CN105695509A - 一种获得高纯度心肌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种获得特异性表达荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因的人诱导多能干细胞株及其用于获得高纯度心肌细胞的方法；包含以下步骤：构建一对TALEN质粒；构建供体质粒；核转染；筛选获得含有荧光蛋白基因和蛋白质合成抑制剂抗性基因的第三改性诱导性人多能干细胞；将所述第三改性诱导型人诱导多能干细胞定向分化成心肌细胞；本发明利用最新的基因修饰工具TALEN，将同源重组的供体质粒的同源臂设计改变到1KB左右，使得进行同源重组需要的筛选技术和基因操作技术大为降低，极大的提高了同源重组的效率。

Description

一种获得高纯度心肌细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种获得高纯度心肌细胞的方法。
背景技术
心脏毒性是药物研发失败的主要原因之一，也是临床前安全评价研究的难题之一。随着技术的发展，诱导型人多能干细胞和人胚胎干细胞定向分化成心肌细胞已经建立起完整的流程。这样通过多能干细胞生成成熟心肌细胞就能为药物研发提供细胞来源。通过分化人多能干细胞生成的心肌细胞就能作为药筛模型大大减少药物开发的时间和成本。所以越来越多的研究者开始使用诱导型人多能干细胞和人胚胎干细胞定向分化成心肌细胞进行药物的心脏毒性测试。
此前已经有研究者通过同源重组的传统方法使用人胚胎干细胞构建出NKX2.5eGFP/w的细胞株，但是由于人胚胎肝细胞的来源以及伦理问题，使用人胚胎干细胞进行治疗受到了一些限制。
此外，使用传统的同源重组技术筛选过程、载体构建过程都极为复杂，DNA的体外扩增工作量极大，这样整个标记细胞株的构建过程就会非常耗时，构建培养NKX2.5eGFP/w细胞株效率较低。
为此，需要一种新的能高效使用诱导型人多能干细胞定向分化成为心肌细胞的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的使用诱导型人多能干细胞定向分化成为心肌细胞，旨在解决现在使用人胚胎干细胞进行细胞分化的问题。
本发明是这样实现的：一种获得高纯度心肌细胞的方法，包含以下步骤：
A.构建TALEN质粒，所述TALEN质粒的靶向为心肌细胞特异性基因外显子；
B.构建供体质粒，所述供体质粒包含所述TALEN质粒的切割位点左右各1000bp序列的同源序列构成的同源臂、荧光蛋白基因、蛋白质合成抑制剂抗性基因；
C.核转染，将所述供体质粒和TALEN质粒共转染入人诱导多能干细胞中，获得第一改性诱导性人多能干细胞；
D．筛选获得含有荧光蛋白基因和蛋白质合成抑制剂抗性基因的第三改性诱导性人多能干细胞；
E.将所述第三改性诱导型人诱导多能干细胞定向分化成心肌细胞。
本方法通过基因敲入的方式同时将荧光分子编码序列和蛋白质合成抑制剂抗性基因定点整合到要标记的基因的起始密码子基因序列内，使得分化得到的心肌细胞能够同时拥有荧光和抗药性双重标记。由于引入了荧光基因，所以可以通过荧光分子的表达强度和表达地点定位和定量我们要研究的基因。此外，本发明利用TALEN方法来提高同源重组效率，将同源重组的供体质粒的同源臂设计改变到1KB左右，极大的降低了实验的难度，并且使得实验效率有了明显提升。这比现有技术有了明显进步。
本发明的进一步改进在于：所述蛋白质合成抑制剂抗性基因可为嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、白喉霉素抗性基因。其中优选的为嘌呤霉素抗性基因，英文为puromycin基因。嘌呤霉素puromycin是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到生长的肽链中。虽然嘌呤霉素能够同A位点结合，但是不能参与随后的任何反应，因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。在这里我们通过加入puromycin基因以及其他蛋白质合成抑制剂抗性基因起到筛选的作用。为了书写方便，下文中统一用puromycin基因为例指代蛋白质合成抑制剂抗性基因。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤B中供体质粒还包括TALEN切割位点左右各1000bp序列基因、终止子SV40pA，LoxP序列基因，磷酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉素基因。这些基因主要为了辅助筛选需要的改性诱导型人诱导多能干细胞。通过步骤C得到的改性诱导性人多能干细胞包括成功转染的和未发生转染的，而发生了转染的改性诱导性人多能干细胞又包括三类，分别是发生了定点整合的细胞、发生了非定点整合的细胞以及因为有供体质粒残留到细胞中使的细胞也具有抗药性但实际上未发生整合的细胞。但是我们只需要发生了定点整合的细胞，所以需要通过一些方法来筛选出目标细胞。所以我们引入了终止子SV40pA，LoxP序列基因，磷酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉素基因以进行D步骤的工作。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤D包括以下分步骤：D1．所述第一改性诱导性人多能干细胞经过新霉素富集后，通过单细胞克隆及PCR鉴定，获得所述供体质粒敲入的第二改性诱导性人多能干细胞；这一步可以将未成功转染以及供体质粒残留到细胞中使的细胞也具有抗药性但实际上未发生整合的细胞的细胞除去，只留下成功转染的细胞。
