CN113106123A - T-all来源诱导多能干细胞模型及其构建方法 - Google Patents
T-all来源诱导多能干细胞模型及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113106123A CN113106123A CN202110418276.1A CN202110418276A CN113106123A CN 113106123 A CN113106123 A CN 113106123A CN 202110418276 A CN202110418276 A CN 202110418276A CN 113106123 A CN113106123 A CN 113106123A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- induced pluripotent
- pluripotent stem
- culturing
- stem cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 76
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 67
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 208000017414 Precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 84
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 29
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 17
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 11
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 claims description 9
- 101000932480 Homo sapiens Fms-related tyrosine kinase 3 ligand Proteins 0.000 claims description 9
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 42
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 19
- 101150020831 mael gene Proteins 0.000 description 19
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 17
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000011160 research Methods 0.000 description 13
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 11
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 11
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 8
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- 102000001759 Notch1 Receptor Human genes 0.000 description 5
- 108010029755 Notch1 Receptor Proteins 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 3
- -1 MRP Proteins 0.000 description 3
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 3
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 102100024316 Calcium/calmodulin-dependent 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase 1A Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 102100034862 Homeobox protein Hox-B2 Human genes 0.000 description 2
- 101001117044 Homo sapiens Calcium/calmodulin-dependent 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase 1A Proteins 0.000 description 2
- 101001019752 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B2 Proteins 0.000 description 2
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000836084 Homo sapiens Serpin B7 Proteins 0.000 description 2
- 101000798701 Homo sapiens Transmembrane protein 40 Proteins 0.000 description 2
- 101000786318 Homo sapiens Zinc finger BED domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 102100025521 Serpin B7 Human genes 0.000 description 2
