WO2020183984A1 - エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法、および、エレクトロポレーター用電源装置 - Google Patents

エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法、および、エレクトロポレーター用電源装置 Download PDF

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power supply
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壮 眞壁
廣道 渡部
康裕 森泉
俊幸 森泉
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株式会社ベックス
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    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the disclosure in this application is a method for introducing a substance into protoplasts or algae by electroporation (hereinafter, may be simply referred to as a “substance introduction method”), and a power supply device for an electroporator (hereinafter, simply “power supply”). It may be described as "device”).
  • the present invention relates to a substance introduction method having excellent substance introduction efficiency when introducing a substance into protoplasts or algae by electroporation, and a power supply device used for the substance introduction method.
  • Genetic modification by genome editing is used in various research fields including medicine and biology to elucidate the basic mechanism of living organisms or as a model of human diseases.
  • Various methods are known for genetic modification, but since the advent of genome editing technology using the CRISPR / Cas9 system, various application examples have been developed due to its ease and accuracy.
  • a method for introducing a substance such as CRISPR / Cas9 into cells a PEG method, an electroporation method, a particle gun method, a microinjection method and the like are known.
  • a PEG method As a method for introducing a substance such as CRISPR / Cas9 into cells, a PEG method, an electroporation method, a particle gun method, a microinjection method and the like are known.
  • the Cas9 protein is introduced into a fertilized egg of a mammal by an electroporation method (see Patent Document 1).
  • the electroporation method is known as a method for introducing substances into animal cells and protoplasts.
  • the electrical conditions applied to the mixed solution of the cells and the introduced substance sandwiched between the electrodes for example, the voltage value, the number of times the voltage is applied, the time for applying the voltage, and the pulse interval (after applying the voltage) The rest time until the next voltage is applied) can be adjusted. Therefore, the experimental conditions are appropriately selected according to the cell type.
  • Patent Document 2 although it is described that a substance such as nucleic acid can be introduced into a protoplast by an electroporation method, a substance is not often introduced into a protoplast by an electroporation method. Therefore, there is a problem that the desirable conditions for electroporation for protoplasts are not well known.
  • the purpose of the disclosure of the present application is to provide a substance introduction method based on a new voltage application condition, and a power supply device for providing the new voltage application condition.
  • the disclosure in this application relates to the following method of introducing a substance into protoplasts or algae by electroporation, and a power supply device for an electroporator.
  • a method of introducing a substance into protoplasts or algae by electroporation is A mixed solution placement step of placing a mixed solution containing protoplasts or algae and a substance to be introduced between a pair of electroporation electrodes.
  • a voltage application process in which a voltage is applied between a pair of electroporation electrodes, Including The voltage application process One or more poration pulse application steps of applying a positive voltage poration pulse followed by a negative voltage poration pulse to one of the pair of electroporation electrodes. The interval between the application of the positive voltage poration pulse and the application of the negative voltage poration pulse is 50 ⁇ sec or less. Material introduction method.
  • a driving pulse application step of applying a driving pulse is included after the poration pulse application step.
  • the substance to be introduced is selected from nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, and substances that are ionized or charged.
  • Power supply for electroporator The power supply is Poration pulse DC power supply unit for outputting poration pulse, Control unit and Including The control unit A positive voltage poration pulse is applied followed by a negative voltage poration pulse, and The interval between the application of the positive voltage poration pulse and the application of the negative voltage poration pulse is 50 ⁇ sec or less. Control the output of the poration pulse so that Power supply for electroporator.
  • a driving pulse DC power supply unit for outputting a driving pulse is further included.
  • the control unit controls so that the absolute value of the voltage outputs a driving pulse smaller than the poration pulse.
  • the control unit further includes a hard timer.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a pulse waveform applied in a voltage application step of the substance introduction method according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a pulse waveform applied in the voltage application step of the substance introduction method according to the second embodiment.
  • FIG. 3 is a plasmid map of the plasmid used in Example 2.
  • FIG. 4 is a base sequence of the plasmid map shown in FIG.
  • FIG. 5A shows the waveforms of the poration pulse and the driving pulse obtained by the oscilloscope when the pulse is applied in the second embodiment.
  • FIG. 5B shows a waveform obtained by enlarging the first set of poration pulses of FIG. 5A in the time axis direction.
  • FIG. 5A shows the waveforms of the poration pulse and the driving pulse obtained by the oscilloscope when the pulse is applied in the second embodiment.
  • FIG. 5B shows a waveform obtained by enlarging the first set of poration pulses of FIG
  • FIG. 5C shows the waveforms of the poration pulse and the driving pulse obtained in Comparative Example 2 and
  • FIG. 5D shows the waveform of the driving pulse.
  • FIG. 6 is a drawing substitute photograph
  • FIG. 6A is a fluorescence photograph of a protoplast after electroporation of Example 2 and culturing for 24 hours, taken by using an inverted microscope.
  • FIG. 6B is a fluorescence photograph of Comparative Example 2
  • FIG. 6C is a fluorescence photograph of Comparative Example 3.
  • FIG. 7 is a drawing substitute photograph
  • FIG. 7A is a fluorescence photograph of the protoplast after electroporation of Example 3 and culturing for 24 hours
  • FIG. 7B is a normal optical photograph.
  • FIG. 8 is a drawing substitute photograph, the left side of FIG.
  • FIG. 8A is a normal enlarged photograph of the cell mass obtained in Example 4, and the right side is an autofluorescent fluorescence photograph of the same cell mass.
  • the left side of FIG. 8B is a normal enlarged photograph of the cell mass obtained in Comparative Example 4, and the right side is an autofluorescent fluorescence photograph of the same cell mass.
  • the left side of FIG. 8C is a photograph of the cell mass obtained in Example 4 and Comparative Example 4 after culturing for 6.5 months, and the right side is a photograph of the autofluorescence of the same cell mass.
  • FIG. 9 is a drawing substitute photograph, and FIG. 9 left side is a fluorescence photograph of GFP of the shoot obtained in Example 5.
  • FIG. 9 is a fluorescence photograph of the autofluorescence of the shoot obtained in Comparative Example 5.
  • FIG. 10 is a diagram showing an outline of the primers used in Example 5.
  • FIG. 11 is a drawing-substituting photograph, which is a photograph showing the electrophoresis result of Example 5.
  • FIG. 12 shows the waveform of the first set of poration pulses obtained by an oscilloscope when a pulse is applied using the power supply device produced in Example 6.
  • the substance introduction method is (1) A mixed solution placement step of arranging a mixed solution containing protoplasts or algae and a substance to be introduced between a pair of electroporation electrodes. (2) A voltage application step of applying a voltage between a pair of electroporation electrodes and Includes.
  • Protoplasts can be isolated from plant cells by a known method using enzymes.
  • the type of plant is not particularly limited as long as protoplasts can be produced.
  • algae having no cell wall can also be used as a substance introduction method in the same manner as protoplasts.
  • Algae is a general term for organisms that perform oxygen-generating photosynthesis, excluding moss plants, fern plants, and seed plants.
  • cyanobacteria cyanobacteria
  • eukaryotes such as diatoms, yellow-green algae, and whirlpool algae.
  • Cellular organisms Sea algae, which are multicellular organisms such as red algae, brown algae, and green algae, and the like. In the following, when protoplasts and algae are grouped together, they will be referred to as "protoplasts, etc.”
  • the substance to be introduced into protoplast, etc. by the electroporation method is not particularly limited as long as it is a substance that can be introduced into protoplast, etc.
  • electroporation a substance is introduced by applying electricity between a pair of electrodes for electroporation. Therefore, the substance is not particularly limited as long as it is charged (ionized or charged) when added to the electroporation medium.
  • nucleic acids such as DNA and RNA, amino acids, peptides in which about 2 to 49 amino acids are bound, proteins in which 50 or more amino acids are bound, and the like can be mentioned. In the case of nucleic acid, it may be single-stranded or double-stranded.
  • the substance to be ionized may be a low molecular weight organic compound or an inorganic compound.
