CN102388136B - 新颖的核重编程序物质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够替代Klf4的重编程序物质，其选自：IRX家族的成员(例如，IRX6)、GLIS家族的成员(例如，GLIS1)、PTX家族的成员(例如，PITX2)、DMRTB1以及编码它们的核酸。也提供了一种生产iPS细胞的方法，所述方法包括下述步骤：向体细胞中导入一种或多种上述的细胞核重编程序物质和当与Klf4组合时能够从体细胞诱导iPS细胞的物质。也提供了通过所述方法可以得到的包含外来核酸的iPS细胞，所述外来核酸编码任一种上述细胞核重编程序物质，以及通过诱导iPS细胞分化来生产体细胞的方法。

Description

新颖的核重编程序物质
技术领域
本发明涉及新颖的核重编程序物质及其用途，更具体地，涉及可以替代Klf4的新颖的核重编程序物质，和使用所述物质建立诱导的多能干(在下文中称作iPS)细胞的方法。 
背景技术
近年来，小鼠和人iPS细胞已经相继建立。Yamanaka等人通过分析EST数据库，鉴别出了在多能细胞(诸如胚胎干细胞和生殖细胞)中特异性地表达基因，并使用敲除的小鼠技术等，进行了功能分析。考虑到其它研究组的一些报告，他们选择了24个基因作为在体细胞中诱导多能性(重编程序细胞核)的候选物[WO 2007/069666A1；Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell，126：663-676(2006)]。他们如下诱导iPS细胞：通过将这24个基因导入来自报告小鼠的成纤维细胞(MEF)中，其中新霉素抗性基因被敲入(knock-in)Fbx15基因座中，并借助于逆转录病毒，使细胞表达这些基因。通过转移24个基因中的23个，他们进一步缩小了对于细胞核重编程序而言最重要的基因的范围，并最终鉴别出了4个基因Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc作为在体细胞中的细胞核重编程序的必需因子[WO 2007/069666A1；Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell，126：663-676(2006)]。 
另外，Yamanaka等人成功地建立了iPS细胞(Nanog iPS细胞)，所述细胞表现出与在胚胎干(ES)细胞中的那些几乎相同的基因表达和后天修饰特性，并通过生产转基因小鼠，成功地制备出嵌合小鼠，其中绿荧光蛋白(GFP)和嘌呤霉素-抗性基因整合进Nanog的基因座中，它们的表达与Fbx15表达相比更集中在多能细胞中，使源自该小鼠的MEF表达上述的4个基因，并成功地选择出嘌呤霉素-抗性的和GFP-阳性细胞[Okita，K.等人，Nature，448：313-317(2007)]。此后，据披露，使用除了c-Myc基因之外的3个因子，也可以制备iPS细胞，这也构成嵌合小鼠的种系[Nakagawa，M.等人，Nat.Biotethnol.，26：101-106(2008)]。 
此外，Yamanaka等人通过将与在小鼠中使用的那些相同的4个基 因或3个基因导入人皮肤成纤维细胞中，成功地建立了iPS细胞[WO2007/069666A1；Takahashi，K.等人，Cell，131：861-872(2007)]。因此，已经证实，通过将确定的因子导入体细胞中，可以在人和小鼠中制备在多能性方面与胚胎干细胞相当的iPS细胞。 
在4个基因Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc中，据报道，Oct3/4和Sox2是维持胚胎干细胞的自我更新和多能性所必需的，且还已经报道，c-Myc参与维持胚胎干细胞的自我更新和多能性。同时，Klf4属于Krüppel-样因子(Klf)家族，即控制不同的生物学过程的转录因子，包括增殖、分化、发育和细胞凋亡[McConnell，B.B.等人，Bioassays，29：549-557(2007)]，但是它的功能的细节仍然不明。不同于胚胎干细胞，从植入后胚胎的上胚层建立的上胚层干细胞(EpiSC)不能形成嵌合的胚胎，甚至当注射进宿主胚泡中时。但是，在EpiSC中，以与在胚胎干细胞中的那些类似的水平表达Oct3/4和Sox2，而在显著更低的水平表达Klf4基因。最近，据报道，通过将单独的Klf4基因转入EpiSC中，可以获得与胚胎干细胞的性质类似的性质[Guo，G.等人，Development，136：1063-1069(2009)]。 
由于胚胎干细胞不表现出形态学变化，甚至在通过RNAi抑制(knock down)Klf4时[Nakatake，Y.等人，Mol.Cell.Biol.，26：7772-7782(2006)]，但是，Klf4可能不是维持胚胎干细胞的未分化状态所必需的。Yamanaka等人假设，用属于相同的各个家族的其它基因可以替代这4个基因，并证实，甚至当用Klf1、Klf2或Klf5替换Klf4时，可以建立iPS细胞[WO 2007/069666A1；Nakagawa，M.等人，Nat.Biotethnol.，26：101-106(2008)]。Thomson等人的研究组报道，使用Nanog和Lin28替代Klf4和c-Myc，可以制备人iPS细胞[WO 2008/118820A2；Yu，J.等人，Science，318：1917-1920(2007)]；可以认为，Klf4的功能与Nanog相比具有许多共同的方面。 
当用视黄酸处理胚胎干细胞来诱导它们的分化时，不仅Klf4的表达减少，而且Klf2和Klf5的表达也减少。注意到该事实，Jiang等人同时抑制了Klf2、Klf4和Klf5，并发现，在胚胎干细胞中诱导了分化，表明Klf家族的至少某些成员(诸如Klf2和Klf5)可以在胚胎干细胞中在功能上替代Klf4[Jiang，J.等人，Nat.Cell Biol.，10：353-360(2008)]。他们继续将Klf2或Klf5基因或其它转录因子和后生调节因子与3个基因 Oct3/4、Sox2和c-Myc一起转入MEF中；他们证实，Klf2和Klf5可以替代Klf4，并发现，Esrrb(一种与雌激素受体类似的孤儿细胞核受体)也能够替代Klf4[Feng，B.等人，Nat.Cell Biol.，11：197-203(2009)]。 
发明内容
在发现iPS细胞的临床应用中，最重要的是阐明核重编程序机制的所有细节。鉴别可以替代公知知识中现有核重编程序物质的未知核重编程序物质不仅在帮助阐明核重编程序机制中，而且在开发用于建立最适合临床应用的iPS细胞的方法中都是非常重要的。因此，本发明的一个目的是鉴别新颖的核重编程序物质，特别是可以替代Klf4的新颖的核重编程序物质，并提供使用所述物质建立iPS细胞的新颖的方法。 
为了实现该目的，发明人不仅对在多能细胞(诸如胚胎干细胞)中特异性地表达的基因的基因文库，而且对更宽范围的转录因子的基因文库，进行了广泛的基因分析，其可以用于建立iPS细胞作为Klf4的替代物。结果，发明人发现：当属于IRX家族的基因、属于GLIS家族的基因、属于PTX家族的基因或DMRT-样家族B(具有富含脯氨酸的C-端)1(DMRTB1)基因与3个基因Oct3/4、Sox2和c-Myc一起转入成年小鼠皮肤成纤维细胞或MEF中时，可以有效地建立iPS细胞，将这些转录因子鉴别为在功能上可以替代Klf4的新颖的核重编程序物质，并开发了本发明。 
因此，本发明提供了下述内容： 
[1]一种生产iPS细胞的方法，所述方法包括下述步骤：向体细胞中转入下述的(1)和(2)： 
(1)一种或多种选自下述的物质：IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员、DMRTB1以及编码它们的核酸， 
(2)当与Klf4组合时，能够从体细胞诱导iPS细胞的物质。 
[2]根据上面[1]所述的方法，其中在上面(1)中提及的物质包括至少一种选自下述的物质：iroquois同源框蛋白6(IRX6)、GLIS家族锌指1(GLIS1)、成对-样同源结构域转录因子2亚型b(PITX2)、DMRTB1以及编码它们的核酸。 
[3]根据上面[1]所述的方法，其中在上面(2)中提及的物质选自：Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Nanog和Lin家族以 及编码它们的核酸。 
【4】根据上面[1]所述的方法，其中在上面(2)中提及的物质是Oct3/4。 
【5】根据上面[1]所述的方法，其中在上面(2)中提及的物质是Oct3/4和Sox2。 
【6】根据上面[1]所述的方法，其中在上面(2)中提及的物质是Oct3/4和c-Myc。 
【7】根据上面[1]所述的方法，其中在上面(2)中提及的物质是Oct3/4、Sox2和c-Myc。 
【8】一种从体细胞诱导iPS细胞的诱导物，其包含下述的(1)和(2)： 
(1)一种或多种选自下述的物质：IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员、DMRTB1以及编码它们的核酸， 
(2)当与Klf4组合时，能够从体细胞诱导iPS细胞的物质。 
【9】根据上面[8]所述的诱导物，其中在上面(1)中提及的物质包括至少一种选自下述的物质：IRX6、GLIS1、PITX2、DMRTB1以及编码它们的核酸。 
【10】一种iPS细胞，其含有编码一种或多种选自下述的因子的外来核酸：IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员和DMRTB1。 
【11】根据上面[10]所述的iPS细胞，其含有编码一种或多种选自下述的因子的外来核酸：IRX6、GLIS1、PITX2和DMRTB1。 
【12】根据上面[10]所述的iPS细胞，其中所述至少一种外来核酸整合进基因组中。 
【13】一种生产体细胞的方法，所述方法包括：处理根据上面[10]所述的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞。 
【14】一种从体细胞诱导iPS细胞的诱导物，其包含一种或多种选自下述的物质：IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员、DMRTB1以及编码它们的核酸，其中所述诱导物与当与Klf4组合时能够从体细胞诱导iPS细胞的物质一起，转移进体细胞中。 
【15】一种或多种选自下述的物质用于生产iPS细胞的用途：IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员、DMRTB1以及编码它们的核酸，其中所述物质与当与Klf4组合时能够从体细胞诱导iPS细胞的物质一起，转移进体细胞中。 
[16]一种选自下述的物质：IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员、DMRTB1以及编码它们的核酸，所述物质作为从体细胞诱导iPS细胞的诱导物，其中所述物质与当与Klf4组合时能够从体细胞诱导iPS细胞的物质一起，转移进体细胞中。 
[17]根据上面[10]所述的iPS细胞在生产体细胞中的用途。 
[18]根据上面[10]所述的iPS细胞，其作为生产体细胞的细胞来源。 
根据本发明，已经证实IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员和DMRTB1能够在核重编程序中在功能上替代Klf4。预见到研究这些核重编程序物质的作用机制会促进核重编程序机制的阐明。本发明最近已经将除了在胚胎干细胞中特异性地表达的那些以外的基因鉴别为核重编程序物质的事实提示：在将来会发现现在未知的其它的核重编程序物质。 
