａ）。さらに一部の植物については根部分を切り出して根片とし、２μＭのＣｒｅタンパク質溶液を１時間浸漬させた後、ＣＩＭ培地にてカルス誘導を行った（実験ｂ）。１週間後、ＳＩＭ培地上にてシュート（茎とその上部組織）を誘導した。さらに２週間後、シュート片をＲＩＭ培地に移植して根を誘導した。一部の植物組織に対しては、この時点でＧＵＳ染色を行った（実験ｂ）。残りの植物組織に対しては、開花および結種まで栽培し、種子を取得した。この種子をＢ５アガロース培地上にて発芽させ１週間後、ＧＵＳ染色を行った（実験ｃ）。
（３）結果
結果を図１１に示す。
結果を図１１に示す。
実験ａ：植物個体に対してＣｒｅタンパク質の溶液を浸漬させたところ、植物組織の一部がＧＵＳ染色されていることが確認され、Ｃｒｅタンパク質が核内に導入できていることが明らかとなった。
実験ｂ：根片に対してＣｒｅタンパク質の溶液を浸漬させ、根片をカルス化した後に植物体へと再生させた際、再生個体における葉組織においてＧＵＳ染色されていることが確認された。したがって、Ｃｒｅタンパク質は、再生可能な細胞の核内に導入できていることが明らかとなった。
実験ｃ：根片に対してＣｒｅタンパク質の溶液を浸漬させ、根片をカルス化した後に植物体へと再生させ、さらに種子が得られた個体において、ＧＵＳ染色されていることが確認された。したがって、Ｃｒｅタンパク質は、植物個体として再生可能な細胞の核内に導入できていることが明らかとなった。
本発明によれば、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を直接導入することができる。したがって、植物の育種、品種改良、ならびに植物の遺伝学の研究等において本発明を利用することができる。
配列番号：１は、ＮＯＳプロモーター増幅用のプライマーの塩基配列である。
配列番号：２は、ＮＯＳプロモーター増幅用のプライマーの塩基配列である。
配列番号：３は、ＧＦＰ断片増幅用のプライマーの塩基配列である。
配列番号：４は、ＧＦＰ断片増幅用のプライマーの塩基配列である。
配列番号：５は、ゲノムＤＮＡ増幅産物を得るためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：６は、ゲノムＤＮＡ増幅産物を得るためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＮＤ１のアミノ酸配列である。
配列番号：８は、ＺＦ（ＺＦＬ１）－ＮＤ１のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）－ＦｏｋＩのアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、ＺＦ（ＺＦＬ１）－ＦｏｋＩのアミノ酸配列である。
Claims (13)
- エレクトロポレーションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法。
- 下記の条件下：
ポアリング電圧が約１２０Ｖ／ｃｍ～約１２００Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約１ｍｓ～約１００ｍｓ、
バッファーの導電率が約０．１Ｓ／ｍ～約４．０Ｓ／ｍ、
バッファーの浸透圧が約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．１μＭ～約１００μＭ
においてエレクトロポレーションが行われる、請求項１記載の方法。 - ポアリング電圧が約３００Ｖ／ｃｍ～約７５０Ｖ／ｃｍ、
ポアリング時間が約２ｍｓ～約７５ｍｓ
である、請求項２記載の方法。 - タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭである、請求項２または３記載の方法。
- バッファーとしてイーグル最小必須培地またはその改変培地を用いる、請求項２～４のいずれか１項記載の方法。
- バッファーとしてＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉを用いる、請求項５記載の方法。
- 請求項１～６のいずれか１項記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集酵素を導入することを特徴とする、ゲノム編集方法。
- 請求項１～６のいずれか１項記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変酵素を導入することを特徴とする、ゲノム改変方法。
- プロテイントランスダクションを用いることを特徴とする、細胞壁を有する植物細胞の核内にタンパク質を導入する方法。
- 下記の条件下：プロテイントランスダクションが、下記条件：
バッファーの浸透圧が約５０～約１０００ｍＯｓｍ／ｋｇ、および
タンパク質の濃度が約０．２μＭ～約２００μＭ
においてプロテイントランスダクションが行われる、請求項９記載の方法。 - タンパク質の濃度が約０．５μＭ～約１００μＭである、請求項１０記載の方法。
- 請求項９～１１のいずれか１項記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム編集酵素を導入することを特徴とする、ゲノム編集方法。
- 請求項９～１１のいずれか１項記載の方法を用いて、細胞壁を有する植物細胞の核内にゲノム改変酵素を導入することを特徴とする、ゲノム改変方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020550019A JP7178122B2 (ja) | 2018-10-12 | 2019-08-23 | 植物細胞の核内へのタンパク質導入法 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| WO2020075399A1 true WO2020075399A1 (ja) | 2020-04-16 |
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2019/033139 WO2020075399A1 (ja) | 2018-10-12 | 2019-08-23 | 植物細胞の核内へのタンパク質導入法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024116373A1 (ja) * | 2022-12-01 | 2024-06-06 | 国立大学法人広島大学 | Ｄｎａを二本鎖切断するヌクレアーゼドメイン |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1156360A (ja) * | 1997-08-27 | 1999-03-02 | Iwate Pref Gov | エレクトロポレーションによる遺伝子導入法 |
| JPH11103858A (ja) * | 1997-10-01 | 1999-04-20 | Tr Tec Kk | エレクトロポレーションによるｄｎａ導入方法 |
| WO2018143480A1 (ja) * | 2017-01-31 | 2018-08-09 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物に物質を導入する方法 |
-
2019
- 2019-08-23 JP JP2020550019A patent/JP7178122B2/ja active Active
- 2019-08-23 WO PCT/JP2019/033139 patent/WO2020075399A1/ja active Application Filing
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| FURUHATA Y. ET AL.: "A method using electroporation for the protein delivery of Cre recombinase into cultured Arabidopsis cells with an intact cell wall", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 9, no. 1, 15 February 2019 (2019-02-15), pages 2163, XP055701075 * |
| MORIKAWA H. ET AL.: "Electric gene transfer into plant protoplasts and cells", BIOTECHNOLOGY IN AGRICULTURE, 1988, pages 175 - 202 * |
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| WO2024116373A1 (ja) * | 2022-12-01 | 2024-06-06 | 国立大学法人広島大学 | Ｄｎａを二本鎖切断するヌクレアーゼドメイン |
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