D2．通过核转染转入CRE重组酶，切除磷酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉素抗性基因，获得心肌细胞特异性基因具有荧光蛋白基因和蛋白质合成抑制基因标记的第三改性诱导多能干细胞株。
本发明的进一步技术方案是：E步骤中所述第三改性诱导性人多能干细胞利用荧光蛋白基因进行流式细胞术分选纯化心肌细胞，也可以通过蛋白质合成抑制剂抗性基因的药物抗性获得高纯度的心肌细胞。
本发明的进一步技术方案是：所述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、远红外色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、橙色、荧光蛋白基因，橙红色荧光蛋白基因，翠绿色荧光蛋白基因中的一种。其中优选的为绿色荧光蛋白基因eGFP。绿荧光蛋白是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基，其发光过程不同于其它生物发光组织，是不需荧光素酶参与的。eGFP基因产生的荧光明显，颜色对比度较大，比较适合进行观察和计算。
本发明的进一步技术方案是：所述绿色荧光蛋白基因和蛋白合成抗性基因可通过P2A，F2A,E2A,和T2A序列进行共表达。
本发明的进一步技术方案是：所述心肌细胞特异性基因为Nkx2.5。Nkx2.5参与了心脏形成,包括右侧环化、心腔分化、心脏间隔功能成熟以及工作心肌和传导系统的维持等过程，是多能干细胞分化成为心肌细胞的重要工具。
本发明的有益效果是：首先，本发明使用诱导型人多能干细胞定向分化成为心肌细胞，来源方便，使用人体尿液即可，不存在伦理上问题。
其次，本发明利用最新的基因修饰工具TALEN，将同源重组的供体质粒的同源臂设计改变到1KB左右，使得进行同源重组需要的筛选技术和基因操作技术大为降低，极大的提高了同源重组的效率。
附图说明
图1是本发明实施例提供的TALEN质粒构建序列图。
图2是本具体实施例中SingleStrandAnnealing测试图解。
图3是本发明实施例提供的293T细胞在转染后的细胞荧光照片。
图4是本发明实施例提供的Donor质粒构建示意图。
图5是本发明实施例提供的经过药杀后的单克隆细胞连接PCR的结果。
图6是本发明实施例提供的经过药杀后的单克隆细胞测序分析结果。
图7是本发明实施例提供的经过PCR扩展显示阳性并且细胞测序正确的单克隆细胞进行Southern杂交的结果图。
图8是本发明实施例提供的切除筛选标记基因的示意图。
图9是本发明实施例提供的切除筛选标记基因的结果图。
图10是本发明实施例提供的诱导性人多能干细胞分化出的心肌细胞的荧光照片。
图11是本发明实施例提供的cTNT阳性的心肌细胞比例（cTNT%），A为第16-18天筛选前的心肌细胞cTNT%，B为GFP分选后的心肌细胞cTNT%，C为Neomycin处理后的心肌细胞cTNT%。
具体实施方式
可以进行以下操作以实现本发明提供的高效获得心肌细胞的方法。
（1）TALEN设计与组装
选取基因NKX2.5（Homosapiens）的CDS区在1号外显子序列进行BLAST，未发现假基因序列，在1号外显子设计插入位点。用Golden-Gate法对TALENs进行组装。
TALEN即转录激活因子样效应物核酸酶，包括识别DNA序列的TALE和切割DNA的核酸酶部分，是基因修饰中的重要工具之一。TALE蛋白中间为33-35个氨基酸的重复结构组成，但第12位跟13位氨基酸可变，称为重复单元可变的双氨基酸残基（RVD）.TALE单体通过RVD识别单个核苷酸，对应关系为：NG=T,HD=C,NI=A,NN=G或者A，其中N为天冬酰胺，H为组氨酸，I为异亮氨酸，D为天冬氨酸，A、T、G、C为四种核苷酸。本具体实施例中针对NKX2.5左臂和右臂的TALENRVDs如图一所示。可以看到左臂的TALEN质粒的核苷酸序列是CGGGCCCAGCGTAGGC，右臂的TALEN质粒的核苷酸序列是CCTCCTGCATGCTGGC。
TALEN质粒的左臂序列如序列表中SEQIDNO:1所示。
TALEN质粒的右臂序列如序列表中SEQIDNO:2所示。
TALEN质粒构建完成之后，需要对其进行测试，以确保TALEN的切割活性以及切割正确性。
（2）SingleStrandAnnealing测试
