CN104726492A - 构建lqt疾病模型的方法及其在筛选药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了构建LQT疾病模型的方法及其在筛选药物中的应用，该方法包括：(1)利用附着体载体，将重编程因子编码基因引入携带LQTS相关突变基因的体细胞中，以便获得诱导多能干细胞；以及(2)在适于所述诱导多能干细胞分化的条件下，培养所述诱导多能干细胞，以便获得心肌细胞，所述心肌细胞构成所述LQTS疾病模型。利用该方法，能够快速有效地制备获得LQTS疾病模型。

Description

构建LQT疾病模型的方法及其在筛选药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及构建LQT疾病模型的方法及其在筛选药物中的应用。

背景技术

先天性长QT综合征(long QT syndrome，LQTS)属于遗传性心律失常，是由于编码心肌细胞离子通道的基因异常所导致，也被称为“离子通道病”。LQTS患者具有QT间期延长(大于0.48秒)和T波形态异常的心电图特征，临床表现为反复发作的晕厥和室性心律失常，尤其是尖端扭转性室性心动过速(Torsade de pointes,TdP)。据统计，未经治疗的LQTS患者的10年死亡率高达50％，且约1/2500的患者终身伴随猝死风险。美国近年数据显示，LQTS在人群中的发病率约1:2000～1:5000，尤其多见于儿童和青少年。据此推算，我国LQTS患者接近30万。由于LQTS具有发病突然、猝死率高、青少年多发的特点，已成为遗传性心律失常的研究前沿和热点。目前认为先天性LQTS是由于调控心室肌细胞膜复极化离子通道的基因发生突变所致。

然而，目前关于LQTS疾病模型的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效构建LQT疾病模型的方法。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种构建心肌细胞的方法，构建获得的心肌细胞可以作为LQT疾病模型。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)利用附着体载体，将重编程因子编码基因引入携带LQTS相关突变基因的体细胞中，以便获得诱导多能干细胞；以及(2)在适于所述诱导多能干细胞分化的条件下，培养所述诱导多能干细胞，以便获得心肌细胞，所述心肌细胞构成所述LQTS疾病模型。发明人发现，利用本发明的该方法，能够快速有效地制备获得LQTS疾病模型，且适于构建JLNS型LQT疾病S疾病模型，另外，本发明的方法利用附着体载体方式进行重编程，避免了逆转录病毒引起的基因组不稳定性及潜在的致癌性的风险，提高重编程效率。已知附着体质粒在作为载体将外源基因引入细胞中时，不会整合到供体细胞基因组中，并且附着体质粒可以在后续细胞传代过程中丢失，因此可以得到无外源基因整合的重组细胞。但之前的很多尝试利用附着体质粒作为载体将重编程因子引入体细胞中来获得诱导多能干细胞(iPSC)都未能成功，原因在于获 得诱导多能干细胞需要同时转入多个重编程因子，成功效率低。

本发明的发明人通过采用经过优化的重编程因子的组合以及附着体质粒的分配，可以成功地将重编程因子引入到来自LQT疾病患者的体细胞中。在本文中，所使用的术语“重编程因子”是指一种或多种生物活性因子(例如生物活性因子混合物)，其作用在细胞上以改变转录，从而使细胞重编程为多潜能性(multipotency)或多能性(pluripotency)细胞。可以向细胞提供重编程因子，所述细胞例如来自具有感兴趣心脏病的家族史或遗传组成的个体的细胞，例如成纤维细胞、脂肪细胞、尿液细胞等，这些因子能够单独提供或以重编程因子的单一组合物(即预先混合的组合物)来提供。可以相同的摩尔比或不同的摩尔比来提供该因子。可以在培养本发明的细胞的过程中一次或多次提供该因子。根据本发明的实施例，所述重编程因子包括：OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、SV40LT、L-MYC和LIN28。由此，有利于提高重编程效率。根据本发明的实施例，所述附着体载体包括：第一附着体质粒，所述第一附着体质粒携带编码OCT4的核苷酸序列、编码SOX2的核苷酸序列、编码KLF4的核苷酸序列、编码NANOG的核苷酸序列；第二附着体质粒，所述第二附着体质粒携带编码OCT4的核苷酸序列、编码SOX2的核苷酸序列、编码KLF4的核苷酸序列、编码SV40LT的核苷酸序列；以及第三附着体质粒，所述第三附着体质粒携带编码L-MYC的核苷酸序列、编码LIN28的核苷酸序列。由此，能够有效提高重编程效率，且第三附着体质粒携带编码L-MYC的核苷酸序列可以大大降低致癌风险。在本发明的实施例中，发明人还利用常规的逆转录病毒转染方法来获得诱导多能干细胞，通过比较发现，通过采用上述附着体质粒组合，可以实现下列优点的至少之一：

