CN102782122B

CN102782122B - 有效建立经诱导的多能干细胞的方法

Info

Publication number: CN102782122B
Application number: CN201180009618.9A
Authority: CN
Inventors: 山中伸弥; 五岛直树; 前川桃子; 河村义史; 望月宏美
Original assignee: JAPAN BIOLOG INFORMATICS CONSO; Kyoto University; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: JAPAN BIOLOG INFORMATICS CONSO; Kyoto University; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Japan Biological Informatics Consortium
Priority date: 2010-02-16
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2031-02-16
Also published as: US8927277B2; JP5765746B2; SG183315A1; EP2536828A4; KR20120131180A; CN102782122A; WO2011102531A1; CA2789749A1; EP2536828A1; KR101857302B1; US20130029423A1; CA2789749C; IL221481A; IL221481A0; EP2536828B1; JP2013519371A

Abstract

提供的是改善iPS细胞建立效率的方法，其包括使选自GLIS家族的成员(例如GLIS1)和编码其的核酸的一种或多种物质、和选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质与体细胞接触的步骤，可以通过该方法获得的、包含编码GLIS家族的成员或Klf家族的成员的外源核酸的iPS细胞，和通过诱导iPS细胞分化产生体细胞的方法。

Description

有效建立经诱导的多能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及改善经诱导的多能干细胞(下文称为iPS细胞)的建立效率的方法和因此的试剂，更具体而言涉及使用GLIS家族的成员和Klf家族的成员改善iPS细胞的建立效率的方法和因此的试剂等。

发明背景

近年来，小鼠和人iPS细胞已相继建立。Takahashi和Yamanaka通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因转移到来自报道小鼠的成纤维细胞内诱导iPS细胞，其在所述报道小鼠中将新霉素抗性基因敲入到Fbx15基因座内，并且迫使细胞表达该基因[Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell，126: 663-676(2006)]。Okita等人成功建立了显示与胚胎干(ES)细胞的那些几乎相同的基因表达和后天修饰概况的iPS细胞(Nanog iPS细胞)，通过产生具有绿色荧光蛋白(GFP)和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog的基因座内的转基因小鼠，所述Nanog的表达比Fbx15的表达更局限于多能细胞中，迫使来自小鼠的成纤维细胞表达上述四种基因，并且选择其为嘌呤霉素抗性的细胞和GFP阳性细胞[Okita，K.等人，Nature，448: 313-317(2007)]。类似结果由其他团体获得[Wernig，M.等人，Nature，448: 318-324(2007)；Maherali，N.等人，Cell Stem Cell，1: 55-70(2007)]。其后，揭示iPS细胞还可以用除c-Myc基因外的3种因子产生[Nakagawa，M.等人，Nat. Biotethnol.，26: 101-106(2008)]。

此外，Takahashi等人[Takahashi，K.等人，Cell，131: 861-872(2007)]通过将与小鼠中使用的那些相同的4种基因引入人皮肤成纤维细胞内成功建立了iPS细胞。另一方面，Yu等人使用Nanog和Lin28代替Klf4和c-Myc产生人iPS细胞[Yu，J.等人，Science，318: 1917-1920(2007)]。因此，已证实通过将限定因子转移到体细胞内，可以在人和小鼠中产生就多能性而言与ES细胞可比较的iPS细胞。

自那以后，已作出广泛多样的尝试，以增加iPS细胞建立的效率，包括通过转移TERT和SV40大T抗原(称为人细胞永生化基因)连同四种因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc [Park，I.H.等人，Nature，451: 141-146(2008)]建立的iPS细胞，伴随Nanog和Lin28加入前述四种因子建立的iPS细胞[Liao，J.等人，Cell Research，18: 600-603(2008)]，和伴随UTF1加入前述四种或除c-Myc外的三种因子建立的iPS细胞[Zhao，Y.等人，Cell Stem Cell，3: 475-479(2008)]。然而，其中仍未达到良好改善的情况维持原状。

发明概述

本发明人进行广泛研究，不仅在多能细胞例如ES细胞中特异性表达的基因中，还从更广泛范围的转录因子的基因文库中，寻找可以用于建立iPS细胞的基因作为用于Klf4的替代物。通过将属于GLIS家族的基因(例如GLIS1)、属于PTX家族的基因(例如PITX2)、或DMRT样家族B具有富含脯氨酸的C末端1基因(DMRTB1)，连同三种基因Oct3/4、Sox2和c-Myc一起转移到小鼠和人表皮成纤维细胞，本发明人因此成功地有效建立iPS细胞，并且将这些转录因子鉴定为能够在功能上取代Klf4的新核重编程物质(于2009年2月27日提交的美国临时申请号61/208,853，和于2009年9月8日提交的美国临时申请号61/276,123)。

接下来，本发明人研究与Klf4组合使用的这些Klf4替代因子GLIS1、PITX2和DMRTB1对iPS细胞建立的作用。作为出乎意料的结果，当与Klf4组合时，PITX2和DMRTB1显示出完全无附加效应，而GLIS1和Klf4的组合使用对小鼠和人细胞中的iPS细胞建立产生显著协同作用。本发明人基于这些发现进行进一步研究，并且已发展了本发明。

相应地，本发明提供了下述：

[1]改善iPS细胞建立效率的方法，其包括使下述(1)和(2)与体细胞接触：

(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。

[2]根据上文[1]的方法，其中上文的物质(1)包括GLIS家族锌指1(GLIS1)或编码GLIS1的核酸。

[3]根据上文[1]或[2]的方法，其中上文的物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。

[4]包含下述(1)和(2)的iPS细胞建立效率改进剂：

(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。

[5]根据上文[4]的改进剂，其中上文的物质(1)包括GLIS1或编码GLIS1的核酸。

[6]根据上文[4]或[5]的改进剂，其中上文的物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。

[7]产生iPS细胞的方法，其包括使下述(1)、(2)和(3)与体细胞接触：

(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(3)通过与上文的物质(1)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质。

[8]根据上文[7]的方法，其中上文的物质(1)包括GLIS1或编码GLIS1的核酸。

[9]根据上文[7]或[8]的方法，其中上文的物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。

[10]根据上文[7] - [9]中任一项的方法，其中上文的核重编程物质(3)选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员、Nanog和编码其的核酸。

[11]根据上文[7] - [9]中任一项的方法，其中上文的核重编程物质(3)包括Oct3/4或编码其的核酸。

[12]根据上文[11]的方法，其中上文的核重编程物质(3)包括Oct3/4和Sox2或编码其的核酸。

[13]根据上文[11]的方法，其中上文的核重编程物质(3)包括Oct3/4、Sox2和c-Myc或编码其的核酸。

[14]用于来自体细胞的iPS细胞诱导的试剂，其包括下述(1)、(2)和(3)：

(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

[15]根据上文[14]的试剂，其中上文的物质(1)包括GLIS1或编码GLIS1的核酸。

[16]根据上文[14]或[15]的试剂，其中上文的物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。

[17]根据上文[14] - [16]中任一项的试剂，其中上文的核重编程物质(3)选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员、Nanog和编码其的核酸。

[18]根据上文[14] - [16]中任一项的试剂，其中上文的核重编程物质(3)包括Oct3/4或编码其的核酸。

[19]根据上文[18]的试剂，其中上文的核重编程物质(3)包括Oct3/4和Sox2或编码其的核酸。

[20]根据上文[18]的试剂，其中上文的核重编程物质(3)包括Oct3/4、Sox2和c-Myc或编码其的核酸。

[21]iPS细胞，其包含下述(1)和(2)：

(1)选自编码GLIS家族的成员的外源核酸的一种或多种核酸，

(2)选自编码Klf家族的成员的外源核酸的一种或多种核酸。

[22]根据上文[21]的iPS细胞，其中将所述外源核酸整合到基因组中。

[23]产生体细胞的方法，其包括处理根据上文[21]或[22]的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞。

[24]产生体细胞的方法，其包括下述(1)和(2)：

(1)通过根据上文[7] – [13]中任一项的方法产生iPS细胞的步骤，和

(2)处理通过上文步骤(1)获得的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞的步骤。

[25]下述(1)和(2)改善iPS细胞建立效率的用途：

(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。

[26]选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质改善iPS细胞建立效率的用途，其中该物质连同选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质一起与体细胞接触。

[27]下述(1)、(2)和(3)产生iPS细胞的用途：

(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

[28]下述(1)和(2)产生iPS细胞的用途：

(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，

(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，其中所述因子连同通过与上文的物质(1)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质一起与体细胞接触。

[29](1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质产生iPS细胞的用途，其中所述物质连同(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质、和通过与上文的物质(1)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质一起与体细胞接触。

[30]根据上文[21]或[22]的iPS细胞在产生体细胞中的用途。

[31]根据上文[21]或[22]的iPS细胞，其中iPS细胞充当产生体细胞中的细胞来源。

如上所述，本发明的iPS细胞建立效率改进剂能够显著改善来自体细胞的iPS细胞建立效率，并且因此在例如对于通过自体移植的人移植医学的应用中有用。

附图简述

图1是显示用于通过功能缩小来自人Gateway^?入门克隆(N. Goshima等人，Nature methods，2008)的入门克隆的步骤的示意图。

图2概述用于制备用于从转录因子的入门克隆筛选体细胞重编程因子的转录因子文库的程序。

图3是通过借助于逆转录病毒将总共4种不同基因即3种基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和G06(基因密码名称: GLIS1)、H08(基因密码名称: DMRTB1)或H10(基因密码名称: PITX2)转移到Nanog-GFP小鼠表皮成纤维细胞内获得的GFP阳性集落形态的照相表示。“Klf-G6-1”指示通过转移G06(基因密码名称: GLIS1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-H8-2”指示通过转移H08(基因密码名称: DMRTB1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-H10-1”和“Klf-H10”指示通过转移H10(基因密码名称: PITX2)连同3种基因获得的iPS细胞克隆。P0显示在集落建立时获得的照片；P1显示关于第一代(24个孔)的照片；P2显示关于第二代(6个孔)的照片。对于每组三张照片，左侧小图显示GFP阳性集落的图像，中间小图显示相位差图像，并且右侧小图显示GFP阳性集落图像和相位差图像的重叠照片。仅Klf-H10-1通过Reseed方法建立，而其他通过MSTO方法建立。

图4是在集落建立时，通过借助于逆转录病毒将总共4种不同基因即3种基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc)和F09(基因密码名称: IRX6)、G06(基因密码名称: GLIS1)、H08(基因密码名称: DMRTB1)或H10(基因密码名称: PITX2)转移到Nanog-GFP小鼠表皮成纤维细胞内获得的GFP阳性集落形态的照相表示。“Klf-F9”指示通过转移F09(基因密码名称: IRX6)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-G6-1”和“Klf-G6-2”指示通过转移G06(基因密码名称: GLIS1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-H8-1”和“Klf-H8-2”指示通过转移H08(基因密码名称: DMRTB1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-H10”指示通过转移H10(基因密码名称: PITX2)连同3种基因获得的iPS细胞克隆。“Reseed”显示通过Reseed方法获得的结果；“MSTO” 显示通过MSTO方法获得的结果。

图5是关于G6-1(Klf-G6-1)、H8-2(Klf-H8-2)和H10(Klf-H10)iPS细胞克隆的基因组PCR结果的照相表示，其中“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，并且“质粒”指示通过扩增整合到pMXs内的每种基因制备的阳性对照。

图6是除图5中所示的那种外，对H10(Klf-H10)iPS细胞克隆的基因组PCR结果的照相表示。在图6中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，并且“质粒”指示通过扩增整合到pMXs内的每种基因制备的阳性对照。

图7是关于G6-1(Klf-G6-1)、H8-2(Klf-H8-2)和H10(Klf-H10)iPS细胞克隆的RT-PCR结果的照相表示，其中“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞；“ES”和“iPS”指示小鼠ES细胞和iPS细胞；“Sox2 RT-”是阴性对照。

图8是除图7中所示的那种外，对H10(Klf-H10)iPS细胞克隆的RT-PCR结果的照相表示。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞；“ES”和“iPS”指示小鼠ES细胞和iPS细胞；“Sox2 RT-”是阴性对照。

图9是计数通过将2种因子(Oct3/4、Sox2)或3种因子(Oct3/4、Sox2、Klf4)与G6(GLIS1)、H8(DMRTB1)或H10(PITX2)的组合转移到Nanog-GFP小鼠表皮成纤维细胞内建立的iPS细胞(GFP阳性细胞)集落的结果的图示。概括了三次(对于仅对照四次)独立实验的结果。

图10显示在感染后22天来自所示因子转导的皮肤成纤维细胞的Nanog-GFP阳性集落数目。

图11显示在感染后22天来自所示因子转导的皮肤成纤维细胞的Nanog-GFP阳性集落比。该图表显示三次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。**: p<0.01。

图12显示来自皮肤成纤维细胞(P0；第0代)的Nanog-GFP阳性集落。荧光图像(左侧)；相位差图像(中间)；合并图像(右侧)。

图13显示在感染后20天来自所示因子转导的MEFs的Nanog-GFP阳性集落数目。在感染3天后，将成纤维细胞再种植到饲养细胞上。

图14显示在感染后20天来自所示因子转导的MEFs的Nanog-GFP阳性集落比。该图表代表三次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。**: p<0.01。

图15显示来自MEFs(P0；第0代)的Nanog-GFP阳性集落。荧光图像(左侧)；相位差图像(中间)；合并图像(右侧)。

图16是计数通过将3种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc)与Klf4和/或G6(GLIS1)的组合转移到成年表皮成纤维细胞(HDF)内建立的iPS细胞(ES样细胞)集落的结果的图示，其中“104”和“105”分别指示关于再种植到饲养细胞上的5×10⁴细胞/100 mm皿和5×10⁵细胞/100 mm皿的结果。概括了三次独立实验的结果。

图17是计数通过将3种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc)与Klf4和/或G6(GLIS1)的组合转移到成年表皮成纤维细胞(HDF)内建立的非iPS细胞(非ES样细胞)集落的结果的图示，其中“104”和“105”分别指示关于再种植到饲养细胞上的5×10⁴细胞/100 mm皿和5×10⁵细胞/100 mm皿的结果。概括了三次独立实验的结果。

图18是由Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和G6建立的iPS集落(ES样集落)的相位差图像的照相表示。

图19显示在感染后约30天来自所示因子转导的人表皮成纤维细胞(上：5 × 10⁴细胞，下：5 × 10⁵细胞)的ESC样集落数目。

图20显示在感染后约30天来自所示因子转导的人表皮成纤维细胞(上：5 × 10⁴细胞，下：5 × 10⁵细胞)的ESC样集落比。该图表显示三次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。*: p<0.05；**: p<0.01。

图21显示通过OSK + GLIS1生成的人ESC样集落。

图22显示在建立的人iPS克隆中转导基因的基因组-PCR分析。AHDF：成年表皮成纤维细胞。

图23显示在通过OSK + GLIS1生成的人iPSCs中ESC-标记基因的RT-PCR分析。AHDF：成年表皮成纤维细胞；201B7：通过OSKM生成的人iPS克隆。

图24显示如通过DNA微阵列测定的，比较在由OSK + GLIS1生成的iPSCs和成年HDFs之间(上)、和在OSK + GLIS1转导的iPSCs和OSKM转导的iPSCs之间(下)的总体基因表达的散布图。计算关联系数(R²)。

图25显示由OSK + GLIS1生成的人iPSCs的畸胎瘤形成。

图26显示在多种小鼠组织中GLIS1的表达。从每种小鼠组织中分离的总RNA通过定量RT-PCR进行检查。该图表显示四次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。

图27显示在暴露于GLIS1 shRNAs的皮肤成纤维细胞中内源GLIS1的定量RT-PCR分析。该图表显示二次独立实验的平均值伴随平均误差(误差条)。

图28显示GLIS1 shRNAs对通过3种重编程因子(OSK)的iPSC建立效率的作用。在OSK连同或不连同GLIS1 shRNA转导到皮肤成纤维细胞内后四周，计数Nanog-GFP阳性集落的数目。