附图说明
图1是显示了通过人Gateway进入克隆的功能来选择进入克隆的步骤(N.Goshima等人，Nature methods，2008)的示意图。 
图2显示了从转录因子的进入克隆产生用于体细胞重编程序因子筛选的转录因子表达文库的流程图。 
图3是借助于逆转录病毒把共4种基因(即，3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G06(基因名：GLIS1)、H08(基因名：DMRTB1)或H10(基因名：PITX2))转入Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞中所得到的GFP-阳性菌落的形态学的代表性照片。“Klf-G6-1”指示与3个基因一起转移G06(基因名：GLIS1)得到的iPS细胞克隆；“Klf-H8-2”指示与3个基因一起转移H08(基因名：DMRTB1)得到的iPS细胞克隆；“Klf-H10-1”和“Klf-H10”指示与3个基因一起转移H10(基因名：PITX2)得到的iPS细胞克隆。P0显示了在菌落建立时拍摄的图像；P1显示了第1代的图像(24孔)；P2显示了第2代的图像(6孔)。对于每组3个照片，左图显示了GFP-阳性菌落图像，中图显示了相差图像，右图显示了GFP-阳性菌落图像和相差图像的重叠照片。仅Klf-H10-1通过Reseed方法建立，而其它通过MSTO方法建立。 
图4是借助于逆转录病毒把共4种基因(即，即，3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和F09(基因名：IRX6)、G06(基因名：GLIS1)、H08(基 因名：DMRTB1)或H10(基因名：PITX2))转入Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞中所得到的GFP-阳性菌落在菌落建立时的形态学的代表性照片。“Klf-F9”指示与3个基因一起转移F09(基因名：IRX6)得到的iPS细胞克隆；“Klf-G6-1”和“Klf-G6-2”指示与3个基因一起转移G06(基因名：GLIS1)得到的iPS细胞克隆；“Klf-H8-1和“Klf-H8-2”指示与3个基因一起转移H08(基因名：DMRTB1)得到的iPS细胞克隆；“Klf-H10”指示与3个基因一起转移H10(基因名：PITX2)得到的iPS细胞克隆。“Reseed”显示了通过Reseed方法得到的结果；“MSTO”显示了通过MSTO方法得到的结果。 
图5是在G6-1(Klf-G6-1)、H8-2(Klf-H8-2)和H10(Klf-H10)iPS细胞克隆上进行基因组-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图6是在图5中的那些以外的另一个H10(Klf-H10)iPS细胞克隆上进行基因组-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图7是在G6-1(Klf-G6-1)、H8-2(Klf-H8-2)和H10(Klf-H10)iPS细胞克隆上进行RT-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞；“ES”和“iPS”指示小鼠胚胎干细胞和iPS细胞；“Sox2RT-“是阴性对照。 
图8是在图7中的那些以外的另一个H10(Klf-H10)iPS细胞克隆上进行基因组-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞；“ES”和“iPS”指示小鼠胚胎干细胞和iPS细胞；“Sox2RT-”是阴性对照。 
图9是通过把3种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞中建立的iPS细胞(GFP-阳性细胞)的菌落的数目的计数结果的图形表示。总结了6个独立实验的结果。 
图10是通过把2种因子(Oct3/4、Sox2)和G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞中建立的iPS细胞(GFP-阳性细胞)的菌落的数目的计数结果的图形表示。总结了 2个独立实验的结果。 
图11是代表性照片，其显示了通过把3种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞中建立的iPS细胞的菌落，和通过把2种因子(Oct3/4、Sox2)和G6(GLIS1)或H8(DMRTB1)的组合转入Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞中建立的iPS细胞的菌落。P0显示了在菌落建立时拍摄的图像；P1显示了第1代的图像；P2显示了第2代的图像。对于每组3张照片，左图显示了GFP-阳性菌落图像，中图显示了相差图像，右图显示了GFP-阳性菌落图像和相差图像的重叠照片。 
图12是在图11所示的iPS细胞克隆上进行基因组-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图13是在图11所示的iPS细胞克隆上进行基因组-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“ES”和“iPS”指示使用4种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的小鼠胚胎干细胞和iPS细胞。 
图14是通过把2种因子(Oct3/4、c-Myc)和H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞中建立的iPS细胞的菌落的代表性照片。P0显示了在菌落建立时拍摄的图像；P1显示了第1代的图像；P2显示了第2代的图像。对于每组3张照片，左图显示了GFP-阳性菌落图像，中图显示了相差图像，右图显示了GFP-阳性菌落图像和相差图像的重叠照片。 
图15是在图14所示的iPS细胞克隆上进行基因组-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图16是在图14所示的iPS细胞克隆上进行基因组-PCR的结果的代表性照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“ES”和“iPS”指示使用4种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的小鼠胚胎干细胞和iPS细胞。 
图17是通过把3种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS细胞(GFP-阳性细胞)的菌落的数目的计数结果的图形表示。总结了 4个独立实验的结果。 
图18是通过把2种因子(Oct3/4、Sox2)和G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS细胞(GFP-阳性细胞)的菌落的数目的计数结果的图形表示。在2(OS)+H10中建立的菌落的数目是1(对于MSTO方法)和1(对于Reseed方法)。 
图19的代表性照片显示了通过把3种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS细胞的菌落，和通过把2种因子(Oct3/4、Sox2)和G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转入Nanog-GFP小鼠MEF中建立的iPS细胞的菌落。P0显示了在菌落建立时拍摄的图像；P1显示了第1代的图像；P2显示了第2代的图像。OS+G6、OS+H8和OS+H10是在P0时的照片。对于每组3张照片，左图显示了GFP-阳性菌落图像，中图显示了相差图像，右图显示了GFP-阳性菌落图像和相差图像的重叠照片。 
图20是在图19所示的iPS细胞克隆(3种因子+G6、H8或H10)上进行基因组-PCR的结果的照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图21是在图19所示的iPS细胞克隆(3种因子+G6、H8或H10)上进行基因组-PCR的结果的照片。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“ES”和“iPS”指示使用4种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的小鼠胚胎干细胞和iPS细胞。 
图22是在畸胎瘤上进行基因组-PCR的结果的照片，所述畸胎瘤通过将从成年小鼠(Nanog-GFP小鼠)皮肤成纤维细胞建立的iPS克隆(G6-1克隆、G6-6克隆、H8-2克隆、H10克隆)皮下注射进免疫缺陷的小鼠中来制备。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图23显示了通过将G6-1克隆或G6-6克隆皮下注射进免疫缺陷的小鼠中制备的畸胎瘤的组织学染色的图像(苏木素-曙红染色)。 
图24显示了通过将H8-2克隆或H10克隆皮下注射进免疫缺陷的小鼠中制备的畸胎瘤的组织学染色的图像(苏木素-曙红染色)。 
图25的散点图显示了为了测定在K-G6和MEF之间、或在K-G6 和4F基因之间是否存在基因表达模式差异而进行的DNA微阵列分析的结果(变化倍数线：2-倍)。 
图26的散点图显示了为了测定在K-H8和MEF之间、或在K-H8和4F之间是否存在基因表达模式差异而进行的DNA微阵列分析的结果(变化倍数线：2-倍)。 
图27的散点图显示了为了测定在K-H10和MEF之间、或在K-H10和4F基因之间是否存在基因表达模式差异而进行的DNA微阵列分析的结果(变化倍数线：2-倍)。 
图28显示了基于各个细胞之间的相关系数而进行的聚簇的结果。 
图29的代表性照片是通过把3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)转入HDF中所建立的iPS细胞的菌落图像和碱性磷酸酶染色图像。为了对照，也显示了用4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的iPS细胞的菌落图像。 
图30是通过把3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)转入HDF中所建立的iPS细胞的第2代菌落的代表性照片。为了对照，也显示了用4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的iPS细胞的菌落图像。 
图31是基因组-PCR的结果的代表性照片，所述基因组-PCR是在通过把3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)转入HDF中所建立的iPS细胞克隆上进行。在该图中，“4种因子”指示用4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的iPS细胞，“AHDF”指示用作体细胞来源的成年皮肤成纤维细胞，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图32是RT-PCR的结果的代表性照片，所述RT-PCR是在通过把3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)转入HDF中所建立的iPS细胞克隆上进行。在该图中，“4种因子”和“AHDF”与在图31中的那些相同，“KhES1”指示人胚胎干细胞，“201B7”指示在过去建立的iPS细胞[Cell，131：861-872(2007)]。 