- 102100032470 Transmembrane protein 40 Human genes 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 102100025797 Zinc finger BED domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 101150000411 lrp gene Proteins 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 101150062876 mrp gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- KEQHJBNSCLWCAE-UHFFFAOYSA-N thymoquinone Chemical compound CC(C)C1=CC(=O)C(C)=CC1=O KEQHJBNSCLWCAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- PWVRXSQPCQPQHM-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminophenyl)-1h-indol-6-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(N)C=C2N1 PWVRXSQPCQPQHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039884 Integrin-linked kinase-associated serine/threonine phosphatase 2C Human genes 0.000 description 1
- 101710160759 Integrin-linked kinase-associated serine/threonine phosphatase 2C Proteins 0.000 description 1
- 102100036981 Interferon regulatory factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000890 Interferon regulatory factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 101100459258 Xenopus laevis myc-a gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/604—Klf-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18811—Sendai virus
- C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种T‑ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：a、将携带KOS、c‑Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T‑ALL生物体的外周血单个核细胞中；b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。本发明还公开了一种诱导多能干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及T-ALL研究模型技术领域，特别是涉及诱导多能干细胞及其构建方法。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种常见的血液系统恶性肿瘤，由造血干细胞的异常增殖和分化引起。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是由T细胞前体的基因改变引起的，导致胸腺、血液、骨髓和外周组织中T细胞的发育停滞和聚集。多年来，转录因子表达失调、CDKN2A/2B细胞周期调节因子的损伤和NOTCH1信号的过度激活在T-ALL的发病机制中起着重要作用。尽管T-ALL的诊断和治疗已经取得了很大的进展，但耐药、复发等难治性T-ALL的治疗仍然是临床亟待解决的问题，因此构建合适的T-ALL研究模型对于T-ALL的临床研究具有重要的作用。
发明内容
基于此，有必要提供一种T-ALL来源诱导多能干细胞及其构建方法，提供T-ALL的研究模型。
一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；
b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。
在其中一些实施例中，所述病毒载体选自仙台病毒。
在其中一些实施例中，步骤a中，转染之前，包括将源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞悬浮在造血干细胞无血清培养基中，接种于培养板上，培养66小时～78小时的步骤。
在其中一些实施例中，所述造血干细胞无血清培养基含有L-谷氨酰胺、SCF、FLT3LG、IL-3和IL-6。
在其中一些实施例中，在所述造血干细胞无血清培养基中，L-谷氨酰胺的质量百分数为0.8％～1.2％，SCF为80ng/mL～120ng/mL，FLT3LG为80ng/mL～120ng/mL、IL-3为15ng/mL～25ng/mL，IL-6为8ng/mL～12ng/mL。
在其中一些实施例中，步骤b包括：将步骤a得到的转染后的细胞先在无层粘连蛋白的培养板中培养66小时～78小时；经离心、复悬之后，转移入包被层粘连蛋白的培养板上进行培养。
在其中一些实施例中，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在缺乏细胞因子的培养基中进行培养。
在其中一些实施例中，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在SCF≤60ng/mL，FLT3LG≤60ng/mL、IL-3为12.5ng/mL，IL-6为6ng/mL的无血清培养基中进行培养。
在其中一些实施例中，步骤b包括：在包被层粘连蛋白的培养板上培养20小时～28小时后，在胚胎干细胞培养基中进行培养。
所述的诱导多能干细胞的制备方法制备得到的诱导多能干细胞。