发明详述

本发明提供了改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在体细胞的核重编程步骤中，使(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，和(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质(下文也称为本发明的建立效率改善因子)与体细胞接触。因为体细胞核重编程通过使核重编程物质与体细胞接触来达到，所以本发明还提供了产生iPS细胞的方法，其包括使(3)通过与上文的物质(1)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质(下文也简称为核重编程物质)连同上文的物质(1)和(2)一起与体细胞接触。此处，其中iPS细胞不能单独由上文的物质(3)(核重编程物质)建立，但当核重编程物质连同本发明的iPS细胞建立效率改善因子一起与体细胞接触时可以建立的情况，也视为“建立效率的改善”。

(a)体细胞的来源

除哺乳动物起源(例如人、小鼠、猴、牛、猪、大鼠、犬等)的生殖细胞外的任何细胞可以用作原材料用于在本发明中产生iPS细胞。例子包括角质化上皮细胞(例如角质化的表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如舌浅表的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如肾上腺髓质细胞)、用于代谢或贮存的细胞(例如肝细胞)、构成界面的内膜上皮细胞(例如I型肺泡细胞)、闭膜管的内膜上皮细胞(例如血管内皮细胞)、具有转运能力的具有纤毛的细胞(例如气道上皮细胞)、用于细胞外基质分泌的细胞(例如成纤维细胞)、收缩细胞(例如平滑肌细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞)、感觉相关细胞(例如杆状细胞)、自主神经系统神经元(例如胆碱能神经元)、感觉器官和外周神经元的支持细胞(例如卫星细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如星形胶质细胞)、色素细胞(例如视网膜色素上皮细胞)、其祖细胞(例如组织祖细胞)等。不存在关于细胞分化程度，从其中收集细胞的动物年龄等的限制；甚至未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞可以类似地用作本发明中的体细胞来源。未分化的祖细胞的例子包括组织干细胞(成体干细胞)例如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞。

作为体细胞来源的哺乳动物个体的选择并无特别限制；然而，当获得的iPS细胞待用于人中的再生医学时，从预防移植物排斥的观点来看，从具有与患者那种相同或基本上相同的HLA类型的患者或另一个人中收集体细胞是特别优选的。如本文使用的，当它们移植到使用免疫抑制剂等的患者时，“基本上相同的HLA类型”意指供体的HLA类型与患者那种匹配至移植细胞(其已通过诱导衍生自供体的体细胞的iPS细胞分化获得)可以移入的程度。例如，它包括其中主要HLAs(例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的三个主要基因座)是等同的(下文将应用相同含义)等的HLA类型。当获得的iPS细胞不施用于(移植到)人，而是用作例如用于筛选评估患者的药物敏感性或不良反应的细胞来源时，同样希望从具有与药物敏感性或不良反应关联的相同遗传多态性的患者或另一个人中收集体细胞。

在实施核重编程的步骤前，从哺乳动物中分离的体细胞可以根据细胞的选择使用本身已知适合于其培养的培养基进行预培养。此类培养基的例子包括但不限于，含有约5 - 20%胎牛血清(FCS)的最小必需培养基(MEM)、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。当转移试剂例如阳离子脂质体例如用于使体细胞接触本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质(如果需要的话，和下文提及的另一种iPS细胞建立效率改进剂)时，有时优选培养基已替换为无血清培养基，以便预防转移效率减少。

(b)本发明的iPS细胞建立效率改善因子

在本发明中，GLIS家族是具有五个C2H2(Cys₂-His₂-类型)锌指区的Kruppel样锌指家族，其以其与Gli转录因子[Glis= Gli相似的，Kim，Y.S.等人，J. Biol. Chem.，277(34)，30901-30913(2002)]的相似性命名。GLIS家族的成员为(membered)正或负控制在胚胎发育过程中多种基因的表达的转录因子。这个基因家族的成员例子包括但不限于GLIS家族锌指1(GLIS1)、GLIS2、GLIS3等，其中优先给予GLIS1。应当指出GLIS1是在小鼠ES细胞中不表达的基因。

尽管在本发明中使用的GLIS家族的成员可以是衍生自任选选择的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、猴、牛、马、猪、犬等)的细胞或组织[例如，胸腺、骨髓、脾、脑、脊髓、心脏、骨骼肌、肾、肺、肝、胰腺或前列腺的细胞或组织、其相应前体细胞、干细胞或癌细胞等]的蛋白质或编码其的核酸，优先给予衍生自人或小鼠细胞或组织的那些。

关于人和小鼠起源的GLIS家族成员的氨基酸序列和cDNA序列的信息可以根据表1中所示的NCBI登记号获得。本领域技术人员基于cDNA序列信息能够容易地分离编码各自蛋白质的核酸，且根据需要产生重组蛋白质。

表1

与上文显示的每种氨基酸序列具有90%或更多、优选95%或更多、更优选98%或更多、特别优选99%或更多同一性，且具有与野生型蛋白质那种等价的iPS细胞建立效率改善效应的天然或人工突变蛋白质，和编码其的核酸，也可以用作本发明的iPS细胞建立效率改善因子。此处，在改善iPS细胞建立效率中的效应可以通过比较在其中仅指定重编程因子(例如2种因子Oct3/4和Sox，由2种因子和c-Myc组成的3种因子等)转移至体细胞的情况，和其中除转移重编程因子外，还使本发明的iPS细胞建立效率改善因子与体细胞接触的情况之间出现的iPS细胞集落数目加以验证。

关于本发明的GLIS家族的成员和编码其的核酸，可以单独使用属于该家族的任何一种因子，或可以组合使用两种或更多种。

Klf(Krüppel样因子) 家族的成员为控制多种生物学过程的转录因子，所述生物学过程例如增殖、分化、发生和细胞凋亡[McConnell，B.B.等人，Bioassays，29: 549-557(2007)]，但其功能仍有待详细阐明。这个基因家族的成员例子包括但不限于Klf1、Klf2、Klf4、Klf5等，其中优先给予Klf4。如上所述，GLIS家族具有五个C2H2类型锌指区，而Klf家族具有三个C2H2类型锌指区。

Yamanaka等人假设相同四种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)可以用属于相同各自家族的其他基因代替，并且显示即使当Klf4替换为Klf1、Klf2或Klf5时，iPS细胞也可以建立[WO 2007/069666 A1；Nakagawa，M.等人，Nat. Biotethnol.，26: 101-106(2008)]。当ES细胞用视黄酸处理以诱导其分化时，不仅Klf4而且Klf2和Klf5减少其表达。注意到这个事实，Jiang等人的团体近来同时敲低Klf2、Klf4和Klf5，并且发现在ES细胞中诱导分化，显示Klf家族成员中的至少一些，例如Klf2和Klf5，可以在ES细胞中在功能上代替Klf4[Jiang，J.等人，Nat. Cell Biol.，10: 353-360(2008)]。他们继续将Klf2或Klf5基因或其他转录因子或后生调节因子连同三种基因Oct3/4、Sox2和c-Myc一起转移到MEF内，证实Klf2和Klf5可以代替Klf4，并且发现Esrrb，类似于雌激素受体的孤儿核受体，也能够代替Klf4 [Feng，B.等人，Nat. Cell Biol.，11: 197-203(2009)]。这些发现导致Klf1、Klf2、Klf5和甚至Esrrb也具有在本文给出的实施例中证实的Klf4效应(与GLIS家族组合使用的iPS细胞建立效率的改善)的观念。

尽管在本发明中使用的Klf家族的成员可以是衍生自任选选择的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、猴、牛、马、猪、犬等)的细胞或组织[例如，胸腺、骨髓、脾、脑、脊髓、心脏、骨骼肌、肾、肺、肝、胰腺或前列腺的细胞或组织、其相应前体细胞、干细胞或癌细胞等]的蛋白质或编码其的核酸，优先给予人或小鼠起源的那些。

关于人和小鼠起源的Klf家族成员的氨基酸序列和cDNA序列的信息可以根据表2中所示的NCBI登记号获得。本领域技术人员基于cDNA序列信息能够容易地分离编码各自蛋白质的核酸，且根据需要产生重组蛋白质。

表2

与上文显示的每种氨基酸序列具有90%或更多、优选95%或更多、更优选98%或更多、特别优选99%或更多同一性，且具有与野生型蛋白质那种等价的iPS细胞建立效率改善效应的天然或人工突变蛋白质，和编码其的核酸，也可以用作本发明的iPS细胞建立效率改善因子。

关于本发明的Klf家族的成员和编码其的核酸，可以单独使用属于该家族的任何一种因子，或可以组合使用两种或更多种。

假设经历核重编程的体细胞以足以改善建立效率的水平内源表达GLIS家族的成员或Klf家族的成员中任何一个的组成成分中的一种或多种，其为本发明的上述iPS细胞建立效率改善因子，除去内源表达的组成成分仅剩余组成成分的组合也可以包括在本发明中的“iPS细胞建立效率改善因子”的范围中。

以蛋白质形式的本发明的iPS细胞建立效率改善因子转移至体细胞可以使用本身已知用于蛋白质转移到细胞内的方法来达到。此类方法包括例如使用蛋白质转移试剂的方法，使用蛋白质转移结构域(PTD)或细胞穿透肽(CPP)融合蛋白的方法，显微注射法等。蛋白质转移试剂是商购可得的，包括基于阳离子脂质的那些，例如BioPOTER蛋白质递送试剂(Gene Therapy Systems)、Pro-Ject^TM蛋白质转移试剂(PIERCE)和ProVectin(IMGENEX)；基于脂质的那些，例如Profect-1(Targeting Systems)；基于膜可穿透肽的那些，例如Penetrain Peptide(Q biogene)和Chariot Kit(Active Motif)，利用HVJ包膜(灭活的日本血凝素病毒)的GenomONE(ISHIHARA SANGYO KAISHA，LTD.)等。转移可以根据与这些试剂附着的方案来达到，通常程序如下所述。将本发明的蛋白质的iPS细胞建立效率改善因子在合适溶剂(例如缓冲溶液例如PBS或HEPES)中稀释，加入转移试剂，将混合物在室温温育约5 – 15分钟，以形成复合物，在将培养基更换为无血清培养基后，将这种混合物加入细胞中，并且将细胞在37℃温育一至数小时。其后，将培养基去除且替换为含血清培养基。

开发的PTDs包括使用蛋白质的跨细胞结构域的那些，例如果蝇衍生的AntP、HIV衍生的TAT(Frankel，A.等人，Cell 55，1189-93(1988)或Green，M. & Loewenstein，P. M. Cell 55，1179-88(1988))、Penetratin(Derossi，D.等人，J. Biol. Chem. 269，10444-50(1994))、Buforin II(Park，C. B.等人Proc. Natl Acad. Sci. USA 97，8245-50(2000))、Transportan(Pooga，M.等人FASEB J. 12，67-77(1998))、MAP(模型两亲肽)(Oehlke，J.等人Biochim. Biophys. Acta. 1414，127-39(1998))、K-FGF(Lin，Y. Z.等人J. Biol. Chem. 270，14255-14258(1995))、Ku70(Sawada，M.等人Nature Cell Biol. 5，352-7(2003))、朊病毒(Lundberg，P.等人Biochem. Biophys. Res. Commun. 299，85-90(2002))、pVEC(Elmquist，A.等人Exp. Cell Res. 269，237-44(2001))、Pep-1(Morris，M. C.等人Nature Biotechnol. 19，1173-6(2001))、Pep-7(Gao，C.等人Bioorg. Med. Chem. 10，4057-65(2002))、SynBl(Rousselle，C.等人Mol. Pharmacol. 57，679-86(2000))、HN-I(Hong，F. D. & Clayman，G L. Cancer Res. 60，6551-6(2000))、和HSV衍生的VP22。衍生自PTDs的CPPs包括聚精氨酸例如11R(Cell Stem Cell，4,381-384(2009))和9R(Cell Stem Cell，4，472-476(2009))。

制备掺入本发明的iPS细胞建立效率改善因子的cDNA和PTD序列或CPP序列的融合蛋白表达载体，并且使用该载体执行重组表达。将融合蛋白回收且用于转移。转移可以以与上文相同的方式执行，除了不加入蛋白质转移试剂外。

显微注射，将蛋白质溶液置于具有约1 μm的尖端直径的玻璃针中且将溶液注射到细胞内的方法，确保蛋白质转移到细胞内。

蛋白质转移的其他有用方法包括电穿孔、半完整细胞法[Kano，F.等人Methods in Molecular Biology，第322卷，357-365(2006)]、使用Wr-t肽的转移[Kondo，E.等人，Mol. Cancer Ther. 3(12)，1623-1630(2004)]等。

蛋白质转移操作可以执行一次或多次任选选择的次数(例如一次或多次至10次或更少、或一次或多次至5次或更少等)。优选地，转移操作可以重复执行两次或更多次(例如3次或4次)。关于重复转移操作的时间间隔是例如6 – 48小时，优选12 – 24小时。

当强调iPS细胞建立效率时，优选本发明的iPS细胞建立效率改善因子不作为蛋白质使用，而是以编码其的核酸的形式使用。核酸可以是DNA或RNA，并且可以是DNA/RNA嵌合体，其中优先给予DNA。核酸可以是双链或单链的。在双链的情况下，同样可以是双链DNA、双链RNA、或DNA/RNA杂交物。优选地，核酸是双链DNA，优选cDNA。

本发明的基于核酸的iPS细胞建立效率改善因子可以根据常规方法，克隆自例如衍生自人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猴、猪、犬等)的细胞或组织[例如，胸腺、骨髓、脾、脑、脊髓、心脏、骨骼肌、肾、肺、肝、胰腺或前列腺的细胞或组织、其相应前体细胞、干细胞或癌细胞等]的cDNA。

本发明的iPS细胞建立效率改善因子转移至体细胞可以使用本身已知用于基因转移至细胞的方法来达到。将编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸插入包含能够在宿主体细胞中起作用的启动子的合适表达载体内。有用的表达载体包括例如病毒载体例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和仙台病毒、用于在动物细胞中表达的质粒(例如pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。

待使用的载体的类型可以根据待获得的iPS细胞的预期用途适当选择。有用的载体包括腺病毒载体、质粒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。

在表达载体中使用的启动子的例子包括EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等，其中优先给予EF1α启动子、CAG启动子、MoMuLV LTR、CMV启动子、SRα启动子等。

需要时，除启动子外，表达载体还可以含有增强子、多腺苷酸化信号、可选标记基因、SV40复制起点等。可选标记基因的例子包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。

关于编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸，任何一种都可以单独整合到表达载体上，并且以组合的某些可以整合到一种表达载体上。此外，一种或多种核酸可以连同一种或多种重编程基因一起整合到一种表达载体上。

在上述程序中，当本发明的iPS细胞建立效率改善因子和重编程因子的基因组合整合到一种表达载体时，这些基因可以优选经由使得多顺反子表达成为可能的序列整合到表达载体内。使用使得多顺反子表达成为可能的序列使得能够更有效地表达在一种表达载体中整合的多种基因。使得多顺反子表达成为可能的有用序列包括例如口蹄疫病毒的2A序列(SEQ ID NO:9；PLoS ONE 3，e2532，2008，Stem Cells 25，1707，2007)、IRES序列(美国专利号4,937,190)等，其中优先给予2A序列。