图33的代表性照片是通过把2个基因(Oct3/4、Sox2)和H8(DMRTB1)、或3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和H10(PITX2)转入DP31中所建立的iPS细胞的菌落图像和碱性磷酸酶染色图像。为了对照，也显示了用4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)建立的iPS细胞的菌落 图像。 
图34是通过把2个基因(Oct3/4、Sox2)和H8(DMRTB1)转入DP31中所建立的iPS细胞的第1代菌落的代表性照片。 
图35是基因组-PCR的结果的代表性照片，所述基因组-PCR是在通过把2个基因(Oct3/4、Sox2)和H8(DMRTB1)转入DP31中所建立的iPS细胞克隆上进行。在该图中，“DP31”指示用作体细胞来源的牙髓干细胞克隆，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图36是RT-PCR的结果的代表性照片，所述RT-PCR是在通过把2个基因(Oct3/4、Sox2)和H8(DMRTB1)转入DP31中所建立的iPS细胞克隆上进行。在该图中，“DP31”指示用作体细胞来源的牙髓干细胞克隆，“hES”指示人胚胎干细胞，“201B7”指示在过去建立的iPS细胞[Cell，131：861-872(2007)]。 
图37是通过把3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和H10(PITX2)转入DP31中所建立的iPS细胞的第1代菌落的代表性照片。 
图38是基因组-PCR的结果的代表性照片，所述基因组-PCR是在通过把3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和H10(PITX2)转入DP31中所建立的iPS细胞克隆上进行。在该图中，“DP31”指示用作体细胞来源的牙髓干细胞克隆，“质粒”指示通过扩增整合进pMXs中的每个基因而制备的阳性对照。 
图39是RT-PCR的结果的代表性照片，所述RT-PCR是在通过把3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和H10(PITX2)转入DP31中所建立的iPS细胞克隆上进行。在该图中，“DP31”指示用作体细胞来源的牙髓干细胞克隆，“hES”指示人胚胎干细胞，“201B7”指示在过去建立的iPS细胞[Cell，131：861-872(2007)]。 
图40显示了畸胎瘤的组织学染色的图像(苏木素-曙红染色)，所述畸胎瘤通过将用3个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G6(GLIS1)建立的iPS细胞克隆注射进Scid小鼠睾丸中来制备。 
具体实施方式
本发明提供了可以替代Klf4的新颖的核重编程序物质，以及通过将所述物质和当与Klf4组合时能够从体细胞诱导iPS细胞的核重编程序物 质转入体细胞中来生产iPS细胞的方法。 
(a)新颖的核重编程序物质(替代Klf4)
在本发明中，“核重编程序物质”表示能够从体细胞诱导iPS细胞的任意物质，其可以由任意物质组成，诸如蛋白因子或编码它们的核酸(包括整合进载体中的形式)或低分子化合物。通过本发明鉴别出的可以替代Klf4的核重编程序物质是：蛋白，所述蛋白属于IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族和DMRT-样家族B(具有富含脯氨酸的C-端1(DMRTB1))的成员，或编码它们的核酸。 
IRX(iroquois同源框)家族具有一个同源框结构域，被认为是在脊椎动物胚胎的模式形成过程中起多种作用。该基因家族的成员的实例包括、但不限于：iroquois同源框蛋白1(IRX1)、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、IRX6等，优选IRX6。IRX6是在人和小鼠胚胎干细胞中不表达的基因。 
GLIS家族包含这样的转录因子，其具有5个C2H2型锌指区，并在胚胎发生过程中正或负控制不同基因的表达。该基因家族的成员的实例包括、但不限于：GLIS家族锌指1(GLIS1)、GLIS2、GLIS3等，优选GLIS1。GLIS1是在小鼠胚胎干细胞中不表达的基因。 
PTX家族具有一个同源框结构域，且参与侧不对称的器官发生和决定。该基因家族的成员的实例包括、但不限于：成对-样同源结构域转录因子1(PITX1)、PITX2、PITX3等，优选PITX2。已知PITX2存在3种亚型(亚型a、b和c)。尽管可以使用任意的亚型，例如，优选地使用亚型b。 
DMRT-样家族B(具有富含脯氨酸的C-端1(DMRTB1))是未知功能的转录因子，其具有两性DNA结合基序。DMRTB1是在人和小鼠胚胎干细胞中不表达的基因。 
尽管在本发明中使用的IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员和DMRTB1可以是：源自任选地选择的哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、猴、牛、马、猪、狗等)的蛋白或编码它们的核酸，但是人或小鼠起源的蛋白或核酸是优选的。参考在表1中显示的NCBI登录号，可以获得关于上述的人或小鼠起源的核重编程序物质的氨基酸序列和cDNA序列的信息；本领域技术人员基于cDNA序列信息能够容易地分离编码各种蛋白的核酸，并根据需要生产重组蛋白。 
表1 
与上面显示的每个氨基酸序列具有90％或更高、优选95％或更高、更优选98％或更高、特别优选99％或更高的同一性、且具有与野生型蛋白等效的作为Klf4的替代物的核重编程序潜力的天然的或人工的突变型蛋白和编码它们的核酸，也可以用作本发明的可以替代Klf4的核重编程序物质。 
在IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员和DMRTB1(包括编码它们的核酸)中，可以使用单独的任一种，且可以组合地使用2种或更多种。 
(b)当与Klf4组合时能够诱导iPS细胞的核重编程序物质
目前，已知下述的包含Klf4的核重编程序物质的组合能够从体细胞诱导iPS细胞(在下文中，仅给出蛋白因子的名称)。 
(1)Oct3/4，Klf4，c-Myc 
(2)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2(Sox2可以替换为Sox1，Sox3，Sox15，Sox17或Sox18；c-Myc可以替换为T58A(活性突变体)，N-Myc，或L-Myc) 
(3)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，Fbx15，Nanog，Eras，ECAT15-2，TclI，β-连环蛋白(活性突变体S33Y) 
(4)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，TERT，SV40大T 
(5)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，TERT，HPV16E6 
(6)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，TERT，HPV16E7 
(7)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，TERT，HPV16E6，HPV16E7 
(8)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，TERT，Bmil 
[关于上面显示的因子的更多的信息，参见WO 2007/069666(关于在上面(2)的组合中用Sox18替换Sox2的信息，参见Nature Biotechnology，26，101-106(2008))；关于组合“Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2”，也参见Cell，126，663-676(2006)，Cell，131，861-872(2007)等；关于组合“Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，hTERT，SV40大T”，也参见Nature，451，141-146(2008).] 
(9)Oct3/4，Klf4，Sox2[参见Nature Biotechnology，26，101-106(2008)] 
(10)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，Nanog，Lin28[参见Cell Research(2008)600-603] 
(11)Oct3/4，Klf4，c-Myc，Sox2，SV40大T(也参见Stem Cells，26，1998-2005(2008)) 
(12)Oct3/4，Klf4[也参见Nature，454，646-650(2008)；Cell Stem Cell，2：525-528(2008)] 
(13)Oct3/4，Klf4，L-Myc 
因此，当与Klf4组合时能够诱导iPS细胞的核重编程序物质的优选组合是与上面(1)-(13)相同的物质的组合，但是不包括Klf4，即， 
(i)Oct3/4，c-Myc 
(ii)Oct3/4，c-Myc，Sox2(Sox2可以替换为Sox1，Sox3，Sox15，Sox17或Sox18；c-Myc可以替换为T58A(活性突变体)，N-Myc，或L-Myc) 
(iii)Oct3/4，c-Myc，Sox2，Fbx15，Nanog，Eras，ECAT15-2，TclI，β-连环蛋白(活性突变体S33Y) 
(iv)Oct3/4，c-Myc，Sox2，TERT，SV40大T 
(v)Oct3/4，c-Myc，Sox2，TERT，HPV16E6 
(vi)Oct3/4，c-Myc，Sox2，TERT，HPV16E7 
(vii)Oct3/4，c-Myc，Sox2，TERT，HPV16E6，HPV16E7 
(viii)Oct3/4，c-Myc，Sox2，TERT，Bmil 
(ix)Oct3/4，Sox2 
(x)Oct3/4，c-Myc，Sox2，Nanog，Lin28 
(xi)Oct3/4，c-Myc，Sox2，SV40大T 
(xii)Oct3/4，和 
(xiii)Oct3/4，L-Myc。关于上面的(i)-(xiii)，Oct3/4可以替换为Oct家族的其它成员，例如，Oct1A、Oct6等。此外，Sox2(或Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18)可以替换为Sox家族的其它成员，例如，Sox7等。 