本发明对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)体细胞进行重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs)。结果表明T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。
附图说明
图1为本发明一实施例的PBMC细胞重编程为iPSC过程的显微拍摄图(40×)；
图2为本发明一实施例的iPSC克隆传代10次后的显微拍摄图(40×)；
图3为本发明一实施例的iPSC克隆的碱性磷酸酶染色结果(40×)；
图4为本发明一实施例的iPSC四种多能性标志蛋白的免疫荧光染色图；
图5为本发明一实施例的畸胎瘤的三胚层HE染色图；
图6为本发明一实施例的Notch1突变的基因组测序图，其中，H-iPS为健康人PBMC来源的iPS细胞，W10-iPS为T-ALL来源的iPS细胞；
图7为本发明一实施例的LY411575药物处理W10-iPS的IC50曲线图；
图8为本发明一实施例的非耐药W10-iPS与耐药W10-R的耐药性流式检测图；
图9为本发明一实施例的非耐药iPS和耐药iPS生信分析结果图；
图10为本发明一实施例的6种基因敲降W10-R的耐药性流式检测图；
图11为本发明一实施例的MAEL基因敲降W10-R的耐药性流式检测图；
图12为本发明一实施例的各组细胞内MAEL、MRP、LRP基因的相对表达量统计图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明实施例提供一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；
b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。
本发明对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)体细胞进行重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs)。结果表明T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。
与传统的肿瘤模型相比，通过本实施例构建的T-ALL来源的iPSC模型具有以下优点：(1)可用于T-ALL进展的早期研究；(2)原代T-ALL来源的iPSC可再次分化为T-ALL细胞。对这一过程进行基因筛选和表观遗传学分析，有助于识别与T-ALL发生、发展相关的原癌基因突变和表观遗传学修饰；(3)由于肿瘤是一个异质性细胞群，每个iPS克隆来自单个肿瘤细胞，因此，对每个iPS克隆进行单独研究，可以全面挖掘肿瘤发生、发展的机制肿瘤发病机制复杂；(4)T-ALL来源的iPSCs能长期维持自我更新和增殖，是高通量筛选治疗药物和毒性研究的理想平台；(5)来源于T-ALL细胞的iPSCs是一种个体化的T-ALL肿瘤模型；(6)T-ALL来源的耐药iPSCs可作为T-ALL耐药研究模型，用于进一步研究T-ALL的耐药机制并开发相应药物。因此，与传统的肿瘤模型相比，iPSC模型能够更准确地揭示肿瘤发病机制和耐药机制，开发有效的肿瘤治疗方法。
诱导多能干细胞可通过在体细胞导入核程序重编因子的基因来制备。核程序重编因子可选自OCT4、SOX2、c-Myc、Klf4、NANOG、LIN28、KOS中的组合。但是，并非所有导入了这些基因的体细胞会被诱导成iPS细胞，事实上，只有其中一部分会被诱导成iPS细胞。
其中在本发明实施例中，T-ALL来源的体细胞制备诱导多能干细胞使用的核程序重编因子选自KOS、c-Myc和Klf4的组合。
用于形成诱导多能干细胞的体细胞的种类，例如，可使用诸如成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、血细胞、皮肤角质形成细胞、间充质干细胞、造血干细胞或神经干细胞等体细胞。体细胞可以是从活体收集的任何体细胞，或者是作为细胞株系建立的体细胞。当需要将制备的多能干细胞或从这种细胞分化的细胞移植到活体中时，优选的是用采集自活体本身的体细胞诱导多能干细胞。本文所限定的细胞为不具有发育全能型的细胞，即本文限定的细胞不能够不包括胚胎干细胞、受精卵等。本发明使用的体细胞为T-ALL来源的外周血单个核细胞。
将编码核程序重编因子的基因导入体细胞中的方法，包括例如将掺入了编码核程序重编因子的基因的载体导入到体细胞中的方法。对载体没有具体限定，而是可以使用选自已知的载体的适当载体。例如，使用病毒载体的方法或者使用非病毒载体的方法中任一者都可用于本发明。这些载体的细节已在许多文献中公布，可从这些许多文献当中作出适当选择来使用载体。
对如上所用的病毒载体没有具体限定，而是通常可使用在基因转移的方法中采用的已知病毒载体，例如反转录病毒载体(包括慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、类人猿病毒载体、痘苗病毒载体或者仙台病毒载体。特别优选地，可使用反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。作为病毒载体，优选其中复制能力缺损从而不能在感染的细胞中自我复制的病毒载体。本发明的病毒载体有选自仙台病毒。
在基因转移时，可使用能提高基因转移效率的物质。能提高基因转移效率的物质的例子包括具有结合到病毒载体的能力的物质，例如诸如纤连蛋白和纤连蛋白片段的物质。可通过将编码核程序重编因子的基因掺入到一种或多种病毒载体中来使用这些基因。当使用两种或更多种反转录病毒载体或慢病毒载体时，特别是当病毒感染进行多次时，优选使用能提高基因转移效率的物质，特别是纤连蛋白或纤连蛋白片段。在一些实施方式中，可以将该提高基因转移效率的物质与携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体一起转染，或分别转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中。
优选的，可使用具有结合到反转录病毒的活性并同时具有结合到靶标细胞(即将向其中导入基因的体细胞)的活性的功能物质，或者可将具有结合到反转录病毒的活性的功能物质和具有靶标细胞结合活性的功能物质一起使用。对具有靶标细胞结合活性的功能物质没有具体限定，不过其例子包括具有能结合靶标细胞的配体的物质。配体的例子包括细胞粘附蛋白(纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)或其片段、激素、细胞因子、细胞表面上的抗原的抗体、多糖、糖蛋白、糖脂、衍白糖蛋白或糖脂的糖链、或者靶细胞的代谢物。本发明的配体优选自层粘连蛋白。可通过将层粘连蛋白包被在培养板上使用。