  • Nucleic acids and amino acids are also charged substances. Therefore, in order to avoid duplication, when the term "ionized or charged substance" is used in the present specification, about 2 to 49 nucleic acids, amino acids, amino acids such as DNA and RNA are bound from the “ionized or charged substance". "Proteins in which 50 or more amino acids are bound to each other" are excluded.
  • the medium is not particularly limited as long as it is a buffer or medium generally used in electroporation.
  • media or buffers such as Opti-MEMI, PBS, HBS, HBSS, Hanks, HCMF can be mentioned.
  • the electrode for electroporation (hereinafter, may be simply referred to as “electrode”) is not particularly limited as long as it is an electrode conventionally used in the electroporation method.
  • electrodes made of metals such as platinum, gold, stainless steel, and aluminum can be mentioned.
  • the two electrodes may have a gap of about 0.25 mm to about 10 mm, for example, about 0.5 mm to about 4 mm or about 1 mm to about 2 mm, and the mixed solution may be placed in the gap.
  • the electrode may be a cuvette electrode in combination with a container for the mixture.
  • Electroporation electrodes can be purchased from, for example, BioRad, BTX, BEX, Eppendorf and the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a pulse waveform applied in a voltage application step of the substance introduction method according to the first embodiment.
  • the poration pulse of the voltage application step according to the first embodiment first has a rectangular positive voltage poration pulse (hereinafter, may be referred to as “plus Pp”) on one of the pair of electrodes. It is applied (a in FIG. 1), and subsequently, a negative voltage poration pulse (hereinafter, may be referred to as “minus Pp”) is applied (b in FIG. 1).
  • the invention according to the first embodiment is characterized in that the interval (t1) from the application of the plus Pp (a) to the application of the minus Pp (b) is 50 ⁇ sec or less. Since the electrodes themselves do not have polarity, if the power supply device and the electrodes are connected, plus Pp is applied to one of the pair of electrodes, and then minus Pp is applied.
  • a commercially available electroporator for example, CUY21EDITII DECAY SQUARE MODE (manufactured by Becks Co., Ltd.), minus Pp can be applied after applying plus Pp, but the interval (t1) is 50 msec to 99.9 msec. There is. That is, in a commercially available electroporator, the lower limit of the pulse interval (t1) when a poration pulse is applied is 50 msec.
  • the substance introduction method power supply device
  • Pp is applied and then minus Pp is applied.
  • the interval (t1) is set to about 1/1000 of that of a commercially available device.
  • the actual interval t1 can be further shortened by setting the program t1 to 0 seconds. Further, since the above 50 ⁇ sec corresponds to the actual interval t1 when the program t1 is set to 0 seconds, the actual interval t1 can be set to 50 ⁇ sec by setting the program t1 to a value of 0 seconds or more when programming. It can be set as above. For example, in the case of improving the conventional device, the actual interval t1 can be set to 100 ⁇ sec by improving the program t1 to 50 ⁇ sec.
  • a power supply device can be manufactured by incorporating a hard timer into the control unit together with improving the program. More specifically, the interval t1 is set in the hard timer, and the hard timer starts counting at the same time when the end of application of plus Pp is detected.
  • the hard timer issues a command to apply the negative Pp to the poration pulse DC power supply unit, so that the negative Pp can be applied in a time shorter than 50 ⁇ sec of the time lag.
  • the hard timer is used for a command to apply minus Pp, and a command to end the application of minus Pp is given by a program. Therefore, it is desirable to improve the program t1 so that it is 0 seconds because the error between the hard timer command and the program command is reduced, but if the error is within the allowable range, the program t1 is not 0 seconds. May be good.
  • a desired value can be input to the hard timer as t1.
  • the actual interval t1 can be arbitrarily adjusted in a very short time of 50 ⁇ sec or less. Therefore, if the hard timer is set to 0 seconds, the minus Pp can be applied at the same time as the application of the plus Pp is completed.
  • t1 when a specific numerical value of t1 is given and explained, it does not mean exactly one point of the numerical value, but may include an error in analysis.
  • the improvement example shown above is only an example of improvement based on the conventional device. Therefore, the above-mentioned improved example is an example for providing the power supply device according to the embodiment, and other methods may be adopted.
  • the power supply device (substance introduction method) according to the first embodiment has a new viewpoint that the interval (t1) for applying minus Pp after applying plus Pp is significantly shortened from that of a commercially available product. It was made in. In the examples described later, when a power supply device was manufactured and tested so as to be 1/1000 (50 ⁇ sec) of 50 msec, which is the lower limit of the commercially available product, it was confirmed that the introduction efficiency was improved.
  • the interval (t1) may be longer than 50 ⁇ sec if the introduction efficiency is improved compared to the efficiency.
  • it may be 5 msec or less, 1 msec or less, 750 ⁇ sec or less, 500 ⁇ sec or less, 400 ⁇ sec or less, 300 ⁇ sec or less, 200 ⁇ sec or less, 100 ⁇ sec or less, 75 ⁇ sec or less, and the like.
  • the lower limit of the interval (t1) may be 0, or may be appropriately set such as 0.01 ⁇ sec or more, 0.1 ⁇ sec or more, 1 ⁇ sec or more, 5 ⁇ sec or more, 10 ⁇ sec or more.
  • the other voltage application conditions of the poration pulse may be the same as the range that can be set by the commercially available product.
  • the waveform of the poration pulse may be a rectangular wave or a damped wave.
  • the set voltage range is 1 to 400 V.
  • the set current range is 1 to 2000 mA.
  • the set pulse width (t2 in FIG. 1) is 0.05 msec to 99.9 msec.
  • the poration pulse application step of applying the minus Pp following the plus Pp may be performed once, or as shown in FIG. 1, twice, three times, four times, five times, or more than one time. It may be possible to apply. Further, when the poration pulse application step is carried out a plurality of times, the interval (t3) from the end of the application of the minus Pp to the application of the next plus Pp may be set in the same manner as in the above t1. As shown, it may be 50 msec to 1000 msec.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a pulse waveform applied in the voltage application step of the substance introduction method according to the second embodiment.
  • the second embodiment is different from the first embodiment in that a driving pulse is applied after the poration pulse is applied, and other points are the same as those in the first embodiment. Therefore, in the description of the substance introduction method and the second embodiment of the power supply device, the points different from those of the first embodiment will be mainly described, and the repetitive description of the matters explained in the first embodiment will be omitted. To do. Therefore, it goes without saying that the matters explained in the first embodiment can be adopted in the second embodiment even if they are not explicitly explained in the second embodiment.
  • the driving pulse after the poration pulse is applied, a pulse with a voltage smaller than the absolute value of the voltage applied by the poration pulse is applied.
  • a driving pulse following the poration pulse the introduction efficiency of the substance can be improved.
  • the driving pulse (d in FIG. 2) may be the same as the commercially available driving pulse.
  • the waveform of the driving pulse may be a rectangular wave or a damped wave.
  • the set voltage range is 1 to 350 V.
  • the set current range is 1 to 2000 mA.
  • the set pulse width (t4 in FIG. 2) is 0.05 msec to 1000 msec.
  • the set pulse interval (t5 in FIG. 2) is 1 to 1000 msec.
  • the set number of pulses is 1 to 1000 times.
  • FIG. 2 an example in which a positive voltage driving pulse is applied three times and then a negative voltage driving pulse is applied three times is shown.
  • Good For example, positive voltage and negative voltage may be combined alternately.
  • the power supply device may further include a driving pulse DC power supply unit for outputting the driving pulse, and the control unit may be controlled so that the driving pulse can be applied after the poration pulse is applied.
  • Example 1 [Manufacturing of power supply]
  • the program of the control unit of CUY21EDITII DECAY SQUARE MODE manufactured by Becks Co., Ltd.
  • the program t1 is 0 seconds
  • the interval between the application of plus Pp and the application of minus Pp becomes 50 ⁇ sec.
  • a power supply was manufactured.
  • the other electrical conditions are the same as those of the CUY21EDITII DECAY SQUARE MODE.