从组合到一起的这些事实判断，当与Klf4组合时能够诱导iPS细胞的核重编程序物质优选地选自：Oct家族的成员(例如，Oct3/4、Oct1A、Oct6)、Sox家族的成员(例如，Sox2、Sox1、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18)、Myc家族的成员(例如，c-Myc、n-Myc、L-Myc)和Nanog和Lin家族的成员(例如，Lin28、Lin28b)。更优选地，可以使用至少包含Oct3/4、且可以任选地另外包含Sox2和/或c-Myc的组合[即，(a)Oct3/4、(b)Oct3/4+Sox2、(c)Oct3/4+c-Myc和(d)Oct3/4+Sox2+c-Myc中的任一个]，且这可以用于与Nanog和/或Lin28的其它组合中。在这里，包含L-Myc(替代c-Myc)的组合也代表优选的实施方案。 
除了上面的(i)-(xiii)以外的任意组合(但是包含其中任一个的所有组分，且另外包含任意其它任选地选择的物质)，也可以被包含在本发明的“核重编程序物质”的范围内。例如，Klf家族的成员(例如，Klf1、Klf2、Klf5)或其它已知的可替换的因子(例如，Esrr家族的成员诸如Esrrb、Esrrg等)可以作为其它物质组合地使用。条件是，要经历核重编程序的体细胞 会在足以造成核重编程序的水平内源地表达上面的(i)-(xiii)中任一项的一种或多种组分，仅其它组分的组合(不包括表达的一种或多种组分)也可以被包含在本发明的“当与Klf4组合时能够诱导iPS细胞的核重编程序物质”的范围内。 
当要将得到的iPS细胞用于治疗目的时，在这些组合中，2种因子Oct3/4和Sox2的组合[即，上面的(ix)]或3种因子Oct3/4、Sox2和L-Myc的组合[即，上面的(ii)]是优选的。同时，当得到的iPS细胞不是用于治疗目的时(例如，用作研究工具，诸如用于药物发现筛选等)，4种因子Oct3/4、c-Myc(或L-Myc)、Sox2和Lin28的组合、或由这4种因子和Nanog组成的5种因子的组合[即，上面的(x)]是优选的。 
参考在WO 2007/069666(出版中，Nanog被描述为ECAT4)中提及的NCBI登录号，可以得到关于前述单个蛋白因子的小鼠和人cDNA序列的信息。分别参考NCBI登录号NM_145833和NM_024674，可以得到关于Lin28的小鼠和人cDNA序列的信息。分别参考NCBI登录号NM_001031772和NM_001004317，可以得到关于Lin28b的小鼠和人cDNA序列的信息。分别参考NCBI登录号NM_008506和NM_001033081，可以得到关于L-Myc的小鼠和人cDNA序列的信息。本领域技术人员能够容易地分离这些cDNA。当用作核重编程序物质时，蛋白因子本身可以如下制备：将得到的cDNA插入适当的表达载体中，将该载体转入宿主细胞中，培养细胞，并从得到的培养物回收重组蛋白因子。同时，当使用的核重编程序物质是编码蛋白因子的核酸时，将得到的cDNA插入病毒或质粒载体中，以构建表达载体，并对该载体进行核重编程序的步骤。 
当与Klf4组合时能够诱导iPS细胞的核重编程序物质不仅包括上述常规已知的蛋白因子或编码它们的核酸的组合，而且包括将来新发现的蛋白因子或编码它们的核酸的组合，且可以另外包括包含非蛋白因子(诸如低分子化合物，只要当与Klf4一起导入体细胞时它能够将体细胞转化成iPS细胞)的组合。 
(c)体细胞的来源
哺乳动物起源(例如，人、小鼠、猴、猪、大鼠等)的除了生殖细胞以外的任意细胞，可以用作在本发明中生产iPS细胞的原料。实例包括角质化上皮细胞(例如，角质化的表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如，舌 浅层的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如，乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如，肾上腺髓质细胞)、代谢或储存细胞(例如，肝细胞)、构成界面的内膜上皮细胞(例如，I型肺泡细胞)、闭膜管的内膜上皮细胞(例如，血管内皮细胞)、具有运输能力的具有纤毛的细胞(例如，呼吸道上皮细胞)、细胞外基质分泌细胞(例如，成纤维细胞)、收缩细胞(例如，平滑肌细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞)、感觉相关的细胞(例如，杆状细胞)、自主神经系统神经元(例如，胆碱能神经元)、感觉器官和外周神经元的支持细胞(例如，卫星细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞)、色素细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)、其祖细胞(组织祖细胞)等。对于细胞分化程度、收集细胞的动物的年龄等没有限制；甚至未分化的祖细胞(包括身体干细胞)和最终分化的成熟细胞同样可以在本发明中用作体细胞来源。未分化的祖细胞的实例包括组织干细胞(身体干细胞)诸如神经干细胞、造血干细胞、间质干细胞、牙髓干细胞。 
作为体细胞来源的单个哺乳动物的选择没有特别限制；但是，当得到的iPS细胞要用于人的再生医学时，从预防移植物排斥的观点看，特别优选地，体细胞是患者自身的细胞，或从具有与患者相同或基本上相同的HLA类型的另一个人(供体)收集。在这里，HLA类型是“基本上相同的”的描述是指，HLA类型的一致性达到这样的程度，其允许细胞移植物在接受细胞的患者中存活，所述细胞通过诱导分化从体细胞-衍生的iPS细胞得到，使用免疫抑制剂等进行移植。实例包括其中主要的HLA类型(例如，3个基因座HLA-A、HLA-B和HLA-DR)是相同的情况等(下面也适用)。当得到的iPS细胞不是要施用(移植)给人，而是用作例如用于筛选或评价患者的药物敏感性或不良反应的细胞来源时，同样希望从患者或具有与药物敏感性或不良反应有关的相同遗传多态性的另一个人收集体细胞。 
使用本身已知适用于其培养的培养基(取决于细胞的类型)，可以预培养从诸如小鼠或人等哺乳动物分离的体细胞。这样的培养基的实例包括、但不限于：含有约5-20％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)、Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。例如，当使用转移试剂(诸如阳离子脂质体)来使细胞接触核重编程序物质(且根据需要，也接触下述的iPS细胞建立效 率提高剂)时，有时优选地使用无血清的培养基来替代培养基，以便防止转移效率降低。 
(d)如何将核重编程序物质转移进体细胞中
使用本身已知的将蛋白转移进细胞中的方法，可以将在上面(a)中所述的“可以替代Klf4的核重编程序物质”和在上面(b)中所述的“当与Klf4组合时能够诱导iPS细胞的核重编程序物质”转移进体细胞中，条件是所述物质是蛋白因子。这样的方法包括：例如，使用蛋白转移试剂的方法，使用蛋白转移结构域(PTD)-或细胞渗透肽(CPP)-融合蛋白的方法，显微注射方法等。蛋白转移试剂是可商业得到的，包括基于阳离子脂质的那些，诸如BioPOTER蛋白递送试剂(Genlti)、Pro-JectTM蛋白转染试剂(PIERCE)、PULSinTM递送试剂(Polyplus-转染)和ProVectin(IMGENEX)；基于脂质的那些，诸如Profect-1(Targeting Systems)；基于膜透性的肽的那些，诸如Penetrain肽(Q biogene)、Chariot试剂盒(Active基序)和GenomONE(Ishihara Sangyo)，其采用HVJ外壳(灭活的仙台病毒)等。按照这些试剂附随的手册，可以实现转移，在下面描述了一种通用规程。在适当的溶剂(例如，缓冲溶液诸如PBS或HEPES)中稀释核重编程序物质，加入转移试剂，在室温温育混合物约5-15分钟，形成复合物，在用无血清的培养基替换培养基以后，将该复合物加入细胞，并在37℃温育细胞1至几小时。此后，去除培养基，并替换为含有血清的培养基。 
开发的PTD包括使用蛋白的细胞转移结构域的那些，诸如果蝇-衍生的AntP、HIV-衍生的TAT(Frankel，A.等人，Cell 55，1189-93(1988)；Green，M.&Loewenstein，P.M.Cell 55，1179-88(1988))、Penetratin(Derossi，D.等人，J.Biol.Chem.269，10444-50(1994))、Buforin II(Park，C.B.等人Proc.Natl Acad.Sci.USA 97，8245-50(2000))、Transportan(Pooga，M.等人FASEB J.12，67-77(1998))、MAP(模型两亲肽)(Oehlke，J.等人Biochim.Biophys.Acta.1414，127-39(1998))、K-FGF(Lin，Y.Z.等人J.Biol.Chem.270，14255-14258(1995))、Ku70(Sawada，M.等人Nature Cell Biol.5，352-7(2003))、朊病毒(Lundberg，P.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.299，85-90(2002))、pVEC(Elmquist，A.等人Exp.Cell Res.269，237-44(2001))、Pep-1(Morris，M.C.等人Nature Biotechnol.19，1173-6(2001))、Pep-7(Gao，C.等人Bioorg.Med.Chem. 10，4057-65(2002))、SynB1(Rousselle，C.等人Mol.Pharmacol.57，679-86(2000))、HN-I(Hong，F.D.&Clayman，G L.Cancer Res.60，6551-6(2000))和HSV-衍生的VP22。PTD-衍生的CPP包括聚精氨酸，诸如11R[Cell Stem Cell，4：381-384(2009)]和9R[Cell Stem Cell，4：472-476(2009)]。 
制备掺入了核重编程序物质的cDNA和PTD或CPP序列的融合蛋白表达载体，以允许重组表达融合蛋白，并回收融合蛋白用于转移。该转移可以如上所述实现，但是没有加入蛋白转移试剂。 
显微注射(该方法将蛋白溶液放入尖直径为约1μm的玻璃针中，并将该溶液注射进细胞中)可以确保将蛋白转移进细胞中。 
其它有用的蛋白转移方法包括电穿孔、半完整细胞方法[Kano，F.等人Methods in Molecular Biology，Vol.322，357-365(2006)]、使用Wr-t肽的转移[Kondo，E.等人，Mol.Cancer Ther.3(12)，1623-1630(2004)]等。 
蛋白转移操作可以执行一次或更多任选地选择的次数(例如，一次或多至10次或更少，或一次或多至5次或更少等)；优选地，转移操作可以重复进行2次或多次(例如，3次或4次)。重复转移之间的时间间隔是例如6-48小时、优选12-24小时。 
如果关注iPS细胞建立效率，优选地使用编码它们的核酸形式的核重编程序物质，而不是蛋白因子本身。所述核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA嵌合体，且可以是双链的或单链的。优选地，所述核酸是双链的DNA，尤其是cDNA。 
将核重编程序物质的cDNA插入适当的表达载体中，所述载体包含能够在宿主体细胞中起作用的启动子。有用的表达载体包括：例如，病毒载体(诸如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和仙台病毒)、用于在动物细胞中表达的质粒(例如，pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。 