在一些实施方式中，步骤a中，转染之前，包括将源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞悬浮在造血干细胞无血清培养基中，接种于培养板上，培养66小时～78小时的步骤。
造血干细胞无血清培养基(SFEM)用于在体外对人造血细胞的培养和扩增。
需说明的是，血清中有可能含有未知的因子、朊病毒、病毒等，因此，本发明的培养基优选不含血清作为培养基成分。
在一些实施方式中，所述造血干细胞无血清培养基含有谷氨酰胺、SCF、FLT3LG、IL-3和IL-6。
在一些实施方式中，在所述造血干细胞无血清培养基中，L-谷氨酰胺的质量百分数为0.8％～1.2％，SCF为80ng/mL～120ng/mL，FLT3LG为80ng/mL～120ng/mL、IL-3为15ng/mL～25ng/mL，IL-6为8ng/mL～12ng/mL。
在一些实施方式中，步骤b包括：将步骤a得到的转染后的细胞先在无层粘连蛋白的培养板中培养66小时～78小时；经离心、复悬之后，转移入包被层粘连蛋白的培养板上进行培养。
在一些实施方式中，所述包被层粘连蛋白的培养板上进行培养为在不充足或者缺乏细胞因子的造血干细胞无血清培养基条件下进行培养。例如SCF≤60ng/mL，FLT3LG≤60ng/mL、IL-3为12.5ng/mL，IL-6为6ng/mL的无血清培养基中进行培养。
在一些实施方式中，步骤b为在35℃～39℃，4.5％～5.5％CO2培养箱中培养。
在一些实施方式中，步骤b包括：在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养20小时～28小时后，在胚胎干细胞培养基中进行培养。
作为干细胞的培养中使用的培养基，可列举STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、mTeSR1培养基(干细胞技术(STEMCELLTechnologies)公司)、TeSR2培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、TeSR－E8培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、Essencial 8培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、HEScGRO(商标)Serum－Free Medium for hEScells(密理博(Millipore)公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPS Medium(EMD密理博(EMDMillipore)公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(BiologicalIndustries Israel Beit-Haemek)株式会社)、NutriStem(商标)XF/FF Culture Medium(史迪金(Stemgent)公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(Biological Industries Israel Beit-Haemek)株式会社)、S－medium(DSPharma生物医学株式会社)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF－FX培养基、CDM培养基、DEF－CS 500Xeno－Free 3D SpheroidCultureMedium(赛拉提斯(Cellartis)公司)、StemFlex培养基(赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific)公司)等。在本发明中，胚胎干细胞培养基选自NutriStem hESC XF培养基。
本发明实施例还提供一种上述任一实施例所述的诱导多能干细胞的制备方法制备得到的诱导多能干细胞。
本发明的T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。例如作为T-ALL耐药性的研究。
作为一种应用，本发明实施例还提供一种诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞源自上述任一实施例的诱导多能干细胞，所述细胞在编码MAEL的靶DNA序列中包含破坏，所述破坏使得MAEL基因的表达量下降。
短语″基因的破坏″或任何类似的短语是指天然DNA序列的位点特异性打断，从而与基因的野生型拷贝相比阻止该基因在细胞中的表达。
在一些实施方式中，所述破坏是插入突变、错义突变、移码突变或缺失突变或其任意组合造成。
在一些实施方式中，所述破坏使得所述细胞的MRP基因的表达量下降。
在一些实施方式中，所述破坏使得所述细胞的LRP基因的表达量下降。
本发明首次发现MAEL基因的高表达与T-ALL的耐药直接相关，通过MAEL基因敲降，可逆转T-ALL的多药耐药。
本发明实施例提供一种MAEL基因的特异性敲降试剂在制备预防或治疗T-ALL耐药性症状的药物中的应用。
实现基因敲降的方法有很多。基因敲降并不局限于将整个基因完整缺失或去除，而只要使基因丧失其原有功能即可。例如，可通过在基因中插入外源DNA片段，使得该基因无法表达功能性蛋白，或可通过在基因中插入或缺失一个或数个碱基，使得该基因发生移码突变，来实现对该基因的敲除。
在一些实施方式中，所述特异性敲降试剂用以执行以下任意一种方法：CRISPR/Cas9、锌指核酸酶、TALEN、MegaTAL、大范围核酸酶、Cpf1、同源重组、RNAi。
优选的，通过RNA干扰(RNAi)实现MAEL基因敲降。RNA干扰技术是近年来常用的一种抑制靶基因表达的方法，采用19-23个碱基或发卡状不同长度的双链RNA可使不同类型细胞的靶基因表达明显降低。RNA干扰技术可以作为基因下调的一项有效技术手段来弥补敲除技术的不足，从而鉴定未知功能的基因转录本。在发育生物学领域，哺乳动物由卵母细胞到受精卵再到后代个体的整个发育过程具有极大的复杂性。因此，将RNA干扰技术应用于胚胎发育领域的研究将有助于深入地揭示调节胚胎发育过程中关键分子生物学的发生机理。在哺乳动物卵母细胞及胚胎中RNA干扰已经得到了广泛应用。RNA干扰技术可以将目的基因特异、高效地下调，这一过程可以通过小干扰RNA(siRNA)以及短发夹RNA(shRNA)这两种类型小分子得以实现，siRNA是体外化学合成的双链小干扰RNA，shRNA是基于质粒的短发夹RNA。在胞内滞留时间方面，转染后48小时内，仅有部分siRNA滞留于胞内，大部分则被降解，而shRNA则可以被宿主细胞持续的合成，所以其作用更为持久，但siRNA发挥作用的速度则相对较快，因为shRNA需要一定的时间来进行转录。