包含编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸的表达载体可以根据载体的选择通过本身已知的技术引入细胞内。在病毒载体的情况下，例如，将含有核酸的质粒引入合适的包装细胞(例如Plat-E细胞)或补充细胞系(例如293细胞)内，将在培养上清液中产生的病毒载体回收，并且通过适合于病毒载体的方法将载体感染至细胞。例如，使用逆转录病毒载体的特定方法公开于WO2007/69666，Cell，126，663-676(2006)和Cell，131，861-872(2007)中。使用慢病毒载体的特定方法公开于Science，318，1917-1920(2007)中。当iPS细胞用作细胞来源用于再生医学时，本发明的iPS细胞建立效率改善因子的表达(再激活)或其中外源基因潜在整合的位点附近存在的内源基因的激活，增加由iPS细胞衍生的分化细胞再生的组织中癌发生的危险。因此，编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸优选是瞬时表达的，而不整合到细胞的染色体内。从这个观点来看，其整合到染色体内是罕见的腺病毒载体的使用是优选的。使用腺病毒载体的特定方法在Science，322，945-949(2008)中描述。因为腺伴随病毒载体在整合到染色体内的频率中也是低的，并且就细胞毒性和炎症可诱导性而言低于腺病毒载体，所以它可以作为另一种优选载体提及。因为仙台病毒载体能够稳定存在于染色体外，并且可以根据需要使用siRNA降解且去除，所以它也是优选利用的。关于仙台病毒载体，可以使用J. Biol. Chem.，282，27383-27391(2007)，Proc. Jpn. Acad.，Ser. B 85，348-362(2009)或JP-B-3602058中描述的那种。

当使用逆转录病毒载体或慢病毒载体时，即使转基因的沉默已发生，它也可能变得再激活。因此，例如，可以优选使用当变得不需要时，其中编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸使用Cre-loxP系统切掉的方法。即，具有预先安排在核酸两个末端上的loxP序列，将iPS细胞诱导，其后使用质粒载体或腺病毒载体允许Cre重组酶作用于细胞，并且可以切掉由loxP序列夹心的区域。因为LTR U3区域的增强子-启动子序列可能通过插入突变上调其附近的宿主基因，所以更优选避免通过基因组中剩余的loxP序列外的LTR的内源基因的表达调节而不是切掉，使用通过缺失该序列制备的3'自灭活的(SIN)LTR，或用例如SV40的多腺苷酸化序列代替该序列。使用Cre-loxP序列和SIN LTR的特定方法公开于Soldner等人，Cell，136: 964-977(2009)，Chang等人，Stem Cells，27: 1042-1049(2009)等中。

同时，作为非病毒载体，质粒载体可以使用脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等转移到细胞内。使用质粒作为载体的特定方法在例如Science，322，949-953(2008)等中描述。

当使用质粒载体、腺病毒载体等时，转染可以执行一次或多次任选选择的次数(例如一次至10次、或一次至5次等)。当将两个或更多个种类的表达载体引入体细胞内时，优选将这些所有种类的表达载体同时引入体细胞内；然而，即使在这种情况下，转染也可以执行一次或多次任选选择的次数(例如一次至10次、一次至5次等)，优选转染可以重复执行两次或更多次(例如3次或4次)。

此外，当使用腺病毒或质粒时，转基因可以整合到染色体内；因此，最终需要通过DNA印迹或PCR证实基因插入染色体内的不存在。为此，如同上述Cre-loxP系统，使用其中转基因整合到染色体内的方法可以是有利的，其后去除基因。在另一个优选模式的实施方案中，可以使用其中转基因使用转座子整合到染色体内的方法，其后使用质粒载体或腺病毒载体允许转座酶作用于细胞，以便从染色体中完全消除转基因。作为优选转座子的例子，可以提及piggyBac，衍生自鳞翅目昆虫的转座子等。使用piggyBac转座子的特定方法公开于Kaji，K.等人，Nature，458: 771-775(2009)，Woltjen等人，Nature，458: 766-770(2009)中。

另一种优选的非整合型载体是附加型载体，其能够在染色体外自复制。使用附加型载体的特定方法公开于Yu等人，Science，324，797-801(2009)中。需要时，通过将编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸插入具有loxP序列的附加型载体内可以构建表达载体，所述loxP序列以相同方向置于对于附加型载体复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上，并且这可以转移至体细胞。

附加型载体的例子包括包含对于自复制所需的衍生自EBV、SV40等的序列作为载体组分的载体。对于自复制所需的载体组分通过复制起点和编码结合复制起点以控制复制的蛋白质的基因具体例示；例子包括用于EBV的复制起点oriP和EBNA-1基因、和用于SV40的复制起点ori和SV40大T抗原基因。

附加型表达载体含有控制编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸转录的启动子。使用的启动子可以是如上所述的。需要时，附加型表达载体可以进一步含有如上所述的增强子、多腺苷酸化信号、选择标记基因等。选择标记基因的例子包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因等。

除噬菌体P1衍生的野生型loxP序列(SEQ ID NO:10)外，在本发明中有用的loxP序列包括，当以相同方向置于侧接对于转基因复制所需的载体组分的位置上时，能够通过重组缺失侧面为loxP序列的序列的任选选择的突变型loxP序列。此类突变型loxP序列的例子包括在5'重复中突变的lox71(SEQ ID NO:11)、在3'重复中突变的lox66(SEQ ID NO:12)、以及在间隔物部分中突变的lox2272和lox511。尽管置于载体组分的5’和3’侧上的两个loxP序列可以是等同或不等同的，但在间隔物部分中突变的两个突变型loxP序列必须是等同的(例如一对lox2272序列、一对lox511序列)。优先给予在5'重复中突变的突变型loxP序列(例如lox71)、和在3'重复中突变的突变型loxP序列(例如lox66)的组合。在这种情况下，由于重组在染色体上剩余的loxP序列具有在5'侧和3'侧上在重复中的双重突变，并且因此不太可能由Cre重组酶识别，从而减少由于不需要的重组引起染色体中的缺失突变的危险。当突变型loxP序列lox71和lox66组合使用时，各自可以置于上述载体组分的5'和3'侧的任何上，但突变型loxP序列以这样的方向插入，从而使得突变位点将位于各自loxP序列的外部末端是必需的。

两个loxP序列各自以相同方向置于对于转基因复制必需的载体组成成分(即复制起点、或编码结合复制起点以控制复制的蛋白质的基因序列)的5'和3'侧上。侧面为loxP序列的载体组成成分可以是复制起点、或编码结合复制起点以控制复制的蛋白质的基因序列、或两者。

附加型载体可以使用脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等引入细胞内。具体地，例如，可以使用在Science，324: 797-801(2009)中和其他地方描述的方法。

对于转基因复制所需的载体组分是否已从iPS细胞中去除可以通过执行DNA印迹分析或PCR分析加以证实，使用包含在载体组分中和/或在loxP序列附近的核苷酸序列的核酸作为探针或引物，用从iPS细胞中分离的附加体部分作为模板，且测定条带的存在或不存在或所检测条带的长度。附加体部分可以通过本领域显而易见的方法进行制备；例如，可以使用在Science，324: 797-801(2009)中和其他地方描述的方法。

(c)核重编程物质

在本发明中，“核重编程物质”指当转移至体细胞时，或当连同本发明的建立效率改善因子[(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，和(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质]一起与体细胞接触时，能够诱导由体细胞诱导iPS细胞的任何一种或多种物质，其可以由任何物质例如蛋白质因子或编码其的核酸(包括整合到载体中的形式)、或低分子化合物组成。作为其为蛋白质因子或编码其的核酸的已知核重编程物质，例如，下述组合是优选的(下文，仅显示关于蛋白质因子的名称)。

(1)Oct3/4、Klf4、c-Myc

(2)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2(Sox2可替换为Sox1、Sox3、Sox15、Sox17或Sox18；Klf4可替换为Klf1、Klf2或Klf5；c-Myc可替换为T58A(活性突变体)或L-Myc)

(3)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Fbx15、Nanog、ERas、TclI

(4)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、SV40大T抗原(下文SV40LT)

(5)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6

(6)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16 E7

(7)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7

(8)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、Bmil

[对于关于上文所示因子的更多信息，参见WO 2007/069666(对于关于在上文的组合(2)中Sox2替换为Sox18和Klf4替换为Klf1或Klf5的信息，参见Nature Biotechnology，26，101-106(2008))；对于组合“Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2”，还参见Cell，126，663-676(2006)，Cell，131，861-872(2007)等；对于组合“Oct3/4、Klf2(或Klf5)、c-Myc、Sox2”，还参见Nat. Cell Biol.，11，197-203(2009)；对于组合“Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、hTERT、SV40 LT”，还参见Nature，451，141-146(2008).]

(9)Oct3/4、Klf4、Sox2(参见Nature Biotechnology，26，101-106(2008))

(10)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28(参见Science，318，1917-1920(2007))

(11)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT(参见Stem Cells，26，1998-2005(2008))

(12)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28(参见Cell Research 18(2008)600-603)

(13)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40LT(参见Stem Cells，26，1998-2005(2008))

(14)Oct3/4、Klf4(参见Nature 454:646-650(2008)、Cell Stem Cell，2，525-528(2008)))

(15)Oct3/4、c-Myc(参见Nature 454:646-650(2008))

(16)Oct3/4、Sox2(参见Nature，451，141-146(2008)，WO2008/118820)

(17)Oct3/4、Sox2、Nanog(参见WO2008/118820)

(18)Oct3/4、Sox2、Lin28(参见WO2008/118820)

(19)Oct3/4、Sox2、c-Myc、Esrrb(此处，Esrrb可以用Esrrg代替，参见Nat. Cell Biol.，11，197-203(2009))

(20)Oct3/4、Sox2、Esrrb(参见Nat. Cell Biol.，11，197-203(2009))

(21)Oct3/4、Klf4、L-Myc(参见Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.，107(32)，14152-14157(2010))

(22)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28(参见WO2011/016588)

(23)Oct3/4、Nanog

(24)Oct3/4(Cell 136: 411-419(2009)、Nature，08436，在线公开的doi:10.1038(2009)

(25)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT(参见Science，324: 797-801(2009))

在上文的(1)-(25)中，Oct3/4可以替换为Oct家族的另一个成员，例如Oct1A、Oct6等。Sox2(或Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18)可以替换为Sox家族的另一个成员，例如Sox7等。此外，假设c-Myc或Lin28包括在上文的组合(1)-(25)中作为核重编程物质，L-Myc或Lin28B可以分别代替c-Myc或Lin28使用。

当上文的因子(1)-(25)的组合包括Klf家族的成员时，与本发明的iPS细胞建立效率改善因子组合使用的“核重编程物质”适当地是含有除Klf家族的这些成员外的因子的那种。当上文的组合(1)-(25)不包括Klf家族的成员时，与本发明的iPS细胞建立效率改善因子组合使用的核重编程物质可以是因子的组合。

除上述核重编程物质外，进一步包含另一种任选选择的物质的组合也适当地用作本发明中的“核重编程物质”。假设经历核重编程的体细胞以足以引起核重编程的水平内源表达上文的(1)-(25)中任何一个的组成成分中的一种或多种，除去一种或多种组成成分的仅剩余组成成分的组合也可以包括在本发明中的“核重编程物质”的范围中。

在这些组合中，例如选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员和Nanog中的一种或多种物质是优选的核重编程物质，其中更大的优先给予Oct3/4和Sox2的组合，Oct3/4、Sox2和c-Myc的组合，Oct3/4、Sox2和L-Myc的组合，或Oct3/4、Sox2、L-Myc和Lin28的组合。

虽然促进iPS细胞的建立，但c-Myc还促进非iPS转化的细胞(部分重编程的细胞、无能(nullipotent)转化的细胞)的生成。本发明人不仅证实共表达GLIS1与Oct3/4、Sox2和Klf4显著促进来自小鼠和人成年皮肤成纤维细胞的iPS细胞建立，还揭示与c-Myc不同，GLIS1不促进非iPS转化的细胞的上述发生。因此，特别优选使用GLIS1而不使用c-Myc。

关于上述每种蛋白质因子的小鼠和人cDNA序列的信息根据WO 2007/069666(在该出版物中，Nanog描述为ECAT4。关于Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg和L-Myc的小鼠和人cDNA序列信息可以分别通过参考下述NCBI登记号获得)中提及的NCBI登记号可获得；本领域技术人员能够容易地分离这些cDNAs。

基因名称小鼠人

Lin28 NM_145833 NM_024674

Lin28b NM_001031772 NM_001004317

Esrrb NM_011934 NM_004452

Esrrg NM_011935 NM_001438

L-Myc NM_008506 NM_001033081。

用于作为核重编程物质使用的蛋白质因子可以通过下述进行制备：将所获得的cDNA插入合适的表达载体内，将载体引入宿主细胞内，且从培养细胞或其条件化培养基中回收重组蛋白质因子。同时，当编码蛋白质因子的核酸用作核重编程物质时，将所获得的cDNA插入病毒载体、附加型载体或质粒载体内，其方式与本发明的基于核酸的iPS细胞建立效率改善因子的上述情况相同，以构建对其实施核重编程步骤的表达载体。需要时，也可以利用上述Cre-loxP系统或piggyBac转座子系统。当编码两种或更多种蛋白质因子的两种或更多种核酸作为核重编程物质转移至细胞时，不同的核酸可以通过分开的载体携带，或多个核酸可以串联连接以获得多顺反子载体。在后面一种情况下，为了允许有效的多顺反子表达，希望将口蹄疫病毒的2A自切割肽插入核酸之间(参见例如，Science，322，949-953，2008)。

当物质是蛋白质因子时，核重编程物质与体细胞的接触可以(a)以与本发明的上述蛋白质iPS细胞建立效率改善因子相同的方式达到，或当物质是编码蛋白质因子的核酸时，(b)以与本发明的上述基于核酸的iPS细胞建立效率改善因子相同的方式达到。(c)当核重编程物质是低分子化合物时，与体细胞的接触可以通过下述来达到：将低分子化合物以合适浓度溶解于水性或非水溶剂中，将溶液加入适合于培养从人或其他哺乳动物中分离的体细胞的培养基[含有约5 - 20%胎牛血清(FCS)的最小必需培养基(MEM)、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等]中，从而使得核重编程物质浓度将落入足以引起体细胞中的核重编程且不引起细胞毒性的范围中，且将细胞培养给定时期。核重编程物质浓度取决于使用的核重编程物质种类而改变，并且适当地选择在约0.1 nM – 约100 nM的范围上。接触的持续时间并无特别限制，只要它足以引起细胞的核重编程；通常，核重编程物质可以允许共存在于培养基中，直至阳性集落出现。

(d)其他iPS细胞建立效率改进剂

近年来，改善常规低的iPS细胞建立效率的多种物质已相继提出。当连同本发明的上述iPS细胞建立效率改善因子一起与体细胞接触时，其他iPS细胞建立效率改进剂预期进一步升高iPS细胞建立效率。

其他iPS细胞建立效率改进剂的例子包括但不限于，除了VPA外的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂[例如低分子抑制剂例如曲古抑菌素A(TSA)、丁酸钠、MC 1293和M344，基于核酸的表达抑制剂例如针对HDAC的siRNAs和shRNAs(例如HDAC1 siRNA Smartpool^?(Millipore)、针对HDAC1的HuSH 29聚体shRNA构建体(OriGene)等)等]，蛋白质甲基转移酶抑制剂[例如5’-氮杂胞苷(5’-azaC)[Nat. Biotechnol.，26(7): 795-797(2008)]，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如低分子抑制剂例如BIX-01294(Cell Stem Cell，2: 525-528(2008))、基于核酸的表达抑制剂例如针对G9a的siRNAs和shRNAs[例如G9a siRNA(人)(Santa Cruz Biotechnology)等)等]，L-通道钙激动剂(例如Bayk8644)[Cell Stem Cell，3，568-574(2008)]，p53抑制剂[例如针对p53的siRNA、shRNA、显性失活突变体等(Cell Stem Cell，3，475-479(2008))；Nature 460，1132-1135(2009))]，Wnt信号传导激活物(例如可溶性Wnt3a)[Cell Stem Cell，3，132-135(2008)]，2i/LIF [2i是丝裂原激活蛋白质激酶信号传导和糖原合酶激酶-3的抑制剂，PloS Biology，6(10)，2237-2247(2008)]，ES细胞特异性miRNA[例如miR-302-367簇(Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08)；miR-302(RNA(2008)14: 1–10)；miR-291-3p、miR-294和miR-295(Nat. Biotechnol. 27: 459-461(2009)]等。如上所述，基于核酸的表达抑制剂可以是容纳编码siRNA或shRNA的DNA的表达载体的形式。