1)安全，根据本发明的实施例，可以获得无外源基因整合的iPSC，具有很大的细胞治疗方面的潜力；而逆转录病毒在重编程过程中会整合到细胞基因组中去，会对供体细胞基因组造成一定的干扰，并有致癌风险。

2)与传统质粒相比，附着体质粒的表达时间较长，可以随细胞的复制而复制，丢失较慢，因此对于2-3周的重编程来讲，可以起到稳定表达外源基因的作用。

根据本发明的实施例，所述携带LQT相关突变基因的体细胞为来自LQT患者的尿液细胞。由此，避免了从皮肤等部位取样而对患者造成的疼痛和伤害。本发明的发明人惊奇地发现利用本发明经过优化的重编程因子的组合以及附着体质粒的分配，可以成功地将重编程因子引入到来自LQT疾病患者的尿液细胞中。

根据本发明的实施例，所述LQT相关突变基因与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(NCBI索取号：CCDS7736.1)相比具有c.605-2A>G/c.815G>A的突变。换句话说，也就是SEQ ID NO：1中第605位的A突变为G，第815位的G突变为A。

根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：(1-1)将所述附着体载体转染所述携 带LQT相关突变基因的体细胞中，得到转染后的体细胞；(1-2)于37℃、5％CO₂条件下，利用无滋养层人诱导多能干细胞(hiPSC)重编程培养基培养所述转染后的体细胞；(1-3)在转染后的第15天将培养基换成mTeSR1继续培养；(1-4)在转染后的第25天，选取具有典型人诱导多能干细胞形态的克隆进行纯化扩增，以便获得所述诱导多能干细胞。由此，能够快速有效地制备获得诱导多能干细胞，且重编程效率高、致癌风险低、安全性高。另外，获得的诱导多能干细胞核型正常，高表达多能性标记物内源Oct4和内源Sox2，Nanog，Rex1，表达量与人胚胎干细胞株H9相当。

根据本发明的实施例，所述编码OCT4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：2所示的序列；所述编码SOX2的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：3所示的序列；所述编码NANOG的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：4所示的序列；所述编码SV40LT的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：5所示的序列；所述编码KLF4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：6所示的序列；所述编码L-MYC的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：7所示的序列；以及所述编码LIN28的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：8所示的序列。由此，发明人发现可以进一步提高重编程的效率。

根据本发明的实施例，由诱导多能干细胞分化为心肌细胞的方法并不受特别限制，发明人经过多次筛选实验，发现，可以所述心肌细胞是通过下列步骤获得的。具体的，步骤(2)进一步包括：(2-1)利用分散酶对步骤(1)中所得到的所述诱导多能干细胞进行分散，(2-2)按照2X10⁵个细胞/10平方厘米，将所述多能干细胞接种在包被基质胶的含有mTeSR1培养基的平板上，并培养至融合度为70～90％融合度；(2-3)在超慢贴附六孔板中，使用ACCUTASE细胞消化液，将步骤(2-2)中所得到的培养物消化为单细胞，并在含有Matrigel(40mg/mL)、BMP4(1ng/mL；Invitrogen)和Rho激酶抑制剂(ROCK)(10mM；R&D)的mTeSR1培养基中5％氧气条件下进行培养24小时；(2-4)将步骤(2-3)中所得的培养物进行清洗，并更换为含有抗坏血酸(AA,50mg/mL；Sigma)、2mM Gluta-MAX-1(Invitrogen)、BMP4(10ng/mL)和人重组激活素-A(10ng/mL；Invitrogen)的StemPro34SFM培养基中培养三天；以及(2-5)向所得到的培养物中添加Wnt抑制剂IWR-1(5mM；Enzo Life Sciences)后继续培养4天，以便获得所述心肌细胞。由此可以显著提高获得心肌细胞的效率。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种心肌细胞。根据本发明的实施例，所述心肌细胞是通过前面所述的方法构建的。