在一些实施方式中，所述特异性敲降试剂包括引物或探针。
在一些实施方式中，所述特异性敲降试剂选自以下siRNA对中的至少一种：(SEQID NO:25，SEQ ID NO:26)；(SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28)；(SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30)。
以下为具体实施例。
实验步骤：
1、T-ALL来源iPSCs的制备
(1)外周血单个核细胞的分离培养
在病毒感染前3天，用淋巴细胞分离液从新鲜外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。然后，将PBMC悬浮在StemSpan SFEM培养基中(含有1％L-谷氨酰胺、100ng/mLSCF、100ng/mL FLT3LG、20ng/mL IL-3和10ng/mL IL-6)(简称PBMC培养基)。随后，将1×106个PBMCs接种于24孔板上，在37℃，5.0％CO2培养箱中培养。每天更换一半培养基，连续3天。
(2)PBMCs向iPSCs的重编程
根据试剂使用说明书，用
-iPS 2.0仙台病毒重编程试剂盒(A16517，美国赛默飞世尔科技公司)对PBMCs进行感染。大致步骤如下：在第0天，仙台病毒以5:5:3(KOS:c-Myc:Klf4)的MOI添加到2×105个PBMCs中。将细胞和病毒混合物在室温下以2300rpm离心30min后，用上清液重悬，接种于24孔板上，于37℃，5.0％CO2培养箱中培养。感染24小时后，收集PBMCs，在室温下200g离心10min。弃去上清液，加入0.5ml PBMC培养基复悬PBMCs，转入24孔板，于5.0％CO2培养箱中37℃培养2天。第3天，将PBMCs转移到预先包被了层粘连蛋白-521(LN521)的6孔板上，并补充1mL不含细胞因子的StemSpan SFEM培养基。第4天，用NutriStem hESC XF培养基半量换液。第6天，每天用新鲜的NutriStem hESC XF培养基全量换液，直到观察到胚胎干细胞样克隆(第12-21天)。
(3)碱性磷酸酶染色
使用蓝色碱性磷酸酶(AP)底物试剂盒(SK-5300，VECTOR Laboratories)对iPSCs进行碱性磷酸酶染色。大致实验步骤如下：iPSCs用4％多聚甲醛固定后，用新鲜配制的碱性磷酸酶染色剂室温避光孵育30分钟。染色结束后，用倒置显微镜对染色iPSCs进行检查和拍摄。
(4)多能性标志蛋白免疫荧光染色检测
用免疫荧光染色抗体检测iPSCs内SOX2、POU5F1、NANOG和SSEA-4这四种多能性标志蛋白的表达情况。大致实验步骤如下：(1)固定细胞及通透处理：吸弃培养孔中的培养基，加入500ul预温至37℃的D-PBS清洗；利用4％多聚甲醛溶液对iPSCs进行固定后，用含0.1％Triton-X 100的DPBS溶液对iPSCs进行打孔。(2)封闭：加入5％BSA溶液室温孵育1小时进行封闭处理。(3)一抗孵育：分别用1％BSA稀释的兔抗Sox2抗体(1:400，A11936，Abclonal)、小鼠抗SSEA4抗体(1:500，ab16287，Abcam)、兔抗POU5F1抗体(1:400，A7920，Abclonal)、小鼠抗NANOG抗体(1:500，YM0464，Immunoway)对iPSCs进行一抗孵育，4℃过夜。(4)二抗孵育：用1％BSA稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体(1:500，A0423，Beyotime)，AlexaFluor 647标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:500，A0473，Beyotime)和4'，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐(DAPI，Sigma-Aldrich)对iPSCs进行孵育，室温放置1小时。(5)封片：抗体孵育完的iPSCs用封片剂进行封片，干燥后即可用倒置荧光显微镜进行观察拍照。
(5)畸胎瘤的形成与检测
将3×106到5×106iPSCs皮下注射到6-10周龄的健康成年NOD/SCID小鼠(中国广东医学实验动物中心)中。注射后约15-30天，畸胎瘤生长成直径约1-2厘米的球体。切除畸胎瘤，用10％中性福尔马林固定3天，然后转移到100％乙醇中。然后，对畸胎瘤进行苏木精-伊红(H&E)染色，显微镜下观察并拍摄三个胚层的典型细胞或结构。
2、耐药iPSCs的构建
T-ALL-PBMCs来源的iPSCs(T-iPSCs)用1.25μM～160μM的LY411575进行处理，药物浓度按梯度递增(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM)。72小时后用7AAD染色，流式检测细胞死亡率，并计算LY411575的半抑制浓度(IC50)。为了构建耐药的iPSCs，iPSCs在培养初期用1/6IC50浓度的LY411575孵育24h后，换成无药培养基继续培养3-5天。经过几个周期的药物处理，逐步提高药物浓度，最终使得T-iPSCs可以耐受80μM LY411575，获得耐药W4-iPS(W4-R)和耐药W10-iPS(W10-R)。
3、RNA测序与生物信息学分析
使用TRIzol试剂(Thermo，15596-026)分别提取1×106个W4-iPS、W4-R、W10-iPS和W10-R细胞的总RNA，样本送诺禾致源公司进行RNA测序和生物信息学分析。RNA测序和生物信息学分析具体细节参考文献：Chandel NS,Jasper H,Ho TT and Passegue E:Metabolicregulation of stem cell function in tissue homeostasis and organismalageing.Nature cell biology 18:823-832,2016.