在核重编程物质的上述组成成分中，例如SV40大T也可以包括在iPS细胞建立效率改进剂的范围中，因为它们是对于体细胞的核重编程非必需的辅助因子。虽然核重编程的机制仍不明了，但除对于核重编程必需的因子外，辅助因子视为核重编程物质还是iPS细胞建立效率改进剂无关紧要。因此，因为体细胞核重编程过程视为起因于核重编程物质和iPS细胞建立效率改进剂与体细胞接触的总体事件，所以它看起来不一定是对于本领域技术人员区分两者必需的。

当改进剂分别是(a)蛋白质因子、(b)编码蛋白质因子的核酸、或(c)低分子化合物时，iPS细胞建立效率改进剂与体细胞的接触可以以与本发明的上述iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质相同的方式来达到。

iPS细胞建立效率改进剂包括本发明的iPS细胞建立效率改善因子可以与核重编程物质同时与体细胞接触，并且任何一种可以预先接触，只要与在不存在该物质的情况下获得的效率相比较，来自体细胞的iPS细胞建立效率显著改善。在一个实施方案中，例如，当核重编程物质是编码蛋白质因子的核酸并且iPS细胞建立效率改进剂是化学抑制剂时，在基因转移处理后将细胞培养给定时间长度后，iPS细胞建立效率改进剂可以加入培养基中，因为核重编程物质涉及从基因转移处理到蛋白质因子的大量表达的给定时滞长度，而iPS细胞建立效率改进剂能够快速作用于细胞。在另一个实施方案中，当核重编程物质和iPS细胞建立效率改进剂都以病毒或质粒载体的形式使用时，例如，两者可以同时引入细胞内。

(e)通过培养条件改善建立效率

iPS细胞建立效率可以进一步通过在低氧条件下在用于体细胞的核重编程过程中培养细胞得到改善(参见Cell Stem Cell、5、第237-241页(2009))。如本文提及的，术语“低氧条件”意指在细胞培养时的环境氧浓度显著低于大气中的那种。特别地，可以提及涉及比在5-10% CO₂/95-90%空气气氛(其通常用于普通细胞培养)中的环境氧浓度更低的氧浓度的条件；例子包括涉及18%或更少的环境氧浓度的条件。优选地，环境氧浓度是15%或更少(例如14%或更少、13%或更少、12%或更少、11%或更少等)、10%或更少(例如9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少等)、或5%或更少(例如4%或更少、3%或更少、2%或更少等)。环境氧浓度优选是0.1%或更多(例如0.2%或更多、0.3%或更多、0.4%或更多等)、0.5%或更多(例如0.6%或更多、0.7%或更多、0.8%或更多、0.95%或更多等)、或1%或更多(例如1.1%或更多、1.2%或更多、1.3%或更多、1.4%或更多等)。

尽管可以使用在细胞环境中产生低氧状态的任何方法，但最容易的方法是在允许调整氧浓度的CO₂温箱中培养细胞，并且这代表合适情况。允许调整氧浓度的CO₂温箱是从多个制造商商购可得的(例如由Thermo scientific，Ikemoto Scientific Technology，Juji Field，Wakenyaku制造的用于低氧培养的CO₂温箱等)。

在低氧条件下开始细胞培养的时间并无特别限制，只要与正常氧浓度相比较(20%)，iPS细胞建立效率未阻止得到改善。尽管培养可以在体细胞与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质接触前、或与接触同时或在接触后开始，但优选例如在低氧条件下的培养正好在体细胞与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质接触后、或在接触后的给定时间间隔[例如1 - 10(例如2、3、4、5、6、7、8或9)天]后开始。

在低氧条件下细胞培养的持续时间并无特别限制，只要与正常氧浓度相比较(20%)，iPS细胞建立效率未阻止得到改善；例子包括但不限于3天或更多、5天或更多、7天或更多或10天或更多、和50天或更少、40天或更少、35天或更少或30天或更少等的时期。在低氧条件下优选的培养持续时间取决于环境氧浓度而改变；本领域技术人员可以根据使用的氧浓度适当地调整培养的持续时间。在本发明的一个实施方案中，如果iPS细胞候选集落用药物抗性作为指数进行选择，那么优选在开始药物选择前从低氧条件恢复正常氧浓度。

此外，用于在低氧条件下的细胞培养的优选开始时间和优选培养持续时间还取决于使用的核重编程物质的选择、在正常氧浓度下的iPS细胞建立效率等而改变。

(f)iPS细胞的选择和鉴定

在与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质(和另一种iPS细胞建立效率改进剂)接触前，细胞可以例如在适合于培养ES细胞的条件下进行培养。在小鼠细胞的情况下，用作为分化抑制因子的白血病抑制因子(LIF)加入普通培养基执行培养。同时，在人细胞的情况下，希望碱性成纤维细胞生长因子(LIF)和/或干细胞因子(SCF)代替LIF加入。通常，细胞在作为饲养细胞、用放射或抗生素处理以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的共存下培养。通常，STO细胞等通常用作MEFs，但对于诱导iPS细胞，通常使用SNL细胞[McMahon，A.P. & Bradley，A. Cell 62，1073–1085(1990)]等。与饲养细胞的共培养可以在与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质接触前、在接触时或在接触后(例如1-10天后)开始。

iPS细胞的候选集落可以通过用药物抗性和报道分子活性作为指示剂的方法，并且还通过基于形态学的肉眼检测的方法进行选择。作为前者的例子，使用重组细胞选择对于药物抗性和/或报道分子活性阳性的集落，其中药物抗性基因和/或报道基因靶向在多能细胞中特异性高度表达的基因的基因座(例如Fbx15、Nanog、Oct3/4等，优选Nanog或Oct3/4)。作为此类重组细胞的例子，可以提及其中βgeo(其编码β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合蛋白)基因敲入Fbx15基因基因座中的小鼠衍生的MEF和TTF(Takahashi & Yamanaka，Cell，126，663-676(2006))，或其中绿色荧光蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog基因基因座中的转基因小鼠衍生的MEF和TTF(Okita等人，Nature，448，313-317(2007))等。同时，通过形态学的肉眼检查用于选择候选集落的方法包括例如由Takahashi等人在Cell，131，861-872(2007)中描述的方法。尽管使用报道细胞的方法是方便和有效的，但当iPS细胞制备用于人治疗的目的时，通过肉眼检查的集落选择从安全性观点来看是希望的。

所选集落的细胞作为iPS细胞的鉴定可以如上所述通过对于Nanog(或Oct3/4)报道分子的阳性应答(嘌呤霉素抗性、GFP阳性等)，以及通过可见ES细胞样集落的形成加以证实；然而，为了增加准确度，可以执行测试例如碱性磷酸酶染色，分析多种ES细胞特异性基因的表达，和将所选细胞转移至小鼠且证实畸胎瘤形成。

当编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸转移至体细胞时，所获得的iPS细胞是不同于常规已知iPS细胞的新细胞，因为在其中含有外源核酸。特别地，如果当外源核酸使用逆转录病毒、慢病毒等转移至体细胞，那么外源核酸通常整合到所获得的iPS细胞的基因组中，从而使得含有外源核酸的特征稳定保留。

(g)关于iPS细胞的使用应用

因此建立的iPS细胞可以用于多种目的。例如，通过利用就多能干细胞例如ES细胞而言报道的分化诱导的方法(例如分化诱导的方法包括对于神经干细胞在JP-A-2002-291469中描述的方法，对于胰腺干样细胞在JP-A-2004-121165中描述的方法，和对于造血细胞在JP-T-2003-505006中描述的方法；通过胚状体形成的分化诱导的方法包括在JP-T-2003-523766中描述的方法)，可以由iPS细胞诱导分化成多种细胞(例如心肌细胞、血细胞、神经细胞、血管内皮细胞、胰岛素分泌细胞等)。因此，使用从相同或基本上相同的HLA类型的患者或另一个人中收集的体细胞诱导iPS细胞将使得通过自体移植的干细胞疗法成为可能，其中iPS细胞分化成所需细胞(即，患者的受累器官的细胞，对疾病具有疗效的细胞等)，将其移植给患者。此外，因为认为由iPS细胞分化的功能细胞(例如肝细胞)比相应的现有细胞系更好地反映在体内功能细胞的实际状态，所以它们还可以适当地用于体外筛选药物候选化合物的有效性和毒性等。

本发明在下文借助于下述实施例进一步详细描述，然而，本发明决不限于下述实施例。

实施例

参考实施例1：筛选新重编程因子

通过图1中所示的方法，广泛人基因的约20000个克隆基于由Goshima等人生成的人Gateway^?入门克隆进行排序(使用由N. Goshima等人在Nature methods，2008中描述的文库；由Y. Maruyama等人在Nucleic Acid Res.，2009中公开的数据库)。具体地，针对用NCBI RefSeq登记的37900个序列(24200种基因)，对人Gateway^?入门克隆中的含有全长ORF的约50000个克隆实施BLASTP搜索，其中标准是80%或更多的覆盖度和95%或更多的氨基酸同一性。因此构建由不涉及N类型和F类型各自中的序列重叠的约20000个入门克隆组成的子文库，所述N类型具有其在3'末端上的终止密码子，所述F类型缺乏终止密码子。这些约20000个排序的入门克隆通过生物信息学技术分类成蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶、转录因子、GPCRs及其他克隆；构建由转录因子的入门克隆组成的子文库(覆盖超过50%的所有人转录因子)(图1)。如图2中所示，通过与pMXs-GW目的载体的LR反应对于来自转录因子的这个子文库的每个入门克隆制备表达克隆DNA。将这种反应液转移至大肠埃希杆菌(Escherichia coli)DH5α，随后将其克隆以构建转录因子表达文库(用于重编程因子筛选的转录因子表达文库)。人Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc基因各自也整合到相同pMXs-GW内，以构建各自的表达克隆。由这种DNA生成重组逆转录病毒且用于下述实验中。

使用来自Nanog-GFP小鼠[Okita等人，Nature，448，313-317(2007)]的表皮成纤维细胞执行诱导iPS细胞的实验。该实验使用两个系统进行：涉及在用作饲养细胞的MSTO上的逆转录病毒感染的系统(用丝裂霉素C处理以终止其细胞分裂的SNL细胞)[下文MSTO法，Cell，126，663-676(2006)]，和涉及感染而不使用饲养细胞，随后为细胞再种植和在MSTO上的后续培养的系统[下文Reseed法，Nature Biotech.，26，第101-106页(2008)]。

对于第一次筛选，使用24孔板诱导iPS细胞。将Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞种植到明胶(Reseed法)或MSTO(MSTO法)上。第二天，将成纤维细胞用由多种质粒制备的逆转录病毒感染(第0天)。具体地，将成纤维细胞用三种基因Oct3/4、Sox2和c-Myc和选自上述转录因子文库的一种基因以1:1:1:1的比感染。对于阴性对照，将成纤维细胞用三种基因Oct3/4、Sox2和c-Myc以1:1:1的比感染。对于阳性对照，将成纤维细胞用四种基因Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc以1:1:1:1的比感染。

将成纤维细胞用10% FBS/DMEM培养直至在感染后第2天，并且在第3天和以后用ES培养基[Cell，126，663-676(2006)]培养。当成纤维细胞最初种植到明胶(Reseed法)上时，在第3天时将它们再种植到MSTO上。其后，在每两天将培养基替换为相同培养基的新鲜供应的同时，在第21天时开始嘌呤霉素选择，并且在第28天时检查细胞。因此，GFP阳性集落在掺入连同三种基因一起转移的每种基因[样品F09(基因密码名称: IRX6)、样品G06(基因密码名称: GLIS1)、样品H08(基因密码名称: DMRTB1)、和样品H10(基因密码名称: PITX2)]的孔中出现，证实小鼠iPS细胞的建立。当再次使用6孔板尝试iPS诱导时，GFP阳性集落同样出现；获得再现性。在集落形成和第一代和第二代时获得的GFP阳性iPS细胞集落的照片图像和相位差图像显示于图3和4中。

这些结果证实这四种因子作为能够代替Klf4的新重编程因子的鉴定。当使用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)或HDF(人表皮成纤维细胞)代替成年小鼠皮肤成纤维细胞执行相同实验时，同样建立iPS细胞(GFP阳性集落)。

参考实施例2：建立的小鼠iPS细胞的分析

使用Gentra Puregene Cell Kit(QIAGEN)提取基因组，并且使用PCR酶(Takara Ex Taq)和在参考实施例1中建立的iPS细胞执行基因组-PCR。结果显示于图5和6中。在建立的所有iPS细胞中，证实在基因组上仅转基因的存在和在基因组上其他基因的不存在。对于G6-1克隆(基因密码名称: GLIS1)，用于转移的c-Myc不插入基因组上(图5)。因为逆转录病毒载体直到插入基因组上才稳定表达，所以认为这个克隆G6-1已建立，具有仅三种因子Oct3/4、Sox2和GLIS1的表达。

接下来，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)执行RT-PCR分析。结果显示于图7和8中。在参考实施例1中建立的所有iPS细胞表达ES细胞特异性标记基因Nanog、Oct3/4、Sox2、Rex1和ECAT1。这些结果证实使用新重编程因子建立的细胞作为iPS细胞的鉴定。

实施例1: 用组合使用的G6和Klf4建立小鼠iPS细胞

(a)组合使用的G6和Klf4对小鼠iPS细胞的建立效率的作用

进行研究以测定当使用与Klf4组合的在参考实施例1中鉴定的G6(基因密码名称: GLIS1)、H8(基因密码名称: DMRTB1)和H10(基因密码名称: PITX2)(其为能够代替Klf4的新重编程因子)时，iPS细胞是否可以建立。使用如参考实施例1中的Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞通过Reseed法进行实验。用于基因转移的基因的组合显示于下文。

(1)Oct3/4、Sox2

(2)Oct3/4、Sox2、G6(基因密码名称: GLIS1)

(3)Oct3/4、Sox2、H8(基因密码名称: DMRTB1)

(4)Oct3/4、Sox2、H10(基因密码名称: PITX2)

(5)Oct3/4、Sox2、Klf4

(6)Oct3/4、Sox2、Klf4、G6

(7)Oct3/4、Sox2、Klf4、H8

(8)Oct3/4、Sox2、Klf4、H10。

通过将逆转录病毒载体(pMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-G6、pMXs-H8、pMXs-H10)分开转移至Plat-E细胞(Morita，S.等人，Gene Ther. 7，1063-1066)制备用于重编程的逆转录病毒，所述Plat-E细胞在前一天已经以2.5×10⁶细胞/100 mm培养皿(Falcon)种植。使用的培养肉汤是DMEM/10% FCS [补充有10%胎牛血清的DMEM(Nacalai tesque)，并且细胞在37℃、5% CO₂下培养。

为了促进载体转移，将27 μL FuGene6转染试剂置于300 μL Opti-MEM I Reduced-Serum Medium(Invitrogen)中，并且允许混合物在室温静置5分钟。随后，加入9 μg每种表达载体，并且允许混合物在室温进一步静置15分钟，这之后将它们加入Plat-E培养肉汤中。在第2天时，将Plat-E上清液替换为培养基的新鲜供应。在第3天时，将培养上清液回收且通过0.45 μm无菌滤器(Whatman)过滤，并且将聚凝胺(Nacalai)以4 μg/mL加入以获得病毒液体。

通过从小鼠背/腹部皮肤中取出真皮，并且在明胶覆盖的皿上培养，获得使用的Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞。

使用的培养肉汤是DMEM/10% FCS，并且将成纤维细胞以8.0×10⁵细胞/皿种植至100 mm皿(Falcon)，并且在37℃、5% CO₂下培养。第二天，将每种逆转录病毒液体[上文的组合(1)-(8)中的任何]加入，以通过过夜感染转移基因。