在本发明的再一方面，本发明提供了前面所述的心肌细胞在筛选药物中的用途，所述药物用于治疗LQT疾病，优选JLNS型LQT疾病。发明人发现，本发明的心肌细胞保留LQTS的基因型，心肌细胞表现出的特性与患者的临床特征相吻合，通过使所述心肌细胞 与药物接触，能够有效筛选用于治疗LQT疾病，特别是JLNS型LQT疾病的药物。具体的，根据本发明的实施例，将候选化合物与根据本发明实施例的心肌细胞接触，并且检测与候选化合物前后，心肌细胞的动作电位时程的延长，如果接触后动作电位时程明显的延长得到明显改善，则说明该候选化合物可以用于治疗LQT疾病。利用该方法，发明人验证了目前所使用的exiletine满足上述筛选要求。

在本发明的又一方面，本发明提供了一种制备诱导多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)利用附着体载体，将重编程因子编码基因引入体细胞；以及(2)在适于体细胞重编程的条件下，对步骤(1)中得到的细胞进行培养，以便获得诱导多能干细胞。发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备获得诱导多能干细胞，且利用附着体载体方式进行重编程，避免了逆转录病毒引起的基因组不稳定性及潜在的致癌性的风险，提高重编程效率。

本发明的发明人通过采用经过优化的重编程因子的组合以及附着体质粒的分配，可以成功地将重编程因子引入到来自LQT疾病患者的体细胞中。在本文中，所使用的术语“重编程因子”是指一种或多种生物活性因子(例如生物活性因子混合物)，其作用在细胞上以改变转录，从而使细胞重编程为多潜能性(multipotency)或多能性(pluripotency)细胞。可以向细胞提供重编程因子，所述细胞例如来自具有感兴趣心脏病的家族史或遗传组成的个体的细胞，例如成纤维细胞、脂肪细胞、尿液细胞等，这些因子能够单独提供或以重编程因子的单一组合物(即预先混合的组合物)来提供。可以相同的摩尔比或不同的摩尔比来提供该因子。可以在培养本发明的细胞的过程中一次或多次提供该因子。根据本发明的实施例，所述重编程因子包括：OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、SV40LT、L-MYC和LIN28。由此，有利于提高重编程效率。根据本发明的实施例，所述附着体载体包括：第一附着体质粒，所述第一附着体质粒携带编码OCT4的核苷酸序列、编码SOX2的核苷酸序列、编码KLF4的核苷酸序列、编码NANOG的核苷酸序列；第二附着体质粒，所述第二附着体质粒携带编码OCT4的核苷酸序列、编码SOX2的核苷酸序列、编码KLF4的核苷酸序列、编码SV40LT的核苷酸序列；以及第三附着体质粒，所述第三附着体质粒携带编码L-MYC的核苷酸序列、编码LIN28的核苷酸序列。由此，能够有效提高重编程效率，且第三附着体质粒携带编码L-MYC的核苷酸序列可以大大降低致癌风险。在本发明的实施例中，发明人还利用常规的逆转录病毒转染方法来获得诱导多能干细胞，通过比较发现，通过采用上述附着体质粒组合，可以实现下列优点的至少之一：

1)安全，根据本发明的实施例，可以获得无外源基因整合的iPSC，具有很大的细胞治疗方面的潜力；而逆转录病毒在重编程过程中会整合到细胞基因组中去，会对供体细胞基因组造成一定的干扰，并有致癌风险。

2)与传统质粒相比，附着体质粒的表达时间较长，可以随细胞的复制而复制，丢失较慢，因此对于2-3周的重编程来讲，可以起到稳定表达外源基因的作用。

根据本发明的实施例，所述体细胞为尿液细胞。根据本发明的一个具体示例，所述体细胞可以为来自LQT患者、携带LQT相关突变基因的尿液细胞。由此，避免了从皮肤等部位取样而对患者造成的疼痛和伤害。本发明的发明人惊奇地发现利用本发明经过优化的重编程因子的组合以及附着体质粒的分配，可以成功地将重编程因子引入到来自LQT疾病患者的尿液细胞中。

根据本发明的实施例，所述LQT相关突变基因与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(NCBI索取号：CCDS7736.1)相比具有c.605-2A>G/c.815G>A的突变。换句话说，也就是SEQ ID NO：1中第605位的A突变为G，第815位的G突变为A。