根据得到的iPS细胞的预期用途，可以选择使用的载体的适当种类。有用的载体包括：例如，腺病毒载体、质粒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。 
在表达载体中使用的启动子的实例包括：EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(Moloney小鼠白血病病毒) LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等，优选EF1α启动子、CAG启动子、MoMuLV LTR、CMV启动子、SRα启动子等。 
除了启动子以外，根据需要，表达载体可以含有增强子、聚腺苷酸化信号、选择标记基因、SV40复制起点等。有用的选择标记基因的实例包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。 
作为核重编程序物质的核酸(重编程序基因)可以分别地整合进不同的表达载体中，或者可以将2种或更多种、优选2-3种基因整合进单个表达载体中。当使用提供高基因转移效率的逆转录病毒或慢病毒载体，优选前一种情况，当使用质粒、腺病毒或附加型载体等时，优选后一种情况。此外，可以组合地使用整合了2种或更多种基因的表达载体和整合了单独一种基因的另一种表达载体。 
在上文背景中，当将多种基因整合进一种表达载体中时，这些基因可以优选地通过使得能够进行多顺反子表达的间插序列而插入表达载体内。通过使用能够进行多顺反子表达的间插序列，可能更有效地表达在一种表达载体中整合的多种基因。能够进行多顺反子表达的有用序列包括：例如，口蹄疫病毒的2A序列(SEQ ID NO：2；PLoS ONE 3、e2532、2008、Stem Cells 25、1707、2007)、IRES序列(美国专利号4,937,190)等，优选2A序列。 
根据载体的选择，通过本身已知的技术，可以将携带核酸作为核重编程序物质的表达载体导入细胞中。例如，在病毒载体的情况下，可以将含有核酸的质粒导入适当的包装细胞(例如，Plt-E细胞)或补充细胞系(例如，293-细胞)中，回收在培养上清液中生成的病毒载体，通过适合病毒载体的方法，用所述载体感染细胞。例如，在WO2007/69666、Cell，126，663-676(2006)和Cell，131，861-872(2007)中，公开了使用逆转录病毒载体的具体方法。在Science，318，1917-1920(2007)中，公开了使用慢病毒载体的具体方法。当将iPS细胞用作用于再生医学的细胞的来源时，优选地短暂地表达重编程序基因，而不整合进细胞的染色体中，因为重编程序基因的表达(再活化)可能增加在从来自iPS细胞的分化细胞再生的组织中致癌的风险。从该观点看，优选地使用很少整合进染色体中的腺病毒载体。在Science，322，945-949(2008)中，公开了使用腺病毒载体的具体方法。因为腺伴随病毒整合进染色体中的频率也较低，且在细胞毒性和炎症诱导能力方面低于腺病毒载体，可以提及它作为另一种优 选的载体。因为仙台病毒载体能够稳定地存在于染色体之外，且根据需要可以使用siRNA进行降解和去除，也优选地使用它。关于仙台病毒载体，可以使用在J.Biol.Chem.，282，27383-27391(2007)，Proc.Jpn.Acad.，Ser.B 85，348-362(2009)或日本专利号3602058中描述的载体。 
当使用逆转录病毒载体或慢病毒载体时，即使已经发生转基因的沉默，也可能重新活化它；因此，例如，优选地使用这样的方法，其中使用Cre/loxP系统，切掉编码核重编程序物质的核酸(当它已经变得不必需时)。也就是说，预先将loxP序列排列在核酸的两端，诱导iPS细胞，此后使用质粒载体或腺病毒载体，使Cre重组酶作用于所述细胞，并切掉loxP序列夹入的区域。因为LTR U3区域的增强子-启动子序列可能通过插入突变上调节在其附近的宿主基因，更优选地，使用3’-自灭活的(SIN)LTR(通过删除该序列或用聚腺苷酸化序列(诸如SV40的聚腺苷酸化序列)替代该序列而制备)，避免在没有切掉的、保留在基因组中的loxP序列之外的LTR对内源基因的表达调节。在Chang等人，Stem Cells，27：1042-1049(2009)中，公开了使用Cre-loxP系统和SIN LTR的具体方法。 
同时，对于非病毒载体，使用脂转染方法、脂质体方法、电穿孔方法、磷酸钙共沉淀方法、DEAE葡聚糖方法、显微注射方法、基因枪方法等，可以将质粒载体转移进细胞中。在例如Science，322，949-953(2008)等中，描述了使用质粒作为载体的具体方法。 
当使用质粒载体或腺病毒载体等时，基因转移可以执行一次或更多任选地选择的次数(例如，一次至10次，或一次至5次)。当将2种或更多种表达载体导入体细胞中时，优选地，这些所有种类的表达载体同时导入体细胞中；然而，即使在这种情况下，转染也可以执行一次或更多任选地选择的次数(例如，一次至10次，一次至5次等)，优选地，转染可以重复执行2次或更多次(例如，3次或4次)。 
另外，当使用腺病毒或质粒时，转基因可以整合进染色体中；因此，最后必须通过DNA印迹法或PCR确认基因没有插入染色体中。为此原因，象前述的Cre-loxP系统一样，可以有利地使用这样的方法，其中使转基因整合进染色体中，然后去除该基因。在另一个优选的实施方案模式中，可以使用这样的方法，其中使用转座子，使转基因整合进染色体中，然后使用质粒载体或腺病毒载体，使转座酶作用于细胞，从而从染 色体中彻底消除转基因。作为优选的转座子的实例，可以提及piggyBac(源自鳞翅目昆虫的转座子)等。在Kaji，K.等人，Nature，458：771-775(2009)；Woltjen等人，Nature，458：766-770(2009)中，公开了使用piggyBac转座子的具体方法。 
另一个优选的非重组类型载体是可在染色体外自主复制的附加型载体。Yu等人in Science，324，797-801(2009)公开了使用附加型载体的具体规程。根据需要，通过将重编程序基因插入附加型载体(其具有loxP序列，所述loxP序列以相同朝向放置在附加型载体复制必需的载体元件的5’和3’侧)中，可以构建表达载体，这可以转移进体细胞中。 
附加型载体的实例包括这样的载体，其含有它的自主复制必需的序列(源自EBV、SV40等)作为载体元件。具体地，它的自主复制必需的载体元件是复制起点或编码蛋白(其结合复制起点以调节它的复制)的基因；实例包括复制起点oriP和EBNA-1基因(对于EBV)，以及复制起点ori和SV40大T抗原基因(对于SV40)。 
附加型表达载体含有控制重编程序基因的转录的启动子。使用的启动子可以是与上面相同的启动子。附加型表达载体可以根据需要另外包含增强子、加A信号、选择标记基因等，如上所述。选择标记基因的实例包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因等。 
可以用于本发明中的loxP序列的实例包括：噬菌体P1-衍生的野生型loxP序列(SEQ ID NO：17)，和任选地选择的突变型loxP序列，其当以相同朝向放在夹住重编程序基因复制必需的载体元件的位置处时，能够通过重组删除在loxP序列之间的序列。突变型loxP序列的实例包括lox71(SEQ ID NO：18，其具有在5’侧重复序列中的突变)、lox66(SEQ ID NO：19，其具有在3’侧重复序列中的突变)、lox2272、lox511等(它们具有在其间隔部分中的突变)。尽管放在载体元件的5’和3’侧的2个loxP序列可以是相同的或不同的，在具有在其间隔区域中的突变的突变型loxP序列的情况下，使用相同的序列(例如，一对lox2272序列、一对lox511序列)。优选地，使用具有在5’侧重复序列中的突变的突变型loxP序列(例如，lox71)和具有在3’侧重复序列中的突变的突变型loxP序列(例如，lox66)的组合。在该情况下，在重组后保留在染色体上的loxP序列具有在5’和3’侧上的重复序列中的双重突变，且因此不可能被Cre重组酶识别；因此，降低了由于不希望的重组在染色体中造成删除突变的风 险。当使用lox71和lox66时，任一种突变型loxP序列可以放在前述载体元件的5’和3’侧，但是必须以使突变位点位于loxP序列的外端处的朝向插入突变型loxP序列。 
将2个loxP序列以相同的朝向放在重编程序基因复制必需的载体元件的5’和3’侧(即，复制起点，或结合复制起点以调节它的复制的基因序列)。在loxP序列之间的载体元件可以是复制起点，或编码复制起点以调节它的复制的蛋白的基因序列，或二者。 
使用例如脂转染方法、脂质体方法、电穿孔方法、磷酸钙共沉淀方法、DEAE葡聚糖方法、显微注射方法、基因枪方法等，可以将附加型载体导入细胞中。具体地，可以使用例如描述在Science，324：797-801(2009)中的方法。 
通过进行DNA印迹分析或PCR分析，可以确定重编程序基因复制必需的载体元件是否已经从iPS细胞去除，在所述分析中，使用包含在载体元件内和/或在loxP序列附近的碱基序列的核酸作为探针或引物，使用从iPS细胞分离出的附加体级分作为模板，以检查带是否存在或检测到的带的长度。使用本领域众所周知的方法，例如，在Science，324：797-801(2009)中描述的方法，可以制备附加体级分。 
当通过与Klf4组合能够诱导iPS细胞的核重编程序物质是低分子化合物时，可以如下将其导入体细胞中：将所述物质以适当的浓度溶解在水性或非水性溶剂中，将该溶液加入适用于培养从人或小鼠分离的体细胞的培养基[例如，含有约5-20％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)、Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基和它们的组合等]中，使得核重编程序物质浓度落入足以在体细胞中造成核重编程序且不会造成细胞毒性的范围内，并培养所述细胞指定的时段。核重编程序物质浓度随使用的核重编程序物质的种类而变化，并在约0.1nM至约100nM的范围内适当选择。接触持续时间没有特别限制，只要足以造成细胞的核重编程序即可；通常，可以使核重编程序物质共存于培养基中，直到阳性菌落出现。 
(e)iPS细胞建立效率提高剂
近年来，相继提出了多种提高iPS细胞的建立效率(其在传统上较低)的物质。因此，除了上述的核重编程序物质以外，可以预期，通过使这些iPS细胞建立效率提高剂接触体细胞，会增加iPS细胞的建立效 率。 