  • the enzyme solution includes 1.5% Cellulase YC (manufactured by Kikkoman), 0.25% Macerozyme R200 (manufactured by Yakult), 700 mg / l calcium chloride, and 0.5 M mannitol (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). (Manufactured by), 5 mM MES (2-morpholinoetan sulfonic acid; 2-Morphorinoethanes ulfonic acid, mnitol hydrate) (manufactured by Dojin Chemical Industries, Ltd.) was used. The pH of the enzyme solution was 5.6.
  • FIG. 5A shows the waveforms of the poration pulse and the driving pulse obtained by the oscilloscope when the pulse is applied in the above (d).
  • FIG. 5B shows a waveform obtained by enlarging the first set of poration pulses (arrow portion in FIG. 5A) of FIG. 5A in the time axis direction. It was confirmed that the interval (t1) from the application of the plus Pp to the application of the minus Pp, which is indicated by the arrow in FIG. 5B, was 50 ⁇ sec, which was as set.
  • FIG. 6A is a fluorescence photograph of a protoplast after electroporation and culturing for 24 hours, taken by using an inverted microscope.
  • FIG. 5C shows the waveforms of the poration pulse and the driving pulse obtained by the oscilloscope.
  • FIG. 6B is a fluorescence photograph of proplast after electroporation and culturing for 24 hours.
  • FIG. 5D shows the waveforms of the poration pulse and the driving pulse obtained by the oscilloscope.
  • FIG. 6C is a fluorescence photograph of protoplasts after electroporation and culturing for 24 hours.
  • FIG. 7A is a fluorescence photograph of protoplasts after electroporation and culturing for 24 hours.
  • FIG. 7B is a normal optical photograph. As is clear from FIG. 7A, it was confirmed that the substance can be introduced even when different types of protoplasts are used.
  • crRNA and tracrRNA, and Cas9 were purchased from Integrated DNA Technologies Co., Ltd. (IDT).
  • Cas9 and gRNA were adjusted according to the protocol of IDT.
  • -Cas9 10 ⁇ g / 100 ⁇ l
  • -CrRNA 10 ⁇ g / 100 ⁇ l
  • TracrRNA 10 ⁇ g / 100 ⁇ l
  • the substance was introduced in the same procedure as in Example 2 except that the prepared introduced substance (Cas9 and gRNA) was used instead of the plasmid.
  • the photograph on the left side of FIG. 8A is a photograph showing the state of the cell mass after culturing for about 2.5 months after electroporation.
  • the left side of FIG. 8A is a normal enlarged photograph of a cell mass, and the right side is an autofluorescent fluorescence photograph of the same cell mass.
  • the left side of FIG. 8C is a normal photograph of the cell mass after culturing for 6.5 months, and the right side is an autofluorescent photograph of the same cell mass.
  • FIG. 8B is a photograph showing the state of the cell mass after culturing for about 2.5 months after electroporation.
  • the left side of FIG. 8B is a normal enlarged photograph of a cell mass, and the right side is an autofluorescent fluorescence photograph of the same cell mass.
  • the left side of FIG. 8C is a normal photograph of the cell mass after culturing for 6.5 months, and the right side is an autofluorescent photograph of the same cell mass.
  • Example 4 in which the knockout substance was introduced, autofluorescence was not observed in the cell mass surrounded by ⁇ .
  • Comparative Example 4 in which the knockout substance was not introduced autofluorescence was confirmed in all the cell clusters.
  • Example 4 Even in the observation after culturing for 6.5 months, the cell mass of Example 4 was translucent, plant carotenoids were not biosynthesized, and autofluorescence was not observed. On the other hand, in the cell mass of Comparative Example 4 in which the knockout substance was not introduced, the formation of carotenoids was visually confirmed, and autofluorescence was also confirmed.
  • dsDNA (10 ⁇ g / 100 ⁇ l) expressing GFP was used in addition to the Cas9 protein and gRNA of Example 4.
  • the sequence of dsDNA is as follows.
  • FIG. 9 is a fluorescence photograph of a shoot after culturing for about 8 months after electroporation.
  • FIG. 9 is a fluorescence photograph of a shoot after culturing for about 8 months after electroporation.
  • Example 5 since dsDNA was knocked in on the PDS gene, the green fluorescence of GFP formed by the expression of dsDNA could be confirmed. On the other hand, in Comparative Example 5 in which no substance was introduced, red autofluorescence was confirmed because the PDS gene was functioning. From the above results, it was confirmed from the phenotype that dsDNA could be knocked in on the target PDS gene.
  • Example 5 the DNA sequence of the shoot obtained in the experiment of Example 5 was confirmed.
  • Cas9 and gRNA having a function of cleaving the PDS gene and dsDNA introduced into the cleaved site were mixed and electroporated. Therefore, the obtained shoot is a heterogeneous genome in which the dsDNA expressing GFP on the PDS gene is knocked in and the genome in which the PDS gene is knocked out.
  • 6 cell clusters and shoots were selected, including shoots in which knock-in was confirmed by the phenotype shown in FIG. 9, and the DNA sequence was examined by the following procedure.
  • DNA was extracted from the selected 6 types of cell masses or shoots by a conventional method, DNA was amplified using the above primers, and the amplified nucleic acid was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis.
  • M 1 kb DNA Ladder Marker (product number: BRG-1 kb-02, product name: DNA ladder marker 1 kb, manufactured by Watson Co., Ltd.) was used.
  • C DNA was extracted from the cell mass obtained in Comparative Example 5 by a conventional method, and the DNA was amplified using the above primers.
  • FIG. 11 shows the result of electrophoresis.
  • Lane number 13 is a shoot in which the green fluorescence of GFP shown in FIG. 9 can be confirmed.
  • the band with the knock-in display and the band with the knock-out display in FIG. 11 were cut out, and the DNA sequence of the band was analyzed using a sequencer.
  • lane number 10 is a chimeric knockout
  • lane number 11 is a chimeric knockout
  • lane number 12 is a hetero knockout
  • lane number 13 is a hetero knockout
  • lane number 15 is a hetero knockout
  • lane number is a homo knockout.
  • knock-in and knock-out of the target site of the PDS gene were confirmed by substance introduction from the DNA sequence in addition to the phenotype.
  • Example 6 The power supply device of Example 6 was manufactured by incorporating a hard timer into the power supply device of Example 1. Next, using the power supply device produced in Example 6, the hard timer was set to 0 seconds, and a substance introduction experiment was conducted in the same procedure as in Example 2.
  • FIG. 12 shows the waveform of the first set of poration pulses obtained by an oscilloscope when a pulse is applied using the power supply device manufactured in Example 6 (the same time axis as in FIG. 5B). As shown in FIG. 12, it was confirmed that the negative Pp was applied at the same time as the application of the positive Pp was completed. In addition, although not shown, it was confirmed that the plasmid could be introduced into the protoplus of tobacco leaves.
  • the substance introduction method disclosed in this application and the power supply device can efficiently introduce the substance into protoplasts or algae. Therefore, it is useful for genome editing in the field of agriculture, forestry and fisheries.