根据本发明的实施例，本发明的制备诱导多能干细胞的方法包括：将所述附着体载体转染所述携带LQT相关突变基因的体细胞，得到转染后的体细胞；于37℃、5％CO₂条件下，利用无滋养层人诱导多能干细胞(hiPSC)重编程培养基培养所述转染后的体细胞；在转染后的第15天将培养基换成mTeSR1继续培养；在转染后的第25天，选取具有典型人诱导多能干细胞形态的克隆进行纯化扩增，以便获得所述诱导多能干细胞。由此，能够快速有效地制备获得诱导多能干细胞，且重编程效率高、致癌风险低、安全性高。另外，获得的诱导多能干细胞核型正常，高表达多能性标记物内源Oct4和内源Sox2，Nanog，Rex1，表达量与人胚胎干细胞株H9相当。

根据本发明的实施例，所述编码OCT4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：2所示的序列；所述编码SOX2的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：3所示的序列；所述编码NANOG的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：4所示的序列；所述编码SV40LT的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：5所示的序列；所述编码KLF4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：6所示的序列；所述编码L-MYC的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：7所示的序列；以及所述编码LIN28的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：8所示的序列。由此，发明人发现可以进一步提高重编程的效率。

发明人发现，利用本发明的方法，能够快速有效地制备获得诱导多能干细胞，且操作简单、致癌性低，安全可靠。根据本发明的具体示例，利用携带LQT相关突变基因的尿液细胞重编程获得的诱导多能干细胞，获得的诱导多能干细胞核型正常，高表达多能性标记物内源Oct4和内源Sox2，Nanog，Rex1，表达量与人胚胎干细胞株H9相当，且可进一步分化形成心肌细胞，该心肌细胞保留有LQT疾病的相关特性，表现出与LQT疾病相同的临床症状，能够有效用于构建疾病模型、药物筛选等，以及用于研究LQT疾病的机理等。

附图说明

图1显示了根据本发明的一个实施例，LQTL2iPSC重编程及鉴定结果，其中，

图1A显示了逆转录病毒重编程LQTL2分别在第8天、第15天、第20天和第21天克隆的形态，对应的下图为选定区域放大16倍后的细胞状态；

图1B显示了外源基因沉默检测结果，其中，LQTL2纯化好的克隆用qPCR对外源基因沉默进行检测，阳性对照选择逆转录病毒转染后第6天的细胞，阴性对照选择供体细胞；

图1C显示了qPCR检测C2和C14多能性标记物内源Oct4、内源Sox2、Nanog和Rex1的表达结果，其中，阳性对照为H9ESCs(P54)，供体细胞的表达量设为1；

图1D显示了G显带法核型分析结果，显示克隆C2、C14均为正常的46，XY核型；

图1E显示了流式细胞分析hiPSCs表面标记物Tra-1-60检测结果，其中，LQTL2-C2的阳性率为97.4％，LQTL2-C14阳性率为99.6％，不使用一抗仅使用二抗的样品作为对照；

图1F显示了重硫酸盐法对Oct4和Nanog启动子区进行甲基化分析结果，其中，白色圆圈表示去甲基化的CpGs，黑色圆圈表示甲基化；H9ESC和供体细胞作为对照；

图1G显示了外源基因整合检测结果，其中，LQTL2-C2和C14都整合了外源性的Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc，供体细胞作为阴性对照，四个因子相对应的pMXs质粒作为阳性对照；

图1H显示了体外分化实验(EB形成)结果，其中，左侧表示LQTL2-C2和C14EB球悬浮第8天和贴壁第8天的镜检图，右图为提取LQTL2-C2EB贴壁之后第8天细胞的mRNA，用qPCR检测各内中外三个胚层标记物的表达，LQTL2-C2未分化iPSC的表达量设为1；

图2显示了根据本发明的一个实施例，LQTL1iPSC重编程及鉴定结果，其中，

图2A显示了附着体质粒组合的结构示意图；

图2B显示了附着体质粒重编程LQTL1第16天、第18天和第21天克隆形变情况，对应的下图是选定区域放大16倍后的细胞图片；

图2C显示了第25天的克隆形态，其中，右侧图为左侧图4倍放大；

图2D显示了qPCR检测LQTL1-C4和C5多能性标记物内源的Oct4、Sox2、Nanog、Lin28的表达结果，其中，阳性对照为H9ESC(P54)，供体细胞相关基因的表达量设为1；