iPS细胞建立效率提高剂的实例包括、但不限于：组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂[例如，丙戊酸(VPA)(Nat.Biotechnol.，26(7)：795-797(2008)]，低分子抑制剂诸如曲古抑菌素A、丁酸钠、MC 1293和M344，基于核酸的表达抑制剂诸如针对HDAC的siRNA和shRNA(例如，HDAC1 siRNA Smartpool(Millipore)、针对HDAC1的HuSH 29聚体shRNA构建体(OriGene)等)等)，DNA甲基转移酶抑制剂(例如，5’-氮胞苷)[Nat.Biotechnol.，26(7)：795-797(2008)]，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如，低分子抑制剂诸如BIX-01294(Cell Stem Cell，2：525-528(2008)、基于核酸的表达抑制剂诸如针对G9a的siRNA和shRNA(例如，G9a siRNA(人)(Santa Cruz Biotechnology)等)等]，L-通道钙激动剂(例如，Bayk8644)[Cell Stem Cell，3，568-574(2008)]，p53抑制剂[例如，针对p53的siRNA和shRNA(Cell Stem Cell，3，475-479(2008))，UTF1[Cell Stem Cell，3，475-479(2008)]，Wnt信号传递诱导物(例如，可溶的Wnt3a)[Cell Stem Cell，3，132-135(2008)]，2i/LIF[2i是促分裂原-活化的蛋白激酶信号传递和糖原合酶激酶-3的抑制剂，PloS Biology，6(10)，2237-2247(2008)]，胚胎干细胞-特异性的miRNA[例如，miR-302-367簇(Mol.Cell.Biol.doi：10.1128/MCB.00398-08)、miR-302(RNA(2008)14：1-10)、miR-291-3p、miR-294和miR-295(这3个描述在Nat.Biotechnol.27：459-461(2009)中)]等。如上所述，基于核酸的表达抑制剂可以是携带编码siRNA或shRNA的DNA的表达载体的形式。 
在前述的核重编程序物质的组分中，例如SV40大T等也可以被包含在iPS细胞建立效率提高剂的范围内，因为它们被视作体细胞核重编程序的非必需的(而是辅助性的)因子。在核程序化的机制仍然不明的情况下，核重编程序非必需的辅助因子可以方便地视作核重编程序物质或iPS细胞建立效率提高剂。因此，因为体细胞核重编程序过程被理解为核重编程序物质和iPS细胞建立效率提高剂接触体细胞所产生的总事件，本领域技术人员没有必要总是区分核重编程序物质和iPS细胞建立效率提高剂。 
对于下述的每种情况，可以如上所述，使iPS细胞建立效率提高剂接触体细胞：(a)所述提高剂是蛋白因子，(b)所述提高剂是编码蛋白因子的核酸，和(c)所述提高剂是低分子化合物。 
可以使iPS细胞建立效率提高剂与核重编程序物质同时接触体细胞，或可以预先接触任一种，只要与没有所述提高剂时相比，显著提高从体细胞建立iPS细胞的效率即可。在一个实施方案中，例如，当核重编程序物质是编码蛋白因子的核酸且iPS细胞建立效率提高剂是化学抑制剂时，可以在基因转移处理后培养细胞给定的时间长度以后，将iPS细胞建立效率提高剂加入培养基中，因为核重编程序物质距离基因转移处理滞后给定的时间长度以大量表达蛋白因子，而iPS细胞建立效率提高剂能够迅速地作用于细胞。在另一个实施方案中，当核重编程序物质和iPS细胞建立效率提高剂都以病毒或非病毒载体的形式使用时，例如，二者可以同时导入细胞中。 
(f)通过培养条件提高建立效率
在细胞的核重编程序步骤中，通过在低氧条件下培养用于该目的的体细胞，可以进一步提高iPS细胞的建立效率。本文使用的术语“低氧条件”是指，在细胞培养过程中在环境气氛中的氧浓度明显低于空气中的氧浓度。具体地，这样的条件包括比5-10％CO2/95-90％空气的环境气氛(这常用于普通细胞培养)中的氧浓度更低的氧浓度；例如，在环境气氛中18％或更低的氧浓度是适用的。优选地，在环境气氛中的氧浓度是15％或更低(例如，14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低等)、10％或更低(例如，9％或更低、8％或更低、7％或更低、6％或更低等)或5％或更低(例如，4％或更低、3％或更低、2％或更低等)。在环境气氛中的氧浓度优选地是0.1％或更高(例如，0.2％或更高、0.3％或更高、0.4％或更高等)、0.5％或更高(例如，0.6％或更高、0.7％或更高、0.8％或更高、0.9％或更高等)或1％或更高(例如，1.1％或更高、1.2％或更高、1.3％或更高、1.4％或更高等)。 
关于如何在细胞环境中建立低氧条件没有限制；最容易的合适的方法是，在允许控制氧浓度的CO2培养箱中培养细胞。这样的CO2培养箱可从许多设备生产商商业地得到(例如，可以使用由Thermo Scientific、Ikemoto Scientific Technology、Juji Field Inc.和Wakenyaku Co.，Ltd.生产的用于低氧培养的CO2培养箱)。 
在低氧条件下开始细胞培养的时机没有特别限制，只要与在正常氧浓度(20％)得到的效率相比，它不会妨碍提高iPS细胞的建立效率即可。开始时间可以是在核重编程序物质接触体细胞之前或之后，且可以是在 接触同时。例如，优选地，核重编程序物质接触体细胞之后立即，或在接触后给定的时间以后(例如，1-10(例如，2、3、4、5、6、7、8或9)天)，开始在低氧条件下的细胞培养。 
在低氧条件下的细胞培养持续时间没有特别限制，只要与在正常氧浓度(20％)得到的效率相比，它不会妨碍提高iPS细胞的建立效率即可。实例包括、但不限于：3天或更久、5天或更久、7天或更久、或10天或更久至50天或更短、40天或更短、35天或更短、或30天或更短。在低氧条件下的细胞培养的优选持续时间也随在环境气氛中的氧浓度而变化；本领域技术人员可以根据使用的氧浓度，适当地调节细胞培养的持续时间。在本发明的一个实施方案中，当使用抗药性作为指标来选择iPS细胞候选菌落时，优选地，在开始药物选择之前，从低氧条件恢复正常氧浓度。 
此外，在低氧条件下的细胞培养的优选开始时间和持续时间也随下述因素而变化：使用的核重编程序物质的选择，在包含正常氧浓度的条件下建立iPS细胞的效率，和其它因素。 
使核重编程序物质(和iPS细胞建立效率提高剂)接触细胞以后，可以在适合培养例如胚胎干细胞的条件下培养细胞。在小鼠细胞的情况下，向普通培养基中加入白血病抑制因子(LIF)作为分化抑制剂，进行培养。同时，在人细胞的情况下，需要加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或干细胞因子(SCF)来替代LIF。通常，在用辐射或抗生素处理以终止其细胞分裂的、作为饲养细胞的小鼠胚胎-衍生的成纤维细胞(MEF)共同存在下，培养细胞。通常，STO细胞等经常用作MEF，但是为了诱导iPS细胞，通常使用SNL细胞[McMahon，A.P.&Bradley，A.Cell 62，1073-1085(1990)]等。可以在接触核重编程序物质之前、在接触同时或在接触之后(例如，1-10天后)，开始与饲养细胞的共培养。 
通过使用抗药性和报告基因活性作为指标的方法，以及通过基于形态学的目检的方法，可以选择iPS细胞的候选菌落。作为前者的一个实例，使用重组细胞，选择抗药性和/或报告基因活性阳性的菌落，其中抗药性基因和/或报告基因靶向特异性地在多能细胞中高度表达的基因的基因座(例如，Fbx15、Nanog、Oct3/4等，优选Nanog或Oct3/4)。这样的重组细胞的实例包括：来自具有敲入Fbx15基因座中的βgeo(其编码β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合蛋白)基因的小鼠的MEF [Takahashi&Yamanaka，Cell，126，663-676(2006)]，来自具有整合进Nanog基因座中的绿荧光蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因的转基因小鼠的MEF[Okita等人，Nature，448，313-317(2007)]等。同时，基于形态学的目检的后一种方法的实例包括，Takahashi等人在Cell，131，861-872(2007)中描述的方法。尽管使用报告细胞的方法是方便且有效的，从安全性的观点看，当制备用于人治疗目的的iPS细胞时，希望通过目检来选择菌落。当使用2种因子Oct3/4和Sox2作为通过与Klf4组合能够诱导iPS细胞的核重编程序物质时，得到的菌落大部分属于与胚胎干细胞相当的高质量的iPS细胞，尽管建立的克隆的数目减少，所以即使不使用报告细胞，也可以有效地建立iPS细胞。 
通过对上述Nanog(或Oct3/4)报告基因(嘌呤霉素抗性、GFP阳性等)的阳性应答，以及通过肉眼可见的胚胎干细胞-样菌落的形成，可以证实选择的菌落的细胞作为iPS细胞的身份。但是，为了增加准确度，可能进行试验，诸如碱性磷酸酶染色、分析不同的ES-细胞-特异性的基因的表达、和将选择的细胞移植给小鼠、以及证实畸胎瘤形成。 
当以编码蛋白(其选自IRX家族的成员、GLIS家族的成员、PTX家族的成员和DMRTB1)的核酸的形式将能够替代Klf4的核重编程序物质转移进体细胞中时，得到的iPS细胞是新颖的细胞，其与常规的已知的iPS细胞的差别在于，其中含有外源性核酸。具体地，如果使用逆转录病毒、慢病毒等将外源性核酸转移进体细胞中，所述外源性核酸通常整合进得到的iPS细胞的基因组中，使得含有外源性核酸的特征稳定地保留。 
如此建立的iPS细胞可以用于各种目的。例如，借助于报道的胚胎干细胞的分化诱导方法，可以诱导iPS细胞分化成多种细胞(例如，心肌细胞、血细胞、神经细胞、血管内皮细胞、胰岛素分泌细胞等)。因此，使用从患者或具有相同或基本上相同的HLA类型的另一个人收集的体细胞诱导iPS细胞，能够实现基于移植的干细胞治疗，其中所述iPS细胞分化成希望的细胞(患者的受影响的器官的细胞，对疾病具有治疗效果的细胞等)，并将分化的细胞移植给患者。此外，因为认为从iPS细胞分化成的功能细胞(例如，肝细胞)会比对应的现有细胞系更好地反映体内功能细胞的实际状态，它们也可以合适地用于药物候选化合物的有效性和毒性的体外筛选等。 
在下文中，借助于下述的实施例，更详细地描述本发明，但是，本发明绝不限于这些实施例。 
实施例 
[实施例1：新颖的重编程序因子的筛选] 
根据在图1中描述的方法，使用Goshima等人制备的人Gateway进入克隆(使用在N.Goshima等人，NatureMethods，2008中描述的文库。数据库公开在Y.Maruyama等人，Nucleic Acid Res.，2009.)，构建人综合(comprehensive)基因的大约20000个克隆重叠群。更具体地，使用80％或更好的覆盖度和95％或更高的氨基酸同一性标准，针对NCBIRefSeq 37900序列(24200个基因)，进行含有来自人Gateway进入克隆的全长ORF的大约50000个克隆的blastp检索，构建出由大约20000个不具有在N-型(具有在ORF的3’末端处的终止密码子)或F-型(不具有终止密码子)内的重叠序列的进入克隆组成的子文库。使用生物信息学技术，将这些大约20000个进入克隆重叠群分类成蛋白激酶、蛋白磷酸酶、转录因子、GPCR或其它克隆组，并构建由转录因子(覆盖所有人转录因子中的不小于50％)的进入克隆组成的子文库(图1)。从该转录因子子文库中，通过在图2中所示的使用pMXs-GW目标载体的LR反应，为每个进入克隆制备表达克隆DNA，并将该反应液转入大肠杆菌DH5α中，进行克隆，并构建转录因子表达文库(用于筛选重编程序因子的转录因子表达文库)。此外，将人基因Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc分别整合进相同的pMXs-GW中，并构建每个表达克隆。从这些DNA，生产重组逆转录病毒，它们用于下述的实验。 
使用Nanog-GFP小鼠的真皮成纤维细胞，进行iPS细胞的诱导实验(Okita等人，Nature，448，313-317(2007))。在这方面，在2个系统中进行实验：1个是其中在MSTO(已经停止细胞分裂的丝裂霉素-C处理过的SNL细胞)饲养细胞上进行逆转录病毒感染的系统(在下文中称作MSTO方法，Cell，126，663-676(2006))，另一个是这样的系统，其中在感染时不使用饲养细胞，并在感染后重新接种细胞后在MSTO上进行培养(在下文中称作Reseed方法，Nature Biotech.，26，101-106(2008))。 