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Abstract

新たな電圧印加条件のエレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法を提供することを課題とする。　エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法であって、　該物質導入方法は、　一対のエレクトロポレーション用電極の間に、プロトプラストまたは藻類および導入する物質を含む混合液を配置する混合液配置工程と、　一対のエレクトロポレーション用電極間に電圧を印加する電圧印加工程と、 を含み、　電圧印加工程が、　一対のエレクトロポレーション用電極の一方に、プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加するポレーションパルス印加工程を１以上含み、　プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が５０μｓｅｃ以下である、 物質導入方法、 により、課題が解決できる。

Description

エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法、および、エレクトロポレーター用電源装置
　本出願における開示は、エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法（以下、単に「物質導入方法」と記載することがある。）、および、エレクトロポレーター用電源装置（以下、単に「電源装置」と記載することがある。）に関する。特に、エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入の際に、物質の導入効率に優れた物質導入方法、および、当該物質導入方法に用いる電源装置に関する。
　ゲノム編集による遺伝子改変は、医学および生物学を含む様々な研究分野において、生物の基本的メカニズムの解明のために、あるいは、ヒトの疾患のモデルとして、使用されている。遺伝子改変には様々な方法が知られているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いるゲノム編集技術が出現して以来、その手軽さと正確性からさまざまな応用例が開発されている。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等の物質の細胞への導入方法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が知られている。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をエレクトロポレーション法により、哺乳動物の受精卵に導入した例が知られている（特許文献１参照）。
　また、ゲノム編集による遺伝子改変は、植物細胞でも行われる。植物細胞は硬い細胞壁で覆われている。そのため、植物細胞の遺伝子改変は、細胞壁を取り除いたプロトプラストの状態で、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションにより、核酸を導入した例が知られている（特許文献２参照）。
特開２０１７－１８４６３９号公報 特表２０１１－５１４１４１号公報
　エレクトロポレーション法は、上記のとおり、動物細胞やプロトプラストへの物質導入方法として知られている。ところで、市販のエレクトロポレーターは、電極間に挟んだ細胞と導入物質の混合液に印加する電気条件、例えば、電圧値、電圧印加回数、電圧を印加する時間、パルス間隔（電圧を印加後、次の電圧を印加するまでの休止時間）等の調整ができる。したがって、細胞の種類に応じて、適宜実験条件を選択している。しかしながら、上記特許文献２に記載のとおり、エレクトロポレーション法により、プロトプラストへ核酸等の物質を導入できることは記載されているが、エレクトロポレーション法によるプロトプラストへの物質導入はあまり行われていない。したがって、プロトプラストに対するエレクトロポレーションの望ましい条件はあまり知られていないという問題がある。
　本出願の開示は、上記問題点を解決するためになされたものである。そして、新たにエレクトロポレーター用電源装置を開発し、プロトプラストへ物質導入する際のエレクトロポレーションの条件を検討したところ、（１）プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加し、且つ、（２）プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔を５０μｓｅｃ以下とすると、プロトプラストに対する物質の導入効率が向上すること、を新たに見出した。
　すなわち、本出願の開示の目的は、新たな電圧印加条件による物質導入方法、および、当該新たな電圧印加条件を提供するための電源装置を提供することである。
　本出願における開示は、以下に示す、エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法、および、エレクトロポレーター用電源装置に関する。
（１）エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法であって、
　該物質導入方法は、
　　一対のエレクトロポレーション用電極の間に、プロトプラストまたは藻類、および、導入する物質を含む混合液を配置する混合液配置工程と、
　　一対のエレクトロポレーション用電極間に電圧を印加する電圧印加工程と、
を含み、
　電圧印加工程が、
　　一対のエレクトロポレーション用電極の一方に、プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加するポレーションパルス印加工程を１以上含み、
　　プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が５０μｓｅｃ以下である、
物質導入方法。
（２）ポレーションパルス印加工程の後に、ドライビングパルスを印加するドライビングパルス印加工程を含む、
上記（１）に記載の物質導入方法。
（３）導入する物質が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、および、イオン化もしくは帯電する物質、から選択される、
上記（１）または（２）に記載の物質導入方法。
（４）エレクトロポレーター用電源装置であって、
　電源装置は、
　　ポレーションパルスを出力するためのポレーションパルス直流電源部と、
　　制御部と、
を含み、
　制御部は、
　　プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加し、且つ、
　　プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が５０μｓｅｃ以下、
となるように、ポレーションパルスの出力を制御する、
エレクトロポレーター用電源装置。
（５）ドライビングパルスを出力するためのドライビングパルス直流電源部を更に含み、
　制御部は、ポレーションパルスを出力した後、電圧の絶対値がポレーションパルスより小さいドライビングパルスを出力するように制御する、
上記（４）に記載のエレクトロポレーター用電源装置。
（６）制御部が、ハードタイマーを更に含む、
上記（４）または（５）に記載のエレクトロポレーター用電源装置。
　本出願で開示する電源装置を用い、新たなエレクトロポレーション条件により物質導入を行うと、物質の導入効率が向上する。
図１は、第１の実施形態に係る物質導入方法の電圧印加工程で印加されるパルスの波形の一例を示す図である。 図２は、第２の実施形態に係る物質導入方法の電圧印加工程で印加されるパルスの波形の一例を示す図である。 図３は、実施例２で用いたプラスミドのプラスミドマップである。 図４は、図３に示すプラスミドマップの塩基配列である。 図５Ａは実施例２においてパルスを印加した際に、オシロスコープで得られたポレーションパルスとドライビングパルスの波形を表す。図５Ｂは、図５Ａの１セット目のポレーションパルスを時間軸方向に拡大した波形を表している。図５Ｃは比較例２、図５Ｄは比較例３で得られたポレーションパルスとドライビングパルスの波形を表す 図６は図面代用写真で、図６Ａは、実施例２のエレクトロポレーション後、２４時間培養後のプロトプラストを、倒立顕微鏡を用いて撮像した蛍光写真である。図６Ｂは比較例２、図６Ｃは比較例３の蛍光写真である。 図７は図面代用写真で、図７Ａは、実施例３のエレクトロポレーション後、２４時間培養後のプロトプラストの蛍光写真で、図７Ｂは、通常光写真である。 図８は図面代用写真で、図８Ａの左側は実施例４で得られた細胞塊の通常の拡大写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。図８Ｂの左側は比較例４で得られた細胞塊の通常の拡大写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。図８Ｃの左側は実施例４および比較例４で得られた６．５カ月培養後の細胞塊の写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である 図９は図面代用写真で、図９左側は、実施例５で得られたシュートのＧＦＰの蛍光写真である。図９右側は、比較例５で得られたシュートの自家蛍光の蛍光写真である。 図１０は、実施例５で用いたプライマーの概略を示す図である。 図１１は図面代用写真で、実施例５の電気泳動結果を示す写真である。 図１２は、実施例６で作製した電源装置を用いてパルスを印加した際に、オシロスコープで得られた、１セット目のポレーションパルスの波形を表す。