图2E显示了流式细胞分析hiPSCs表面标记物Tra-1-60的表达结果，其中，LQTL1-C4和C5的阳性率分别为96.4％、90.8％；不使用一抗仅使用二抗的样品作为 对照；

图2F显示了G显带法核型分析结果，其中，克隆LQTL1-C4、C5均为正常的46，XY核型；

图2G显示了重硫酸盐法对LQTL1-C4，C5的Oct4和Nanog启动子区进行甲基化分析结果，其中，白色圆圈表示去甲基化的CpGs，黑色圆圈表示甲基化，H9ESC和供体细胞分别作为对照；

图2H显示了体外分化实验(EB形成)结果，其中，左侧表示LQTL1-C4和C5EB球悬浮第8天和贴壁第8天的镜检图，右图为提取LQTL1-C4EB贴壁之后第8天细胞的mRNA，用qPCR检测各内中外三个胚层标记物的表达，LQTL1-C4未分化iPSC的表达量设为1；

图2I显示了PCR分析附着体质粒残留结果，其中，PCR模板使用细胞的质粒提取物，T-OCT4表示外源性OCT4，T-NANOG表示外源性NANOG，T2-KLF4表示外源性KLF4(2)，T-SOX2表示外源性SOX2，T-SV40LT表示外源性SV40LT，T-LIN28表示外源性LIN28，T-L-MYC表示外源性L-MYC，OCT4表示内源性OCT4；

图2J显示了Transgene检测外源基因沉默结果，其中，LQTL1供体细胞作为阴性对照，重编程所用质粒作为阳性对照，实验组没有检测到相关外源基因的表达；

图2K显示了外源基因整合检测中LQTL1供体细胞作为阴性对照，重编程所用质粒作为阳性对照，实验组细胞均没有整合外源质粒。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

根据临床症状及心电图表现，选取1名携带c.605-2A>G/c.815G>A突变的LQTS患者，收集患者及其双亲尿液，分别提取尿液上皮细胞。获得的3株供体细胞分别命名为LQTL1(儿子)，LQTL2(父亲)，LQTH1(母亲)。在该家族中，儿子为LQT综合征患者，父母为携带者。

实施例1：逆转录病毒重编程

(1)供体细胞LQTL1和LQTL2用尿细胞扩增培养基(CIB,Cat#Iso-1030)培养。 感染病毒前一天将尿液上皮细胞按2万细胞分至12孔板1孔。

(2)采用PEI转染法转染pMXs病毒质粒进293T细胞，即利用293T细胞分别包装病毒pMXs-Oct4(O)、pMXs-Sox2(S)、pMXs-Klf4(K)、pMXs-c-Myc(M)以及pMXs-eGFP，获得编码pMXs-Sox2/Klf4/Oct4/c-Myc的逆转录病毒，病毒上清用0.45μm滤膜过滤，获得感染液。

(3)向感染液中加8μg/ml聚凝胺(polybrene)，分两次使用病毒组合OSKM感染步骤(1)中培养获得的细胞LQTL1和LQTL2，eGFP感染细胞作为感染效率的对照，感染后的细胞用人诱导多能干细胞(hiPSC)重编程培养基(CIB,Cat#Rep-1102)继续培养。

(4)在培养第6天将细胞铺到有饲养层(将小鼠胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C处理后得到)的T25瓶，每瓶2万细胞，培养基不变，每天换液。

(5)在培养第9天陆续有小克隆出现，第20天左右基本可以从形态上判定是否为类hESC的iPSC克隆，随后将具有典型iPSC形态的克隆挑出来纯化、扩增，用ECM(Sigma)包被的培养板培养克隆，培养基是mTeSR1(StemCell)，每天换液，获得LQTS患者特异性iPS细胞两株L1C4和L1C5，以及患者父亲iPS细胞两株L2C2和L2C14。

其中，整个诱导过程在37℃，5％CO₂条件下进行。 

结果：使用基于pMXs质粒的编码Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc的逆转录病毒转染尿液细胞LQTL1和LQTL2，成功地得到了LQTL1和LQTL2来源的hiPSCs，感染后细胞利用人iPSC重编程培养基(CIB)培养第4天时，细胞开始有明显形变，细胞变短并且呈小眼睛状的细胞增多。培养第6天时将细胞铺至滋养层细胞上继续培养，大约至第8天时，有许多克隆团出现；第15天时，具有hiPSCs典型形态的克隆开始出现，至第20天，大量典型hiPSCs形态的克隆出现，培养20天时的细胞形态见图1A。