4、W10-R细胞的基因敲降
根据说明书，使用
3000(Thermo Fisher Scientific，USA)分别将6个基因的siRNA(100nM，苏州吉玛生物)转染至W10-R细胞内。细胞培养72h后用于实验。为了避免脱靶效应，每种基因分别使用三对siRNA进行基因敲降。siRNA的序列见表1。
表1 siRNA序列
5、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)
采用qRT-PCR检测基因敲降后W10-R细胞的基因表达水平。利用AurumTMTotal RNAMini Kit(Bio-Rad,California,USA)从1×106个细胞中提取总RNA。然后，使用BioSciTMWitEnzy First-Stand cDNA Synthesis Kit(8072021，达科为生物)将1μg总RNA反转录合成cDNA。利用BioSciTM WitEnzy 2×SYBR Green qPCR Master Mix(8073021，达科为生物)进行实时荧光定量PCR反应。以18sRNA作为内对照。qRT-PCR引物的核苷酸序列如表2所示。
表2 qRT-PCR引物的核苷酸序列
实验结果如下。
1、T-ALL来源iPSCs的制备
选择1例携带Notch 1突变的T-ALL患者(NM_017617.3:c.5033T>C(p.L1678P))。利用非整合型仙台病毒，用iPSC重编程因子(Sox-2、Klf4、Oct4和Myc)感染T-ALL来源PBMC细胞，进行重编程。实验结果如下：
(1)人T-ALL来源PBMC细胞体外重编程为iPSCs
根据图1和图2可见，人T-ALL来源PBMC细胞经仙台病毒感染后第7天在显微镜下可见若干小细胞克隆，生长迅速，感染后第13天即可形成边缘清晰的典型的ESC样克隆。
(2)碱性磷酸酶染色鉴定
由于iPSC具有碱性磷酸酶活性，利用碱性磷酸酶染色试剂盒对挑取的iPSC克隆进行染色，若为正确的iPSC，则会在细胞原位生成蓝色反应产物。从图3可以看出，2个iPSC克隆均成功被染成蓝色，初步判定为正确的iPSC。
(3)iPSC多能性标志蛋白的免疫荧光染色鉴定
用免疫荧光染色抗体检测iPSC内SOX2、POU5F1、NANOG和SSEA-4这四种多能性标志蛋白的表达情况，结果如图4所示，显示iPSC高表达这四种多能性标志蛋白。
(4)畸胎瘤形成及鉴定
iPSCs注射到NOD/SCID小鼠体内15天后，可形成畸胎瘤，三胚层的HE染色图如图5所示。
(5)Notch 1突变位点检测
基因组测序分析确定T-ALL来源PBMCs衍生的iPSCs(W10-iPS)存在与原始T-ALL突变相同的Notch1突变(NM_017617.3:c.5033T>C(p.L1678P))(如图6)。
2、LY411575耐药T-iPSCs的构建
为了计算LY411575的半数最大抑制浓度(IC50)，将LY411575剂量从1.25μM增加到160μM，用7AAD染色法检测细胞死亡率。根据拟合曲线，IC50值计算为51.75μM(图7)。在此基础上，建立了可耐受80μM LY411575药物浓度的耐药W4-iPS(W4-R)和W10-iPS(W10-R)。为了检测W10-R细胞的耐药性，分别用80μM LY411575处理非耐药的W10-iPS和耐药的W10-R细胞72h和96h后，流式检测细胞死亡率。实验结果显示，药物处理72h和96h后W10-R细胞死亡率分别为5.24％和11.59％，均远远低于非耐药W10-iPS细胞44.54％和81.83％的死亡比例(图8)，证明我们经过药筛获得了耐药的W10-R细胞。
3、总RNA测序及生信分析结果
为了揭示T-iPSCs耐药的可能机制，我们对非耐药iPS和耐药iPS进行了全面的转录组学研究。如图9A和9B所示，在非耐药组和耐药组之间发现4872个基因的RNA表达发生了改变(W_iPS vs W_R)。为了找出与耐药性相关的阳性调控基因，我们从27个Log2FC值大于5的基因中筛选出6个在W_R细胞中高表达的基因(ZBED2、SERPINB7、HOXB2、PDE1A、MAEL和TMEM40)(图9C和9D)。表3列出了所选6个基因的基因功能和Log2FC值。
表3W_R细胞中高表达的6个基因列表
| 基因名称 | 功能 | Log<sub>2</sub>FC(W-R/W-iPS) |
| ZBED2 | 一种干扰素调节因子-1的拮抗剂，可改变胰腺癌细胞 | 6.83 |
| SERPINB7 | 其表达可预测吉西他滨治疗后胰腺癌的低生存率 | 6.73 |
| HOXB2 | 一种促肿瘤因子 | 5.75 |
| PDE1A | 胸腺醌诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的关键蛋白 | 5.58 |
| MAEL | 促进ILKAP降解，从而促进胃癌进展 | 5.57 |
| TMEM40 | 与舌鳞癌的进展有关 | 5.50 |
4、MAEL基因可能是影响T-iPSCs耐药性的重要基因
为了鉴定出影响T-iPSCs耐药性的关键调控基因，我们分别利用上述6个基因的siRNA来敲降W10-R细胞。在80μM LY411575处理72小时后，我们观察到在W10-R中使用MAEL-siRNA进行敲降后细胞死亡率最高，且与其它各组相比有显著性差异(图10)。
为进一步验证MAEL基因表达与iPS细胞耐药性之间的关系，我们用MAEL基因三对siRNA的两对进行两两组合，分别转染W10-R细胞，72h后用80μM LY411575处理96h，然后流式检测细胞死亡率。MAEL-944/1067siRNA敲降的W10-R细胞标记为MAELRNAi-1 W10-R(③)，MAEL-1067/1148siRNA敲降的W10-R细胞标记为MAELRNAi-2 W10-R(④)，MAEL-1148/944siRNA敲降的W10-R细胞标记为MAELRNAi-3 W10-R(⑤)。细胞耐药性的流式检测结果如图11所示。可以看出，与②组相比，③、④、⑤组细胞的死亡率均有显著提高，其中④、⑤组细胞的死亡率最高，两组之间没有显著差异。
为了阐明MAEL基因敲降后W10-R细胞内耐药相关基因的表达情况，我们同时还利用qRT-PCR检测了各组细胞内MAEL、MRP、LRP基因的相对表达量，统计结果如图12所示。可以看出，与W10-R细胞相比，MAEL基因敲降的三组W10-R细胞(MAELRNAi-1 W10-R、MAELRNAi-2 W10-R和MAELRNAi-3 W10-R)中MAEL基因及MRP基因的相对表达量均显著下降；MAELRNAi-2 W10-R和MAELRNAi-3 W10-R细胞中的LRP基因的相对表达量显著下降。上述结果表明：MAEL基因的敲降可导致W10-R细胞内耐药基因MRP和LRP的表达下降，最终降低W10-R细胞的耐药性，部分恢复其对LY411575的敏感性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> T-ALL来源诱导多能干细胞模型及其构建方法
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ucugaggcau gggaauauut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aauauuccca ugccucagat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gcaccauccc aaccaguaut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
auacugguug ggauggugct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccuggagaug aaguggaagt t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cuuccacuuc aucuccaggt t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcgaguugac uuuacgaaut t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
auucguaaag ucaacucgct t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gcaaguggca aucagccuut t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
aaggcugauu gccacuugct t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ggaaggcagu cgccaugaut t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aucauggcga cugccuucct t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gggagauugg guuuauaaat t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
uuuauaaacc caaucuccct t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ggcaggucaa agucugguut t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