在病毒感染后第二天时，将逆转录病毒液体去除且替换为DMEM/10% FCS，并且使用DMEM/10% FCS培养细胞直至感染后第3天。在感染后第3天时，将培养基去除，并且通过加入10 mL PBS将细胞洗涤。在PBS去除后，将0.25% 胰蛋白酶/1 mM EDTA(Invitrogen)加入，并且允许反应在37℃进行约5分钟。在细胞浮起后，通过加入ES细胞培养基[补充有15%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、100 μM非必需氨基酸(Invitrogen)、100 μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)、50 U/mL青霉素(Invitrogen)和50 μg/mL链霉素(Invitrogen)的DMEM(Nacalai Tesque)]将它们悬浮，并且种植至具有先前对其种植的饲养细胞的100 mm皿。使用的饲养细胞是用丝裂霉素C处理以终止其细胞分裂的SNL细胞[McMahon，A.P. & Bradley，A. Cell，62，1073–1085(1990)]。在每两天将ES细胞培养基替换为相同培养基的新鲜供应的同时，继续培养直至可见集落出现；在感染后26 – 28天，计数GFP阳性集落。三次独立实验的结果显示于表3和图9中(图9是表3中所示结果的图示；四次独立实验的结果仅对于对照显示)。

在这些条件下，即使具有G6、H8或H10对于Oct3/4和Sox2的加入，iPS细胞也无法建立，或仅极少数iPS细胞可以建立。当将H8或H10加入Oct3/4、Sox2和Klf4时，与添加的不存在(Oct3/4、Sox2和Klf4)相比较，iPS集落计数不升高。相比之下，当将G6加入Oct3/4、Sox2和Klf4时，iPS集落计数显著升高，其水平比具有G6对于Oct3/4和Sox2的添加获得的集落计数和具有Klf4对于Oct3/4和Sox2的添加获得的集落计数的总和高得多。使用组合的Klf4和G6显示对iPS细胞建立效率是协同有效的。

(b)GLIS1和c-Myc对使用三种重编程因子(OSK)的小鼠iPS细胞建立的改善作用的比较

我们随后比较GLIS1和c-Myc促进用OSK的iPSC生成的能力。在成年小鼠皮肤成纤维细胞中，GLIS1的效应与c-Myc的那种是可比较的，如通过形成的GFP阳性集落数目判断的(图10)。我们还观察到当GLIS1和c-Myc与OSK共引入时，在GFP阳性集落数目中的协同增加(图10)。

我们接下来分析GFP阳性集落与在转导后出现的总集落的比。单因素重复测量ANOVA检验和事后Bonferroni检验用于分析。对于小于0.05(*)或0.01(**)的P值，差异视为统计上显著的。结果显示于图11中。重要的是，GLIS1显著促进GFP阳性集落、而不是GFP阴性集落的生成，所述GFP阴性集落代表部分重编程的细胞或经转化的细胞(图11)。相比之下，与GFP阳性集落比较，c-Myc更显著地增加GFP阴性集落数目(图11)。当GLIS1共表达时，c-Myc的这种不希望有的效应被抵消。类似结果用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)获得(图13和图14)。GFP阳性集落显示于图12和图15中。

我们还证实用OSK + GLIS1由MEF建立的iPS细胞是有种系能力的(germline-competent)。

实施例2：用组合使用的G6和Klf4建立人iPS细胞

(a)组合使用的G6和Klf4对人iPS细胞的建立效率的作用

使用成人表皮成纤维细胞(HDF)进行研究，以测定组合使用的Klf4和G6(GLIS1)的协同效应在人细胞中是否也是显著的。用于基因转移的基因的组合显示于下文。

(1)Oct3/4、Sox2、c-Myc

(2)Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4

(3)Oct3/4、Sox2、c-Myc、G6(基因密码名称: GLIS1)

(4)Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、G6。

如由Takahashi，K.等人在Cell，131: 861-872(2007)中所述的，使用慢病毒(pLenti6/UbC-Slc7a1)迫使HDF表达小鼠同向性病毒受体Slc7a1基因。如由Takahashi，K.等人在Cell，131: 861-872(2007)中所述的，使用慢病毒用上文的组合(1)-(4)中的基因转染这些细胞(2.6×10⁵细胞/60 mm皿)。在病毒感染后6天，将细胞回收且再种植到饲养细胞上(5×10⁴细胞或5×10⁵细胞/100 mm皿)。使用的饲养细胞是用丝裂霉素C处理以终止其细胞分裂的SNL细胞[McMahon，A.P. & Bradley，A. Cell，62，1073–1085(1990)]。在感染后7天开始，将细胞在补充有4 ng/mL重组人bFGF(WAKO)的灵长类动物ES细胞培养基(ReproCELL)中培养。在感染后30 – 35天，计数ES细胞样集落。三次独立实验的结果显示于图16(ES样集落)和图17(非ES样集落)中。用Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和G6建立的iPS集落的相位差图像显示于图18中。与将Klf4加入Oct3/4、Sox2和c-Myc和将G6(GLIS1)加入Oct3/4、Sox2和c-Myc相比较，将Klf4和G6加入Oct3/4、Sox2和c-Myc导致数目大得多的ES细胞样集落的出现(图16)。这些集落显示出ES细胞样形态(图18)。简言之，在人细胞中同样，当组合使用Klf4和G6时，注意到对iPS细胞建立效率的协同作用。

(b)GLIS1和c-Myc对使用三种重编程因子(OSK)的人iPS细胞建立的改善作用的比较

我们随后以与实施例1(b)中所述相同的方式比较GLIS1和c-Myc促进用OSK的iPSC生成的能力。在人成年成纤维细胞中，当与OSK共引入时，GLIS1显示与c-Myc可比较程度的相似效应，且促进ESC样集落的生成(图19)。显著地，GLIS1特异性促进ESC样集落，而不是非ESC样集落的生成。相比之下，与ESC样集落比较，c-Myc更显著地增加非ESC样集落数目(图20)。通过OSK + GLIS1生成的人ESC样集落显示于图21中。

随后，使用QIAGEN “Gentra Puregene Cell Kit”提取基因组，并且使用PCR酶(Takara Ex Taq)执行基因组PCR。结果显示于图22中。我们证实了在建立的人iPSC系中转基因的存在(图22)。使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)执行RT-PCR分析。结果显示于图23中。通过OSK + GLIS1生成的细胞表达未分化的ESC标记基因，包括Oct3/4、Sox2、Nanog和Rex1(图23)。我们接下来执行DNA微阵列分析。将总RNAs用Cy3标记，并且根据制造商的方案，与全人基因组微阵列(Whole Human Genome Microarray)(Agilent)杂交。使用G2505C微阵列扫描系统(Microarray Scanner System)(Agilent)扫描阵列。使用GeneSpring GX11.0.1软件程序(Agilent)分析数据。结果显示于图24中。用OSK + GLIS1建立的细胞在总体基因表达中类似于用OSKM生成的iPSCs(图24)。我们随后如先前描述的执行畸胎瘤形成(Cell，131(5)，861-872(2007))。通过OSK + GLIS1生成的细胞产生含有所有三个胚层的多种组织的畸胎瘤(图25)。这些结果证实GLIS1强烈且特异性促进通过OSK的人iPSCs生成。

实施例3：GLIS1的表达和功能分析

我们随后检查了GLIS1的表达模式。小鼠已表达序列标志(EST)数据库的分析预测GLIS1表现朝向接合子偏差，尤其是在受精卵子中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ESTProfileViewer.cgi?uglist=Mm.331757；在2010年4月24日时)。此外，由MGI提供的基因表达数据显示在中期II卵母细胞中的中等GLIS1表达和在2细胞胚胎中的弱表达，并且在8细胞至E4.5胚胎中未检测到表达(http://www.informatics.jax.org/searches/expression.cgi?32989；在2010年4月24日时)。这些基于网络的分析强烈指出GLIS1在卵母细胞和单细胞胚胎中的特异性表达。为了实验上证实这些发现，我们从未受精卵、1细胞胚胎、2细胞胚胎和胚泡中，以及从几种成年小鼠组织包括肾、胎盘、脑、肺、肝、脾和卵巢中分离总RNAs。此外，我们使用从小鼠ESCs、MEFs和成年皮肤成纤维细胞中分离的总RNAs。实时PCR分析检测到在单细胞胚胎和未受精卵中GLIS1的最高表达(图26)。最中等的表达水平在2细胞胚胎和胎盘组织中检测到(图26)。弱表达存在于几种组织包括肾、卵巢、ESCs、MEFs和皮肤成纤维细胞中(图26)。这些数据证实GLIS1 RNA在未受精卵和单细胞胚胎中富集。

我们接下来检查虽然以低水平表达，但在成纤维细胞中的内源GLIS1是否在通过OSK的iPSC生成过程中起作用。为此，我们构建了几种逆转录病毒载体以表达GLIS1 shRNA。shRNA介导的敲低如先前描述的执行(Nature，460(7259)，1132-1135(2009))。我们发现当转染到成年小鼠皮肤成纤维细胞内时，shRNA2(靶序列(SEQ ID NO:3的位置822-842)：ggcctcaccaaccctgcacct；SEQ ID NO:13)和shRNA6(靶序列(SEQ ID NO:3的位置1457-1477)：gcccttcaatgcccgctacaa；SEQ ID NO:14)有效抑制GLIS1，而shRNA4(靶序列(SEQ ID NO:3的位置857-877)：gggcaatgaacccatctcaga；SEQ ID NO:15)是较不有效的(图27，配对t检验用于统计分析)。我们随后将这些shRNAs各自连同OSK一起引入含有Nanog-GFP报道分子的成纤维细胞内。我们发现shRNA2和shRNA6显著减少GFP阳性集落的数目(图28)。用shRNA4观察到较弱的效应。这个结果暗示内源GLIS1在通过OSK的iPSC生成过程中起支持作用。

虽然本发明已着重于优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是优选实施方案可以进行修改。本发明预期本发明可以通过除本说明书中详细描述那些外的方法进行体现。相应地，本发明包含在附加“权利要求”的要点和范围中包含的所有修饰。

此外，在本文引用的任何出版物包括专利和专利申请中公开的内容在此整体引入作为参考，到它们已在本文中公开的程度。

本申请基于美国临时专利申请号61/305,107和61/379,949，其内容在此引入作为参考。

序列表

<110> Kyoto University

NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY

JAPAN BIOLOGICAL INFORMATICS CONSORTIUM

<120> 有效建立经诱导的多能干细胞的方法

<130> 091667

<150> US 61/305,107

<151> 2010-02-16

<150> US 61/379,949

<151> 2010-09-03

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2816

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (568)..(2430)

<400> 1

cactgtgtac tgagactgga tgcatccttg caataaaaaa gaggttgatc acgacaaatg 60

tgaaccccgc cgttataaaa acagccatca tggctgtaaa tgccaaaaag cagtcagtct 120

tgtaacttga aaaaaaaaaa aaaggaattg tagattgtgc gcatggactc ggagtggggg 180

cggtggacag taagtcatga tgttttggtg gtaccacctg gttgaatttc ttcatctgaa 240

taagaagctc ctgtgatgtt ctggggaggc cttggaaggc tagcgcatcc ctcatagaaa 300

gtgaatggga gctacggaca ccgtaccccg ggctcagaga agagcctgct ggacctggac 360

cttgctgagg gccctggccc cacctgctgc cagggcctgt ttctccctgc aggaagccca 420

ccgccccggg ctcaccccca agcttgtgag aggctgctgc atttccccca ccctgacagg 480

tcacctagac cccaggccac gtatgtgaac ggcagcctcc caaccacaca acacatcaaa 540

caggagtcct tgcccgacta ccaagcc atg gca gag gcc cgc aca tcc ctg tct 594

Met Ala Glu Ala Arg Thr Ser Leu Ser

1 5

gcc cac tgt cgg ggc ccg ctg gcc act ggc ctg cac cca gac ctg gac 642

Ala His Cys Arg Gly Pro Leu Ala Thr Gly Leu His Pro Asp Leu Asp

10 15 20 25

ctc ccg ggc cga agc ctc gcc acc cct gcg cct tcc tgc tac ctt ctg 690

Leu Pro Gly Arg Ser Leu Ala Thr Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu

30 35 40

ggc agc gaa ccc agc tct ggc ctg ggc ctc cag ccc gag acc cac ctc 738

Gly Ser Glu Pro Ser Ser Gly Leu Gly Leu Gln Pro Glu Thr His Leu

45 50 55

ccc gag ggc agc ctg aag cgg tgc tgc gtc ttg ggc cta ccc ccc acc 786

Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg Cys Cys Val Leu Gly Leu Pro Pro Thr

60 65 70

tcc cca gcc tcc tcc tca ccc tgt gcc tcc tcc gac gtc acc tcc atc 834

Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Cys Ala Ser Ser Asp Val Thr Ser Ile

75 80 85

atc cgc tcc tcc cag acg tct ctg gtc acc tgt gta aat gga ctc cgg 882

Ile Arg Ser Ser Gln Thr Ser Leu Val Thr Cys Val Asn Gly Leu Arg

90 95 100 105

agc ccc cct ctg acg gga gat ctg ggg ggc cct tcc aag cgg gcc cgg 930

Ser Pro Pro Leu Thr Gly Asp Leu Gly Gly Pro Ser Lys Arg Ala Arg

110 115 120

cct ggc cct gca tcg acg gac agc cat gag ggc agc ttg caa ctt gaa 978

Pro Gly Pro Ala Ser Thr Asp Ser His Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu

125 130 135

gcc tgc cgg aag gcg agc ttc ctg aag cag gaa ccc gcg gat gag ttt 1026

Ala Cys Arg Lys Ala Ser Phe Leu Lys Gln Glu Pro Ala Asp Glu Phe

140 145 150

tca gag ctc ttt ggg cct cac cag cag ggc ctg ccg ccc ccc tat ccc 1074

Ser Glu Leu Phe Gly Pro His Gln Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro

155 160 165

ctg tct cag ttg ccg cct ggc cca agc ctt gga ggc ctg ggg ctg ggc 1122

Leu Ser Gln Leu Pro Pro Gly Pro Ser Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly

170 175 180 185

ctg gca ggc agg gtg gtg gcc ggg cgg cag gcg tgc cgc tgg gtg gac 1170

Leu Ala Gly Arg Val Val Ala Gly Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp

190 195 200

tgc tgt gca gcc tat gag cag cag gag gag ctg gtg cgg cac atc gag 1218

Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln Gln Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu

205 210 215

aag agc cac atc gac cag cgc aag ggc gag gac ttc acc tgc ttc tgg 1266

Lys Ser His Ile Asp Gln Arg Lys Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp

220 225 230

gct ggc tgc gtg cgc cgc tac aag ccc ttc aac gcc cgc tac aag ctg 1314

Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr Lys Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu

235 240 245

ctc atc cac atg cga gtg cac tcg ggc gag aag ccc aac aag tgc atg 1362

Leu Ile His Met Arg Val His Ser Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met

250 255 260 265

ttt gaa ggc tgc agc aag gcc ttc tca cgg ctg gag aac ctc aag atc 1410

Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile

270 275 280

cac ctg agg agc cac acg ggc gag aag ccg tac ctg tgc cag cac ccg 1458

His Leu Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro

285 290 295

ggt tgc cag aag gcc ttc agc aac tcc agc gac cgc gcc aag cac cag 1506

Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser Asn Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln

300 305 310

cgc acc cac cta gac acg aag ccg tac gcc tgt cag atc cct ggc tgc 1554

Arg Thr His Leu Asp Thr Lys Pro Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys

315 320 325

tcc aag cgc tac aca gac ccc agc tcc ctc cgc aag cac gtc aag gcc 1602

Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser Ser Leu Arg Lys His Val Lys Ala