实施例2：非整合iPSC重编程

1)供体细胞LQTH1用尿细胞扩增培养基(CIB,Cat#Iso-1030)培养。

2)转染前用胰酶将供体细胞LQTH1消化成单细胞，用尿液细胞扩增培养基(CIB,Cat#Iso-1030)终止消化，200g离心3mins，弃上清液，用培养基重悬细胞，台盼蓝计数后取100万细胞用于核转染。

3)通过核转染试剂(Lonza,VPI-1005)和电转程序S-0005(AmaxaNucleofector II)将Episome质粒组合(购自Addgene，其中质粒pCEP4-M2L使用的是CIB将c-Myc替换为L-Myc的质粒)共转进100万供体细胞，其中，Episome质粒组合的结构示意图见图2A。

4)将转染后的细胞铺至2个ECM包被过的T25瓶，用人诱导多能干细胞(hiPSC) 重编程培养基培养(CIB,Cat#Rep-1101)，于37℃、5％CO₂条件下培养，隔天换液。

5)在转染后的第15天将培养基换成mTeSR1(Stem Cell)，每天换液。

6)在转染后的第25天，将人诱导多能干细胞(hiPSC)挑取出来用于后续纯化扩增，获得患者母亲iPS细胞两株Q1C3和Q1C6。

结果：使用附着体质粒组合成功地将LQTL1重编程为iPSCs。其中，在转染后的第16天时细胞出现明显形变，并且在第21天时基本呈现hiPSC的典型形态(转染后第21天的细胞形态见图2B)。转染后第25天，挑取具有典型hiPSCs形态的克隆至ECM包被的12孔板上进行纯化培养(转染后第25天的细胞形态见图2C)，经过大约一个月的纯化之后，细胞呈现非常均一的hiPSC克隆形态，边缘清晰，核质比大，克隆中的细胞呈眼睛状形态。

实施例3：iPSC鉴定

(1)核型分析

1)将实施例2中所得到的诱导多能干细胞在终止培养前3小时，加秋水仙碱处理细胞，培养终止后加胰蛋白酶收集细胞。

2)0.075M低渗液(0.075M低渗液KCl溶液)处理，稍后加入固定液(冰乙酸：甲醇＝1:3)固定细胞，重复固定1-2次。

3)视细胞量多少加适量固定液制成细胞悬液，吸取细胞悬液滴在玻片上，玻片放在烘箱中烘烤。

4)将玻片放入pH为7.0～7.2的胰酶中消化，再放入37℃NaCl溶液中清洗。

5)将玻片用Giemsa染液染色，晾干后用OLYMPUS,BX41/BX2阅片。

(2)甲基化分析 

在该实施例中，采用常规的重亚硫酸盐测序法(该方法被视为测定甲基化程度的金标准)对Oct4和Nanog启动子区进行甲基化分析，其中，采用H9ESC和供体细胞作为对照。在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶可以被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。大多数脊椎动物基因组DNA都会含有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因的5’端非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传。重亚硫酸盐能够使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，通过PCR扩增所需要的片段，则尿嘧啶能够全部转化成胸腺嘧啶。简言之，在本实施例中所采用的重亚硫酸盐测序法包括：

a、利用重亚硫酸盐(亚硫酸氢钠)处理基因组DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。

b、采用BSP引物(重亚硫酸盐测序PCR引物)进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶 全部转化为胸腺嘧啶。

c、PCR产物克隆至载体后进行测序。

(3)流式细胞仪分析hiPSC表面标记物Tra-1-60

其中，Tra-1-60抗体来源于Millipore，检测仪器是BD C6.DNA提取用Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega)，总RNA提取用TRIzol(Sigma,T9424-100)，qPCR使用的系统为ABITM 7500实时定量PCR，荧光染料为SYBR Premix EXTaqTM(Takara)，beta-actin用于qPCR内参，所有检测样品均三个平行重复。

(4)EB形成(体外分化)

1)用胰蛋白酶(1mg/ml,Gibco)消化生长在滋养层细胞上的克隆使其脱落，在非吸附性T25瓶(Corning)中用KSR为基础且不含bFGF的培养基悬浮培养，