SSA，即单链退火检测原理如图2所示，在GFP（绿色荧光蛋白）表达载体中，GFP基因被TALEN或者CRISPR识别位点分割为两部分；当GFP表达质粒和TALEN或者CRISPR质粒二者共转入细胞后，被TALEN或者CRISPR切割为线性的GFP表达载体质粒重新形成完整的GFP基因，其发光强弱代表TALEN或者CRISPR的切割效率。
扩增NKX2.5识别序列并克隆至报告基因质粒，然后将TALEN质粒对与对应的报告基因质粒转染进入293T细胞，然后以GFP表达的情况反应TALEN的切割活性。荧光亮度越高说明TALEN切割活性越高。在本具体实施例中，进行SingleStrandAnnealing测试20小时和44小时后的荧光效率照片如图3所示，可以看出随着时间增长，293T细胞的GFP荧光表达越来越强，并且在44小时的时候荧光效率超过了30%，而作为对照组的单独转染报告质粒的细胞没有GFP表达。这说明了TALEN切割的成功。
（3）Donor质粒构建
在确定了内源活性的TALEN靶点NKX2.5后，需要构建Donor质粒用于基因敲入的服务。Donor质粒左右臂序列根据TALEN切割位点选取左右各大约1000bp序列亚克隆出来连接到并载体上。如图4所示，E1表示1号外显子,E2表示2号外显子,TALEN切割位点位于E1。Donor质粒从左到右的结构依次是左臂序列、eGFP编码序列、P2A片段、POROMYCIN编码序列、SV40PA/BGHpA转录终止片段、LoxP序列、SV40PA/BGHpA转录终止片段、NEOMYCIN编码序列、PGK启动子以及右臂序列。其中NEOMYCIN基因通过CRE-LOXP系统切除。
Donor质粒的序列如序列表中SEQIDNO:3所示。
（4）转染
将诱导性人多能干细胞iPSCs在包被matrigel的六孔板上培养，matrigel是一种基质胶。每天更换mTeSR1培养基，培养条件为37℃，5%CO2；待细胞达到80%汇合率时可进行电转。电转前用Accutase消化剂将细胞消化成单细胞，通过核转染试剂和电转程序A-024将TALEN质粒和Donor质粒共转进100万iPS细胞中。将转染后的细胞铺至包被过matrigel的六孔板的一个孔中，用mTeSR1及10uMRockinhibitor培养，次日改用mTeSR1培养，每天更换培养基，待细胞密度达80%进行传代，约每4天传代一次。
（5）Neomycin筛选
电转后传3代，在转染后第13天进行药杀，药杀即是Neomycin筛选，细胞密度约50%，用含0.5mg/mLG418的mTeSR1处理细胞24h，处理过程添加10uMRockinhibitor，24h后用mTeSR1培养细胞，细胞存活率约为10%。
G418（Geneticin,遗传霉素）是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
（6）单细胞克隆建立
进行单细胞克隆的前一天复苏feeder到T25瓶中；用Accutase将iPS细胞消化成单细胞，按照500cells/瓶的密度将单细胞接种到feeder上，用KSR培养基及10uMRockinhibitor培养，摇匀后放入37℃5%CO2培养箱进行培养。从第三天开始每天更换KSR培养基；第三到第四天可见小克隆形成，第十一天挑取单细胞克隆至包被matrigel的96孔板上。一共挑取了97个克隆。用0.5mg/mLG418进行药杀，结果46个克隆存活。Feeder是滋养层细胞，现在也可以使用无滋养层细胞来做。
（7）连接PCR
每个克隆分成两份，一份用于扩增，一份用于鉴定。用快速裂解液提取DNA，进行连接PCR及测序分析。在基因组和Knock-IN片段内分别设计引物进行PCR扩展。对单细胞克隆后再次药杀存活的46个克隆进行连接PCR鉴定，结果如图5所示，有34个克隆左臂和右臂均阳性。图5中箭头所指编号为PCR阳性克隆。
（8）测序
通过细胞测序确认供体质粒发生整合的位置的正确性，另外也可以排除同源基因中没有整合供体质粒的那个同源基因没有发生因TALEN切割产生的突变。利用SUVEYORYAssay引物进行PCR扩增及测序，分析敲入序列的正确性以及NHEJ情况。图6是测序结果，被检测克隆在另外一个NKX2.5位点含NHEJ，说明是单敲入克隆。
（9）Southern杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
用WizardGenomicDNAPurificationKit提取基因组DNA。以5’–ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA和5’–TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGA为引物从Donor质粒中扩增GFPprobe序列，用PCRDIGProbeSynthesisKit（Roche，Cat#11636090910）标记探针。用HindⅢ酶切基因组DNA，用DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII（Roche，Cat#11585614910）进行杂交检测。