　以下、図面を参照しつつ、物質導入方法の実施形態、および、電源装置の実施形態について、詳しく説明する。なお、本明細書において、同種の機能を有する部材には、同一または類似の符号が付されている。そして、同一または類似の符号の付された部材について、繰り返しとなる説明が省略される場合がある。
（物質導入方法および電源装置の第１の実施形態）
　物質導入方法は、
（１）一対のエレクトロポレーション用電極の間に、プロトプラストまたは藻類、および、導入する物質を含む混合液を配置する混合液配置工程と、
（２）一対のエレクトロポレーション用電極間に電圧を印加する電圧印加工程と、
を含んでいる。
　プロトプラストは、植物細胞から酵素を用いた公知の方法で単離することができる。植物の種類は、プロトプラストを作製できれば特に制限はない。また、細胞壁を有しない藻類も、プロトプラストと同様に物質導入方法に用いることができる。なお、藻類は、酸素発生型光合成を行う生物のうち、コケ植物、シダ植物、種子植物を除いた総称であり、例えば、シアノバクテリア（藍藻）；珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻などの真核細胞生物；紅藻、褐藻、緑藻などの多細胞生物である海藻類、等が挙げられる。なお、以下において、プロトプラストと藻類を纏める時には「プロトプラスト等」と記載する。
　エレクトロポレーション法によりプロトプラスト等に導入する物質としては、プロトプラスト等に導入できる物質であれば特に制限はない。エレクトロポレーションは、一対のエレクトロポレーション用電極間に電気を印加することで物質を導入する。したがって、物質としては、エレクトロポレーション用媒体に添加した時に、電荷を帯びるもの（イオン化もしくは帯電する物質）であれば特に制限はない。例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、アミノ酸、アミノ酸が２～４９個程度結合したペプチド、アミノ酸が５０個以上結合したタンパク質等が挙げられる。なお、核酸の場合、一本鎖であっても２本鎖であってもよい。また、イオン化する物質としては、低分子有機化合物や無機化合物であってもよい。なお、核酸やアミノ酸も帯電する物質である。したがって、重複を避けるため、本明細書において、「イオン化もしくは帯電する物質」と記載した場合、「イオン化もしくは帯電する物質」から「ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、アミノ酸、アミノ酸が２～４９個程度結合したペプチド、アミノ酸が５０個以上結合したタンパク質」は除かれる。
　媒体は、エレクトロポレーションで一般的に用いられるバッファーや培地等であれば特に制限はない。例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩ、ＰＢＳ、ＨＢＳ、ＨＢＳＳ、Ｈａｎｋｓ、ＨＣＭＦなどの培地またはバッファーが挙げられる。
　エレクトロポレーション用電極（以下、単に「電極」と記載することがある。）は、従来からエレクトロポレーション法において使用される電極であれば特に制限はない。例えば、白金、金、ステンレス鋼、アルミニウムなどの金属からなる電極が挙げられる。通常、２本の電極が約０．２５ｍｍないし約１０ｍｍ、例えば約０．５ｍｍないし約４ｍｍまたは約１ｍｍないし約２ｍｍのギャップをあけ、そのギャップに混合液を配置すればよい。電極は、混合物を入れるための容器と組み合わせたキュベット電極であってもよい。エレクトロポレーション用電極は、例えば、ＢｉｏＲａｄ社、ＢＴＸ社、ＢＥＸ社、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社などから購入できる。
　図１を参照して、第１の実施形態に係る物質導入方法の電圧印加工程について、より詳しく説明する。図１は、第１の実施形態に係る物質導入方法の電圧印加工程で印加されるパルスの波形の一例を示す図である。第１の実施形態に係る電圧印加工程のポレーションパルスは、先ず、一対の電極の一方に、矩形状のプラス電圧のポレーションパルス（以下、「プラスＰｐ」と記載することがある。）が印加され（図１のａ）、続いて、マイナス電圧のポレーションパルス（以下、「マイナスＰｐ」と記載することがある。）が印加される（図１のｂ）。そして、第１の実施形態に係る発明では、プラスＰｐ（ａ）を印加後、マイナスＰｐ（ｂ）を印加するまでの間隔（ｔ１）が、５０μｓｅｃ以下であることが特徴である。なお、電極自体は極性を持たないので、電源装置と電極を接続すれば、一対の電極の一方には、プラスＰｐが印加され、続いて、マイナスＰｐが印加される。
　市販のエレクトロポレーター、例えば、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴＩＩ　ＤＥＣＡＹ　ＳＱＵＡＲＥ　ＭＯＤＥ（株式会社ベックス社製）では、プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加することはできるが、間隔（ｔ１）は５０ｍｓｅｃ～９９．９ｍｓｅｃとなっている。つまり、市販のエレクトロポレーターでは、ポレーションパルスを印加する場合のパルスの間隔（ｔ１）の下限値は５０ｍｓｅｃである。
　一方、第１の実施形態に係る物質導入方法（電源装置）では、従来のエレクトロポレーターが設定可能な電圧印加条件の範囲を超えて再検討した結果、プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加する間隔（ｔ１）を、市販装置の１／１０００程度にしている。つまり、市販のエレクトロポレーターでは、全く想定していない条件を試したところ、プロトプラスト等への物質の導入効率を高められることを新たに発見した。
　プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加する間隔（ｔ１）を５０μｓｅｃ以下とするためには、電源装置のプログラムと、必要に応じてハードを改良することで実施できる。より具体的には、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴＩＩ　ＤＥＣＡＹ　ＳＱＵＡＲＥ　ＭＯＤＥ（株式会社ベックス社製）（以下、「従来装置」と記載することがある。）の制御部を、以下のとおり改良することで作製できる。
（１）プログラムで改良
　プラスＰｐ印加後、マイナスＰｐを印加する間隔ｔ１の下限値は、ＣＰＵ性能に応じて決まる。より具体的には、従来装置では、プログラム上でｔ１（以下、プログラム上で設定するｔ１を「プログラムｔ１」と記載する。）を０秒に設定しても、実際にプログラムの指令に従って、プラスＰｐからマイナスＰｐを印加するまでに５０μｓｅｃのタイムラグが発生することを新たに発見した。従来装置では、プラグラムｔ１は５０ｍｓｅｃとなるように作製されていたが、プログラムを改良し、プログラムｔ１を０秒とすることで、プラスＰｐ印加後、マイナスＰｐ印加までの実際の間隔ｔ１が５０μｓｅｃの電源装置を作製できる。なお、ＣＰＵの性能が上がれば、プログラムｔ１を０秒とすることで、実際の間隔ｔ１を更に短くすることも可能である。また、上記の５０μｓｅｃは、プログラムｔ１を０秒とした時の実際の間隔ｔ１に相当することから、プログラミングする際に、プログラムｔ１を０秒以上の値とすることで、実際の間隔ｔ１を５０μｓｅｃ以上に設定できる。例えば、従来装置の改良の場合、プログラムｔ１を５０μｓｅｃに改良することで、実際の間隔ｔ１を１００μｓｅｃとすることができる。
（２）プログラムおよびハードを改良
　上記のとおり、プログラムｔ１を０秒に改良しても、実際の間隔ｔ１は５０μｓｅｃのタイムラグがある。そのため、実際の間隔ｔ１を５０μｓｅｃより更に短くしたい場合は、プログラムの改良のみでは困難である。したがって、実際の間隔ｔ１を５０μｓｅｃより短くしたい場合は、プログラムの改良と共に、ハードタイマーを制御部に組み込むことで電源装置を作製できる。より具体的には、ハードタイマーに間隔ｔ１を設定し、ハードタイマーはプラスＰｐの印加終了を検知すると同時にカウントを開始する。そして、ハードタイマーに設定した間隔ｔ１に到達したと同時にハードタイマーからポレーションパルス直流電源部にマイナスＰｐを印加する指令を出すことで、上記タイムラグの５０μｓｅｃより短い時間で、マイナスＰｐを印加できる。なお、ハードタイマーは、マイナスＰｐの印加指令に用いられ、マイナスＰｐの印加終了の指令はプログラムで行う。そのため、プログラムｔ１を０秒となるように改良すると、ハードタイマーの指令とプログラムの指令との間の誤差が少なくなるので望ましいが、誤差の許容範囲内であればプログラムｔ１は０秒でなくてもよい。なお、ハードタイマーには、ｔ１として所望の数値を入力できる。そのため、ハードタイマーを用いる場合には、実際の間隔ｔ１を５０μｓｅｃ以下の非常に短い時間で任意に調整が可能となる。したがって、ハードタイマーの設定を０秒にすれば、プラスＰｐの印加終了と同時にマイナスＰｐを印加できる。なお、本明細書において、ｔ１の具体的な数値を挙げて説明した場合、厳密に当該数値の一点のみを意味するのではなく、解析の際の誤差を含んでもよい。