2)8天后将EB球贴壁于0.1％的明胶(Millipore，ES-006-B)包被过的培养板，再10％MEF贴壁培养，

3)再8天后收RNA用于鉴定，此鉴定可以反映出细胞在体外的分化潜能。

(9)试验结果

体外分化实验显示这两个克隆均能形成EB球，贴壁后形成内、中、外3个胚层类型的细胞，发明人对LQTL2-C2的EB球贴壁后形成的细胞提取mRNA，反转录为c-DNA,qPCR检测3个胚层标记物的表达，发现与未分化的iPSC相比，三个胚层的标记物中有6个标记物的表达提高了100倍以上。

9.1LQTL2iPSCs鉴定

对于逆转录病毒诱导得来的iPSCs，对LQTL2来源的iPSC进行进一步鉴定，具体结果如下：

qPCR检测LQTL2iPSCs外源基因沉默发现LQTL2-C2，C4，C9,C12，C14外源基因OKSM均沉默(结果见图1B)，其中以LQTL2-C2和C14沉默最好。因此，选取这两个克隆进行进一步鉴定。具体地，与供体细胞相比，这两个克隆均高表达多能性标记物内源Oct4和内源Sox2，Nanog，Rex1，表达量与人胚胎干细胞株H9相当(结果见图1C)。且核型检测发现C2，C14核型正常(结果见图1D)，基因组中整合了逆转录病毒及其编码的OKSM四个因子(结果见图1G)；超过97％的细胞群体表达人胚胎干细胞特异性标记物Tra-1-60(结果见图1E)，且其Oct4和Nanog启动子区去甲基化(结果见图1F)。体外分化实验显示这两个克隆均能形成EB球，贴壁后形成3个胚层类型的细胞，对LQTL2-C2的EB球贴壁后形成的细胞提取mRNA，反转录为c-DNA，qPCR检测3个胚层标记物的表达，发现与未分化的iPSC相比，三个胚层的标记物中有6个标记物的表达提高了100倍以上(结果见图1H)。

9.2LQTL1iPSC鉴定

对于附着体质粒诱导得来的LQTL1iPSC，qPCR检测LQTL1-C1，C2,C4，C5多能标记物内源Oct4，内源Sox2，内源Lin28和内源Nanog，表达量与人胚胎干细胞株H9相当(结果见图2D)。因此，选择C4和C5进行进一步鉴定。进一步核型检测发现C4，C5核型正常(结果见图2F)，超过90％的细胞群体表达人胚胎干细胞特异性标记物Tra-1-60(结果见图2E)，且其中Oct4和Nanog启动子区去甲基化(结果见图2G)。从C4P24和C5P8的细胞中提取质粒，PCR检测附着体质粒骨架上的外源基因Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Nanog、SV40LT、L-MYC均为阴性，表示在这些细胞中用于重编程的附着体质粒已经完全丢失(结果见图2I)；Transgene检测LQTL1C4和C5外源基因Oct4、Nanog、Klf4、SV40LT、Sox2、Lin28和L-MYC，发现细胞中外源基因均较好沉默(结果见图2J)；基因组中没有外源基因的整合(结果见图2K)。体外分化实验显示这两个克隆均能形成EB球，贴壁后形成3个胚层类型的细胞，对C4的EB球贴壁后形成的细胞提取mRNA，反转录为c-DNA，qPCR检测3个胚层标记物的表达，发现与未分化的iPSC相比，三个胚层的标记物中有6个标记物的表达提高了100倍以上(结果见图2H)。

实施例3iPSC分化为心肌细胞

利用分散酶对实施例2中所得到的诱导多能干细胞进行分散，按照2X10⁵个细胞/10平方厘米，将经过分散的多能干细胞接种在包被基质胶的含有mTeSR1培养基的平板上，并培养至融合度为70～90％融合度；在超慢贴附六孔板中，使用ACCUTASE细胞消化液，将所得到的培养物消化为单细胞，并在含有Matrigel(40mg/mL)、BMP4(1ng/mL；Invitrogen)和Rho激酶抑制剂(ROCK)(10mM；R&D)的mTeSR1培养基中5％氧气条件下进行培养24小时；)将所得的培养物进行清洗，并更换为含有抗坏血酸(AA,50mg/mL；Sigma)、2mM Gluta-MAX-1(Invitrogen)、BMP4(10ng/mL)和人重组激活素-A(10ng/mL；Invitrogen)的StemPro34SFM培养基中培养三天；以及向所得到的培养物中添加Wnt抑制剂IWR-1(5mM；Enzo Life Sciences)后继续培养4天，通过免疫荧光染色α-actinin和β-myosin(心肌细胞的标志物)，可以证明通过诱导分化得到了心肌细胞。

实施例4心肌细胞性能鉴定

按照常规方法进行检测，发明人发现，实施例3中所得到的心肌细胞同正常人相比，动作电位时程明显的延长，与LQT疾病的表现型相符。由此，可以通过利用该心肌细胞作为疾病模型用于药物筛选。另外，通过基因测序发明人发现，实施例3中所得到的心肌细胞存在LQT相关突变基因与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相比具有c.605-2A>G/c.815G>A

实施例5LQT药物筛选

将候选化合物与实施例3中所得到的心肌细胞接触，并且检测与候选化合物前后，心肌细胞的动作电位时程的延长，如果接触后动作电位时程明显的延长得到明显改善，则说明该候选化合物可以可以用于治疗LQT疾病。利用该方法，发明人验证了目前所使用的exiletine满足上述筛选要求。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种构建LQT疾病模型的方法，其特征在于，包括：

(1)利用附着体载体，将重编程因子编码基因引入携带LQT相关突变基因的体细胞中，以便获得诱导多能干细胞；以及

(2)在适于所述诱导多能干细胞分化的条件下，培养所述诱导多能干细胞，以便获得心肌细胞，所述心肌细胞构成所述LQT疾病模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述携带LQT相关突变基因的体细胞为来自LQT患者的尿液细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LQT相关突变基因与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相比具有c.605-2A>G/c.815G>A突变。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重编程因子包括：OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、SV40LT、L-MYC和LIN28。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述附着体载体包括：

第一附着体质粒，所述第一附着体质粒携带编码OCT4的核苷酸序列、编码SOX2的核苷酸序列、编码KLF4的核苷酸序列、编码NANOG的核苷酸序列；

第二附着体质粒，所述第二附着体质粒携带编码OCT4的核苷酸序列、编码SOX2的核苷酸序列、编码KLF4的核苷酸序列、编码SV40LT的核苷酸序列；以及

第三附着体质粒，所述第三附着体质粒携带编码L-MYC的核苷酸序列、编码LIN28的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：

(1-1)将所述附着体载体转染所述携带LQT相关突变基因的体细胞中，得到转染后的体细胞；

(1-2)于37℃、5％CO₂条件下，利用无滋养层人诱导多能干细胞重编程培养基培养所述转染后的体细胞；

(1-3)在转染后的第15天将培养基换成mTeSR1继续培养；

(1-4)在转染后的第25天，选取具有典型人诱导多能干细胞形态的克隆进行纯化扩增，以便获得所述诱导多能干细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述编码OCT4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：2所示的序列；

所述编码SOX2的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：3所示的序列；

所述编码NANOG的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：4所示的序列；

所述编码SV40LT的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：5所示的序列；

所述编码KLF4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：6所示的序列；

所述编码L-MYC的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：7所示的序列；以及

所述编码LIN28的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：8所示的序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：

(2-1)利用分散酶对步骤(1)中所得到的所述诱导多能干细胞进行分散，

(2-2)按照2X10⁵个细胞/10平方厘米，将所述多能干细胞接种在包被基质胶的含有mTeSR1培养基的平板上，并培养至融合度为70～90％融合度；

(2-3)在超慢贴附六孔板中，使用ACCUTASE细胞消化液，将步骤(2-2)中所得到的培养物消化为单细胞，并在含有Matrigel、BMP4和Rho激酶抑制剂的mTeSR1培养基中5％氧气条件下进行培养24小时；

(2-4)将步骤(2-3)中所得的培养物进行清洗，并更换为含有抗坏血酸、2mMGluta-MAX-1、BMP4和人重组激活素-A的StemPro34SFM培养基中培养三天；以及

(2-5)向所得到的培养物中添加Wnt抑制剂IWR-1后继续培养4天，以便获得所述心肌细胞。

9.一种心肌细胞，其是通过权利要求1～8任一项所述的方法构建的。

10.权利要求9所述的心肌细胞在筛选药物中的用途，所述药物用于治疗LQT疾病，优选JLNS型LQT疾病。