330 335 340 345

cat tca gcc aaa gag cag cag gtg cgt aag aag ctg cat gcg ggc cct 1650

His Ser Ala Lys Glu Gln Gln Val Arg Lys Lys Leu His Ala Gly Pro

350 355 360

gac acc gag gcc gac gtc ctg acc gag tgt ctg gtc ctg cag cag ctc 1698

Asp Thr Glu Ala Asp Val Leu Thr Glu Cys Leu Val Leu Gln Gln Leu

365 370 375

cac acg tcc aca cag ctg gct gcc agc gac ggc aag ggt ggc tgt ggc 1746

His Thr Ser Thr Gln Leu Ala Ala Ser Asp Gly Lys Gly Gly Cys Gly

380 385 390

ctg ggc cag gag ctg ctc cca ggt gtg tat cct ggc tcc atc acc ccc 1794

Leu Gly Gln Glu Leu Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Thr Pro

395 400 405

cat aac gga ctt gca tcg ggc ctc ctg ccc cca gcg cac gac gta cct 1842

His Asn Gly Leu Ala Ser Gly Leu Leu Pro Pro Ala His Asp Val Pro

410 415 420 425

tcc agg cac cac ccg ctg gat gcc acc acc agt tcc cac cac cat ctg 1890

Ser Arg His His Pro Leu Asp Ala Thr Thr Ser Ser His His His Leu

430 435 440

tcc cct ctg ccc atg gct gag agc acc cgg gat ggg ttg ggg ccc ggc 1938

Ser Pro Leu Pro Met Ala Glu Ser Thr Arg Asp Gly Leu Gly Pro Gly

445 450 455

ctc ctc tca cca ata gtc agc ccc ctg aag ggg ctg ggg cca ccg ccg 1986

Leu Leu Ser Pro Ile Val Ser Pro Leu Lys Gly Leu Gly Pro Pro Pro

460 465 470

ctg ccc cca tcc tct cag agc cat tct ccg ggg ggc cag ccc ttc ccc 2034

Leu Pro Pro Ser Ser Gln Ser His Ser Pro Gly Gly Gln Pro Phe Pro

475 480 485

aca ctc ccc agc aag ccg tcc tac cca ccc ttc cag agc cct cca ccc 2082

Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Phe Gln Ser Pro Pro Pro

490 495 500 505

ccg cct ctg ccc agc cca caa ggt tac cag ggc agt ttc cac tcc atc 2130

Pro Pro Leu Pro Ser Pro Gln Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His Ser Ile

510 515 520

cag agt tgc ttc ccc tat ggc gac tgc tac cgg atg gct gaa cca gca 2178

Gln Ser Cys Phe Pro Tyr Gly Asp Cys Tyr Arg Met Ala Glu Pro Ala

525 530 535

gcc ggt ggg gac gga ctg gtc ggg gag acc cac ggt ttc aac ccc ctg 2226

Ala Gly Gly Asp Gly Leu Val Gly Glu Thr His Gly Phe Asn Pro Leu

540 545 550

cgg ccc aat ggc tac cac agc ctc agc acg ccc ttg cct gcc aca ggc 2274

Arg Pro Asn Gly Tyr His Ser Leu Ser Thr Pro Leu Pro Ala Thr Gly

555 560 565

tat gag gcc ctg gct gag gcc tca tgc ccc aca gcg ctg cca cag cag 2322

Tyr Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ser Cys Pro Thr Ala Leu Pro Gln Gln

570 575 580 585

cca tct gaa gat gtg gtg tcc agc ggc ccc gag gac tgt ggc ttc ttc 2370

Pro Ser Glu Asp Val Val Ser Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly Phe Phe

590 595 600

ccc aat gga gcc ttt gac cac tgc ctg ggc cac atc ccc tcc atc tac 2418

Pro Asn Gly Ala Phe Asp His Cys Leu Gly His Ile Pro Ser Ile Tyr

605 610 615

aca gac acc tga aggagccccc acatgcgcct gcccatccag cactgcagat 2470

Thr Asp Thr

620

gccacctcgc ccacctgctg tcgctcccac cctccgtgca cctagcagga gtgccaggcc 2530

acagccggaa cagccaggcc atgacccagg ggagccagcg ctgccacccc acccagcgct 2590

gccagggagc cgccatccga gcttgagctg ggcgcacaga ggtgcccgcc aggatctgtg 2650

gccctgtaac attccctcga tcttgtcttc ccgttcctcc ccgcagtggt tttgaaatca 2710

cagacctcgt gtatataaaa tatgcagaac ttgttttccg ttcccctgcc agttttatat 2770

ttttggtttt acaagaaaaa acattaaaaa ctggaaagga gatgtg 2816

<210> 2

<211> 620

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Ala Glu Ala Arg Thr Ser Leu Ser Ala His Cys Arg Gly Pro Leu

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu His Pro Asp Leu Asp Leu Pro Gly Arg Ser Leu Ala

20 25 30

Thr Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Pro Ser Ser Gly

35 40 45

Leu Gly Leu Gln Pro Glu Thr His Leu Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg

50 55 60

Cys Cys Val Leu Gly Leu Pro Pro Thr Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro

65 70 75 80

Cys Ala Ser Ser Asp Val Thr Ser Ile Ile Arg Ser Ser Gln Thr Ser

85 90 95

Leu Val Thr Cys Val Asn Gly Leu Arg Ser Pro Pro Leu Thr Gly Asp

100 105 110

Leu Gly Gly Pro Ser Lys Arg Ala Arg Pro Gly Pro Ala Ser Thr Asp

115 120 125

Ser His Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Ala Cys Arg Lys Ala Ser Phe

130 135 140

Leu Lys Gln Glu Pro Ala Asp Glu Phe Ser Glu Leu Phe Gly Pro His

145 150 155 160

Gln Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Leu Ser Gln Leu Pro Pro Gly

165 170 175

Pro Ser Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Ala

180 185 190

Gly Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln

195 200 205

Gln Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu Lys Ser His Ile Asp Gln Arg

210 215 220

Lys Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr

225 230 235 240

Lys Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu Leu Ile His Met Arg Val His

245 250 255

Ser Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala

260 265 270

Phe Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile His Leu Arg Ser His Thr Gly

275 280 285

Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser

290 295 300

Asn Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln Arg Thr His Leu Asp Thr Lys

305 310 315 320

Pro Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro

325 330 335

Ser Ser Leu Arg Lys His Val Lys Ala His Ser Ala Lys Glu Gln Gln

340 345 350

Val Arg Lys Lys Leu His Ala Gly Pro Asp Thr Glu Ala Asp Val Leu

355 360 365

Thr Glu Cys Leu Val Leu Gln Gln Leu His Thr Ser Thr Gln Leu Ala

370 375 380

Ala Ser Asp Gly Lys Gly Gly Cys Gly Leu Gly Gln Glu Leu Leu Pro

385 390 395 400

Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Thr Pro His Asn Gly Leu Ala Ser Gly

405 410 415

Leu Leu Pro Pro Ala His Asp Val Pro Ser Arg His His Pro Leu Asp

420 425 430

Ala Thr Thr Ser Ser His His His Leu Ser Pro Leu Pro Met Ala Glu

435 440 445

Ser Thr Arg Asp Gly Leu Gly Pro Gly Leu Leu Ser Pro Ile Val Ser

450 455 460

Pro Leu Lys Gly Leu Gly Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ser Ser Gln Ser

465 470 475 480

His Ser Pro Gly Gly Gln Pro Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser

485 490 495

Tyr Pro Pro Phe Gln Ser Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Pro Gln

500 505 510

Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His Ser Ile Gln Ser Cys Phe Pro Tyr Gly

515 520 525

Asp Cys Tyr Arg Met Ala Glu Pro Ala Ala Gly Gly Asp Gly Leu Val

530 535 540

Gly Glu Thr His Gly Phe Asn Pro Leu Arg Pro Asn Gly Tyr His Ser

545 550 555 560

Leu Ser Thr Pro Leu Pro Ala Thr Gly Tyr Glu Ala Leu Ala Glu Ala

565 570 575

Ser Cys Pro Thr Ala Leu Pro Gln Gln Pro Ser Glu Asp Val Val Ser

580 585 590

Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly Phe Phe Pro Asn Gly Ala Phe Asp His

595 600 605

Cys Leu Gly His Ile Pro Ser Ile Tyr Thr Asp Thr

610 615 620

<210> 3

<211> 2904

<212> DNA

<213> 小家鼠

<220>

<221> CDS

<222> (222)..(2591)

<400> 3

ggggacccag tggcgtccga atccgggagc tctggggtgg cgcggggctc gccgaggggc 60

gaggcgaatt tgggggccct gaggcctcgc tctcgcggga atgatgctgg aaatgatgct 120

gaggctccgg cgtgagactt gcggctgccg gcggagcgga gtgtgagccg gtgaatgggg 180

agcctggcgc gacccccagc cgtgcgcccc gccccggcgc c atg cat tgc gag gtg 236

Met His Cys Glu Val

1 5

gcc gag gca ctt tcg gac aag agg cca aag gag gcc cct ggt gct cct 284

Ala Glu Ala Leu Ser Asp Lys Arg Pro Lys Glu Ala Pro Gly Ala Pro

10 15 20

ggc cag ggc cgc ggg cct gtc agc ctg gga gcg cac atg gcc ttc agg 332

Gly Gln Gly Arg Gly Pro Val Ser Leu Gly Ala His Met Ala Phe Arg

25 30 35

att gct gtg agt ggt ggc ggc tgc ggg gac ggg aac ccg cta gac ctg 380

Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Cys Gly Asp Gly Asn Pro Leu Asp Leu

40 45 50

ctg cct cgg cta ccg gtg cca cca cca cgt gcc cac gat ctc ctt cgg 428

Leu Pro Arg Leu Pro Val Pro Pro Pro Arg Ala His Asp Leu Leu Arg

55 60 65

ccc cgg agc cct cga gac tat ggt gtg tcc aag acc ggc agc ggg aag 476

Pro Arg Ser Pro Arg Asp Tyr Gly Val Ser Lys Thr Gly Ser Gly Lys

70 75 80 85

gtg aac ggg agc tac ggg cac agc tca gag aag agc ctg ctg gac ctg 524

Val Asn Gly Ser Tyr Gly His Ser Ser Glu Lys Ser Leu Leu Asp Leu

90 95 100

gac ctg gcc gag ggt ccc agc ccc tcc tgc cac cag ggt ctg ttt ctt 572

Asp Leu Ala Glu Gly Pro Ser Pro Ser Cys His Gln Gly Leu Phe Leu

105 110 115

cct gca ggg acc cca cca ccc cgg ggt cac ccc cct gtc tgt gag aag 620

Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Arg Gly His Pro Pro Val Cys Glu Lys

120 125 130

ctg ctg cac ttc ccc cac cca aac agg tca ccc aga cct cag gct acg 668

Leu Leu His Phe Pro His Pro Asn Arg Ser Pro Arg Pro Gln Ala Thr

135 140 145

ttt gtg aac ggc agc ctc cca gcc gct cag cac atc aag caa gaa gcc 716

Phe Val Asn Gly Ser Leu Pro Ala Ala Gln His Ile Lys Gln Glu Ala

150 155 160 165

cta ccg gac tac cag gcc atg gtc agc gcc cac aca ccc ctg ccc acc 764

Leu Pro Asp Tyr Gln Ala Met Val Ser Ala His Thr Pro Leu Pro Thr

170 175 180

cac tgc cga gcc cca tcg tcc atg ggt ctg ccc tca gac ctg gac ttt 812

His Cys Arg Ala Pro Ser Ser Met Gly Leu Pro Ser Asp Leu Asp Phe

185 190 195

cca gac cga ggc ctc acc aac cct gca cct tcc tgc tac ctt ctg ggc 860

Pro Asp Arg Gly Leu Thr Asn Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu Gly

200 205 210

aat gaa ccc atc tca gac ctg ggt ccc caa ccc gag gcc cac ctc ccc 908

Asn Glu Pro Ile Ser Asp Leu Gly Pro Gln Pro Glu Ala His Leu Pro

215 220 225

gag ggc agc ctg aaa cgc tgc tgc ctc ctg ggc ctg ccc ccc acc tct 956

Glu Gly Ser Leu Lys Arg Cys Cys Leu Leu Gly Leu Pro Pro Thr Ser

230 235 240 245

tca gcc tcc tcc tca ccc tgt gcc tcc tca gat atc aat cct gtc atc 1004

Ser Ala Ser Ser Ser Pro Cys Ala Ser Ser Asp Ile Asn Pro Val Ile

250 255 260

cac tcc tcc cag aca gct cta gtt agc tgt gta aat gga ctc cga agc 1052

His Ser Ser Gln Thr Ala Leu Val Ser Cys Val Asn Gly Leu Arg Ser

265 270 275

cca cct ctg ccg gga gac ctg ggg ggc cct ccc aag cgg tca cgg ccc 1100

Pro Pro Leu Pro Gly Asp Leu Gly Gly Pro Pro Lys Arg Ser Arg Pro

280 285 290

ggg cct gca tcc agt gac ggc cag gag ggc agc ttg cag ctt gaa gca 1148

Gly Pro Ala Ser Ser Asp Gly Gln Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Ala

295 300 305

tgc cgg aag tca ggc ttc ctg aag cag gag ccc atg gac gag ttt tca 1196

Cys Arg Lys Ser Gly Phe Leu Lys Gln Glu Pro Met Asp Glu Phe Ser

310 315 320 325

gag ctt ttt gct cca cac cac cag ggt ttg cca ccc cct tac ccc ttg 1244

Glu Leu Phe Ala Pro His His Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Leu

330 335 340

cct cag ttg cca act ggc ccc ggc ctc gga ggc cta ggg ctg ggc ctg 1292

Pro Gln Leu Pro Thr Gly Pro Gly Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu

345 350 355

gca ggt agg atg gtt gcc ggt cgg cag gca tgc cgc tgg gtg gac tgc 1340

Ala Gly Arg Met Val Ala Gly Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp Cys

360 365 370

tgc gca gcc tac gag cag cag gag gag ctg gtg cgg cac atc gag aag 1388

Cys Ala Ala Tyr Glu Gln Gln Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu Lys

375 380 385

agc cac atc gac cag cgc aag ggc gaa gac ttc acc tgc ttc tgg gcc 1436

Ser His Ile Asp Gln Arg Lys Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp Ala

390 395 400 405

ggg tgt gtg cgg cgc tac aag ccc ttc aat gcc cgc tac aag ctg ctc 1484

Gly Cys Val Arg Arg Tyr Lys Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu Leu

410 415 420

atc cac atg agg gta cac tca ggc gag aag ccc aac aag tgc atg ttc 1532

Ile His Met Arg Val His Ser Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met Phe

425 430 435

gaa ggc tgc agt aaa gcc ttt tcc cgt ctg gag aac ctg aag atc cat 1580

Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile His

440 445 450

ctg cgg agc cac aca ggc gag aaa cca tac ctg tgc cag cac cca ggc 1628

Leu Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro Gly

455 460 465

tgc cag aag gcc ttc agc aac tcc agc gac cgt gcc aag cac caa cgc 1676

Cys Gln Lys Ala Phe Ser Asn Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln Arg

470 475 480 485

acc cac ctc gac acg aag cca tat gct tgt cag atc cct ggc tgc tcc 1724

Thr His Leu Asp Thr Lys Pro Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys Ser

490 495 500

aag cgc tac acg gac ccc agc tcc ctc cgc aag cac gtg aag gcc cac 1772

Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser Ser Leu Arg Lys His Val Lys Ala His

505 510 515

tca gcc aaa gag cag cag gtg cgt aag aag ctg cac aca ggt gcc gac 1820

Ser Ala Lys Glu Gln Gln Val Arg Lys Lys Leu His Thr Gly Ala Asp

520 525 530

cca gag gct gat gtt ctg tcc gag tgt ctg tcc ctg cag cag ctc caa 1868

Pro Glu Ala Asp Val Leu Ser Glu Cys Leu Ser Leu Gln Gln Leu Gln

535 540 545

gca tcc aca ctg ttg ccg gcc agc aga ggg aag ggc agc caa acc ctg 1916

Ala Ser Thr Leu Leu Pro Ala Ser Arg Gly Lys Gly Ser Gln Thr Leu

550 555 560 565

agc cag gag ctc ctc cca ggt gtg tat cct ggc tcc gtc acc cca caa 1964

Ser Gln Glu Leu Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Ser Val Thr Pro Gln

570 575 580

aac ggg ctt gct tca ggc atc ctg tcc ccc tcc cac gat gtc cct tcc 2012

Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ile Leu Ser Pro Ser His Asp Val Pro Ser