　上記に示した改良例は、従来装置を基に改良した一例に過ぎない。したがって、上記の改良例は、実施形態に係る電源装置を提供するための一例であって、他の方法を採用してもよい。
　なお、上記のとおり、第１の実施形態に係る電源装置（物質導入方法）は、プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加する間隔（ｔ１）を、市販品から大幅に短くするという新たな視点でなされたものである。後述する実施例では、市販品の下限値である５０ｍｓｅｃの１／１０００（５０μｓｅｃ）となるように電源装置を作製して実験したところ、導入効率が向上したことを確認したが、市販品の導入効率と比較して導入効率が向上すれば、間隔（ｔ１）は５０μｓｅｃより長くてもよい。例えば、５ｍｓｅｃ以下、１ｍｓｅｃ以下、７５０μｓｅｃ以下、５００μｓｅｃ以下、４００μｓｅｃ以下、３００μｓｅｃ以下、２００μｓｅｃ以下、１００μｓｅｃ以下、７５μｓｅｃ以下、等としてもよい。
　第１の実施形態に係る電源装置（物質導入方法）により、物質の導入効率が向上したのは、プラスＰｐからマイナスＰｐを印加する間隔（ｔ１）が短くなることで、プラスＰｐの電圧の絶対値およびマイナスＰｐの電圧の絶対値に相当する電圧差があたかも連続して印加されたためと考えられる。したがって、間隔（ｔ１）の下限値は、０としてもよいし、０．０１μｓｅｃ以上、０．１μｓｅｃ以上、１μｓｅｃ以上、５μｓｅｃ以上、１０μｓｅｃ以上等、適宜設定すればよい。
　第１の実施形態に係る電源装置（物質導入方法）において、ポレーションパルスのその他の電圧印加条件は、市販品が設定可能な範囲と同じでよい。例えば、ポレーションパルスの波形は、矩形波であってもよいし、減衰波であってもよい。設定電圧範囲は、１～４００Ｖが挙げられる。設定電流範囲は、１～２０００ｍＡが挙げられる。設定パルス幅（図１のｔ２）は、０．０５ｍｓｅｃ～９９．９ｍｓｅｃが挙げられる。
　なお、プラスＰｐに続きマイナスＰｐを印加するポレーションパルス印加工程は、一回でもよいし、図１に示すように２回、或いは、３回、４回、５回等、１以上の複数回印加できるようにしてもよい。また、ポレーションパルス印加工程を複数回実施する場合、マイナスＰｐを印加終了後、次のプラスＰｐを印加するまでの間隔（ｔ３）は、上記ｔ１と同様に設定してもよいし、従来のとおり、５０ｍｓｅｃ～１０００ｍｓｅｃとしてもよい。
（物質導入方法および電源装置の第２の実施形態）
　次に、図２を参照して、物質導入方法および電源装置の第２の実施形態について説明する。図２は、第２の実施形態に係る物質導入方法の電圧印加工程で印加されるパルスの波形の一例を示す図である。第２の実施形態では、ポレーションパルスを印加後、ドライビングパルスを印加する点で第１の実施形態と異なり、その他の点は第１の実施形態と同様である。したがって、物質導入方法および電源装置の第２の実施形態の説明では、第１の実施形態と異なる点を中心に説明し、第１の実施形態において説明済みの事項についての繰り返しとなる説明は省略する。よって、第２の実施形態において明示的に説明されなかったとしても、第２の実施形態において、第１の実施形態で説明済みの事項を採用可能であることは言うまでもない。
　ドライビングパルスは、ポレーションパルスの印加後、ポレーションパルスで印加する電圧の絶対値より小さい電圧のパルスが印加される。ポレーションパルスに引き続き、ドライビングパルスを印加することで、物質の導入効率を向上できる。
　ドライビングパルス（図２のｄ）は、市販品のドライビングパルスと同じでよい。例えば、ドライビングパルスの波形は、矩形波であってもよいし、減衰波であってもよい。設定電圧範囲は、１～３５０Ｖが挙げられる。設定電流範囲は、１～２０００ｍＡが挙げられる。設定パルス幅（図２のｔ４）は、０．０５ｍｓｅｃ～１０００ｍｓｅｃが挙げられる。設定パルス間隔（図２のｔ５）は1～１０００ｍｓｅｃが挙げられる。設定パルス回数は、１～１０００回が挙げられる。なお、図２に示す例では、プラス電圧のドライビングパルスを３回印加後、マイナス電圧のドライビングパルスを３回印加した例が示されているが、プラス電圧とマイナス電圧の組み合わせは適宜設定すればよい。例えば、プラス電圧とマイナス電圧を交互に組合わせてもよい。
　ドライビングパルスを印加する場合は、ドライビングパルスを出力するためのドライビングパルス直流電源部を電源装置が更に備え、ポレーションパルスを印加後、ドライビングパルスが印加できるように、制御部を制御すればよい。
　以下に実施例を掲げ、各実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単にその具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は、発明の範囲を限定したり、あるいは制限するものではない。
＜実施例１＞
［電源装置の作製］
　ＣＵＹ２１ＥＤＩＴＩＩ　ＤＥＣＡＹ　ＳＱＵＡＲＥ　ＭＯＤＥ（株式会社ベックス社製）の制御部のプログラムを、プログラムｔ１が０秒となるように改良することで、プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加するまでの間隔が５０μｓｅｃとなる電源装置を作製した。なお、その他の電気的条件は、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴＩＩ　ＤＥＣＡＹ　ＳＱＵＡＲＥ　ＭＯＤＥと同じである。
＜比較例１＞
　ＣＵＹ２１ＥＤＩＴＩＩ　ＤＥＣＡＹ　ＳＱＵＡＲＥ　ＭＯＤＥを比較例１の電源装置とした。
［物質導入実験１］
＜実施例２＞
［タバコの葉］
（１）プロトプラストの単離
（ａ）無菌植物（タバコの葉：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）からよく展開した葉を切り取り、太い葉脈を除去してシャーレに置いた（１ｇ）。
（ｂ） 約１ｍｌの酵素液を加え、葉を２ｍｍ幅くらいとなるように、メスで切り刻んだ。なお、酵素液には、１．５％　Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　Ｙ－Ｃ（キッコーマン社製）、０．２５％　Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　Ｒ２００（ヤクルト社製）、７００ｍｇ／ｌ　塩化カルシウム、０．５Ｍ　マンニトール（富士フィルム和光純薬社製）、５ｍＭ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸；２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，　ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）（同仁化学研究所社製）を用いた。なお、酵素液のｐＨは５．６であった。以下において、ｐＨを記載する場合は、個々の試薬のｐＨではなく、溶液全体のｐＨを表す。
（ｃ）葉を全て刻んだら、更に９ｍｌの酵素液を加え、シャーレの周りをサージカルテープで密封し、軽く振り混ぜた。
（ｄ）暗黒下２５℃で約４時間静置し、その間に数回軽く振り混ぜた。
（ｅ）倒立顕微鏡でプロトプラスト単離されていることを確認した。
（ｆ）パストゥールピペットを使って、プロトプラストを含んだ酵素液を１００μｍのナイロンメッシュに通した。
（ｇ）ろ液を１０ｍｌの遠心管に移し、７００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（ｈ）上清をパストゥールピペットで除去し、８ｍｌの洗浄液でプロトプラストを懸濁し、７００ｒｐｍで３分間間遠心分離した。なお、洗浄液には、７００ｍｇ／ｌ　塩化カルシウム、０．５Ｍ　マンニトール、５ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ５．６を用いた。
（ｉ）さらに２回同操作を繰り返した。
（ｊ）その後、プロトプラストを１８％ショ糖溶液上に重層し、７００ｒｐｍで５分間遠心分離して、プロトプラストを精製した。
（２）物質導入の実施
（ａ）上記（１）で単離したプロトプラストを、１ｍｌのエレクトロポレーション用緩衝液に懸濁した。なお、緩衝液には、７０ｍＭ　ＫＣｌ、０．５Ｍ　マンニトール、５ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ５．６を用いた。
（ｂ）懸濁液の一部を用い、血球計算盤で密度を測定した。
（ｃ）プロトプラストの密度が５０万個/ｍｌになるように、エレクトロポレーション用緩衝液で調整し、１００μｌを０．２ｃｍのキュベット電極（ＢＥＸ社製，ＳＥ－２０２）に移し、プラスミドＤＮＡの濃度が１０μｇ／１００μｌとなるように加えた。なお、プラスミドＤＮＡは、ＧＦＰタンパク質を発現するように設計されたもので、図３にプラスミドマップを示す。また、配列（配列番号：１）を図４に示す。
（ｄ）実施例１で作製した電源装置を用い、以下の条件でパルスを印加した。
＜ポレーションパルス＞
・電圧設定：１４０Ｖ
・パルス幅（ｔ２）：０．５ｍｓｅｃ
・プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加するまでの間隔（ｔ１）：５０μｓｅｃ
・マイナスＰｐを印加終了後、次のプラスＰｐを印加するまでの間隔（ｔ３）：５０ｍｓｅｃ
・パルス印加回数：プラスＰｐ→マイナスＰｐのセットを２回