对于第一次筛选，在24-孔乎板中进行iPS细胞诱导。将Nanog-GFP小鼠真皮成纤维细胞接种在明胶(Reseed方法)或MSTO(MSTO方法) 上，次日，用由不同质粒生产的逆转录病毒感染(第0天)。具体地，以1∶1∶1∶1的比例，用3个基因(Oct3/4、Sox2和c-Myc)和1个来自前述转录因子文库的基因感染细胞。作为阴性对照，以1∶1∶1的比例，用3个基因(Oct3/4，Sox2和c-Myc)感染细胞。作为阳性对照，以1∶1∶1∶1的比例，用4个基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)感染细胞。 
在10％FBS/DMEM中，培养细胞，直到感染次日，并从第3天开始，在ES培养基(Cell，126，663-676(2006))中培养。当将细胞首次接种到明胶上时(Reseed方法)，在第3天将它们重新接种到MSTO上。此后，每2天更换培养基，从第21天开始，对这些细胞进行嘌呤霉素选择，并在第28天进行观察。结果，在分别用3个基因转染样品F09(基因名：IRX6)、样品G06(基因名：GLIS1)、样品H08(基因名：DMRTB1)或样品H10(基因名：PITX2)的基因的孔中，出现GFP-阳性菌落，并确认了小鼠iPS细胞的建立。此外，当使用6-孔平板再次进行iPS诱导时，也出现了GFP-阳性菌落，并证实了再现性。在图3和4中，显示了GFP-阳性菌落图像和各个iPS细胞在菌落形成时、第1代和第2代的相差图像。 
从上面的结果可以看出，这4种因子是可以替代Klf4的新颖的重编程序因子。同时，当使用MEF替代成年小鼠真皮成纤维细胞时，也建立了iPS细胞(GFP-阳性菌落)。 
[实施例2：建立的小鼠iPS细胞的分析] 
使用QIAGEN“Gentra Puregene细胞试剂盒”，并使用PCR酶(Takara Ex Taq)，提取基因组，使用在实施例1中建立的iPS细胞，进行基因组-PCR。结果如图5和6所示。在所有iPS细胞中，证实了仅转染的基因被插入基因组中，没有用于转染的基因没有插入基因组中。同时，在G6-1克隆(基因名：GLIS1)中，用于转染的c-Myc没有插入基因组中(图5)。由于逆转录病毒载体在插入基因组中之前不会稳定地表达，推测通过仅3种因子(Oct3/4、Sox2和GLIS1)的表达建立了该G6-1克隆。 
接着，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)，进行RT-PCR分析。结果如图7和8所示。在实施例1中建立的iPS细胞都表达胚胎干细胞特异性的标记基因Nanog、Oct3/4、Sox2、Rex1和ECAT1。从这些结果， 证实了使用新颖的重编程序因子建立的细胞是iPS细胞。 
[实施例3：小鼠iPS细胞的建立和分析(2)] 
使用与实施例1相同的方法，通过导入下述的重编程序因子，建立小鼠iPS细胞。使用与实施例1相同的Nanog-GFP小鼠真皮成纤维细胞，并进行MSTO方法和Reseed方法。 
(1)Oct3/4，Sox2，c-Myc和G6(基因名：GLIS1) 
(2)Oct3/4，Sox2，c-Myc和H8(基因名：DMRTB1) 
(3)Oct3/4，Sox2，c-Myc和H10(基因名：PITX2) 
(4)Oct3/4，Sox2和G6 
(5)Oct3/4，Sox2和H8 
(6)Oct3/4，Sox2和H10 
在基因转染后28天，计数GFP-阳性菌落的数目。上面(1)-(3)的结果显示在图9中(它是6个实验的结果的总结)。尽管使用仅3种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc)没有建立菌落，通过加入本发明的重编程序因子(GLIS1、DMRTB1或PITX2)，建立了菌落。当加入DMRTB1时，观察到特别显著的作用。从这些结果，证实了本发明的这些因子是重编程序因子。 
上面(4)-(6)的结果如图10所示(它是2个实验的结果的总结)。尽管使用仅2种因子(Oct3/4、Sox2)没有建立菌落，通过加入本发明的重编程序因子(GLIS1或DMRTB1)，建立了菌落。同时，在加入PITX2的2个实验中，没有观察到菌落。 
在图11中，显示了GFP-阳性菌落图像和各个iPS细胞在菌落形成时(P0)、第1代(P1)和第2代(P2)的相差图像。 
接着，使用QIAGEN“Gentra Puregene细胞试剂盒”，并使用PCR酶(Takara Ex Taq)，提取基因组，使用在上面建立的iPS细胞，进行基因组-PCR。结果如图12所示。在所有iPS细胞中，证实了仅转染的基因被插入基因组中，没有用于转染的基因没有插入基因组中。同时，在使用3种因子+G6(GLIS1)的实验中，用于转染的c-Myc没有插入基因组中(图12最左边的泳道)。由于逆转录病毒载体在插入基因组中之前不会稳定地表达，推测通过仅3种因子(Oct3/4、Sox2和GLIS1)的表达建立了该克隆。 
接着，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)，进行RT-PCR分析。结果如图13所示。在上面建立的iPS细胞都表达胚胎干细胞特异性的标记基因Nanog、Oct3/4、Sox2、Rex1和ECAT1。从这些结果，证实了使用新颖的重编程序因子建立的细胞是iPS细胞。 
[实施例4：小鼠iPS细胞的建立和分析(3)] 
使用与实施例3相同的方法，通过与本发明的重编程序因子(G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2))组合地导入Oct3/4和c-Myc，建立小鼠iPS细胞。结果，在Oct3/4、c-Myc和H10(PITX2)的组合中，检测到GFP-阳性菌落(iPS菌落)。在图14中，显示了GFP-阳性菌落图像和iPS菌落在菌落形成时(P0)、第1代(P1)和第2代(P2)的相差图像。 
接着，使用QIAGEN“Gentra Puregene细胞试剂盒”，并使用PCR酶(Takara Ex Taq)，提取基因组，使用在上面建立的iPS细胞，进行基因组-PCR。结果如图15所示。在建立的iPS细胞中，证实了仅转染的基因被插入基因组中，没有用于转染的基因没有插入基因组中。 
接着，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)，进行RT-PCR分析。结果如图16所示。在上面建立的iPS细胞表达胚胎干细胞特异性的标记基因Nanog、Oct3/4、Sox2、Rex1和ECAT1。从这些结果，证实了使用新颖的重编程序因子建立的细胞是iPS细胞。 
[实施例5：小鼠iPS细胞的建立和分析(4)] 
从胎儿Nanog-GFP小鼠(受精后13.5天)，分离出成纤维细胞(MEF)。使用与实施例3和4相同的技术，将下述的重编程序因子导入这些MEF中。 
(1)Oct3/4，Sox2，c-Myc和G6(基因名：GLIS1) 
(2)Oct3/4，Sox2，c-Myc和H8(基因名：DMRTB1) 
(3)Oct3/4，Sox2，c-Myc和H10(基因名：PITX2) 
(4)Oct3/4，Sox2和G6 
(5)Oct3/4，Sox2和H8 
(6)Oct3/4，Sox2和H10 
在基因转染后28天，计数GFP-阳性菌落的数目。上面(1)-(3)的结果显示在图17中(它是4个实验的结果的总结)。尽管使用仅3种因子 (Oct3/4、Sox2、c-Myc)几乎没有建立任何菌落，通过加入本发明的重编程序因子(GLIS1、DMRTB1或PITX2)，建立了菌落，当加入DMRTB1时，观察到特别显著的作用。 
上面(4)-(6)的结果如图18所示(1个实验的结果)。尽管使用仅2种因子(Oct3/4、Sox2)没有建立菌落，通过加入本发明的重编程序因子(GLIS1、DMRTB1或PITX2)，建立了菌落。当加入DMRTB1时，观察到特别显著的作用。 
在图19中，显示了GFP-阳性菌落图像和各个iPS细胞在菌落形成时(P0)、第1代(P1)和第2代(P2)的相差图像。 
接着，使用QIAGEN“Gentra Puregene细胞试剂盒”，并使用PCR酶(Takara Ex Taq)，提取基因组，使用在上面建立的iPS细胞，进行基因组-PCR。上面(1)-(3)的结果如图20所示。在所有iPS细胞中，证实了仅转染的基因被插入基因组中，没有用于转染的基因没有插入基因组中。 
接着，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)，进行RT-PCR分析。上面(1)-(3)的结果如图21所示。在上面建立的iPS细胞都表达胚胎干细胞特异性的标记基因Nanog、Oct3/4、Sox2、Rex1和ECAT1。从这些结果，证实了使用新颖的重编程序因子建立的细胞是iPS细胞。 
[实施例6：畸胎瘤的制备和嵌合小鼠的产生] 
使用在前述实施例中从成年小鼠(Nanog-GFP小鼠)的真皮成纤维细胞建立的下述iPS细胞克隆，制备畸胎瘤。 
·G6-1克隆：用3种因子Oct3/4、Sox2和G6(GLIS1)建立 
·G6-6克隆：用4种因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和G6(GLIS1)建立 
·H8-2克隆：用4种因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和H8(DMRTB1)建立 
·H10克隆：用4种因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和H10(PITX2)建立 
根据在Cell，126，663-676(2006)中描述的方法，制备畸胎瘤。具体地，将1×106个iPS细胞皮下地注射进免疫缺陷的小鼠中，在4周后，从所述小鼠分离畸胎瘤。从这些畸胎瘤中，以与上述相同的方式，提取基因组，并使用PCR酶(Takara Ex Taq)，进行基因组-PCR。结果如图22所示。在所有畸胎瘤中，证实了仅转染的基因被插入基因组中，没有用于转染的基因没有插入基因组中。 
接着，切割这些畸胎瘤，并在含有4％甲醛的PBS(-)中固定。制作石蜡包埋的组织的切片，并用苏木素-曙红染色。结果如图23和24所示。从组织学观点看，肿瘤由多类细胞组成，并且由于观察到脂肪组织、横纹肌组织、角化组织、具纤毛的柱状上皮组织、神经组织、软骨、胶原纤维组织、平滑肌组织等，证实了iPS细胞的多能性。 
此外，作为将这些iPS细胞显微注射进源自ICR小鼠的胚泡中的结果，产生了成年嵌合体。 
[实施例7：微阵列分析] 
进行DNA微阵列分析，以研究在使用本发明的新颖的重编程序因子(G6、H8、H10)建立的iPS细胞和使用常规的4种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)建立的iPS细胞之间是否存在基因表达差异。根据在Cell，131，861-872(2007)中描述的技术，使用下述的iPS细胞和源自MEF的总RNA，进行分析。 
·K-G6：通过将4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc和G6)转染进MEF中所建立的iPS细胞(第5代) 
·K-H8：通过将4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc和H8)转染进MEF中所建立的iPS细胞(第5代) 