585 590 595

agg cac cac cca ctg gag gtc ccc act ggt tcc cac cac cac ctg tcc 2060

Arg His His Pro Leu Glu Val Pro Thr Gly Ser His His His Leu Ser

600 605 610

cct ctg ccc aca gct gag agc acc agg gat ggc ctg ggg ccc agt ctc 2108

Pro Leu Pro Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asp Gly Leu Gly Pro Ser Leu

615 620 625

ctt tca ccc atg gtc agc cca ctg aag ggg ctt ggt ccc cca ccg cta 2156

Leu Ser Pro Met Val Ser Pro Leu Lys Gly Leu Gly Pro Pro Pro Leu

630 635 640 645

cca cca gcc tcc cag agt cag tct cca ggg gga cag tca ttc tct aca 2204

Pro Pro Ala Ser Gln Ser Gln Ser Pro Gly Gly Gln Ser Phe Ser Thr

650 655 660

gtc ccc agc aag cct acc tac cca tcc ttc caa agc cca cca cct ctg 2252

Val Pro Ser Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Phe Gln Ser Pro Pro Pro Leu

665 670 675

ccc agc ccc caa ggc tac caa ggc agt ttc cat tcc atc cag aac tgc 2300

Pro Ser Pro Gln Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His Ser Ile Gln Asn Cys

680 685 690

ttc ccc tac gct gac tgc tac cgg gcc act gag cca gca gcc tcc agg 2348

Phe Pro Tyr Ala Asp Cys Tyr Arg Ala Thr Glu Pro Ala Ala Ser Arg

695 700 705

gat gga ctg gtg ggt gat gcc cac ggt ttc aac ccc ttg cga ccc agc 2396

Asp Gly Leu Val Gly Asp Ala His Gly Phe Asn Pro Leu Arg Pro Ser

710 715 720 725

aca tac tcc agc ctc agc aca cct tta tcc gca cca ggc tac gag acc 2444

Thr Tyr Ser Ser Leu Ser Thr Pro Leu Ser Ala Pro Gly Tyr Glu Thr

730 735 740

ctg gca gaa acg ccg tgt ccc cca gcg ctg cag cca cag cca gct gaa 2492

Leu Ala Glu Thr Pro Cys Pro Pro Ala Leu Gln Pro Gln Pro Ala Glu

745 750 755

gac ctg gta cct agt ggt cct gag gac tgt ggc ttc ttc ccc aat ggg 2540

Asp Leu Val Pro Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly Phe Phe Pro Asn Gly

760 765 770

gcc ttt gac cac tgt ctg agt cac atc ccg tcc atc tac act gac acc 2588

Ala Phe Asp His Cys Leu Ser His Ile Pro Ser Ile Tyr Thr Asp Thr

775 780 785

tga aggaaggggc gctgctctgc ctgcctgcct ggctcctgag ctacttcacc 2641

tacctgccat ctgctggtgc ttcccacacg gggcagcaag gccacaccac agggtacttc 2701

cctacctgga gggctgtctg gtccagagct gcctgccagg agctatggcc ctctgacagc 2761

cccatggctg tgtcttcctc tctctccata aggttctcaa atcacagacc tcgtgtatat 2821

acaatgtaca ggacctcttt tccgccgccc tgcaagtttt atatttttgg ttttacaaga 2881

aaaacattaa aaactggaaa cta 2904

<210> 4

<211> 789

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 4

Met His Cys Glu Val Ala Glu Ala Leu Ser Asp Lys Arg Pro Lys Glu

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ala Pro Gly Gln Gly Arg Gly Pro Val Ser Leu Gly Ala

20 25 30

His Met Ala Phe Arg Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Cys Gly Asp Gly

35 40 45

Asn Pro Leu Asp Leu Leu Pro Arg Leu Pro Val Pro Pro Pro Arg Ala

50 55 60

His Asp Leu Leu Arg Pro Arg Ser Pro Arg Asp Tyr Gly Val Ser Lys

65 70 75 80

Thr Gly Ser Gly Lys Val Asn Gly Ser Tyr Gly His Ser Ser Glu Lys

85 90 95

Ser Leu Leu Asp Leu Asp Leu Ala Glu Gly Pro Ser Pro Ser Cys His

100 105 110

Gln Gly Leu Phe Leu Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Arg Gly His Pro

115 120 125

Pro Val Cys Glu Lys Leu Leu His Phe Pro His Pro Asn Arg Ser Pro

130 135 140

Arg Pro Gln Ala Thr Phe Val Asn Gly Ser Leu Pro Ala Ala Gln His

145 150 155 160

Ile Lys Gln Glu Ala Leu Pro Asp Tyr Gln Ala Met Val Ser Ala His

165 170 175

Thr Pro Leu Pro Thr His Cys Arg Ala Pro Ser Ser Met Gly Leu Pro

180 185 190

Ser Asp Leu Asp Phe Pro Asp Arg Gly Leu Thr Asn Pro Ala Pro Ser

195 200 205

Cys Tyr Leu Leu Gly Asn Glu Pro Ile Ser Asp Leu Gly Pro Gln Pro

210 215 220

Glu Ala His Leu Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg Cys Cys Leu Leu Gly

225 230 235 240

Leu Pro Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Cys Ala Ser Ser Asp

245 250 255

Ile Asn Pro Val Ile His Ser Ser Gln Thr Ala Leu Val Ser Cys Val

260 265 270

Asn Gly Leu Arg Ser Pro Pro Leu Pro Gly Asp Leu Gly Gly Pro Pro

275 280 285

Lys Arg Ser Arg Pro Gly Pro Ala Ser Ser Asp Gly Gln Glu Gly Ser

290 295 300

Leu Gln Leu Glu Ala Cys Arg Lys Ser Gly Phe Leu Lys Gln Glu Pro

305 310 315 320

Met Asp Glu Phe Ser Glu Leu Phe Ala Pro His His Gln Gly Leu Pro

325 330 335

Pro Pro Tyr Pro Leu Pro Gln Leu Pro Thr Gly Pro Gly Leu Gly Gly

340 345 350

Leu Gly Leu Gly Leu Ala Gly Arg Met Val Ala Gly Arg Gln Ala Cys

355 360 365

Arg Trp Val Asp Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln Gln Glu Glu Leu Val

370 375 380

Arg His Ile Glu Lys Ser His Ile Asp Gln Arg Lys Gly Glu Asp Phe

385 390 395 400

Thr Cys Phe Trp Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr Lys Pro Phe Asn Ala

405 410 415

Arg Tyr Lys Leu Leu Ile His Met Arg Val His Ser Gly Glu Lys Pro

420 425 430

Asn Lys Cys Met Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe Ser Arg Leu Glu

435 440 445

Asn Leu Lys Ile His Leu Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu

450 455 460

Cys Gln His Pro Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser Asn Ser Ser Asp Arg

465 470 475 480

Ala Lys His Gln Arg Thr His Leu Asp Thr Lys Pro Tyr Ala Cys Gln

485 490 495

Ile Pro Gly Cys Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser Ser Leu Arg Lys

500 505 510

His Val Lys Ala His Ser Ala Lys Glu Gln Gln Val Arg Lys Lys Leu

515 520 525

His Thr Gly Ala Asp Pro Glu Ala Asp Val Leu Ser Glu Cys Leu Ser

530 535 540

Leu Gln Gln Leu Gln Ala Ser Thr Leu Leu Pro Ala Ser Arg Gly Lys

545 550 555 560

Gly Ser Gln Thr Leu Ser Gln Glu Leu Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly

565 570 575

Ser Val Thr Pro Gln Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ile Leu Ser Pro Ser

580 585 590

His Asp Val Pro Ser Arg His His Pro Leu Glu Val Pro Thr Gly Ser

595 600 605

His His His Leu Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asp Gly

610 615 620

Leu Gly Pro Ser Leu Leu Ser Pro Met Val Ser Pro Leu Lys Gly Leu

625 630 635 640

Gly Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ala Ser Gln Ser Gln Ser Pro Gly Gly

645 650 655

Gln Ser Phe Ser Thr Val Pro Ser Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Phe Gln

660 665 670

Ser Pro Pro Pro Leu Pro Ser Pro Gln Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His

675 680 685

Ser Ile Gln Asn Cys Phe Pro Tyr Ala Asp Cys Tyr Arg Ala Thr Glu

690 695 700

Pro Ala Ala Ser Arg Asp Gly Leu Val Gly Asp Ala His Gly Phe Asn

705 710 715 720

Pro Leu Arg Pro Ser Thr Tyr Ser Ser Leu Ser Thr Pro Leu Ser Ala

725 730 735

Pro Gly Tyr Glu Thr Leu Ala Glu Thr Pro Cys Pro Pro Ala Leu Gln

740 745 750

Pro Gln Pro Ala Glu Asp Leu Val Pro Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly

755 760 765

Phe Phe Pro Asn Gly Ala Phe Asp His Cys Leu Ser His Ile Pro Ser

770 775 780

Ile Tyr Thr Asp Thr

785

<210> 5

<211> 2949

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (595)..(2034)

<400> 5

agtttcccga ccagagagaa cgaacgtgtc tgcgggcgcg cggggagcag aggcggtggc 60

gggcggcggc ggcaccggga gccgccgagt gaccctcccc cgcccctctg gccccccacc 120

ctcccacccg cccgtggccc gcgcccatgg ccgcgcgcgc tccacacaac tcaccggagt 180

ccgcgccttg cgccgccgac cagttcgcag ctccgcgcca cggcagccag tctcacctgg 240

cggcaccgcc cgcccaccgc cccggccaca gcccctgcgc ccacggcagc actcgaggcg 300

accgcgacag tggtggggga cgctgctgag tggaagagag cgcagcccgg ccaccggacc 360

tacttactcg ccttgctgat tgtctatttt tgcgtttaca acttttctaa gaacttttgt 420

atacaaagga actttttaaa aaagacgctt ccaagttata tttaatccaa agaagaagga 480

tctcggccaa tttggggttt tgggttttgg cttcgtttct tctcttcgtt gactttgggg 540

ttcaggtgcc ccagctgctt cgggctgccg aggaccttct gggcccccac atta atg 597

Met

1

agg cag cca cct ggc gag tct gac atg gct gtc agc gac gcg ctg ctc 645

Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ser Asp Met Ala Val Ser Asp Ala Leu Leu

5 10 15

cca tct ttc tcc acg ttc gcg tct ggc ccg gcg gga agg gag aag aca 693

Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys Thr

20 25 30

ctg cgt caa gca ggt gcc ccg aat aac cgc tgg cgg gag gag ctc tcc 741

Leu Arg Gln Ala Gly Ala Pro Asn Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu Ser

35 40 45

cac atg aag cga ctt ccc cca gtg ctt ccc ggc cgc ccc tat gac ctg 789

His Met Lys Arg Leu Pro Pro Val Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu

50 55 60 65

gcg gcg gcg acc gtg gcc aca gac ctg gag agc ggc gga gcc ggt gcg 837

Ala Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala

70 75 80

gct tgc ggc ggt agc aac ctg gcg ccc cta cct cgg aga gag acc gag 885

Ala Cys Gly Gly Ser Asn Leu Ala Pro Leu Pro Arg Arg Glu Thr Glu

85 90 95

gag ttc aac gat ctc ctg gac ctg gac ttt att ctc tcc aat tcg ctg 933

Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu

100 105 110

acc cat cct ccg gag tca gtg gcc gcc acc gtg tcc tcg tca gcg tca 981

Thr His Pro Pro Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Ser Ser Ser Ala Ser

115 120 125

gcc tcc tct tcg tcg tcg ccg tcg agc agc ggc cct gcc agc gcg ccc 1029

Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro

130 135 140 145

tcc acc tgc agc ttc acc tat ccg atc cgg gcc ggg aac gac ccg ggc 1077

Ser Thr Cys Ser Phe Thr Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Asn Asp Pro Gly

150 155 160

gtg gcg ccg ggc ggc acg ggc gga ggc ctc ctc tat ggc agg gag tcc 1125

Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Arg Glu Ser

165 170 175

gct ccc cct ccg acg gct ccc ttc aac ctg gcg gac atc aac gac gtg 1173

Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val

180 185 190

agc ccc tcg ggc ggc ttc gtg gcc gag ctc ctg cgg cca gaa ttg gac 1221

Ser Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp

195 200 205

ccg gtg tac att ccg ccg cag cag ccg cag ccg cca ggt ggc ggg ctg 1269

Pro Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu

210 215 220 225

atg ggc aag ttc gtg ctg aag gcg tcg ctg agc gcc cct ggc agc gag 1317

Met Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ser Glu

230 235 240

tac ggc agc ccg tcg gtc atc agc gtc agc aaa ggc agc cct gac ggc 1365

Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly

245 250 255

agc cac ccg gtg gtg gtg gcg ccc tac aac ggc ggg ccg ccg cgc acg 1413

Ser His Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Arg Thr

260 265 270

tgc ccc aag atc aag cag gag gcg gtc tct tcg tgc acc cac ttg ggc 1461

Cys Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Ser Ser Cys Thr His Leu Gly

275 280 285

gct gga ccc cct ctc agc aat ggc cac cgg ccg gct gca cac gac ttc 1509

Ala Gly Pro Pro Leu Ser Asn Gly His Arg Pro Ala Ala His Asp Phe

290 295 300 305

ccc ctg ggg cgg cag ctc ccc agc agg act acc ccg acc ctg ggt ctt 1557

Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Ser Arg Thr Thr Pro Thr Leu Gly Leu

310 315 320

gag gaa gtg ctg agc agc agg gac tgt cac cct gcc ctg ccg ctt cct 1605

Glu Glu Val Leu Ser Ser Arg Asp Cys His Pro Ala Leu Pro Leu Pro

325 330 335

ccc ggc ttc cat ccc cac ccg ggg ccc aat tac cca tcc ttc ctg ccc 1653

Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn Tyr Pro Ser Phe Leu Pro

340 345 350

gat cag atg cag ccg caa gtc ccg ccg ctc cat tac caa gag ctc atg 1701

Asp Gln Met Gln Pro Gln Val Pro Pro Leu His Tyr Gln Glu Leu Met

355 360 365

cca ccc ggt tcc tgc atg cca gag gag ccc aag cca aag agg gga aga 1749

Pro Pro Gly Ser Cys Met Pro Glu Glu Pro Lys Pro Lys Arg Gly Arg

370 375 380 385

cga tcg tgg ccc cgg aaa agg acc gcc acc cac act tgt gat tac gcg 1797

Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala Thr His Thr Cys Asp Tyr Ala

390 395 400

ggc tgc ggc aaa acc tac aca aag agt tcc cat ctc aag gca cac ctg 1845

Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu

405 410 415

cga acc cac aca ggt gag aaa cct tac cac tgt gac tgg gac ggc tgt 1893

Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys

420 425 430

gga tgg aaa ttc gcc cgc tca gat gaa ctg acc agg cac tac cgt aaa 1941

Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys

435 440 445

cac acg ggg cac cgc ccg ttc cag tgc caa aaa tgc gac cga gca ttt 1989

His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln Cys Gln Lys Cys Asp Arg Ala Phe

450 455 460 465

tcc agg tcg gac cac ctc gcc tta cac atg aag agg cat ttt taa 2034

Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Phe

470 475

atcccagaca gtggatatga cccacactgc cagaagagaa ttcagtattt tttacttttc 2094

acactgtctt cccgatgagg gaaggagccc agccagaaag cactacaatc atggtcaagt 2154

tcccaactga gtcatcttgt gagtggataa tcaggaaaaa tgaggaatcc aaaagacaaa 2214

aatcaaagaa cagatggggt ctgtgactgg atcttctatc attccaattc taaatccgac 2274

ttgaatattc ctggacttac aaaatgccaa gggggtgact ggaagttgtg gatatcaggg 2334

tataaattat atccgtgagt tgggggaggg aagaccagaa ttcccttgaa ttgtgtattg 2394

atgcaatata agcataaaag atcaccttgt attctcttta ccttctaaaa gccattatta 2454

tgatgttaga agaagaggaa gaaattcagg tacagaaaac atgtttaaat agcctaaatg 2514

atggtgcttg gtgagtcttg gttctaaagg taccaaacaa ggaagccaaa gttttcaaac 2574

tgctgcatac tttgacaagg aaaatctata tttgtcttcc gatcaacatt tatgacctaa 2634

gtcaggtaat atacctggtt tacttcttta gcatttttat gcagacagtc tgttatgcac 2694

tgtggtttca gatgtgcaat aatttgtaca atggtttatt cccaagtatg ccttaagcag 2754

aacaaatgtg tttttctata tagttccttg ccttaataaa tatgtaatat aaatttaagc 2814

aaacgtctat tttgtatatt tgtaaactac aaagtaaaat gaacattttg tggagtttgt 2874

attttgcata ctcaaggtga gaattaagtt ttaaataaac ctataatatt ttatctgaaa 2934

aaaaaaaaaa aaaaa 2949

<210> 6

<211> 479

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ser Asp Met Ala Val Ser Asp Ala Leu