・減衰率：１０％
＜ドライビングパルス＞
・電圧設定：２５Ｖ
・パルス幅（ｔ４）：２５ｍｓｅｃ
・パルス間隔（ｔ５）：５０ｍｓｅｃ
・パルス印加回数：プラス電圧を印加後、マイナス電圧を５回印加
・減衰率：１０％
（ｅ）キュベット内のプロトプラスト溶液を９００μｌの液体培地に移し、２４穴シャーレで２５℃、１６時間照明、８時間暗黒で培養した。なお、培地は、ＭＳ培地、３０ｇ／ｌ　マルトース、０．５ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）、０．５ｍｇ／ｌ　ＢＡ（６ベンジルアミノプリ）、０．５Ｍ　マンニトール、ｐＨ５．７を用いた。
（ｆ）２週間毎に、培地の濃度を０．１ｍｏｌ／ｌずつ下げるよう新しい培地を追加することで、浸透圧を調整した。
（ｇ）コロニーの形成を確認後、再分化用の培地に移した。再分化用の培地には、ＭＳ培地、３０ｇ／ｌ　マルトース、０．１ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、０．５ｍｇ／ｌ　ＢＡ、２．５ｇ／ｌ　ｇｅｌｌａｎ　ｇｕｍ、ｐＨ５．７を用いた。
　図５Ａは、上記（ｄ）において、パルスを印加した際に、オシロスコープで得られた、ポレーションパルスとドライビングパルスの波形を表す。図５Ｂは、図５Ａの１セット目のポレーションパルス（図５Ａの矢印部分）を時間軸方向に拡大した波形を表している。図５Ｂの矢印で示す、プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加するまでの間隔（ｔ１）は５０μｓｅｃで、設定どおりの間隔であることを確認した。また、図６Ａは、エレクトロポレーション後、２４時間培養後のプロトプラストを、倒立顕微鏡を用いて撮像した蛍光写真である。
＜比較例２＞
　比較例１の電源装置を用い、プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加するまでの間隔（ｔ１）を５０ｍｓｅｃとした以外は、実施例１と同様の手順により物質導入を実施した。図５Ｃは、オシロスコープで得られた、ポレーションパルスとドライビングパルスの波形を表す。また、図６Ｂは、エレクトロポレーション後、２４時間培養後のプロップラストの蛍光写真である。
＜比較例３＞
　比較例１の電源装置を用い、プラスＰｐを連続して２回印加後、マイナスＰｐを連続して２回印加し、夫々のパルス間隔（ｔ１）を５０ｍｓｅｃとした以外は、実施例１と同様の手順により物質導入を実施した。図５Ｄは、オシロスコープで得られた、ポレーションパルスとドライビングパルスの波形を表す。また、図６Ｃは、エレクトロポレーション後、２４時間培養後のプロトプラストの蛍光写真である。
　図６Ａ乃至図６Ｃから明らかなように、実施例２の図６Ａの蛍光を示すプロトプラストの数は、図６Ｂおよび図６Ｃより多かった。そして、比較例２の図６Ｂと比較して、実施例２の図６Ａの写真の同一面積内で蛍光を示すプロトプラストの数は、約１．３倍であった。以上の結果から、プラスＰｐを印加後、マイナスＰｐを印加するまでの間隔（ｔ１）を短くするほど、エレクトロポレーションによるプロトプラストへのプラスミドの導入効率が向上することが明らかとなった。
［物質導入実験２］
＜実施例３＞
［タマネギ］
（１）プロトプラストの準備
　タバコの葉から形成したプロトプラストの代え、タマネギのプロトプラストを用いた実験を行った。タマネギのプロトプラストは、タマネギ種子を発芽させ、植物ホルモン０．５ｍｇ／ｌ　２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）、０．１ｍｇ／ｌ　ＴＤＺ（Ｎ－フェニル－Ｎ’－（１，２，３－チアジアゾール－５－イル）尿素）で脱分化したカルスを用いた。
（２）物質導入の実施
　タバコの葉から形成したプロトプラストの代え、タマネギのプロトプラストを用いた以外は、実施例２と同様の手順で実験を行った。
　図７Ａは、エレクトロポレーション後、２４時間培養後のプロトプラストの蛍光写真である。図７Ｂは、通常光写真である。図７Ａから明らかなように、種類の異なるプロトプラストを用いた場合でも、物質導入ができることを確認した。
［物質導入実験３］
＜実施例４＞
［タバコの葉のＰＤＳ遺伝子のノックアウト］
　導入物質として、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡを用いた。ノックアウトのターゲットには、カロテノイド生合成酵素であるフィトエン不飽和化酵素（ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ；ＰＤＳ）遺伝子を選択した。ＰＤＳは、植物のカロテノイドの合成に関連しており、ＰＤＳ遺伝子が欠損すると、カロテノイドが生成できなくなり、葉緑体特有の赤い自家蛍光が消失する。
（１）導入物質の調整
　ＰＤＳ遺伝子をターゲットとするためｇＲＮＡのデザインを行い、５’末端側の配列（ｇＲＮＡ＿ｔａｒｇｅｔ１）と、３’末端側の配列（ｇＲＮＡ＿ｔａｒｇｅｔ２）を決定した。
（ａ）ｇＲＮＡ＿ｔａｒｇｅｔ１
　５’－ＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡ－３’（配列番号２）
（ｂ）ｇＲＮＡ＿ｔａｒｇｅｔ２
　５’－ＧＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＧＣＡＡ－３’（配列番号３）
　上記配列番号２および配列番号３に基づき、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社（ＩＤＴ）から、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、並びに、Ｃａｓ９を購入した。
　購入したＣａｓ９、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを以下の濃度となるように調整し、ＩＤＴ社のプロトコルにしたがって、導入物質（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の調整を行った。
・Ｃａｓ９：１０μｇ／１００μｌ
・ｃｒＲＮＡ：１０μｇ／１００μｌ
・ｔｒａｃｒＲＮＡ：１０μｇ／１００μｌ
（２）物質導入
　プラスミドに代え、調整した導入物質（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）を用いた以外は、実施例２と同様の手順で物質の導入を行った。図８Ａの左側の写真は、エレクトロポレーション実施後、約２．５カ月培養後の細胞塊の様子を示す写真である。図８Ａの左側は細胞塊の通常の拡大写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。また、図８Ｃの左側は６．５カ月培養後の細胞塊の通常の写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。
＜比較例４＞
　導入物質を用いなかった以外は、実施例４と同様の手順で実験を行った。図８Ｂの左側の写真は、エレクトロポレーション実施後、約２．５カ月培養後の細胞塊の様子を示す写真である。図８Ｂの左側は細胞塊の通常の拡大写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。また、図８Ｃの左側は６．５カ月培養後の細胞塊の通常の写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。
　図８Ａに示すとおり、ノックアウト物質を導入した実施例４では、〇で囲った細胞塊は自家蛍光が見られなかった。一方、ノックアウト物質を導入しなかった比較例４では、何れの細胞塊も自家蛍光を確認した。
　また、図８Ｃに示すように、６．５カ月培養後の観察でも、実施例４の細胞塊は半透明で植物のカロテノイドが生合成されておらず、自家蛍光も見られなかった。一方、ノックアウト物質を導入しなかった比較例４の細胞塊は、カロテノイドの形成が目視で確認され、自家蛍光も確認できた。
　以上の結果より、導入物質としてＣａｓ９およびｇＲＮＡを用い、標的であるＰＤＳ遺伝子をノックアウトできたことを確認した。
［物質導入実験４］
＜実施例５＞
［タバコの葉のＰＤＳ遺伝子のノックインおよびノックアウト］
　導入物質として、実施例４のＣａｓ９タンパク質とｇＲＮＡに加え、ＧＦＰを発現するｄｓＤＮＡ（１０μｇ／１００μｌ）を用いた。ｄｓＤＮＡの配列は以下のとおり。
５’－ＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＴＧＡＴＴＡＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＣＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＣＧＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＧＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＡＣＴＡＧＡＴＣＣＣＡＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣ－３’（配列番号４）
　エレクトロポレーション実施時に、上記ｄｓＤＮＡも混合液に添加した以外は、実施例４と同様の手順で実験を行った。図９左側は、エレクトロポレーション実施後、約８カ月培養後のシュートの蛍光写真である。