将连接PCR阳性，且测序正确的34个细胞克隆中选取3个进行Southern杂交。结果如图7所示，目的条带大小约4.7kb；N为野生型对照,1、2、3为待检测克隆。有第1和3两个细胞是发生正确插入的克隆。
（10）切除筛选标记
选取上步骤中经过确认正确插入的克隆，通过转染Cre表达质粒对筛选标记基因Neomycin进行切除，然后再进行单细胞克隆，从中筛选出5个正确切除Neomycin基因的克隆。如图8所示，将Donor质粒中LoxP序列之间的PGK启动子、NEOMYCIN编码序列和SV40PA/BGHpA终止转录片段切去。图9是测试是否切除标记基因的PCR结果，可见成功切除标记基因的细胞和没有成功切除标记基因的细胞在色谱上具有显著差异。
（11）心肌分化
选取切除Neomycin标记基因的克隆进行心肌细胞定向分化，利用3D培养的方法，经过基因修饰的iPSC可以高效分化为心肌细胞，可以自发搏动，并发出如图10所示的绿色荧光。从图10可以看出，对照组iPSC来源EB在第18天检测不到绿色荧光，而NKX2.5GFP-PURO/W来源EB在第11天即可检测到绿色荧光。
对第16-18天的EB进行FACS鉴定，结果如图11所示,cTNT阳性率为64.7%,利用GFP分选或Puromycin处理之后,cTNT阳性率高达95%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：
A.构建TALEN质粒，所述TALEN质粒的靶向为心肌细胞特异性基因外显子；
B.构建供体质粒，所述供体质粒包含所述TALEN质粒的切割位点左右各1000bp序列的同源序列构成的同源臂、荧光蛋白基因、蛋白质合成抑制剂抗性基因；
C.核转染，将所述供体质粒和TALEN质粒共转染入人诱导多能干细胞中，获得第一改性诱导性人多能干细胞；
D．筛选获得含有荧光蛋白基因和蛋白质合成抑制剂抗性基因的第三改性诱导性人多能干细胞；
E.将所述第三改性诱导型人诱导多能干细胞定向分化成心肌细胞。
2.根据权利要求1所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤B中供体质粒还包括终止子SV40pA、LoxP序列、串联细胞因子、磷酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉素基因。
3.根据权利要求2所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤D包括以下分步骤：
D1．所述第一改性诱导性人多能干细胞经过新霉素富集后，通过单细胞克隆及PCR鉴定，获得所述供体质粒确定敲入的第二改性诱导性人多能干细胞；
D2．将CRE重组酶通过核转染转入所述第二改性诱导性人多能干细胞，切除磷酸甘油激酶启动子及其控制下的新霉素抗性基因，获得心肌细胞特异性基因具有荧光蛋白基因和蛋白质合成抑制剂基因标记的第三改性诱导多能干细胞株。
4.根据权利要求3所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：E步骤中所述第三改性诱导性人多能干细胞利用荧光蛋白基因进行流式细胞术分选纯化心肌细胞。
5.根据权利要求3所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：E步骤中所述第三改性诱导性人多能干细胞利用蛋白质合成抑制剂抗性基因的药物抗性获得高纯度的心肌细胞。
6.根据权利要求1所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：所述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、远红外色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、橙色荧光蛋白基因、橙红色荧光蛋白基因、翠绿色荧光蛋白基因中的一种。
7.根据权利要求1所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：所述蛋白质合成抑制剂抗性基因可为嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、白喉霉素抗性基因中的一种。
8.根据权利要求2所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：所述绿色荧光蛋白基因和蛋白质合成抑制剂抗性基因可通过串联因子进行共表达，所述串联因子为P2A，F2A,E2A,和T2A序列中的一种。
9.根据权利要求1所述的获得高纯度心肌细胞的方法，其特征在于：所述心肌细胞特异性基因外显子为NKX2.5。
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