1 5 10 15

Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys

20 25 30

Thr Leu Arg Gln Ala Gly Ala Pro Asn Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu

35 40 45

Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Val Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp

50 55 60

Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly

65 70 75 80

Ala Ala Cys Gly Gly Ser Asn Leu Ala Pro Leu Pro Arg Arg Glu Thr

85 90 95

Glu Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser

100 105 110

Leu Thr His Pro Pro Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Ser Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala

130 135 140

Pro Ser Thr Cys Ser Phe Thr Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Asn Asp Pro

145 150 155 160

Gly Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Arg Glu

165 170 175

Ser Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp

180 185 190

Val Ser Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu

195 200 205

Asp Pro Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly

210 215 220

Leu Met Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ser

225 230 235 240

Glu Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp

245 250 255

Gly Ser His Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Arg

260 265 270

Thr Cys Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Ser Ser Cys Thr His Leu

275 280 285

Gly Ala Gly Pro Pro Leu Ser Asn Gly His Arg Pro Ala Ala His Asp

290 295 300

Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Ser Arg Thr Thr Pro Thr Leu Gly

305 310 315 320

Leu Glu Glu Val Leu Ser Ser Arg Asp Cys His Pro Ala Leu Pro Leu

325 330 335

Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn Tyr Pro Ser Phe Leu

340 345 350

Pro Asp Gln Met Gln Pro Gln Val Pro Pro Leu His Tyr Gln Glu Leu

355 360 365

Met Pro Pro Gly Ser Cys Met Pro Glu Glu Pro Lys Pro Lys Arg Gly

370 375 380

Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala Thr His Thr Cys Asp Tyr

385 390 395 400

Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His

405 410 415

Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly

420 425 430

Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg

435 440 445

Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln Cys Gln Lys Cys Asp Arg Ala

450 455 460

Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Phe

465 470 475

<210> 7

<211> 3057

<212> DNA

<213> 小家鼠

<220>

<221> CDS

<222> (605)..(2056)

<400> 7

agttccccgg ccaagagagc gagcgcggct ccgggcgcgc ggggagcaga ggcggtggcg 60

ggcggcggcg gcacccggag ccgccgagtg cccctccccg cccctccagc cccccaccca 120

gcaacccgcc cgtgacccgc gcccatggcc gcgcgcaccc ggcacagtcc ccaggactcc 180

gcaccccgcg ccaccgccca gctcgcagtt ccgcgccacc gcggccattc tcacctggcg 240

gcgccgcccg cccaccgccc ggaccacagc ccccgcgccg ccgacagcca cagtggccgc 300

gacaacggtg ggggacactg ctgagtccaa gagcgtgcag cctggccatc ggacctactt 360

atctgccttg ctgattgtct atttttataa gagtttacaa cttttctaag aatttttgta 420

tacaaaggaa cttttttaaa gacatcgccg gtttatattg aatccaaaga agaaggatct 480

cgggcaatct gggggttttg gtttgaggtt ttgtttctaa agtttttaat cttcgttgac 540

tttggggctc aggtacccct ctctcttctt cggactccgg aggaccttct gggcccccac 600

atta atg agg cag cca cct ggc gag tct gac atg gct gtc agc gac gct 649

Met Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ser Asp Met Ala Val Ser Asp Ala

1 5 10 15

ctg ctc ccg tcc ttc tcc acg ttc gcg tcc ggc ccg gcg gga agg gag 697

Leu Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu

20 25 30

aag aca ctg cgt cca gca ggt gcc ccg act aac cgt tgg cgt gag gaa 745

Lys Thr Leu Arg Pro Ala Gly Ala Pro Thr Asn Arg Trp Arg Glu Glu

35 40 45

ctc tct cac atg aag cga ctt ccc cca ctt ccc ggc cgc ccc tac gac 793

Leu Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp

50 55 60

ctg gcg gcg acg gtg gcc aca gac ctg gag agt ggc gga gct ggt gca 841

Leu Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala

65 70 75

gct tgc agc agt aac aac ccg gcc ctc cta gcc cgg agg gag acc gag 889

Ala Cys Ser Ser Asn Asn Pro Ala Leu Leu Ala Arg Arg Glu Thr Glu

80 85 90 95

gag ttc aac gac ctc ctg gac cta gac ttt atc ctt tcc aac tcg cta 937

Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu

100 105 110

acc cac cag gaa tcg gtg gcc gcc acc gtg acc acc tcg gcg tca gct 985

Thr His Gln Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Thr Thr Ser Ala Ser Ala

115 120 125

tca tcc tcg tct tcc ccg gcg agc agc ggc cct gcc agc gcg ccc tcc 1033

Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro Ser

130 135 140

acc tgc agc ttc agc tat ccg atc cgg gcc ggg ggt gac ccg ggc gtg 1081

Thr Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Gly Asp Pro Gly Val

145 150 155

gct gcc agc aac aca ggt gga ggg ctc ctc tac agc cga gaa tct gcg 1129

Ala Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Ser Arg Glu Ser Ala

160 165 170 175

cca cct ccc acg gcc ccc ttc aac ctg gcg gac atc aat gac gtg agc 1177

Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val Ser

180 185 190

ccc tcg ggc ggc ttc gtg gct gag ctc ctg cgg ccg gag ttg gac cca 1225

Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp Pro

195 200 205

gta tac att ccg cca cag cag cct cag ccg cca ggt ggc ggg ctg atg 1273

Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu Met

210 215 220

ggc aag ttt gtg ctg aag gcg tct ctg acc acc cct ggc agc gag tac 1321

Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Thr Thr Pro Gly Ser Glu Tyr

225 230 235

agc agc cct tcg gtc atc agt gtt agc aaa gga agc cca gac ggc agc 1369

Ser Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly Ser

240 245 250 255

cac ccc gtg gta gtg gcg ccc tac agc ggt ggc ccg ccg cgc atg tgc 1417

His Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Pro Pro Arg Met Cys

260 265 270

ccc aag att aag caa gag gcg gtc ccg tcc tgc acg gtc agc cgg tcc 1465

Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Pro Ser Cys Thr Val Ser Arg Ser

275 280 285

cta gag gcc cat ttg agc gct gga ccc cag ctc agc aac ggc cac cgg 1513

Leu Glu Ala His Leu Ser Ala Gly Pro Gln Leu Ser Asn Gly His Arg

290 295 300

ccc aac aca cac gac ttc ccc ctg ggg cgg cag ctc ccc acc agg act 1561

Pro Asn Thr His Asp Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Thr Arg Thr

305 310 315

acc cct aca ctg agt ccc gag gaa ctg ctg aac agc agg gac tgt cac 1609

Thr Pro Thr Leu Ser Pro Glu Glu Leu Leu Asn Ser Arg Asp Cys His

320 325 330 335

cct ggc ctg cct ctt ccc cca gga ttc cat ccc cat ccg ggg ccc aac 1657

Pro Gly Leu Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn

340 345 350

tac cct cct ttc ctg cca gac cag atg cag tca caa gtc ccc tct ctc 1705

Tyr Pro Pro Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Ser Gln Val Pro Ser Leu

355 360 365

cat tat caa gag ctc atg cca ccg ggt tcc tgc ctg cca gag gag ccc 1753

His Tyr Gln Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Leu Pro Glu Glu Pro

370 375 380

aag cca aag agg gga aga agg tcg tgg ccc cgg aaa aga aca gcc acc 1801

Lys Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala Thr

385 390 395

cac act tgt gac tat gca ggc tgt ggc aaa acc tat acc aag agt tct 1849

His Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser

400 405 410 415

cat ctc aag gca cac ctg cga act cac aca ggc gag aaa cct tac cac 1897

His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His

420 425 430

tgt gac tgg gac ggc tgt ggg tgg aaa ttc gcc cgc tcc gat gaa ctg 1945

Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu

435 440 445

acc agg cac tac cgc aaa cac aca ggg cac cgg ccc ttt cag tgc cag 1993

Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln Cys Gln

450 455 460

aag tgt gac agg gcc ttt tcc agg tcg gac cac ctt gcc tta cac atg 2041

Lys Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met

465 470 475

aag agg cac ttt taa atcccacgta gtggatgtga cccacactgc caggagagag 2096

Lys Arg His Phe

480

agttcagtat ttttttttct aacctttcac actgtcttcc cacgagggga ggagcccagc 2156

tggcaagcgc tacaatcatg gtcaagttcc cagcaagtca gcttgtgaat ggataatcag 2216

gagaaaggaa gagttcaaga gacaaaacag aaatactaaa aacaaacaaa caaaaaaaca 2276

aacaaaaaaa acaagaaaaa aaaatcacag aacagatggg gtctgatact ggatggatct 2336

tctatcattc caataccaaa tccaacttga acatgcccgg acttacaaaa tgccaagggg 2396

tgactggaag tttgtggata tcagggtata cactaaatca gtgagcttgg ggggagggaa 2456

gaccaggatt cccttgaatt gtgtttcgat gatgcaatac acacgtaaag atcaccttgt 2516

atgctctttg ccttcttaaa aaaaaaaaaa gccattattg tgtcggagga agaggaagcg 2576

attcaggtac agaacatgtt ctaacagcct aaatgatggt gcttggtgag tcgtggttct 2636

aaaggtacca aacgggggag ccaaagttct ccaactgctg catacttttg acaaggaaaa 2696

tctagttttg tcttccgatc tacattgatg acctaagcca ggtaaataag cctggtttat 2756

ttctgtaaca tttttatgca gacagtctgt tatgcactgt ggtttcagat gtgcaataat 2816

ttgtacaatg gtttattccc aagtatgcct ttaagcagaa caaatgtgtt tttctatata 2876

gttccttgcc ttaataaata tgtaatataa atttaagcaa acttctattt tgtatatttg 2936

taaactacaa agtaaaaaaa aatgaacatt ttgtggagtt tgtattttgc atactcaagg 2996

tgagaaataa gttttaaata aacctataat attttatctg aacgacaaaa aaaaaaaaaa 3056

a 3057

<210> 8

<211> 483

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 8

Met Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ser Asp Met Ala Val Ser Asp Ala Leu

1 5 10 15

Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys

20 25 30

Thr Leu Arg Pro Ala Gly Ala Pro Thr Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu

35 40 45

Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu

50 55 60

Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala Ala

65 70 75 80

Cys Ser Ser Asn Asn Pro Ala Leu Leu Ala Arg Arg Glu Thr Glu Glu

85 90 95

Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu Thr

100 105 110

His Gln Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Thr Thr Ser Ala Ser Ala Ser

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro Ser Thr

130 135 140

Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Gly Asp Pro Gly Val Ala

145 150 155 160

Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Ser Arg Glu Ser Ala Pro

165 170 175

Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val Ser Pro

180 185 190

Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp Pro Val

195 200 205

Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu Met Gly

210 215 220

Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Thr Thr Pro Gly Ser Glu Tyr Ser

225 230 235 240

Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly Ser His

245 250 255

Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Pro Pro Arg Met Cys Pro

260 265 270

Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Pro Ser Cys Thr Val Ser Arg Ser Leu

275 280 285

Glu Ala His Leu Ser Ala Gly Pro Gln Leu Ser Asn Gly His Arg Pro

290 295 300

Asn Thr His Asp Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Thr Arg Thr Thr

305 310 315 320

Pro Thr Leu Ser Pro Glu Glu Leu Leu Asn Ser Arg Asp Cys His Pro

325 330 335

Gly Leu Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn Tyr

340 345 350

Pro Pro Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Ser Gln Val Pro Ser Leu His

355 360 365

Tyr Gln Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Leu Pro Glu Glu Pro Lys

370 375 380

Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala Thr His

385 390 395 400

Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His

405 410 415

Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys

420 425 430

Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr

435 440 445

Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln Cys Gln Lys

450 455 460

Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met Lys

465 470 475 480

Arg His Phe

<210> 9

<211> 81

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒

<400> 9

aaaattgtcg ctcctgtcaa acaaactctt aactttgatt tactcaaact ggctggggat 60

gtagaaagca atccaggtcc a 81

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 噬菌体P1

<400> 10

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变型loxP (lox71)序列

<400> 11

taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变型loxP (lox66)序列

<400> 12

ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA

<400> 13

ggcctcacca accctgcacc t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA

<400> 14

gcccttcaat gcccgctaca a 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA

<400> 15

gggcaatgaa cccatctcag a 21

Claims

1.一种改善iPS细胞建立效率的方法，其包括使下述(1)、(2)、(3)和(4)与体细胞接触：

(1)GLIS家族锌指1(GLIS1)或编码其的核酸，

(2)Oct3/4或编码其的核酸，

(3)Klf1、Klf2、Klf4或Klf5，或编码其的核酸，和

(4)Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox17，或编码其的核酸。

2.根据权利要求1的方法，进一步包括接触以下(5)-(7)的一种或多种物质：

(5)c-Myc、L-Myc或N-Myc，或编码其的核酸，

(6)Lin28或Lin28b，或编码其的核酸，或

(7)Nanog或编码其的核酸。

3.一种产生iPS细胞的方法，其包括使下述(1)、(2)、(3)和(4)与体细胞接触：

(1)GLIS1或编码其的核酸，

(2)Oct3/4或编码其的核酸，

(3)Klf1、Klf2、Klf4或Klf5，或编码其的核酸，和

(4)Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox17，或编码其的核酸。

4.根据权利要求3的方法，进一步包括接触以下(5)-(7)的一种或多种物质：

(5)c-Myc、L-Myc或N-Myc，或编码其的核酸，

(6)Lin28或Lin28b，或编码其的核酸，或

(7)Nanog或编码其的核酸。

5.一种用于从体细胞诱导iPS细胞的试剂，其包括下述(1)、(2)、(3)和(4)：

(1)GLIS1或编码其的核酸，

(2)Oct3/4或编码其的核酸，

(3)Klf1、Klf2、Klf4或Klf5，或编码其的核酸，和

(4)Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox17，或编码其的核酸。

6.根据权利要求5的试剂，进一步包含以下(5)-(7)的一种或多种物质：

(5)c-Myc、L-Myc或N-Myc，或编码其的核酸，

(6)Lin28或Lin28b，或编码其的核酸，或

(7)Nanog或编码其的核酸。

7.一种iPS细胞，其包含下述(1)-(4)：

(1)编码GLIS1的外源核酸，

(2)编码Oct3/4的外源核酸，

(3)编码Klf1、Klf2、Klf4或Klf5的外源核酸，和

(4)编码Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox17的外源核酸。

8.根据权利要求7的iPS细胞，其中将所述外源核酸整合到基因组中。

9.一种产生体细胞的方法，其包括处理根据权利要求7或8的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞。

10.一种产生体细胞的方法，其包括下述(1)和(2)：

(1)通过根据权利要求2的方法产生iPS细胞的步骤，和

(2)处理通过上文的步骤(1)获得的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞的步骤。

11.下述(1)、(2)、(3)和(4)产生iPS细胞的用途：

(1)GLIS1或编码其的核酸，

(2)Oct3/4或编码其的核酸，

(3)Klf1、Klf2、Klf4或Klf5，或编码其的核酸，和

(4)Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox17，或编码其的核酸。

12.根据权利要求7或8的iPS细胞在产生体细胞中的用途。