·K-H10：通过将4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc和H10)转染进MEF中所建立的iPS细胞(第5代) 
·4F：通过将4个基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)转染进MEF中所建立的iPS细胞(第5代) 
·MEF：用于转染的MEF细胞(第1代) 
散点图的结果如图25-27所示(变化倍数线：2-倍)。另外，在表2中显示了每个细胞之间的相关系数，并在图28中显示了基于相关系数的聚类结果。 
表2 
  阵列名称   K-G6-MEF   K-H8-MEF   K-H10-MEF   4F-MEF   MEF
  K-G6-MEF   1   0.997012   0.99035835   0.9905535   0.8930298
  K-H8-MEF   0.997012   1   0.9897563   0.9940246   0.89402026
  K-H10-MEF   0.99035835   0.9897563   1   0.9888173   0.89811915
  4F-MEF   0.9905535   0.9940246   0.9888173   1   0.8940898
  MEF   0.8930298   0.89402026   0.89811915   0.8940898   1
 使用本发明的新颖的重编程序因子建立的iPS细胞都表现出与使用常规的4种因子建立的iPS细胞类似的基因表达模式的事实，证实了本发明的iPS细胞与使用所述4种因子建立的iPS细胞相当，即，本发明的新颖的重编程序因子可以替代Klf4。 
[实施例8：人iPS细胞的建立和分析(1)] 
根据在Takahashi，K.等人，Cell，131：861-872(2007)中描述的方法，使用慢病毒(pLenti6/UbC-Slc7a1)，在成年人或新生儿人真皮成纤维细胞(HDF)中表达小鼠同向性病毒受体Slc7a1基因。根据在Takahashi，K.等人，Cell，131：861-872(2007)中描述的方法，使用逆转录病毒，将4个基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和G6(GLIS1)转染进这些细胞中(1×105细胞/孔，6孔板)。另外，转染4个基因、Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，作为对照。 
在病毒感染后6天，收集细胞，并重新接种到饲养细胞上(5×105细胞/100mm培养皿)。使用已经停止细胞分裂的丝裂霉素C处理过的SNL细胞(McMahon，A.P.&Bradley，A.Cell 62，1073-1085(1990))作为饲养细胞。从感染后第7天，在含有4ng/ml重组人bFGF(WAKO)的灵长类动物胚胎干细胞培养培养基(ReproCELL)中培养细胞。在图29中显示了iPS细胞在感染后约35天时的菌落图像，在图30中显示了第2代iPS细胞的菌落图像。使用Oct3/4、Sox2、c-Myc和G6(GLIS1)建立的iPS细胞表现出与用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4建立的iPS细胞类似的胚胎干细胞-样形态学。此外，它们是碱性磷酸酶活性阳性的。 
接着，使用QIAGEN“Gentra Puregene细胞试剂盒”，并使用PCR酶(Takara Ex Taq)，提取基因组，使用在上面建立的iPS细胞，进行基因组-PCR。结果如图31所示。在建立的iPS细胞中，证实了仅转染的基因被插入基因组中，没有用于转染的基因没有插入基因组中。 
接着，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)，进行RT-PCR分析。结果如图32所示。建立的iPS细胞都表达胚胎干细胞特异性的标记基因Oct3/4、Sox2和Rex1。从这些结果，证实了使用新颖的重编程序因子G6(GLIS1)建立的细胞是iPS细胞。 
[实施例9：人iPS细胞的建立和分析(2)] 
使用与实施例8相同的技术，使用逆转录病毒，将3个基因Oct3/4、Sox2和H8(DMRTB1)或4个基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和H10(PITX2)转染进牙髓干细胞中(J.Dent.Res.，87(7)：676-681(2008))。另外，转染4个基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，作为对照。 
使用与实施例8相同的技术，培养的iPS细胞在感染后约35天时的菌落图像如图33所示，第1代iPS细胞的菌落图像如图34(Oct3/4、Sox2、H8)和图37(Oct3/4、Sox2、c-Myc、H10)所示。建立的iPS细胞表现出与用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4建立的iPS细胞类似的胚胎干细胞-样形态学。此外，它们是碱性磷酸酶活性阳性的。 
接着，使用QIAGEN“Gentra Puregene细胞试剂盒”，并使用PCR酶(Takara Ex Taq)，提取基因组，使用在上面建立的iPS细胞，进行基因组-PCR。结果如图35(Oct3/4、Sox2、H8)和图38(Oct3/4、Sox2、c-Myc、H10)所示。在建立的iPS细胞中，证实了仅转染的基因被插入基因组中，没有用于转染的基因没有插入基因组中。 
接着，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)，进行RT-PCR分析。结果如图36(Oct3/4、Sox2、H8)和图39(Oct3/4、Sox2、c-Myc、H10)所示。建立的iPS细胞表达胚胎干细胞特异性的标记基因Oct3/4、Sox2、Nanog和Rex1。从这些结果，证实了使用新颖的重编程序因子H8(DMRTB1)和H10(PITX2)建立的细胞是人iPS细胞。 
[实施例10：畸胎瘤的制备] 
将人iPS细胞(通过把4种因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和G6(GLIS1)导入HDF中而建立)插入Scid小鼠的睾丸中，并测试它们的多能分化。具体地，首先在含有重组人bFGF(4ng/ml)和Rho激酶抑制剂Y-27632(10μM)的灵长类动物胚胎干细胞培养培养基(ReproCELL，Cosmo Bio)中，培养前述的iPS细胞。1小时后，用胶原IV处理细胞，并收集，然后通过离心进行回收，并悬浮于含有Y-27632(10μM)的DMEM/F12中。将1/4量的汇合细胞(100mm培养皿)注射进Scid小鼠的睾丸中。2-3个月以后，切割肿瘤，使用含有4％甲醛的PBS(-)固定。制作石蜡包埋的组织的切片，并用苏木素-曙红染色。结果如图40所示。从组织学观点看，肿瘤由多类细胞组成，并且由于它已经分化成3个胚层，诸如软骨、上皮平滑肌、上皮和神经组织，证实了iPS细胞的多能性。 
虽然本发明已着重于优选实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，优选实施方案可以进行修改。本发明预期，本发明可以通过除本说明书中详细描述的那些外的方法来实现。因此，本发明包含了在附加的“权利要求”的要旨和范围中包含的所有修饰。 
在本文引用的任何出版物(包括专利和专利申请)中公开的内容在此整体引入作为参考，其程度与它们已在本文中公开一样。 
本申请基于美国临时专利申请号61/208,853和61/276,123，所述美国临时专利申请的内容在此引入作为参考。 

Claims (13)

1.一种生产iPS细胞的方法，所述方法包括下述步骤：向体细胞中转入下述的(1)和(2)：
(1)(a)GLIS1或其编码核酸和/或(b)DMRTB1或其编码核酸，
(2)包括Oct3/4和Sox家族的成员或编码它们的核酸的核重编程序物质，
其中所述Sox家族的成员选自Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox17。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在(2)中提及的核重编程序物质还包括选自以下的物质：Myc家族的成员、Nanog和Lin家族的成员以及编码它们的核酸，
其中所述Myc家族的成员由c-Myc、L-Myc和N-Myc组成，以及其中所述Lin家族的成员由Lin28和Lin28b组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Sox家族的成员为Sox2。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述核重编程序物质包括Oct3/4、Sox2和c-Myc或编码它们的核酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤将包括GLIS1、Oct3/4和Sox2或编码它们的核酸的物质转移进体细胞中。
6.一种从体细胞诱导iPS细胞的诱导物，其包含下述的(1)和(2)：
(1)(a)GLIS1或其编码核酸和/或(b)DMRTB1或其编码核酸，
(2)包括Oct3/4和Sox家族的成员或编码它们的核酸的核重编程序物质，
其中所述Sox家族的成员选自Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox17。
7.一种iPS细胞，其含有下述的(1)和(2)：
(1)编码GLIS1或DMRTB1的外来核酸，
(2)编码Oct3/4和Sox家族的成员的外来核酸，
其中所述Sox家族的成员选自Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox17。
8.根据权利要求7所述的iPS细胞，其中所述外来核酸整合进基因组中。
9.一种生产体细胞的方法，所述方法包括：处理根据权利要求7所述的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞。
10.选自下述的物质用于生产iPS细胞的用途：GLIS1、DMRTB1以及编码它们的核酸，其中所述物质与包括Oct3/4和Sox家族的成员或编码它们的核酸的核重编程序物质一起，转移进体细胞中，
其中所述Sox家族的成员选自Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox17。
11.根据权利要求7所述的iPS细胞在生产体细胞中的用途。
12.一种生产iPS细胞的方法，所述方法包括下述步骤：向体细胞中转入下述的(1)和(2)：
(1)(a)IRX6或其编码核酸和/或(b)PITX2或其编码核酸，
(2)包括Oct3/4、Sox家族的成员和Myc家族的成员或编码它们的核酸的核重编程序物质，其中所述Sox家族的成员选自Sox1、Sox2、Sox3、Sox15和Sox17，以及其中所述Myc家族的成员选自c-Myc、L-Myc和N-Myc。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Sox家族的成员为Sox2，以及其中所述Myc家族的成员为c-Myc。
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