＜比較例５＞
　導入物質を含まなかった以外は、実施例５と同様の手順で実験を行った。図９右側は、エレクトロポレーション実施後、約８カ月培養後のシュートの蛍光写真である。
　図９に示すように、実施例５では、ＰＤＳ遺伝子上にｄｓＤＮＡがノックインされたため、ｄｓＤＮＡの発現により形成したＧＦＰの緑色の蛍光が確認できた。一方、物質を導入していない比較例５では、ＰＤＳ遺伝子が機能していることから、赤い自家蛍光が確認された。以上の結果から、ターゲットであるＰＤＳ遺伝子上にｄｓＤＮＡをノックインできたことを表現型から確認した。
［ＤＮＡ配列の検討］
　次に、実施例５の実験で得られたシュートのＤＮＡ配列の確認を行った。実施例５では、ＰＤＳ遺伝子を切断する機能を有するＣａｓ９およびｇＲＮＡと、切断した箇所に導入するｄｓＤＮＡを混合してエレクトロポレーションを行った。したがって、得られたシュートは、ＰＤＳ遺伝子上にＧＦＰを発現するｄｓＤＮＡがノックインされたゲノムと、ＰＤＳ遺伝子がノックアウトされたゲノムのヘテロとなる。実施例５で得られたシュートの中から、図９に示す表現型でノックインが確認されたシュートを含め、６個の細胞塊およびシュートを選択し、以下の手順によりＤＮＡ配列を調べた。
（１）プライマーの設計
　図１０に示すように、ゲノム編集標的部位を含むＰＤＳ遺伝子（７１３ｂｐ）をＰＣＲで増幅できるように、フォーワードプライマー、リバースプライマーを設計した。配列は以下のとおり。
（ａ）フォーワードプライマー
５’－ＴＧＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣ－３’（配列番号５）
（ｂ）リバースプライマー
５’－ＧＡＧＴＡＣＧＡＡＴＣＣＴＴＡＡＣＴＴＡＴＧＣＣ－３’（配列番号６）
　選択した６種類の細胞塊もしくはシュートから常法により、ＤＮＡを抽出し、上記プライマーを用いてＤＮＡを増幅し、増幅した核酸のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。マーカー（Ｍ）には、１ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　Ｍａｒｋｅｒ（品番：ＢＲＧ－１ｋｂ－０２、品名：ＤＮＡラダーマーカー１ｋｂ、ワトソン株式会社製）を用いた。また、コントロール（Ｃ）には、比較例５で得られた細胞塊から常法により、ＤＮＡを抽出し、上記プライマーを用いてＤＮＡを増幅したものを用いた。
　図１１に電気泳動の結果を示す。レーン番号１３が、図９に示すＧＦＰの緑色の蛍光が確認できたシュートである。次に、図１１中のノックインの表示のあるバンド、および、ノックアウトの表示のバンドを切り出し、シークエンサーを用いて当該バンドのＤＮＡシークエンスを解析した。
　レーン番号１３のノックインのＤＮＡを解析したところ、ＰＤＳ遺伝子の狙った部分にｄｓＤＮＡがヘテロにノックインされていることを確認した。また、レーン番号１０～１６番のノックアウトのＤＮＡを解析したところ、何れもＤＮＡの欠損が確認された。また、ＤＮＡ配列の解析から、レーン番号１０番はキメラノックアウト、レーン番号１１番はキメラノックアウト、レーン番号１２番はヘテロノックアウト、レーン番号１３番はヘテロノックアウト、レーン番号１５番はヘテロノックアウト、レーン番号１６番はホモノックアウトであることも確認した。
　以上の結果より、表現型に加え、ＤＮＡの配列からも、物質導入によりＰＤＳ遺伝子の標的部位のノックインおよびノックアウトを確認した。
＜実施例６＞
　実施例１の電源装置に、ハードタイマーを組み込むことで実施例６の電源装置を作製した。次に、実施例６で作製した電源装置を用い、ハードタイマーの設定を０秒にして、実施例２と同様の手順で物質導入実験を行った。図１２は実施例６で作製した電源装置を用いてパルスを印加した際に、オシロスコープで得られた、１セット目のポレーションパルスの波形を表している（図５Ｂと同じ時間軸）。図１２に示すように、プラスＰｐの印加終了と同時にマイナスＰｐが印加されたことを確認した。また、図示は省略するが、タバコの葉のプロトプラスにプラスミドが導入できたことも確認した。
　本出願で開示する物質導入方法、および、電源装置により、プロトプラストまたは藻類に、物質を効率的に導入できる。したがって、農林水産分野のゲノム編集に有用である。

Claims (6)

  1. 　エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法であって、
    　該物質導入方法は、
    　　一対のエレクトロポレーション用電極の間に、プロトプラストまたは藻類、および、導入する物質を含む混合液を配置する混合液配置工程と、
    　　一対のエレクトロポレーション用電極間に電圧を印加する電圧印加工程と、
    を含み、
    　電圧印加工程が、
    　　一対のエレクトロポレーション用電極の一方に、プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加するポレーションパルス印加工程を１以上含み、
    　　プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が５０μｓｅｃ以下である、
    物質導入方法。
  2. 　ポレーションパルス印加工程の後に、ドライビングパルスを印加するドライビングパルス印加工程を含む、
    請求項１に記載の物質導入方法。
  3. 　導入する物質が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、および、イオン化もしくは帯電する物質、から選択される、
    請求項１または２に記載の物質導入方法。
  4. 　エレクトロポレーター用電源装置であって、
    　電源装置は、
    　　ポレーションパルスを出力するためのポレーションパルス直流電源部と、
    　　制御部と、
    を含み、
    　制御部は、
    　　プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加し、且つ、
    　　プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が５０μｓｅｃ以下、
    となるように、ポレーションパルスの出力を制御する、
    エレクトロポレーター用電源装置。
  5. 　ドライビングパルスを出力するためのドライビングパルス直流電源部を更に含み、
    　制御部は、ポレーションパルスを出力した後、電圧の絶対値がポレーションパルスより小さいドライビングパルスを出力するように制御する、
    請求項４に記載のエレクトロポレーター用電源装置。
  6. 　制御部が、ハードタイマーを更に含む、
    請求項４または５に記載のエレクトロポレーター用電源装置。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0427393A (ja) * 1990-05-22 1992-01-30 Iseki & Co Ltd 植物細胞への遺伝子導入法
JP2001503208A (ja) * 1996-09-09 2001-03-06 ジェネトロニクス・インコーポレイテッド ユーザが設定したパルスを用いる電気穿孔法
JP2002516088A (ja) * 1998-05-22 2002-06-04 エボテック バイオシステムズ アーゲー 生物学的物体の浸透のための方法及びデバイス
JP2008521437A (ja) * 2004-11-30 2008-06-26 マックスサイト インコーポレーティッド コンピュータ化されたエレクトロポレーション
JP2013198637A (ja) * 2012-03-26 2013-10-03 Toshiyuki Moriizumi エレクロトポレーター用電源
JP2014521322A (ja) * 2011-07-25 2014-08-28 クヴェッラ コーポレーション 電気的な試料調製のための方法及びデバイス

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0427393A (ja) * 1990-05-22 1992-01-30 Iseki & Co Ltd 植物細胞への遺伝子導入法
JP2001503208A (ja) * 1996-09-09 2001-03-06 ジェネトロニクス・インコーポレイテッド ユーザが設定したパルスを用いる電気穿孔法
JP2002516088A (ja) * 1998-05-22 2002-06-04 エボテック バイオシステムズ アーゲー 生物学的物体の浸透のための方法及びデバイス
JP2008521437A (ja) * 2004-11-30 2008-06-26 マックスサイト インコーポレーティッド コンピュータ化されたエレクトロポレーション
JP2014521322A (ja) * 2011-07-25 2014-08-28 クヴェッラ コーポレーション 電気的な試料調製のための方法及びデバイス
JP2013198637A (ja) * 2012-03-26 2013-10-03 Toshiyuki Moriizumi エレクロトポレーター用電源

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