aaccagacuu ugaccugcct t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gccuuuagcc guucgcuuat t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
uaagcgaacg gcuaaaggct t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ggaagcaguu uauaucgaut t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
aucgauauaa acugcuucct t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
guugguuaca gcaaguacat t 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
uguacuugcu guaaccaaac tt 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
ggaaccuagu gauugaaaut t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
auuucaauca cuagguucct t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gcguacugca ucaguaauut t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
aauuacugau gcaguacgct t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gggcguuacc agaagcuaat t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
uuagcuucug guaacgccct t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
cccauuggug acuacccaut t 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
auggguaguc accaugggtt 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gccauggaga cuucagcaut t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
augcugaagu cuccauggct t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
uccacaagca agaugggaat t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
uucccaucuu gcuuguggat t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ggcugacagg guucaggaat t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
uuccugaacc cugucagcct t 21
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
ggcaaaaggg gacttagaga tg 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
ggcatagcac tcacaaaagg g 21
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
taagctcatc tgctgtaatg gtg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
ggcaatttat ggtttcgctc ttg 23
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
cgccaggatt cacctttcct t 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
ccctgtaggc taggggagag 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
gcatacaggg acaacaaaca ac 22
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
tctcaaggac agagcgatca t 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
gaagatcccc gaactacggc 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
gaaaacaggt ttcgcccagt c 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
cagagcaacc ggaaaacatc g 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
tcatccttca aaacgtcagg c 21
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
tgggactgga atgtcacg 18
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
aggaatatgc cccgacttc 19
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
gtcttcgggc ctgagctggt gtcg 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
cttggccgtc tcttgggggt cctt 24
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
aactttcgat ggtagtcgcc g 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
ccttggatgt ggtagccgtt t 21
Claims (10)
1.一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；
b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。
2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述病毒载体选自仙台病毒。
3.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤a中，转染之前，包括将源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞悬浮在造血干细胞无血清培养基中，接种于培养板上，培养66小时～78小时的步骤。
4.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述造血干细胞无血清培养基含有L-谷氨酰胺、SCF、FLT3LG、IL-3和IL-6。
5.根据权利要求4所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，在所述造血干细胞无血清培养基中，L-谷氨酰胺的质量百分数为0.8％～1.2％，SCF为80ng/mL～120ng/mL，FLT3LG为80ng/mL～120ng/mL、IL-3为15ng/mL～25ng/mL，IL-6为8ng/mL～12ng/mL。
6.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤b包括：将步骤a得到的转染后的细胞先在无层粘连蛋白的培养板中培养66小时～78小时；经离心、复悬之后，转移入包被层粘连蛋白的培养板上进行培养。
7.根据权利要求6所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在缺乏细胞因子的培养基中进行培养。
8.根据权利要求7所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在SCF≤60ng/mL，FLT3LG≤60ng/mL、IL-3为12.5ng/mL，IL-6为6ng/mL的无血清培养基中进行培养。
9.根据权利要求7所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤b包括：在包被层粘连蛋白的培养板上培养20小时～28小时后，在胚胎干细胞培养基中进行培养。
10.如权利要求1～9任一项所述的诱导多能干细胞的制备方法制备得到的诱导多能干细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110418276.1A CN113106123A (zh) | 2021-04-19 | 2021-04-19 | T-all来源诱导多能干细胞模型及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110418276.1A CN113106123A (zh) | 2021-04-19 | 2021-04-19 | T-all来源诱导多能干细胞模型及其构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113106123A true CN113106123A (zh) | 2021-07-13 |
Family
ID=76718684
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110418276.1A Pending CN113106123A (zh) | 2021-04-19 | 2021-04-19 | T-all来源诱导多能干细胞模型及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113106123A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105833275A (zh) * | 2016-04-28 | 2016-08-10 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 一种利用重编程效应治疗白血病的方法 |
| CN106636206A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-05-10 | 南京市妇幼保健院 | 一种merrf患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法 |
| CN106916850A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种诱导多能性干细胞的重编程方法 |
| US20190194624A1 (en) * | 2016-06-16 | 2019-06-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Novel and efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
-
2021
- 2021-04-19 CN CN202110418276.1A patent/CN113106123A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106916850A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种诱导多能性干细胞的重编程方法 |
| CN105833275A (zh) * | 2016-04-28 | 2016-08-10 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 一种利用重编程效应治疗白血病的方法 |
| US20190194624A1 (en) * | 2016-06-16 | 2019-06-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Novel and efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
| CN106636206A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-05-10 | 南京市妇幼保健院 | 一种merrf患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| H.ZHANG ET AL.: "Reprogramming of Notch1-induced acute lymphoblastic leukemia cells into pluripotent stem cells in mice", 《BLOOD CANCER JOURNAL》 * |
| MARK P CHAO ET AL.: "Human AML-iPSCs Reacquire Leukemic Properties after Differentiation and Model Clonal Variation of Disease", 《CELL STEM CELL》 * |
| 包勤敏 等: "构建脆性X染色体综合征患者来源的诱导多能干细胞系", 《临床检验杂志》 * |
| 胡焕然 等: "构建阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合征患者来源的诱导多能干细胞系", 《临床检验杂志》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cao et al. | Chromatin accessibility dynamics during chemical induction of pluripotency | |
| Chu et al. | Single-cell RNA-seq reveals novel regulators of human embryonic stem cell differentiation to definitive endoderm | |
| CN101835890B (zh) | 有效建立诱导的多能干细胞的方法 | |
| Schnerch et al. | Distinguishing between mouse and human pluripotent stem cell regulation: the best laid plans of mice and men | |
| CN101356270B (zh) | 核重新编程因子 | |
| AU2008286249B2 (en) | Efficient method for nuclear reprogramming | |
| Wang et al. | Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Jdp2-Jhdm1b-Mkk6-Glis1-Nanog-Essrb-Sall4 | |
| CN102388136B (zh) | 新颖的核重编程序物质 | |
| US20090186414A1 (en) | Methods of Generating Cardiomyocytes and Cardiac Progenitors and Compositions | |
| CN105051188A (zh) | 新颖方法 | |
| JP2013535966A (ja) | 引き抜かれた毛包由来のケラチン生成細胞から誘導多能性幹細胞を生成させる方法 | |
| WO2009136867A1 (en) | Method of effecting de-differentiation of a cell | |
| CN103348002A (zh) | 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法 | |
| Chen et al. | Sphere-induced reprogramming of RPE cells into dual-potential RPE stem-like cells | |
| CN109852587B (zh) | 一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法 | |
| CN101492676B (zh) | 用脑膜细胞生成诱导的多能性干细胞的方法及其用途 | |
| US20180371422A1 (en) | Non-viral ipscs inducing method, compositions, kits and ipscs | |
| WO2023166111A1 (en) | Method for the generation of outer radial glial (org) cells | |
| CN112961858B (zh) | T-all耐药模型的构建及应用 | |
| CN114672460B (zh) | 一种靶向cd44的异质型cic细胞模型的制备方法及应用 | |
| CN113106123A (zh) | T-all来源诱导多能干细胞模型及其构建方法 | |
| US20170356005A1 (en) | Non-viral ipscs inducing composition and kits | |
| CN105693842B (zh) | NCoR/SMRT蛋白复合体在调节细胞命运转变中的应用 | |
| Wang et al. | Induction of Pluripotency by Alternative Factors | |
| US20240252551A1 (en) | Novel pluripotent cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210713 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |