CN105916980A

CN105916980A - 用于改进诱导多能干细胞的效率的方法

Info

Publication number: CN105916980A
Application number: CN201480062307.2A
Authority: CN
Inventors: 伴浩志; 饭田章博; 长谷川护
Original assignee: Dnavec Corp
Current assignee: Dnavec Corp
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2016-08-31
Also published as: DK3050961T3; AU2014324233A1; JPWO2015046229A1; EP3050961B1; EP3050961A4; EP3050961A1; JP6543194B2; US20160215270A1; WO2015046229A1; AU2014324233A2; AU2014324233B2; US10975358B2

Abstract

本发明提供用于改进诱导多能干细胞的效率的方法，以及用于其中的载体和组合物。在包括导入依次含有KLF基因，OCT基因，和SOX基因的载体的步骤的多能干细胞诱导中，通过进一步导入含有KLF基因但不含OCT基因和SOX基因的载体，成功显著提高多能干细胞诱导的效率。本发明的方法具有极好的特征，因为它们允许在与生理学环境较近的温度条件下有效诱导多能干细胞，以及多能干细胞诱导后载体的迅速去除。本发明使得能够更有效地诱导多能干细胞。

Description

用于改进诱导多能干细胞的效率的方法

技术领域

本发明涉及用于改进多能干细胞的诱导效率的方法。此外，本发明涉及用于多能干细胞的诱导中的基因投递载体和基因投递组合物，以及它们的用途。具体地，本发明涉及用于在多能干细胞的诱导中提高诱导多能干细胞的效率的技术，所述多能干细胞的诱导包括导入载体的步骤，所述载体在一个载体中依次含有KLF基因，OCT基因和SOX基因。

背景技术

自从由体细胞诱导多能干细胞(诱导的多能干细胞(iPS)细胞；又称“人工多能干细胞”或“诱导多能干细胞”)被报道以来(非专利文献1)，已经通过将重编程因子导入到多种哺乳动物细胞，包括人和小鼠细胞中来产生iPS细胞(非专利文献1至9)。它们中的许多使用逆转录病毒来导入重编程因子。然而，由于逆转录病毒具有由于整合入宿主基因组而致瘤的风险，它们的用途受到限制(非专利文献3)。为了解决这个问题，人们已经尝试了利用腺病毒来诱导iPS细胞，但是只要使用DNA型载体，就不可能完全消除整合到基因组中的担忧。此外，这些载体的iPS细胞诱导效率极低(非专利文献10至13)。

为了解决这些问题，本发明人先前开发了一种利用RNA型病毒仙台病毒载体来诱导iPS细胞的系统(专利文献1和2)。利用仙台病毒载体的iPS细胞诱导效率显著高于使用其他载体的先前案例。由于仙台病毒在其生命周期中不具有DNA期，且因此它们没有整合到宿主基因组中的担忧，它们就安全性而言是极为优越的。而且，所述载体在iPS细胞诱导后可以容易地去除。然而，用于进一步提高iPS细胞诱导效率的本发明的技术尚属未知。

现有技术文献

[专利文献]

[专利文献1]国际公布WO 2010/008054

[专利文献2]国际公布WO 2012/029770

[非专利文献]

[非专利文献1]Takahashi,K.and Yamanaka,S.(2006)Cell 126,663-676

[非专利文献2]Maherali,N.et al.,(2007)Cell Stem Cell 1,55-70

[非专利文献3]Okita,K.et al.,(2007)Nature 448,313-317

[非专利文献4]Wernig,M.et al.,(2007)Nature 448,318-324

[非专利文献5]Takahashi,K.et.al.,(2007)Cell 131,861-872

[非专利文献6]Yu,J.et al.,(2007)Science 318,1917-1920

[非专利文献7]Lowry,W.E.et al.,(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,2883-2888

[非专利文献8]Park,I.H.et al.,(2008)Nature 451,141-146

[非专利文献9]Masaki,H.et al.,(2008)Stem Cell Res.1,105-115

[非专利文献10]Stadtfeld,M.et al.,(2008)Science 322,945-949

[非专利文献11]Okita,K.et al.,(2008)Science 322,949-953

[非专利文献12]Yu,J.et al.,(2009)Science 324,797-801

[非专利文献13]Zhou,W.etal.,(2009)stem cells 27,2667-2674

发明简述

本发明要解决的问题

本发明涉及用于改进多能干细胞的诱导效率的方法。此外，本发明的一个目的是提供在多能干细胞的诱导中使用的基因投递载体和基因投递组合物，及其用途。具体地说，本发明的一个目的是提供在多能干细胞的诱导中提高诱导多能干细胞的效率的方法，和其中使用的基因投递载体和组合物，所述多能干细胞的诱导包括导入载体的步骤，所述载体在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因。

解决问题的手段

本发明人探求在多能干细胞的诱导中，用于进一步提高诱导多能干细胞的效率的方法，所述多能干细胞的诱导包括导入载体的步骤，所述载体在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因(即，重编程因子)。具体地，当温度敏感型载体用作诱导多能干细胞的载体时，虽然在载体导入后在低温(36℃)下培养时以相对高的效率诱导多能干细胞，但是如果它们在37℃的标准细胞培养温度下培养时，多能干细胞的诱导效率可能显著下降。虽然温度敏感型载体由于该载体可以在多能干细胞的诱导后迅速的去除而是优越的，但是问题是为了有效地诱导此类多能干细胞，在载体导入后在低温下培养是必要的。

本发明人在能够以高效率诱导多能干细胞的方法方面进行了专注的研究，该方法通过使用温度敏感型仙台病毒载体，并且在载体导入后不在低温下培养进行。作为结果，发现了在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体的引入中，在没有低温培养的情况下，通过进一步导入包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体，可以显著增加多能干细胞诱导的效率。特别地，与当在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体仅与表达MYC基因的载体组合使用时相比，通过进一步将这些载体与包含KFL基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体组合，在没有低温培养的情况下，可以以显著的高效率诱导iPS细胞。

这允许在没有低温培养的情况下多能干细胞的高效诱导，和多能干细胞的诱导后迅速的载体去除的系统的建立。

也就是说，本发明涉及在多能干细胞的诱导中，提高诱导多能干细胞的效率的方法，以及其中使用的基因投递载体和组合物，更具体地涉及每个权利要求中描述的发明，所述多能干细胞的诱导包括导入载体的步骤，所述载体在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体。由引用同一权利要求的多个权利要求中描述的两项或更多项发明的任意组合所构成的发明也是本申请意图要求保护的发明。更具体地说，本发明涉及下述：

[1]一种在没有低温培养的情况下诱导多能干细胞的方法中改进多能干细胞诱导的效率的方法，所述诱导多能干细胞的方法导入在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体，其中所述方法包括进一步导入包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体；

[2][1]的方法，其中培养在约37℃进行；

[3][1]或[2]的方法，其中所述在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[4][1]至[3]任一项的方法，其中所述包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[5][1]至[4]任一项的方法，其进一步包含导入插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体；

[6][5]的方法，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的L1361C，L1558I，N1197S和K1795E突变；

[7]包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体在制造药物中的用途，所述药物用于在没有低温培养的情况下诱导多能干细胞的方法中改进多能干细胞诱导的效率，所述诱导多能干细胞的方法导入在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体；

[8][7]的用途，其中所述诱导多能干细胞的方法是涉及在约37℃培养的方法；

[9][7]或[8]的用途，其中所述在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[10][7]至[9]任一项的用途，其中所述包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[11]一种用于诱导多能干细胞的组合物，其中所述组合物包含：

(a)温度敏感型仙台病毒载体，其在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因，和

(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体；

[12]一种用于诱导多能干细胞的组合物，其中所述组合物包含：

(a)在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体，其是F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，其是F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[13][11]或[12]的组合物，其进一步包含插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体；

[14][13]的组合物，其进一步包含插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体，其为F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的L1361C，L1558I，N1197S和K1795E突变；

[15][11]至[14]任一项的组合物，其为用于通过在没有低温培养的情况下培养诱导多能干细胞的组合物；

[16]一种用于诱导多能干细胞的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体；

[17]一种用于诱导多能干细胞的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

[18][16]或[17]的试剂盒，其进一步包含插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体；

[19][18]的试剂盒，其进一步包含插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体，其为F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的L1361C，L1558I，N1197S和K1795E突变；

[20][16]至[19]任一项的试剂盒，其为用于通过在没有低温培养的情况下培养诱导多能干细胞的试剂盒；

本申请意图涵盖本申请描述的发明的任何事项及其任何组合。在这些发明中，本申请还意图涵盖排除了任何本申请中描述的事项或其任何组合的发明。此外，本申请中描述的关于本发明的某些具体实施方案不但公开了这些实施方案，还公开了从本申请中公开的包含这些实施方案的上位发明中排除这些实施方案而得到的发明。

发明的效果

本发明使用依次含有KLF基因，OCT基因，和SOX基因的载体，使得能够显著改进多能干细胞诱导的效率。特别地，有用的是能够在没有低温培养的情况下高效率诱导多能干细胞，并且温度敏感型载体的使用使得能够在多能干细胞诱导后载体的迅速去除。

附图简述

图1示出了碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率。示出了第28天，载体感染的人新生儿包皮来源的成纤维细胞(BJ)的碱性磷酸酶染色图像。

图2示出了碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率。所有的条件与图3中的那些相同。

图3示出了碱性磷酸酶染色的集落。在条件1和2下出现的碱性磷酸酶阳性的集落的数量显著高。

图4示出了碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率。示出了从BJ细胞诱导多能干细胞的效率。所有的条件与图3中的那些相同。

图5示出了碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率。其示出了用载体感染的人成体皮肤来源的成纤维细胞(HDF)后第28天细胞的碱性磷酸酶染色结果。

图6示出了碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率。示出了从人成体皮肤来源的成纤维细胞(HDF)诱导多能干细胞的效率。所有的条件与图5中的那些相同。

图7示出了碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率。其示出了使用载体感染人胎儿肺细胞来源的成纤维细胞(MRC-5)后第28天细胞的碱性磷酸酶染色的结果。

图8示出了碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率。其示出碱性磷酸酶阳性集落的诱导效率。所有的条件与图7中的那些相同。

图9示出了诱导的人工多能干细胞的体内多能性。

图10使出了诱导的人工多能干细胞的核型分析。

图11示出了从小鼠成纤维细胞的iPS细胞诱导(碱性磷酸酶染色结果)。

图12示出了通过抗仙台病毒抗体染色对载体去除的确认。

图13示出了通过免疫染色对标志物基因表达的确认。

图14示出了对小鼠iPS细胞的评价结果(拟胚体(embryoid body)形成)。

图15示出了对小鼠iPS细胞的评价结果(体外分化为内胚层)。

图16示出了对小鼠iPS细胞的评价结果(体外分化为中胚层)。

图17示出了对小鼠iPS细胞的评价结果(体外分化为外胚层)。

图18示出了对小鼠iPS细胞的评价结果(体外分化为外胚层)。

图19示出了从人单核细胞的iPS细胞的诱导。

图20示出了从人单核细胞的iPS细胞的诱导(碱性磷酸酶染色图像)。

图21示出了从人单核细胞的iPS细胞的诱导(iPS细胞诱导效率)。

图22示出了从人外周血单个核细胞的iPS细胞的诱导(供体1的细胞外观)。

图23示出了从人外周血单个核细胞的iPS细胞的诱导(供体2的细胞外观)。

图24示出了从人外周血单个核细胞的iPS细胞的诱导(碱性磷酸酶染色)。

图25示出了从人外周血单个核细胞的iPS细胞的诱导(诱导效率)。

图26示出了从人单核细胞的iPS细胞的诱导(供体3的细胞外观)。

图27示出了从人单核细胞的iPS细胞的诱导(供体4的细胞外观)。

图28示出了从人单核细胞的iPS细胞的诱导(碱性磷酸酶染色)。

图29示出了从人单核细胞的iPS细胞的诱导(诱导效率)。

发明的实施方式

下面将详细说明实施本发明的方式。

本发明涉及用于提高多能干细胞诱导的效率的方法，其包括在多能干细胞的诱导中引入含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体的步骤，所述多能干细胞的诱导包括导入在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的载体的步骤。更具体地，本发明的方法是在通过引入在一个载体中依次含有KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型病毒载体诱导多能干细胞的方法中，改进多能干细胞诱导的效率的方法，且其包括进一步导入含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的病毒载体的步骤。

载体导入后，在低温(例如，在36.5℃下和更具体地，例如，36℃或更低)培养是没有必要的。也就是说，使用温度敏感性变体载体，本发明的方法是优越的，这是因为能够在没有低温培养(例如，在低于36.5℃培养)的情况下以高效率诱导多能干细胞，且在多能干细胞的诱导后，载体被迅速的去除。例如，本发明涉及在通过导入在一个载体中依次包括KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体，在没有低温培养的情况下诱导多能干细胞的方法中，改进多能干细胞诱导效率的方法，其包括进一步导入含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体的步骤。可以适当地选择细胞培养的温度，例如，其可以是约37℃，特别是36.5℃至37.5℃，优选36.6℃至37.4℃，且更优选36.7℃至37.3℃。在本发明中，多能干细胞的诱导包括多能干细胞的生成，且多能干细胞诱导的效率的改进包括多能干细胞生成的效率的改进。

虽然对于多能干细胞的诱导，MYC基因的导入可以是不必要的，但是通过引入MYC基因，可以提高多能干细胞诱导的效率。例如，可以通过使用温度敏感型病毒载体，优选温度敏感型仙台病毒载体，导入MYC基因。

本发明提供用于重编程细胞的方法，其包括向分化的细胞，如体细胞中引入或使它们接触在一个载体中依次含有KLF基因，OCT基因，和SOX基因的载体，和含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体。此外，本发明提供用于在细胞重编程中引入上述重编程因子基因的方法，其包括使用在一个载体中依次含有KLF基因，OCT基因，和SOX基因的载体和含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体引入这些重编程因子基因，以及包含用于那些方法中的载体的组合物。

在本发明中，“多能干细胞”是指从胚泡期的动物胚胎的内部细胞团块制备的干细胞或者具有与这些细胞相似的表型的细胞。特别地，本发明中诱导的多能干细胞是表达碱性磷酸酶(一种ES样细胞的指示物)的细胞。这里，“ES样细胞”表明具有与ES细胞相似的特性和/或形态学的多能干细胞。此外，优选地，当培养多能干细胞时，它们形成含有核容量比例高于细胞质的细胞的扁平的集落。可适宜地与滋养细胞(feeder)一起进行培养。此外，与MEF等经培养的细胞在数周时间内停止增殖相对的是，多能干细胞可以长时间传代，这可以基于它们的增殖性在例如每三日一次传代至少15次，优选至少20次，至少25次、至少30次、至少35次、或至少40次时仍不丧失来加以确认。此外，多能干细胞优选表达内源OCT3/4或Nanog，或更优选地，它们表达OCT3/4和Nanog二者。此外，多能干细胞优选表达TERT，并且显示端粒酶活性(合成端粒重复序列的活性)。此外，多能干细胞优选具有分化成三个胚层(内胚层、中胚层、和外胚层)的能力(这可以例如在畸胎瘤形成和/或胚状体形成的过程中确认)。更优选地，多能干细胞当被移植到胚泡中时产生种系嵌合体。能够种系转播(germline transmission)的多能干细胞称为种系能(germline-competent)多能干细胞。这些表型的确认可以通过已知方法进行(WO 2007/69666；Ichisaka T.et al.,Nature 448(7151):313-7,2007)。

此外，在本发明中，“(已)分化的”是指细胞的分化阶段较之以前已经进展，可指例如与多能干细胞相比更为分化，并包括仍然保有分化成多种细胞谱系(例如体性干细胞)的能力的状态，以及终末分化的状态。已分化的细胞是衍生自多能干细胞的细胞(除多能干细胞之外)。已分化的细胞可以是例如不具有分化成三胚层(内胚层、中胚层、和外胚层)的能力的细胞。这样的细胞除非经过重编程，否则不会具有形成三胚层的能力。此外，已分化的细胞可以是例如这样的细胞，其无法生成自身所属的胚层型之外的细胞。已分化的细胞可以是体细胞，并且例如它们可以是生殖细胞以外的细胞。

在本发明中，本发明中重编程(reprogramming)是指：使某细胞的分化状态成为较之未分化的状态，包括例如已分化的细胞脱分化，例如从不具有分化多能性的细胞诱导具有分化多能性的细胞、例如多能干细胞。此外，本发明中脱分化是指特定细胞转化为更不成熟的(例如未分化的)状态。脱分化也可以是指特定细胞返回其分化的最初状态或中间状态。此外，脱分化也可以是指从不能生成自身所属的胚层类型以外的细胞的细胞变成能够分化成其它胚层的细胞的变化。脱分化还包括例如，不具有三胚层分化能力的细胞获得三胚层分化能力。此外，脱分化包括多能干细胞的生成。

此外，本发明中，体细胞是例如多能干细胞及生殖细胞以外的细胞。体细胞包括例如，构成多细胞生物的细胞中的多能干细胞以外的细胞、及其培养细胞。体细胞包括例如体性干细胞和终末分化的细胞。

本发明中的低温培养指在低于36.5℃的温度下培养。低温培养指代在优选低于36.4℃，更优选36.3℃，36.2℃，36.1℃，36℃，35.9℃，35.8℃，35.7℃，35.6℃，35.5℃，35.4℃，35.3℃，35.2℃或35.1℃，甚至更优选低于35℃的低温下培养。下限是例如30℃，优选31℃，更优选32℃，33℃或34℃。此外，本发明中约37℃指代特别地，36.5℃至37.5℃，优选36.6℃至37.4℃，更优选36.7℃至37.3℃。

本发明中的温度敏感性表示与低温下(例如，30℃至36℃)相比，在细胞培养的标准温度下(例如，37℃至38℃)活性显著降低。更优选地，其表示与在36℃相比，在37℃活性显著降低。例如，在表达载体的情况下，与低温下(例如，30℃至36℃)的表达水平相比，在细胞培养的标准温度下(例如，37℃至38℃)温度敏感型载体的表达水平显著较低。例如，仙台病毒中的TS 7(L蛋白中Y942H/L1361C/L1558I突变),TS 12(P蛋白中D433A/R434A/K437A突变),TS 13(P蛋白中D433A/R434A/K437A突变和L蛋白中L1558I突变),TS 14(P蛋白中D433A/R434A/K437A突变和L蛋白中L1361C),TS 15(P蛋白中D433A/R434A/K437A突变和L蛋白中L1361C/L1558I)突变等是温度敏感型突变。

本发明中的载体优选是病毒载体。本发明中，病毒载体是具有病毒来源的基因组核酸，并能够通过在该核酸中组入转基因而表达该转基因的载体。由于仙台病毒载体是染色体非整合性病毒载体并在细胞质中表达，不存在导入的基因会变得整合到宿主的染色体(核源染色体)中的风险。因此，所述载体是安全的，并且在重编程完成之后可以去除。在本发明中，仙台病毒载体包括感染性病毒颗粒，以及病毒核心、病毒基因组和病毒蛋白质的组合物，以及包含非感染性病毒颗粒等的复合物，它们是具有导入细胞中而表达加载的基因的能力的复合物。例如，在仙台病毒中，由仙台病毒基因组及与之结合的仙台病毒蛋白质(NP、P和L蛋白)构成的核糖核蛋白(病毒的核心部分)能够在导入细胞后在细胞中表达转基因(WO00/70055)。针对细胞的导入可以使用转染试剂等来适当地进行。这样的核糖核蛋白(RNP)也包括在本发明的仙台病毒载体中。

仙台病毒是单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)(包括副粘病毒属(Paramyxovirus),麻疹病毒属,腮腺炎病毒属，和肺病毒属)，并含有单链负链(编码病毒蛋白的有义链的反义链)RNA作为基因组。负链(minus-strand)RNA又称为负链(negative-strand)RNA。

单分子负链RNA病毒目除了副粘病毒(副粘病毒科病毒)之外还包括属于如弹状病毒科(包括水泡性病毒属、狂犬病毒属和短暂热病毒属属等属)，和纤丝病毒科等科的病毒(Virus,vol.57,No.1:pp29-36,2007；Annu.Rev.Genet.32,123-162,1998；Fields virology fourthedition,Philadelphia,Lippincott-Raven,1305-1340,2001；Microbiol.Immunol.43,613-624,1999；FieldVirology,Thirdedition pp.1205-1241,1996)。仙台病毒之外的其他副粘病毒科病毒的实例包括新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞病毒(RS病毒)、牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distempervirus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒I、II、III型、属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等。其他例子包括仙台病毒(SeV),人副流感病毒-1(HPIV-1),人副流感病毒-3(HPIV-3),海豹瘟热病毒(PDV),猫瘟热病毒(CDV),海豚麻疹病毒(DMV),小反刍动物瘟病毒(PDPR),麻疹病毒(MV),牛瘟麻疹病毒(RPV),Hendra病毒(Hendra),Nipah病毒(Nipah),人副流感病毒-2(HPIV-2),猿副流感病毒5(SV5),人副流感病毒-4a(HPIV-4a),人副流感病毒-4b(HPIV-4b),腮腺炎病毒(Mumps),和新城疫病毒(NDV)。更优选地，例子包括选自下组的病毒：仙台病毒(SeV),人副流感病毒-1(HPIV-1),人副流感病毒-3(HPIV-3),海豹瘟热病毒(PDV),猫瘟热病毒(CDV),海豚麻疹病毒(DMV),小反刍动物瘟病毒(PDPR),麻疹病毒(MV),牛瘟麻疹病毒(RPV),Hendra病毒(Hendra)，和Nipah病毒(Nipah)。

仙台病毒的核苷酸序列在数据库中的登录号的例子可见：NP基因为M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046、和X17218；P基因为M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007、和X17008；M基因为D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、和X53056；F基因为D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152、和X02131；HN基因为D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、和X56131；L基因为D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587、和X58886。由其他病毒编码的病毒基因的例子包括：对于NP基因(又称N基因)有CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1,D01070；HPIV-2,M55320；HPIV-3,D10025；Mapuera,X85128；Mumps，D86172；MV,K01711；NDV，AF064091；PDPR,X74443；PDV,X75717；RPV,X68311；SeV，X00087；SV5,M81442；和Tupaia,AF079780；对于P基因有CDV,X51869；DMV,Z47758；HPIV-1,M74081；HPIV-3,X04721；HPIV-4a,M55975；HPIV-4b,M55976；Mumps,D86173；MV,M89920；NDV,M20302；PDV,X75960；RPV,X68311；SeV,M30202；SV5,AF052755；和Tupaia,AF079780；对于C基因有CDV,AF014953；DMV,Z47758；HPIV-1.M74081；HPIV-3,D00047；MV,ABO16162；RPV,X68311；SeV,AB005796；和Tupaia,AF079780；对于M基因有CDV,M12669；DMV Z30087；HPIV-1,S38067；HPIV-2,M62734；HPIV-3,D00130；HPIV-4a,D10241；HPIV-4b,D10242；Mumps,D86171；MV,AB012948；NDV,AF089819；PDPR,Z47977；PDV,X75717；RPV,M34018；SeV,U31956；和SV5,M32248；对于F基因有CDV,M21849；DMV,AJ224704；HPN-1,M22347；HPIV-2,M60182；HPIV-3.X05303,HPIV-4a,D49821；HPIV-4b,D49822；Mumps,D86169；MV,AB003178；NDV,AF048763；PDPR,Z37017；PDV,AJ224706；RPV,M21514；SeV,D17334；和SV5,AB021962；以及对于HN(H或G基因)有CDV,AF112189；DMV,AJ224705；HPIV-1,U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3,AB012132；HPIV-4A,M34033；HPIV-4B,AB006954；Mumps,X99040；MV,K01711；NDV,AF204872；PDPR,Z81358；PDV,Z36979；RPV,AF132934；SeV,U06433；和SV-5,S76876。但是，对于所说的每种基因都已知有多种株系，而由于株系的差异可能存在由不同于上面例举的那些的序列组成的基因。携带源自这些基因中的任意者的病毒基因的仙台病毒可用作本发明的载体。例如，本发明的仙台病毒载体包含与上述任意病毒基因的编码序列具有90％或更高，优选95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。此外，本发明的仙台病毒载体包含例如编码与上述任一病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列具有90％或更高，优选95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，或99％或更高同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。此外，本发明的仙台病毒载体包含例如编码在上述任一病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列中具有10个或更少，优选9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的氨基酸序列的核苷酸序列。

本说明书中记载的核苷酸序列和氨基酸序列等的数据库登录号所参考的序列例如参考本申请的申请日及优先权日的序列，可以确定为本申请的申请日或者优先权日的序列，优选确定为本申请的申请日的序列。各个时间点上的序列可以通过参照数据库的修订历史来加以确定。

本发明中使用的仙台病毒载体可以是衍生物，所述衍生物包括具有修饰的病毒基因的病毒，以及化学修饰的病毒等，使得病毒导入基因的能力不受损。

此外，仙台病毒可源自天然株系，野生型株系，突变株系，实验室传代的株系，以及人工构建的株系等。一个例子是Z株系(Medical Journal of OsakaUniversity Vol.6,No.1,March 1955p1-15)。即，这些病毒可以是与分离自自然界的病毒类似的结构的病毒载体，或者通过基因重组人工修饰的病毒，只要能够诱导期望的重编程。例如，它们在野生型病毒的任何基因中可能具有突变或缺失。此外，还可以使用不完整病毒如DI颗粒(J.Virol.68:8413-8417,1994)。例如，可以优选地使用在至少一个编码病毒包膜蛋白或包壳蛋白的基因中具有突变或缺失的病毒。此类病毒为，例如，在感染细胞中能复制基因组但不能形成感染性病毒颗粒的病毒载体。由于不存在将感染扩散到周围的担忧，这样的转播缺陷病毒载体是高度安全的。例如，可以使用这样的病毒载体，其不含有至少一种编码包膜蛋白(如F和/或HN或刺突蛋白，或其组合)的基因(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14):6564-6569(2000))。如果基因组RNA中编码对于基因组复制而言必要的蛋白(例如，NP、P和L蛋白)，则基因组可以在被感染的细胞中复制。为了产生缺陷型的病毒，例如，向产生病毒的细胞反式供应缺陷型基因产物或能够补全它的蛋白质(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14):6564-6569(2000))。此外，还已知在不完全补全缺陷的病毒蛋白质的条件下，以非感染病毒颗粒(VLP)的形式收集病毒载体的方法(WO00/70070)。此外，当以RNP的形式(例如，含有N、L和P蛋白的RNP和基因组RNA)收集病毒载体时，可以在不补全包膜蛋白的条件下产生载体。

此外，还优选使用携带突变病毒蛋白基因的载体。本发明尤其提供利用在病毒基因中有突变和/或缺失的仙台病毒载体的重编程中基因投递方法和重编程细胞的产生方法，及其组合物和试剂盒。例如，在包膜蛋白和包壳蛋白中已知有多种突变，包括减毒突变和温度敏感突变。具有这些突变蛋白质基因的仙台病毒可以有利地在本发明中使用。在本发明中，理想地使用具有降低的细胞毒性的载体。细胞毒性可以例如通过对来自细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放进行定量来加以测量。例如，可以使用与野生型相比具有显著降低的细胞毒性的载体。关于细胞毒性降低的程度，例如可以使用这样的载体：以MOI(感染复数)3使之感染源自人的Hela细胞(ATCC CCL-2)或源自猴的CV-1细胞(ATCC CCL 70)，培养3日后所得的培养基中的LDH释放水平的相比于野生型显著减少，例如减少20％或更多，25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，或50％或更多者。此外，减少细胞毒性的突变还包括温度敏感突变。温度敏感突变是指与低温(30℃至36℃，例如30℃至32℃)相比，显著降低在病毒宿主的通常温度(例如37℃至38℃)下的活性的突变。这样的具有温度敏感突变的蛋白质是有用的，因为病毒能够在容许温度(低温)下制备。具有本发明中有用的温度敏感性突变的病毒载体当在37℃感染时，与在培养细胞中32℃感染时相比，显示的生长速率或基因表达水平为例如1/2或更少，优选1/3或更少，更优选1/5或更少，更优选1/10或更少，更优选1/20或更少。

本发明中使用的仙台病毒载体可以是野生型，只要它不抑制重编程，能够使得重编程因子表达，和能够诱导或支持通过所述重编程因子的重编程的诱导，并且其优选在至少一个，更优选至少2、3、4、5或更多个病毒基因中具有缺失或突变。缺失和突变可以任意组合并导入各个基因中。这里，突变可以是功能障碍型突变或温度敏感型突变，并且优选是这样的突变，其与野生型或不具有所述突变的病毒相比，在至少37℃下将病毒颗粒形成能力(或在非传染性病毒的情况下，非传染性病毒样颗粒(NTVLP)形成能力(Inoueviralet al.,J.Virol.77:3238-3246,2003))，增殖速率和/或任何携带的基因的表达水平降低至优选1/2或更少，更优选1/3或更少，更优选1/5或更少，更优选1/10或更少，且更优选1/20或更少。使用这样的修饰型病毒载体尤其对于多能干细胞的诱导而言可能是有用的。例如，在本文中优选使用的仙台病毒载体具有至少两个缺失或突变的病毒基因。这样的病毒包括那些缺失至少两个病毒基因者、至少两个病毒基因中具有突变者、以及在至少一个病毒基因中具有突变且缺失了至少一个病毒基因者。所述至少两个被突变或缺失的病毒基因优选为编码构成包膜的蛋白的基因。例如，具有F基因缺失、且进一步具有M和/或HN基因缺失或进一步在M和/或HN基因中有突变(例如，NTVLP形成抑制突变和/或温度敏感性突变)的载体是本发明中优选使用的。此外，例如F基因缺失、且M或HN基因也缺失、而余下的M和/或HN基因中具有突变(例如，NTVLP形成抑制突变和/或温度敏感性突变)的载体，也是本发明中优选使用的。本发明中使用的载体更优选具有至少3个缺失或突变的病毒基因(优选至少3个编码包膜构成蛋白质的基因，F、HN、和M)。这样的病毒载体包括：至少3个基因缺失的载体、至少3个基因中具有突变的载体、至少1个基因中有突变且至少2个基因缺失的载体、至少2个基因中有突变且至少1个基因缺失的载体。作为更优选的实施方式的例子，缺失F基因、且M和HN基因也缺失或M和HN基因中还具有突变(例如，NTVLP形成抑制突变和/或温度敏感性突变)的载体是本发明中优选使用的。此外，例如F基因缺失、且M或者HN基因也缺失、而余下的M或者HN基因中有突变(例如，NTVLP形成抑制突变和/或温度敏感性突变)的载体，本发明中也是优选的。这样的突变型病毒可以根据已知方法制备。

例如，仙台病毒的M基因的优选突变包括选自M蛋白质中的69位(G69)、116位(T116)和183位(A183)中的任意位点的氨基酸取代(Inoue,M.等，J.Virol.2003,77:3238-3246)。具有编码突变M蛋白质的基因组的病毒，其中仙台病毒M蛋白质中上述3个位点中的任一个位点、优选任意2个位点的组合、更优选全部3个位点上的氨基酸被其它氨基酸取代，是本发明中优选使用的。

优选的氨基酸突变是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸，例如取代成BLOSUM62矩阵(Henikoff,S.and Henikoff,J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)的分值为3以下、优选2以下、更优选1以下、甚至更优选为0的氨基酸。具体地，可以将仙台病毒M蛋白质的G69、T116和A183分别取代成Glu(E)、Ala(A)和Ser(S)。此外，还可以利用与温度敏感P253-505麻疹病毒株(Morikawa,Y.等，Kitasato Arch.Exp.Med.1991:64；15-30)的M蛋白质的突变同源的突变。突变例如可以使用寡核苷酸等采用公知的突变方法来实施导入。

此外，HN基因的优选的突变的例子包括任意选自仙台病毒的HN蛋白质的262位(A262)、264位(G264)和461位(K461)中的位点的氨基酸取代(Inoue,M.等，J.Virol.2003,77:3238-3246)。具有编码这3个位点中的任何1个、优选任意2个位点的组合、更优选全部3个位点的氨基酸被取代成其它氨基酸的突变HN蛋白质的基因组的病毒是本发明中优选使用的。如上述，优选的氨基酸取代是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。作为优选的一个例子，将仙台病毒HN蛋白质的A262、G264和K461分别取代成Thr(T)、Arg(R)和Gly(G)。此外，例如，使用流行性腮腺炎病毒的温度敏感性疫苗株Urabe AM9为参照，可突变HN蛋白质的464以及468位的氨基酸(Wright,K.E.等，Virus Res.2000:67；49-57)。

此外，仙台病毒可以在P基因和/或L基因中具有突变。这样的突变的例子具体有：SeV P蛋白质的86位的Glu(E86)的突变、以及SeV P蛋白质的511位的Leu(L511)到其它氨基酸的取代。同上述，优选的氨基酸取代是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的例子包括86位的氨基酸到Lys的取代、以及511位的氨基酸到Phe的取代。此外，L蛋白质中的例子包括SeV L蛋白质的1197位的Asn(N1197)和/或1795位的Lys(K1795)到其它氨基酸的取代，且同上述，优选的氨基酸是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的例子是1197位的氨基酸到Ser的取代、以及1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突变能够显著提高持续感染性、2次粒子释放的抑制或细胞毒性的抑制的效果。而且，与包膜蛋白质基因的突变和/或缺失组合，能够急剧地提升这些效果。此外，对于L基因，例子包括SeV L蛋白质的1214位的Tyr(Y1214)和/或1602位的Met(M1602)到其它氨基酸的取代，且同上述，优选的氨基酸是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地可以示例出：1214位的氨基酸到Phe的取代、以及1602位的氨基酸到Leu的取代等。以上示例的突变可以任意组合。

例如，SeV M蛋白质的至少69位的G、116位的T以及183位的A，SeV HN蛋白质的至少262位的A、264位的G以及461位的K，SeV P蛋白质的至少511位的L，SeV L蛋白质的至少1197位的N以及1795位的K分别被取代成其它氨基酸，且F基因缺损或缺失的仙台病毒载体；以及F基因缺损或缺失、且具有与上述的那些同样或更低的细胞毒性和/或具有与上述的那些同样或更高的在37℃对NTVLP形成的抑制的仙台病毒载体，在本发明中特别优选用于表达核重编程因子。具体的取代实例包括：M蛋白质的G69E、T116A以及A183S取代，HN蛋白质的A262T、G264R以及K461G的取代，P蛋白质的L511F取代，以及L蛋白质的N1197S和K1795E取代。

L蛋白质的突变还包括选自SeV L蛋白质的942位(Y942)、1361位(L1361)和1558位(L1558)中的任意位点的氨基酸到其它氨基酸的取代。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的例子包括942位的氨基酸到His的取代、1361位的氨基酸到Cys的取代、和1558位的氨基酸到Ile的取代。特别可以优选使用至少942位或1558位发生了取代的L蛋白质。例如，优选除了1558位以外、1361位也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质。此外，还优选除了942位以外、1558位和/或1361位也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质。这些突变能够提高L蛋白质的温度敏感性。

P蛋白质的突变的例子包括选自SeV P蛋白质的433位(D433)、434位(R434)和437位(K437)中的任意位点的氨基酸到其它氨基酸的取代。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的示例包括：433位的氨基酸到Ala(A)的取代、434位的氨基酸到Ala(A)的取代、437位的氨基酸到Ala(A)的取代等。特别可以优选使用上述3个位点全部发生取代的P蛋白质。这些突变可以提高P蛋白质的温度敏感性。

编码SeV P蛋白质的至少433位的D、434位的R和437位的K这3个位置被取代成其它氨基酸的突变P蛋白质、和SeV L蛋白质的至少1558位的L被取代的突变L蛋白质(优选至少1361位的L也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质)的F基因缺损或缺失的仙台病毒载体；以及具有与上文所述的那些同样或更低的细胞毒性和/或与之同样或更高的温度敏感性的F基因缺损或缺失的仙台病毒载体优选在本发明中使用。除了上述突变以外，各病毒蛋白质中在其它氨基酸上(例如10个以下、5个以下、4个以下、3个以下、2个以下或1个氨基酸)上也可以具有突变。由于包含上述所示突变的载体显示高的温度敏感性，因此在重编程完成后，可通过将细胞在正常温度下(例如，约37℃，特别是36.5℃至37.5℃，优选36.6℃至37.4℃,和更优选36.7℃至37.3℃)培养简便地将载体去除。对于载体去除，也可以在稍微的高温(例如37.5～39℃、优选38～39℃或38.5～39℃)下进行培养。

更具体地，可优选地使用具有例如下述突变的仙台病毒载体(国际公布号WO2010/008054)：

TS 7:L(Y942H/L1361C/L1558I)；

TS 12:P(D433A/R434A/K437A)；

TS 13:P(D433A/R434A/K437A),L(L1558I)；

TS 14:P(D433A/R434A/K437A),L(L1361C)；和

TS 15:P(D433A/R434A/K437A),L(L1361C/L1558I)。

具体的载体可以为例如：其中M蛋白质具有G69E、T116A以及A183S突变，HN蛋白质具有A262T、G264R以及K461G突变；P蛋白质具有L511F突变，且L蛋白质具有N1197S和K1795E突变的F基因缺失的仙台病毒载体(例如Z株)；且通过向该载体中进一步导入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突变而产生的载体是更优选的。具体地，例子包括SeV18+/TSΔF(WO2010/008054和WO2003/025570)和SeV(PM)/TSΔF，以及通过进一步向这些载体中导入上述的TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突变而产生的载体，但不限于此。

“TSΔF”意思是在M蛋白中携带G69E、T116A和A183S突变，在HN蛋白中携带A262T,G264R,和K461G突变，P蛋白中携带L511F突变，以及L蛋白中携带N1197S和K1795E突变，以及缺失F基因。

在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，特别地其携带M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并优选地它进一步具有上述的TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突变。更优选地，其为携带M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步携带TS 12突变的F基因缺失的仙台病毒载体。在含有KLF基因，OCT基因和SOX基因的仙台病毒中，优选KLF基因，OCT基因和SOX基因以此顺序紧接仙台病毒的P基因之后整合，即P基因的紧接下游(正好在负链RNA基因组的5’侧)。

对此没有限制，具体地，SeV(PM)KOS/TS7ΔF，SeV(PM)KOS/TS12ΔF等是优选的载体，且更优选SeV(PM)KOS/TS12ΔF。

此时，优选将其与表达KLF基因的仙台病毒载体(携带KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体)组合。该编码KLF基因的仙台病毒载体(即携带KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因)可以是或不是温度敏感型的，且优选所述载体具有在37℃抑制NTVLP形成的突变。可以根据参考文献Inoue et al.,J.Virol.77:3238-3246,2003测量NTVLP形成。优选的载体是例如携带M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变的F基因缺失的仙台病毒载体。该携带KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体能够在37℃表达装载的基因(KLF基因)。对于该载体，使用在37℃比在一个载体中依次含有KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体在表达装载的基因方面具有更高效率的载体。特别地，优选地是比在一个载体中依次含有KLF基因，OCT基因和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体具有更低温度敏感性的载体(在37℃高抗性和装载的基因的相对高的表达水平)。可以插入KLF基因，例如，在仙台病毒载体的N基因的上游(基因组中N基因的3’侧)，且具体的是，SeV18+KLF4/TSΔF是优选的载体。

此时，优选的是将其与编码MYC基因的温度敏感型病毒载体组合。编码MYC基因的温度敏感型病毒载体是，例如，编码MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体。更具体地，其是携带M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变的F基因缺失的仙台病毒载体，且优选其是进一步具有如上文所述的TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突变的载体。更优选的是，其为携带M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步携带TS 15突变的F基因缺失的仙台病毒载体。MYC基因整合到例如紧接HN基因之后，即，HN基因的紧接下游(正好在负链RNA基因组的5’侧)，例如，在HN基因和L基因之间。更具体地，其可以是SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF，SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF，或SeV(HNL)c-rMYC/TSΔ15。可以通过组合，具体地，SeV(PM)KOS/TS12ΔF，SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF，和SeV18+KLF4/TSΔF获得有利的结果。

载体的细胞毒性例如可以通过对从细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)进行定量来测定。具体地，例如，以MOI 3感染HeLa(ATCC CCL-2)或猴CV-1(ATCC CCL 70)，并测量培养3天后的培养液中的LDH释放量。释放的LDH量越低，细胞毒性越低。此外，温度敏感性可以通过测量病毒宿主的通常温度(例如，37℃至38℃)下病毒增殖的速度或搭载的基因的表达水平来加以测定。如果与无突变者相比，病毒扩增速度和/或搭载的基因的表达水平降低，则判断该突变为温度敏感型突变，且增殖速度和/或表达水平越低，则判断的温度敏感性越高。

此外，当使用包膜病毒时，可以使用这样的病毒，其在包膜中含有与该病毒原本携带的包膜蛋白质不同的蛋白质。例如，在制造病毒时，通过使病毒产生细胞表达希望的外源性包膜蛋白质，能够制造含该外源性包膜蛋白质的病毒。这样的蛋白质没有特殊限制，可以使用赋予对哺乳动物细胞的感染能力的希望的粘附因子、配体、受体等蛋白质。具体实例包括水疱性口炎病毒(VSV)的G蛋白质(VSV-G)。VSV-G蛋白质可以来源于任意的VSV株，例如可以使用Indiana血清型株(J.Virology 39:519-528(1981))来源的VSV-G蛋白，但不限于此。本发明中使用的仙台病毒载体可以包含其它病毒来源的包膜蛋白质任意组合。

携带有核重编程因子的重组仙台病毒的重建可以利用公知方法进行。作为具体的规程，典型地，仙台病毒可以通过下述步骤来制造：(a)在表达病毒粒子形成所必需的病毒蛋白质(NP、P、和L)的细胞中转录编码仙台病毒基因组RNA(负链)或其互补链(正链)的cDNA，和(b)回收含有生成的病毒的培养上清。粒子形成所必需的病毒蛋白质可以由转录后的病毒基因组RNA表达，也可以从基因组RNA以外的来源反式供给它们。例如，可以将编码NP、P和L蛋白质的表达质粒导入细胞来供给。在基因组RNA中粒子形成所必需的病毒基因缺损的情况下，可在病毒产生细胞中另行表达那些病毒基因，以补全粒子的形成。为了在细胞内表达病毒蛋白质或RNA基因组，将编码所述蛋白质或基因组RNA的DNA连接在能够在宿主细胞中发挥功能的适当启动子的下游的载体导入宿主细胞。转录的基因组RNA在病毒蛋白质的存在下得以复制，并形成感染性病毒粒子。在制造基因(如包膜蛋白质的基因等)缺损的缺损型病毒时，可以在病毒产生细胞中表达缺损的蛋白质、能够补偿那些蛋白质或其功能的其它病毒蛋白质、等等。

例如，仙台病毒的制造可以采用以下的公知方法来实施(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；WO03/025570；WO2005/071092；WO2006/137517；WO2007/083644；WO2008/007581；Hasan,M.K.等，J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997、Kato,A.等，1997,EMBO J.16:578-587以及Yu,D.等，1997,Genes Cells 2:457-466；Durbin,A.P.等，1997,Virology 235:323-332；Whelan,S.P.等，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392；Schnell.M.J.等，1994,EMBO J.13:4195-4203；Radecke,F.等，1995,EMBO J.14:5773-5784；Lawson,N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481；Garcin,D.等，1995,EMBO J.14:6087-6094；Kato,A.等，1996,Genes Cells 1:569-579；Baron,M.D.与Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271；Bridgen,A.与Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15400-15404；Tokusumi,T.等.Virus Res.2002:86；33-38、Li,H.-O.等，J.Virol.2000:74；6564-6569)。关于其它的RNA病毒的增殖方法和重组病毒的制造方法，也见“Uirusu-gaku Jikken-gaku Kakuron(详细病毒学实验)”第二次修订版(National Institute of Infectious Diseases Students Institute edition,Maruzen,1982)。

在上述的仙台病毒中，依次整合了KLF基因、OCT基因和SOX基因。在另一个仙台病毒中，整合了KLF基因(没有将OCT基因和SOX基因整合到这一载体中)。一般地，这些外源基因可以插入任何病毒基因(NP,P,M,F,HN,或L)的紧邻前方(基因组上的3’侧)或紧邻后方(基因组上的5’侧)。

关于含有KLF基因，OCT基因和SOX基因的仙台病毒，优选地，在仙台病毒P基因紧邻后方，即在P基因的紧邻下游(在负链RNA基因组上紧邻5’侧)依次整合KLF基因，OCT基因和SOX基因。例如，转录起始信号(S序列)、转录终止信号(E序列)、以及间隔序列(居间序列(I序列)等)可以包含在P基因和KLF基因之间；但不包含其他转录单位(例如编码蛋白编码基因的转录单位)。由于仙台病毒携带负链RNA作为基因组，与通常情况相反，3’侧对应于基因组的上游，5’侧对应于基因组的下游。当KLF基因、OCT基因和SOX基因以此顺序定位于仙台病毒基因组中时，在这三个基因中KLF基因位于最接近3’侧的位置，而SOX基因位于最接近5’侧的位置。由于负链RNA以反义方向编码基因，KLF基因、OCT基因和SOX基因在基因组上是作为反义链而不是作为蛋白编码链(有义链)编码的。当仙台病毒基因组进入细胞中，它使用该基因组作为模板产生反基因组RNA。反基因组是正链，而KLF基因、OCT基因和SOX基因作为蛋白编码链(有义链)加载。在反基因组RNA中，KLF基因、OCT基因和SOX基因的定位使得在这三个基因中，KLF基因位于最接近5’侧，而SOX基因位于最接近3’侧。

这三个基因优选彼此相邻(即这三个基因之间没有其他的基因存在)。这三个基因中每一个都可以合适地被包夹在仙台病毒S(起始)序列和E(终止)序列之间。S序列是起始转录的信号序列，E序列则终止转录。S序列和E序列之间的区域成为单个转录单位。当合适时，在特定基因的E序列和下一基因的S序列之间可以插入充当间隔物(居间序列)的序列。例如，可以有利地使用含有这样的核酸的仙台病毒载体，所述核酸具有如下组成：S-KLF基因-E-I-S-OCT基因-E-I-S-SOX基因-E(S,I,和E分别指S序列、I(居间,intervening)序列，和E序列)。仙台病毒基因组上的P基因和KLF基因将以下述方式连接：P基因-E-I-S-KLF基因-，等等。

当OCT基因、SOX基因和KLF基因以此顺序定位时，例如，可以有利地使用这样的仙台病毒载体，其基因组中含有具有S-OCT基因-E-I-S-SOX基因-E-I-S-KLF基因-E(S、I和E分别指S序列、I(居间)序列、和E序列)构成的核酸。仙台病毒基因组上的P基因和SOX基因将以如下方式连接：P基因-E-I-S-SOX基因-，等等。

可使用仙台病毒的期望的S序列作为S序列，但可优选使用例如3’-UCCCWVUUWC-5’(W＝A或U；V＝A、C或G)序列(SEQ ID NO:1)。尤其是，3’-UCCCAGUUUC-5’(SEQ ID NO:2)、3’-UCCCACUUAC-5’(SEQ IDNO:3)、和3’-UCCCACUUUC-5’(SEQ ID NO:4)是优选的。当这些序列以编码正链的DNA序列表示时，它们分别为5’-AGGGTCAAAG-3’(SEQ ID NO:5)、5’-AGGGTGAATG-3’(SEQ ID NO:6)、和5’-AGGGTGAAAG-3’(SEQ IDNO:7)。仙台病毒载体的E序列优选为例如3’-AUUCUUUUU-5’(编码正链的DNA为5’-TAAGAAAAA-3’)。I序列可以为例如任何三个碱基，具体可以使用3’-GAA-5’(正链DNA中为5’-CTT-3’)。

野生型仙台病毒的基因组在3'的短前导区域之后，依次包含核壳(N)基因、磷(P)基因、基质(M)基因、融合(F)基因、血凝素-神经氨酸酶(HN)基因和大(L)基因、以及短的5'-后随序列(trailer)区域。在仙台病毒载体中也可以按照该顺序配置病毒基因。与野生型病毒相当的重组载体以及各种突变型载体的制备是已知的。而且还显示，使用没有其包膜的单独RNP也可能实现基因导入(WO00/70055)。因此，可以使用仙台病毒RNP作为病毒载体进行重编程。

仙台病毒如果携带NP基因、P基因和L基因就足以作为载体发挥功能，它们可以在细胞中复制基因组并表达搭载的外源基因(KLF、OCT，SOX等等)。在携带NP基因、P基因和L基因这三个基因作为病毒基因的仙台病毒中，KLF、OCT及SOX基因的组插入例如P基因和L基因之间。在含有M基因的载体中，KLF、OCT和SOX基因的组插入例如P基因和M基因之间(WO97/16539)。当M基因缺失的仙台病毒载体中包含F基因时，KLF、OCT和SOX基因的组插入P基因和F基因之间(WO00/70070)。对于缺失M和F基因的仙台病毒载体，插入的位置在P基因和HN基因之间；而对于缺失F、M和HN基因的仙台病毒载体，插入的位置在P基因和L基因之间(WO2003/025570,WO 2006/137517)。缺失病毒基因的载体由于非常安全所以是优选的。在本发明中，可以优选使用具有至少F基因缺失的载体。

此外，对于含有KLF基因但是不含有OCT基因和SOX基因的载体，KLF基因插入到例如NP基因的上游(在3’引导序列和NP基因之间)。

上述的含有KLF、OCT及SOX基因的仙台病毒载体和含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体可以适宜地将它们两种用于重编程中的基因投递，但它们更优选用于还涉及MYC基因导入的重编程。也可以组合表达Glis1基因的载体(Maekawa et al.,Nature,474:225-229,2011)代替MYC基因。MYC基因或Glis1基因可以插入上述的含有KLF、OCT及SOX基因的仙台病毒或含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，但也可以插入别的载体后使用。当将MYC基因或Glis1基因插入别的载体时，可以使用如质粒、病毒载体、以及非病毒载体(例如脂质体)等期望的载体。病毒载体的例子包括腺病毒载体和逆转录病毒载体，但不限于此。更优选的是，MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒载体。在本发明中，上述的含有KLF、OCT及SOX基因的仙台病毒载体和含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体优选与插入了MYC基因或Glis1基因的另外的仙台病毒载体组合使用。上述的仙台病毒载体可以用作起始仙台病毒载体来插入MYC基因或Glis1基因。

当将MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒基因组时，载体中的基因插入位置可以选择期望的位点。例如，MYC基因或Glis1基因优选位于靠负链RNA基因组的后方(5’侧)，例如，比负链RNA病毒基因组的中心更靠5’端(位置比位于中央的基因更靠5’端)。换言之，在位于基因组上的多个蛋白编码序列中，其优选位于距5’端比距3’端更近的位置(见实施例)。MYC基因或Glis1基因可以位于例如最5’侧(即自5’端起的第一个位置)，或者自5’端起的第二或第三个位置。MYC基因或Glis1基因可以位于自基因组的5’端起的第二个位置，具体地，当L基因位于基因组最5’侧，接着是HN基因时，其可位于HN基因和L基因之间(HN-L间)。具体地，优选将MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒基因组中的L基因的紧邻上游(3’侧，例如HN基因与L基因之间)，或者紧邻下游(5’侧，例如L基因与5’-后随序列之间)。最优选其中MYC基因已经插入HN基因和L基因之间的仙台病毒载体。仙台病毒载体可以是例如这样的F基因缺失仙台病毒载体(例如，Z株)，其中M蛋白具有G69E、T116A和A183S突变，HN蛋白具有A262T,G264R和K461G突变，P蛋白具有L511F突变，而L蛋白具有N1197S和K1795E突变；且通过向该载体中进一步导入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS1突变而产生的载体是更优选的。

MYC基因，不仅包括野生型c-MYC还包括T58A突变体、N-MYC和L-MYC，能够诱导多能干细胞(WO2007/69666；Blelloch R.et al.,Cell StemCell,1:245-247,2007)。如此，由于可以通过各种方式选择家族基因并使用，可以合适地选择MYC家族基因来诱导重编程。此外，可以通过合适地导入不改变被编码的氨基酸序列的沉默突变来替换MYC基因中的连续A或T核苷酸序列。

例如，已发现仙台病毒载体等RNA病毒载体表达的野生型c-MYC的量少。然而，通过向野生型c-MYC中导入选自a378g、t1122c、t1125c、a1191g、和a1194g中的一个或多个，优选两个或更多个，三个或更多个，或四个或更多个，或全部5个突变，可以从载体稳定地高表达基因。在本发明中，例如，可以适当地使用SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:9为氨基酸序列)所示的修饰的c-MYC基因(称为“c-rMYC”)。特别地，例子包括SeV(HNL)c-rMYC/TSΔF，SeV(L)c-rMYC/TSΔF，SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF(WO2010/008054；Fusaki etal.,Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.Vol.85,p348-362(2009))，且尤其优选SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF，但不限于此。

当适宜时，可以在上述的携带KLF、OCT和SOX基因的仙台病毒载体，含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，和/或含有MYC基因的仙台病毒载体中进一步搭载用于细胞重编程的基因等。此外，也可以将搭载了用于细胞重编程的基因等的其他载体与上述的仙台病毒载体组合。要搭载的基因可以是从已分化的细胞诱导多能干细胞等各种干细胞的诱导中涉及的期望的基因。例如，可以搭载增加重编程效率的基因。

本发明提供本发明的仙台病毒载体用于在细胞重编程中导入基因的用途，以及这些载体用于在细胞中表达重编程因子以诱导这些细胞的重编程的用途。此外，本发明提供含有本发明的仙台病毒载体的、用于在细胞重编程中导入基因的作用剂(转移剂、基因转移剂)，以及含有这些载体的用于在细胞中表达重编程因子的作用剂。此外，本发明涉及含有本发明的仙台病毒载体的、用于在细胞中表达重编程因子以诱导该细胞的重编程的作用剂。此外，当实施细胞的重编程时，本发明的载体还可以用于在这些细胞中表达期望的基因。本发明的仙台病毒载体可以依照本发明来用于细胞重编程。重编程的诱导具体可以是多能干细胞的诱导。本发明可以用于医学用途和非医学用途，并可以在医学和非医学实施方案中使用。例如，本发明可以用于治疗、手术、和/或诊断目的，或者非治疗、非手术、和/或非诊断目的。

在本发明中，核重编程因子是指能够单独或与多个因子共同用于将某细胞的已分化状态诱导至相对未分化的状态的基因或其产物，包括例如用于诱导已分化的细胞脱分化的基因或其产物。本发明中，核重编程因子(a nuclearreprogramming factor)包括：核的重编程所必需的因子、和提高核重编程的效率的辅助性因子(辅助因子)。本发明中，可以使载体携带用于核重编程(nuclear reprogramming)的希望的基因。例如，可以进一步加载用于多能干细胞的制造的基因。具体地，作为用于诱导多能干细胞的核重编程因子，可以使用例如：在ES细胞、初期胚等中表达、但在分化的多种体细胞中不表达或表达降低的基因(ES细胞特异性基因等)。这样的基因优选是编码转录因子、核蛋白质等的基因。鉴定核重编程基因的方法是已知的(WO2005/80598)，实际上，已证明采用该方法鉴定出的基因显示对于向多能干细胞的重编程(reprogramming)是有用的(WO2007/69666)。

作为这样的基因的例子，可以列举出：DPPA5(发育多能性相关5,ES细胞特异性基因1(ESG1)；登录号NM_001025290,NM_025274,XM_236761)、F-框蛋白15(Fbx15,NM_152676,NM_015798)、Nanog(NM_024865,AB093574)、ECAT1(ES细胞相关转录物1；AB211062,AB211060)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532,NM_181548)、DNMT3L(DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3-样；NM_013369,NM_019448)、ECAT8(AB211063,AB211061)、GDF3(生长分化因子3；NM_020634,NM_008108)、SOX15(SRY(性别决定区Y)-框15；NM_006942,NM_009235)、DPPA4(发育多能性相关4；NM_018189,NM_028610)、DPPA2(NM_138815,NM_028615)、FTHL17(运铁蛋白,重链多肽-样17；NM_031894,NM_031261)、SALL4(sal-样4；NM_020436,NM_175303)、OCT3/4(也称POU5F1；NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、SOX2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、Rex-1(ZFP42(锌指蛋白42同源物)；NM_174900,NM_009556)、Utf1(未分化的胚胎细胞转录因子1；NM_003577,NM_009482)、TCL1A(T细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966,NM_009337)、DPPA3(也称Stella,NM_199286,NM_139218,XM_216263)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235,NM_010637)、联蛋白β1(钙粘蛋白-相关蛋白β1；NM_001904,NM_007614；含S33Y突变体)、c-MYC(NM_002467,NM_010849；含T58A突变体)、STAT3(信号转导者和转录活化者3；NM_139276,NM_213659)、GRB2(结合于生长因子受体的蛋白2；NM_002086,NM_008163)，Glis1基因(Maekawa et al.,Nature,474:225-229,2011；NM_147193,NM_147221)以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。这些基因导入细胞时可诱导多能干细胞(WO2007/69666)。因此，可以在包含KLF、OCT和SOX基因的仙台病毒载体，含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，和/或含有MYC基因的仙台病毒载体中进一步搭载上述基因中尚未搭载于该载体中的基因。或者，可以将搭载这些基因的其他载体与这些仙台病毒载体组合使用。这些基因可以分别组入不同的载体中，或者可以将多个基因一起组入单个载体中。此外，各个基因可以组入单独一种载体中，或者可以将不同类型的载体(包括染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)与上述的本发明的包含KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，或含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体组合使用。此外，各病毒载体可以分别包装，而在使用时组合使用它们。或者，可以将携带不同基因的多个病毒载体预先组合成试剂盒，或者混合成组合物。此外，在细胞的重编程、特别是多能干细胞的制造中也优选使用包含这些基因的任意组合(或全部)的1个或其以上的非整合型病毒载体、以及包含该载体的试剂盒或组合物。对于组合物的情况，载体可以适宜与可药用的担载体和/或媒介物组合，例如混合在灭菌水、pH缓冲液、生理盐水、培养液等中。在这些体系中，还可以将核重编程基因的一部分或大部分替换成作为蛋白质的其表达产物。更具体地，本发明的组合物和试剂盒也可以含有表达重编程因子的其他载体(染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)和/或诱导重编程的化合物、蛋白质等，只要它们包括上述的包含KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体或含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体。优选重编程的必要因子全部由仙台病毒载体表达；然而，也可以仅一部分由仙台病毒载体表达而其它部分由其它载体和/或化合物(例如蛋白质或低分子化合物)供给。此外，本发明的经重编程的细胞的制造方法并不限于全部的基因导入均使用仙台病毒载体来进行的方法。更具体地说，本发明的方法只需使用至少包含KLF基因、OCT基因和SOX基因的上述仙台病毒载体和含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，还包括组合使用表达重编程因子的其它载体(染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)和/或诱导重编程的化合物等。优选地，它们通过进一步与含有MYC基因或Glis1基因的上述仙台病毒载体组合使用。

本发明还提供以下项：

[1]一种在通过导入在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体诱导多能干细胞的方法(包括产生多能干细胞的方法)中，改进诱导多能干细胞的效率(包括改进产生多能干细胞的效率)的方法，其中所述方法包括进一步导入包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体的步骤；

[2][1]的方法，其中所述依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体是温度敏感型病毒载体；

[3][2]的方法，其中所述温度敏感型病毒载体是温度敏感型仙台病毒载体；

[4][3]的方法，其中所述温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含选自下组的突变：TS 7(L蛋白中Y942H，L1361C和L1558I突变),TS 12(P蛋白中D433A，R434A和K437A突变),TS 13(P蛋白中D433A，R434A和K437A突变和L蛋白中L1558I突变),TS 14(P蛋白中D433A，R434A和K437A突变和L蛋白中L1361C),TS 15(P蛋白中D433A，R434A和K437A突变和L蛋白中L1361C和L1558I突变)；

[5][4]的方法，其中所述温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步包括TS 12突变(P蛋白中D433A，R434A和K437A突变)；

[6][3]至[5]任一项的方法，其中KLF基因，OCT基因和SOX基因以此顺序整合紧接到仙台病毒的P基因之后(在负链RNA基因组的P基因的5’侧)；

[7][3]的方法，其中所述温度敏感型仙台病毒载体选自下组：SeV(PM)KOS/TS7ΔF和SeV(PM)KOS/TS12ΔF；

[8][1]至[7]任一项的方法，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体是仙台病毒载体；

[9][8]的方法，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是具有在37℃抑制NTVLP形成的突变的仙台病毒载体；

[10][8]的方法，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[11][8]至[10]任一项的方法，其中KLF基因整合到N基因的上游(在负链RNA基因组中N基因的3’侧)；

[12][8]的方法，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是SeV18+KLF4/TSΔF；

[13][1]至[12]任一项的方法，其进一步包含导入插入有MYC基因的载体的步骤；

[14][13]的方法，其中所述插入有MYC基因的载体是仙台病毒载体；

[15][14]的方法，其中所述插入有MYC基因的仙台病毒载体是温度敏感型仙台病毒载体；

[16][15]的方法，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含选自下组的突变：TS 7，TS 12，TS 13，TS 14和TS 15；

[17][16]的方法，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步包含TS 15突变(P蛋白中的D433A，R434A和K437A突变，和L蛋白中的L1361C和L1558I突变)；

[18][14]至[17]任一项的方法，其中MYC基因整合到L基因紧接之前(在负链RNA基因组的3’侧)；

[19][14]的方法，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF；

[20][13]至[19]任一项的方法，其中所述MYC基因是c-rMyc；

[21][1]至[20]任一项的方法，其不涉及在低温下培养；和

[22][21]的方法，其中在约37℃进行培养。

本发明还提供以下项：

[1]包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体在制造药物中的用途，所述药物用于在通过导入在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体诱导多能干细胞的方法(包括产生多能干细胞的方法)中改进诱导多能干细胞的效率(包括改进产生多能干细胞的效率)；

[2][1]的用途，其中所述依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体是温度敏感型病毒载体；

[3][2]的用途，其中所述温度敏感型病毒载体是温度敏感型仙台病毒载体；

[4][3]的用途，其中所述温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含选自下组的突变：TS 7，TS 12,TS 13,TS 14,和TS 15；

[5][4]的用途，其中所述温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步包括TS 12突变(P蛋白中D433A，R434A和K437A突变)；

[6][3]至[5]任一项的用途，其中KLF基因，OCT基因和SOX基因以此顺序整合到仙台病毒的P基因的紧接之后(在负链RNA基因组的P基因的5’侧)；

[7][3]的用途，其中所述温度敏感型仙台病毒载体选自下组：SeV(PM)KOS/TS7ΔF和SeV(PM)KOS/TS12ΔF；

[8][1]至[7]任一项的用途，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体是仙台病毒载体；

[9][8]的用途，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是具有在37℃抑制NTVLP形成的突变的仙台病毒载体；

[10][8]的用途，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[11][8]至[10]任一项的用途，其中KLF基因整合到N基因的上游(在负链RNA基因组中N基因的3’侧)；

[12][8]的用途，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是SeV18+KLF4/TSΔF；

[13][1]至[12]任一项的用途，其进一步包含导入插入有MYC基因的载体的步骤；

[14][13]的用途，其中所述插入有MYC基因的载体是仙台病毒载体；

[15][14]的用途，其中所述插入有MYC基因的仙台病毒载体是温度敏感型仙台病毒载体；

[16][15]的用途，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含选自下组的突变：TS 7，TS 12，TS 13，TS 14和TS 15；

[17][16]的用途，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步包含TS 15突变(P蛋白中的D433A，R434A和K437A突变，和L蛋白中的L1361C和L1558I突变)；

[18][14]至[17]任一项的用途，其中MYC基因整合到L基因紧接之前(在负链RNA基因组的3’侧)；

[19][14]的用途，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF；

[20][13]至[19]任一项的用途，其中所述MYC基因是c-rMyc；

[21][1]至[20]任一项的用途，其不涉及在诱导和/或产生期间在低温下培养；和

[22][21]的用途，其中在约37℃进行培养。

本发明还提供以下项：

[1]一种用于诱导多能干细胞(包括产生多能干细胞)的组合物和试剂盒，包含(a)在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体和(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体；

[2][1]的组合物和试剂盒，其中所述依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体是温度敏感型病毒载体；

[3][1]的组合物和试剂盒，其中所述温度敏感型病毒载体是温度敏感型仙台病毒载体；

[4][3]的组合物和试剂盒，其中所述温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含选自下组的突变：TS 7，TS 12,TS 13,TS 14,和TS 15；

[5][4]的组合物和试剂盒，其中所述温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步包括TS 12突变(P蛋白中D433A，R434A和K437A突变)；

[6][3]至[5]任一项的组合物和试剂盒，其中KLF基因，OCT基因和SOX基因以此顺序整合到仙台病毒的P基因紧接之后(在负链RNA基因组的P基因的5’侧)；

[7][3]的组合物和试剂盒，其中所述温度敏感型仙台病毒载体选自下组：SeV(PM)KOS/TS7ΔF和SeV(PM)KOS/TS12ΔF；

[8][1]至[7]任一项的组合物和试剂盒，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体是仙台病毒载体；

[9][8]的组合物和试剂盒，其中包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是具有在37℃抑制NTVLP形成的突变的仙台病毒载体；

[10][8]的组合物和试剂盒，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；

[11][8]至[10]任一项的组合物和试剂盒，其中KLF基因整合到N基因的上游(在负链RNA基因组中N基因的3’侧)；

[12][8]的组合物和试剂盒，其中含有KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是SeV18+KLF4/TSΔF；

[13][1]至[12]任一项的组合物和试剂盒，其进一步包含插入有MYC基因的载体；

[14][13]的组合物和试剂盒，其中所述插入有MYC基因的载体是仙台病毒载体；

[15][14]的组合物和试剂盒，其中所述插入有MYC基因的仙台病毒载体是温度敏感型仙台病毒载体；

[16][15]的组合物和试剂盒，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含选自下组的突变：TS 7，TS 12，TS 13，TS 14和TS 15；

[17][16]的组合物和试剂盒，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变，并进一步包含TS 15突变(P蛋白中的D433A，R434A和K437A突变，和L蛋白中的L1361C和L1558I突变)；

[18][14]至[17]任一项的组合物和试剂盒，其中MYC基因整合到L基因紧接之前(在负链RNA基因组的3’侧)；

[19][14]的组合物和试剂盒，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF；

[20][13]至[19]任一项的组合物和试剂盒，其中所述MYC基因是c-rMyc；

[21][1]至[20]任一项的组合物和试剂盒，其不涉及在诱导和/或产生期间在低温下培养；和

[22][21]的组合物和试剂盒，其中在约37℃进行培养。

本发明还提供以下项：

[1]一种用于改进诱导多能干细胞的效率(包括改进产生多能干细胞的效率)的组合物和试剂盒，包含(a)在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体和(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的载体；

[6][3]至[5]任一项的组合物和试剂盒，其中KLF基因，OCT基因和SOX基因以此顺序整合到仙台病毒的P基因的紧接之后(在负链RNA基因组的P基因的5’侧)；

[13][1]至[12]任一项的组合物和试剂盒，其进一步包含使用插入有MYC基因的载体；

[22][21]的组合物和试剂盒，其中在约37℃进行培养。

在本说明书中描述的本发明中，优选组合特别地将KLF基因，OCT基因和SOX基因以此顺序插入一个仙台病毒载体(优选SeV(PM)KOS/TS12ΔF)的载体与含有KLF4基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体(优选SeV18+KLF4/TSΔF)组合。这个时候，更优选将其进一步与表达MYC基因的仙台病毒载体(优选SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF)组合。

导入的因子(KLF基因、OCT基因、SOX基因，MYC基因等)可根据要重编程的细胞的来源来合适地选择，且它们可来源于人类或其他哺乳动物诸如小鼠、大鼠、猪，或灵长类例如猴。此外，基因和蛋白质序列并不一定必须是野生型序列，只要它们能够诱导重编程，它们可以具有突变。使用突变体基因产生多能干细胞的例子是已知的(WO 2007/69666)。例如，编码具有一个或少数个(例如数个，不超过3个、不超过5个、不超过10个、不超过15个、不超过20个或不超过25个)氨基酸添加、缺失、取代和/或插入，且能够诱导重编程的氨基酸序列的基因可以在本发明中使用。此外，只要生物学活性(诱导重编程的能力)得以维持，可以使用例如在N末端和/或C末端缺失或添加一个至数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸的多肽，取代了一个至数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸的多肽等。可以使用的变体包括例如天然蛋白质的片段、类似物和衍生物，以及天然蛋白质与其他多肽的融合蛋白(例如添加有异源信号肽或抗体片段者)。具体地，包括这样的多肽：其包含在野生型氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，并具有与野生型蛋白等同的生物学活性(例如诱导重编程的活性)。当使用野生型蛋白质的片段时，通常，该片段含有野生型多肽(在分泌型蛋白的情况下为成熟形式)的70％以上、优选80％以上、85％以上、更优选90％以上、95％以上或98％以上的连续区域。

氨基酸序列的变体例如可以通过在编码天然多肽的DNA中导入突变来制备(Walker and Gaastra,eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company,New York,1983)；Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492,1985；Kunkel等，Methods Enzymol.154:367-382,1987；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Plainview,N.Y.),1989；U.S.Pat.No.4,873,192)。关于进行氨基酸取代而不影响生物学活性的指导的例子包括Dayhoff等的报道(Dayhoff等，收录于Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.),1978)。

对于进行修饰的氨基酸的数目没有特殊限制，但例如是天然的成熟型多肽的全部氨基酸的30％以下、优选25％以下、更优选20％以下、更优选15％以下、更优选10％以下、5％以下或3％以下，且为例如15个氨基酸以下、优选10个氨基酸以下、更优选8个氨基酸以下、更优选5个氨基酸以下、更优选3个氨基酸以下。在对氨基酸氨基酸进行取代时，通过取代成侧链性质相似的氨基酸可以期待保持蛋白质的活性。这样的取代在本发明中称作保守取代。保守取代的例子包括诸如下列各组中的氨基酸之间的取代等：碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等各组内的氨基酸之间的取代等。此外，可以列举出例如，BLOSUM62取代矩阵(S.Henikoff and J.G.Henikoff,Proc.Acad.Natl.Sci.USA 89:10915-10919,1992)中处于正值关系的氨基酸之间的取代。

经修饰的蛋白质与野生型蛋白质的氨基酸序列之间显示高同源性。高同源性是指：具有例如70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或96％以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如BLASTP程序(Altschul,S.F.等，J.Mol.Biol.215:403-410,1990)来确认。例如，可以在NCBI(National Center for BiothchnologyInformation)的BLAST的网页上，使用默认参数来进行检索(Altschul S.F.等，Nature Genet.3:266-272,1993；Madden,T.L.等，Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul S.F.等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Zhang J.&Madden T.L.,Genome Res.7:649-656,1997)。例如，通过进行2个序列的比较的Blast2序列程序(Tatiana A等，FEMS Microbiol Lett.174:247-250,1999)，制作2个序列的比对，可以确定序列的同一性。空位和错配类似对待，计算出例如相对于天然型细胞因子(分泌后的成熟型的形态)的氨基酸序列全体的同一性的值。具体地，计算出野生型蛋白质(若为分泌蛋白质则为成熟型)的全部氨基酸数中的一致的氨基酸数的比例。

此外，基因可以导入沉默突变，使得所编码的氨基酸序列不改变。特别是，在富含AT的基因中，将5个以上的连续的A或T核苷酸取代成G或C，而不改变所编码的氨基酸序列，从而能够稳定地获得基因的高表达。

修饰蛋白质或者用于重编程的蛋白质的例子是与编码野生型蛋白质的基因的编码区域的一部分或全部在严格条件下杂交的核酸所编码的、具有与野生型蛋白质等同的活性(诱导重编程的活性)的蛋白质。在杂交中，例如，可以从包含野生型蛋白质基因的编码区域序列或其互补序列的核酸或作为杂交对象的核酸中的任何一方制备探针，并可以通过检测其是否与另一方的核酸杂交来进行鉴定。严格杂交的条件例如是：在含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑鱼精DNA、5xDenhardt液(1xDenhardt溶液含0.2％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白以及0.2％Ficoll)的溶液中，于60℃、优选65℃、更优选68℃进行杂交，然后在与杂交相同的温度下，于2xSSC中、优选1xSSC中、更优选0.5xSSC中、更优选0.1xSSC中振荡洗涤2小时的条件。

为了诱导细胞的重编程特别优选的基因的例子通常包括：F-框蛋白15(Fbx15,NM_152676,NM_015798)、Nanog(NM_024865,AB093574)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532,NM_181548)、DPPA2(NM_138815,NM_028615)、OCT3/4(也称POU5F1；NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、SOX2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、TCL1A(T细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966,NM_009337)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235,NM_010637)、联蛋白β1(钙联蛋白相关蛋白beta 1；NM_001904,NM_007614；包括S33Y突变体)、c-MYC(NM_002467,NM_010849；包括T58A突变体)、以及Glis1基因(Maekawaet al.,Nature,474:225-229,2011；NM_147193,NM_147221)，以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。有报导称，在导入这些基因的情况下，显示出诱导多能干细胞的形态的集落的比例高于导入4种基因(OCT3/4、SOX2、KLF4、和c-MYC)时的比例(WO2007/69666)。因此，除了本发明的携带KLF基因，OCT基因，和SOX基因的仙台病毒载体和含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的载体外，进一步使用除了KLF基因、OCT基因和SOX基因之外进一步携带上述基因中的任何一个或其组合的仙台病毒载体，除KFL基因外携带不同于OCT基因和SOX基因的基因的仙台病毒载体，或携带上述基因的任意一个或其组合的仙台病毒载体在本发明中可以用于诱导细胞的重编程，特别是它们可以有利地用于诱导多能干细胞。各个病毒载体可以在使用时进行组合来使用。此外，也可以预先做成试剂盒，或者混合起来作为组合物。此外，本发明还包括除了在一个载体中依次包含KFL基因，OCT基因和SOX基因的载体和含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的载体外，进一步导入含有任意(或全部)上述基因的任意组合的一种或多种仙台病毒载体的方法，含有这些载体的试剂盒和组合物。

优选将用于表达KLF基因、OCT基因和SOX基因的本发明的载体和含有KLF基因到不含有OCT基因和SOX基因的载体组合，特别是与表达MYC和/或Glis1基因的载体组合(Takahashi,K.and Yamanaka S.,Cell 126,663-676,2006；Lowry WE等，Proc Natl Acad Sci U S A,105(8):2883-8,2008；Masaki,H.等，Stem Cell Res.1:105-115,2008；Maekawa et al.,Nature,474:225-229,2011；WO2007/69666)。此处，SOX蛋白质、KLF蛋白质、MYC蛋白质和OCT蛋白质、以及它们的基因是指分别属于SOX家族、KLF家族、MYC家族和OCT家族的成员的蛋白质和基因。有报告称，通过进行调整使得分别表达1个以上的这4个家族的成员，可以从各种已分化的细胞诱导多能干细胞。例如，有报告称，对于SOX家族的基因，使用SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX17中的任何一个基因，均可以诱导多能干细胞(WO2007/69666)。此外，对于KLF家族，使用KLF4或KLF2均能够诱导多能干细胞(WO2007/69666)。对于MYC家族，不仅是使用野生型c-MYC、使用T58A突变体或N-MYC、L-MYC也能够诱导多能干细胞(WO2007/69666；Blelloch R.等，Cell StemCell,1:245-247,2007)。这样，由于可以通过多种方式选择家族的基因然后使用，可以适宜地选择上述的4种家族基因来诱导重编程。

具体地，KLF家族包括KLF1(NM_006563,NM_010635)、KLF2(NM_016270,NM_008452)、KLF4(NM_004235,NM_010637)、和KLF5(NM_001730,NM_009769)；MYC家族包括c-MYC(NM_002467,NM_010849,含T58A突变体)、N-MYC(NM_005378,NM_008709)、和L-MYC(NM_005376,NM_005806)；OCT家族包括OCT1A(NM_002697,NM_198934)、OCT3/4(NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、和OCT6(NM_002699,NM_011141)；SOX家族包括SOX1(NM_005986,NM_009233)、SOX2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、SOX3(NM_005634,NM_009237)、SOX7(NM_031439,NM_011446)、SOX15(NM_006942,NM_009235)、SOX17(NM_022454,NM_011441)、和SOX18(NM_018419,NM_009236)。依照本发明的顺序携带这些基因中的任一个的仙台病毒载体，在本发明中可以用于诱导细胞的脱分化，特别优选用于诱导多能干细胞。最优选的KLF基因，OCT基因，和SOX基因分别是OCT3/4基因，SOX2基因，和KLF4基因。

MYC家族的基因对于多能干细胞的诱导并非必需，仅使用除MYC家族基因以外的3个家族的基因也能够诱导多能干细胞(Nakagawa M.等，NatBiotechnol.26(1):101-6,2008；Wering M.等，Cell Stem Cell 2(1):10-2,2008)。在不表达MYC基因的情况下，例如，使用p53 siRNA和UTF1能够使多能干细胞的诱导效率显著地提高(Y.Zhao等，Cell Stem Cell,3(5):475-479,2008；N.Maherali,and K.Hochedlinger,Cell Stem Cell,3(6):595-605,2008)。此外，有报告称，仅使用除KLF家族的基因之外的3个家族的基因也能够诱导多能干细胞(Park IH等，Nature,451(7175):141-6,2008)。此外，有报告称，通过结合使用G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂(BIX-01294；Kubicek,S.等，Mol.Cell 25,473-481,2007)，仅使用3个基因，即KLF基因、SOX基因和MYC基因就可以从胚胎NPC诱导多能干细胞(Shi Y等，Cell Stem Cell,2(6):525-8,2008)。编码各基因的病毒载体可以分别单独制备。它们可以在使用时组合使用。可以将它们任意组合或全部组合在一起作为试剂盒，或者混合起来形成组合物。除了本发明的携带KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体和含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体之外，本发明还涉及包含含有除了这三种基因和化合物之外的基因的任意组合(或全部)的试剂盒或组合物。基因可以适合地装载到重组载体上。而且，还可以将该试剂盒中所含的一部分重组载体替换成具有相当功能的蛋白质、合成化合物等。

在以上描述的基因的组合中，还可以进一步组合其它基因，来提高重编程的诱导效率。这样的基因的例子包括TERT(NM_198253,NM_009354)和/或SV40大T抗原(NC_001669.1,Fiers,W.(05-11-1978)Nature273:(5658)113-120)(Park IH.等，Nature,451(7175):141-6,2008)。可以进一步组合选自HPV16 E6、HPV16 E7、和Bmil(NM_005180,NM_007552)中的1个或多个基因。此外，可以表达选自Fbx15(Mol Cell Biol.23(8):2699-708,2003)、Nanog(Cell 113:631-642,2003)、Eras(Nature 423,541-545,2003)、DPPA2(Development 130:1673-1680,2003)、TCL1A(Development 130:1673-1680,2003)、以及β-联蛋白(Nat Med 10(1):55-63,2004)中的基因的1个或任意组合。而且，可以组合选自ECAT1(AB211062,AB211060)、DPPA5(NM_001025290,NM_025274,XM_236761)、DNMT3L(NM_013369,NM_019448)、ECAT8(AB211063,AB211061)、GDF3(NM_020634,NM_008108)、SOX15(NM_006942,NM_009235)、DPPA4(NM_018189,NM_028610)、FTHL17(NM_031894,NM_031261)、SALL4(NM_020436,NM_175303)、Rex-1(NM_174900,NM_009556)、Utf1(NM_003577,NM_009482)、DPPA3(NM_199286,NM_139218,XM_216263)、STAT3(NM_139276,NM_213659)、和GRB2(NM_002086,NM_008163)中的1个或多个基因。除了KLF基因、OCT基因和SOX基因之外还包含NANOG基因(NM_024865,AB093574)和LIN28基因(NM_024674)的各基因的组合对于诱导多能干细胞是有用的(Yu J.et al.,Science,318(5858):1917-20,2007)。此外，优选再与MYC基因组合(Liao J等，Cell Res.18(5):600-3,2008)。通过额外表达这些基因，可促进多能干细胞的诱导(WO2007/69666)。在以成熟B细胞作为对象的情况下，例如，可以异处表达髓细胞转录因子C/EBPα(CCAAT/增强子结合蛋白α)(NM_004364)，或者抑制B细胞转录因子Pax5(成对框5；NM_016734)的表达，来促进重编程(Hanna J,Cell.133(2):250-64,2008)。这些因子也可以使用本发明中的染色体非整合型病毒载体进行表达。而且，该试剂盒中所包含的一部分重组载体可以替换成具有相当功能的蛋白质、合成化合物等。

此外，除了表达上述的因子以外，例如，通过与添加化合物组合，也能够提高重编程的效率。例如，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和/或SCF(干细胞因子)可促进多能干细胞的诱导，而且能够在多能干细胞的诱导中代替c-MYC的功能(WO2007/69666)。此外，MAP激酶抑制剂(PD98056)也可以用于建立更接近于ES细胞的多能干细胞等用途(WO2007/69666)。此外，有报告称DNA甲基化酶(Dnmt)抑制剂和/或组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂能够改善多能干细胞的诱导效率(Huangfu D等，Nat Biotechnol.(在线发表2008年6月22日,doi:10.1038/nbt1418)；Nat.Biotechnol.26,795-797(2008))。例如，通过组合使用HDAC(VPA)，仅导入OCT4和SOX2这2个基因就能够诱导多能干细胞(Huangfu,D.等，Nat Biotechnol.2008 26(11):1269-75)。本发明的载体可以用于与这些化合物的施用组合使用。作为Dnmt抑制剂，可以使用例如5-氮杂胞苷等；作为HDAC抑制剂，可以使用例如N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)、丙戊酸抑制物(VPA)等。此外，在使用5-氮杂胞苷时，组合使用糖皮质激素(地塞米松)可以提高效率。

为了重编程细胞，例如，(1)本发明的依次含有KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，和含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，(2)(1)的载体与用于表达MYC基因或Glis1基因的仙台病毒载体的组合，(3)通过对(1)和/或(2)进一步加入用于表达NANOG基因的仙台病毒载体以及用于表达LIN28的仙台病毒载体而产生的组合，(4)(1)至(4)任一项的载体和携带上述其它期望的重编程因子和/或期望的重编程诱导化合物的载体的组合等可以导入细胞中。在组合并导入多个载体和/或化合物的情况下，导入优选同时进行，具体地，优选在添加最初的载体或化合物等后的48小时以内、优选36小时以内、更优选24小时以内、18小时以内、12小时以内、10小时以内、8小时以内、6小时以内、3小时以内、2小时以内或1小时以内，将全部编码重编程因子的载体和/或化合物添加完毕。载体的剂量可以适宜制备，且MOI为例如0.1或更多，优选0.3或更多，0.5或更多，1或更多，2或更多，3或更多，4或更多，或5或更多，且100或更少，优选90或更少，80或更少，70或更少，60或更少，50或更少，40或更少，30或更少，20或更少，10或更少，或5或更少。优选以例如MOI 0.3～100、更优选MOI 0.5～50、更优选MOI 1～40、更优选MOI 1～30、更优选MOI 2～30、例如MOI 3～10进行感染。诱导出的多能干细胞形成与ES细胞十分相似的扁平集落，并表达碱性磷酸酶。此外，诱导出的多能干细胞可以表达未分化细胞标志物Nanog、OCT4和/或SOX2等。此外，诱导出的多能干细胞优选表达TERT和/或显示端粒末端转移酶活性。本发明还涉及表达碱性磷酸酶、优选还表达未分化细胞标志物Nanog和/或TERT的细胞的制造方法，以及上述仙台病毒载体在制作这些细胞和制造用于诱导这些细胞的药剂中的用途。

根据本发明，能够从希望的细胞(包括成人皮肤细胞和新生儿包皮细胞)产生多能干细胞。根据本发明，可以从至少某些类型的细胞(例如成人皮肤细胞和/或新生儿包皮细胞)诱导多能干细胞的集落，例如以0.03×10^-5以上、0.1×10^-5以上、0.3×10^-5以上、0.5×10^-5以上、0.8×10^-5以上、或1×10^-5以上(例如1×10^-5～1×10^-3)的出现率，优选以1.5×10^-5以上、1.7×10^-5以上、2.0×10^-5以上、2.5×10^-5以上、3×10^-5以上、4×10^-5以上、5×10^-5以上、8×10^-5以上、1×10^-4以上、2×10^-4以上、3×10^-4以上、5×10^-4以上、8×10^-4以上、1×10^-3以上、1.5×10^-3以上、2×10^-3以上、5×10^-3、1×10^-2以上、1.5×10^-2以上、2×10^-2以上、2.5×10^-2以上、3×10^-2以上、4×10^-2以上、或5×10^-2以上的出现率。例如，通过本发明，可以从人外周血单个核细胞诱导多能干细胞，以至少1×10^-2(0.01％)的效率，优选至少3×10^-2，5x10^-2，8x10^-2，1x10^-1，2x10^-1，3x10^-1，4x10^-1，或5x10^-1；并可以从人外周血单核细胞诱导多能干细胞，以至少1×10^-3(0.001％)的效率，优选至少3×10^-3，5x10^-3，8x10^-3，1x10^-2，2x10^-2，3x10^-2，4x10^-2，或5x10^-2。可以如上文所述适当地建立MOI，例如，其可以在5，10或30进行。对于至少给定的细胞，与其中使用本发明的表达KLF基因，OCT基因，和SOX基因的仙台病毒载体但不使用含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体的情况相比，通过本发明的依次含有KLF基因，OCT基因，和SOX基因的载体和含有KLF基因但不含有OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体的多能干细胞集落的出现的效率为，例如，1.2倍以上，优选1.3倍以上，1.5倍以上，1.7倍以上，2倍以上，2.5倍以上，3倍以上，3.5倍以上，4倍以上，4.5倍以上，或5倍以上。与常规方法相比，本发明的方法发挥出显著的效果，因为在载体导入后当在37℃培养时多能干细胞的诱导效率显著高，且多能干细胞的诱导后载体被迅速除去。

对于作为诱导重编程的对象的经分化的细胞，没有特殊限制，可以使用希望的体细胞等。不仅可以从小鼠胚胎来源的细胞生成多能干细胞已证明是可能的，从采集自成体小鼠尾部的经分化的细胞、或肝细胞和胃粘膜细胞生成也显示是可行的，这提示该生成并非依赖于细胞类型或分化状态(WO2007/069666；Aoi T.等，Science[2008年2月14日网上发表]；Science.2008；321(5889):699-702)。此外，对于人类，也已经确认可以从成人的面部皮肤来源的成纤维细胞、成人滑膜细胞、新生儿包皮来源成纤维细胞、成人间充质干细胞、成人手掌的皮肤细胞、胚胎细胞等多种多样的细胞诱导多能干细胞(Takahashi K et al.(2007)Cell 131:861-872；Park IH等，Nature,451(7175):141-6,2008)。此外，有报告称，从胰脏β细胞、B淋巴细胞这样的终末分化细胞同样可以诱导多能干细胞(Stadtfeld M等，Curr Biol.2008May 21.[PubMed,PMID:18501604]；Curr Biol.2008；18(12):890-4；Hanna J.等，Cell.133(2):250-64,2008)。这些认识提示，多能干细胞的诱导不依赖于作为来源的细胞。本发明的方法可以适用于从这些希望的体细胞诱导多能干细胞的过程中。具体地，作为重编程的对象的已分化的细胞包括成纤维细胞、滑膜细胞、口腔或胃等的粘膜细胞、肝细胞、骨髓细胞、牙胚细胞、血细胞(例如淋巴细胞和白细胞)、以及其它希望的细胞。血细胞可以是外周血细胞。还优选成纤维细胞，单核细胞，单个核细胞等。此外，细胞可以是来源于例如胚、胚胎、新生儿、小儿、成人或老年人的细胞。此外，对动物的来源没有特殊限制，包括哺乳动物，例如人和非人灵长类(猴等)、小鼠、大鼠等啮齿类和牛、猪、山羊等非啮齿类。

可以从重编程完成后的细胞的集落适宜选择出除去了载体的细胞。例如可以选择自然除去载体的细胞。为此目的，例如可以使用对病毒载体特异性的抗体(例如抗HN抗体)进行负选择。此外，在使用温度敏感性载体时，通过在正常温度(例如，约37℃，特别是36.5℃至37.5℃,优选36.6℃至37.4℃,且更优选36.7℃至37.3℃)下培养，或通过在稍微高的温度(例如37.5～39℃、优选38～39℃或38.5～39℃)下进行培养，可以简便地除去载体。当使用SeV(PM)/TSΔF，或向SeV(PM)/TSΔF中导入了更多突变如TS7,TS12,TS13,TS14,TS15而得到的载体时，传代导致载体的自然丢失。优选载体的例子包括但不限于SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV18+KLF4/TSΔF的组合。此外，在此情况下，可以使用SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF等导入MYC基因。SeV(PM)KOS/TS12ΔF,SeV18+KLF4/TSΔF,和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF的组合是特别优选的。此外不将MYC基因加载到携带有KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体具有以下优点，可以在不使用与癌发生相关的MYC基因的同时进行重编程。这一点有利的原因还在于可以从c-MYC、L-MYC、Glis1等中自由地选择在KLF基因、OCT基因和SOX基因之外的第四种因子。

采用本发明的方法制造的细胞可用于导致分化成各种组织或细胞，并可用于希望的检查、研究、诊断、试验、治疗等。例如，预期诱导出的干细胞可用于干细胞疗法。例如，可以使用采集自患者的体细胞，诱导重编程(reprogramming)，然后，将分化诱导所得的体性干细胞或其它体细胞移植给患者。对于细胞分化诱导的方法没有特殊限制，例如，可以通过视黄酸处理、各种增殖因子-细胞因子处理、利用激素进行的处理来诱导分化。此外，所得细胞可以用于检测希望的药物、化合物的效果，由此可以实施药物、化合物的筛选。

实施例

下面，参照实施例具体描述本发明；然而本发明不应理解为限于实施例。并入本文中引证的所有文件及其他参考资料作为本说明书的一部分。

[实施例1]

pSeV(PM)/TSΔF的构建

下面显示了用于产生在本实施例中使用的仙台病毒载体pSeV(PM)/TSΔF的方法。在本发明中，“(PM)”指插入重编程基因到P基因和M基因之间，“(HNL)”指插入重编程基因到HN基因和L基因之间。此外，在本发明中，“TS”指M蛋白中具有G69E,T116A和A183S突变，HN蛋白中具有A262T,G264R和K461G突变，P蛋白中具有L511突变，且在L蛋白中具有N1197S和K1795E突变；“ΔF”表示F基因缺失。下面，“SeV(PM)/TSΔF”是指在M蛋白中具有G69E,T116A和A183S突变、HN蛋白中具有A262T,G264R和K461G突变，P蛋白中具有L511F突变，且L蛋白中具有N1197S和K1795E突变的F基因缺失的仙台病毒载体(Z株)。该载体在P基因的紧邻下游(P基因和M基因之间)具有一个用于基因导入的插入位点(NotI位点)。但是，这些是示例性的，本发明不限于这些实例。

pSeV(PM)/TSΔF如下构建。实施PCR(94℃3分钟，25个[98℃10秒,55℃15秒,72℃12分钟]的循环，然后72℃7分钟)使用LitmusSalINheIfrgPmutMtsHNtsΔF-GFP delGFP(国际公布号WO2010/008054)作为模板，以及PMNOTI-F(5’-GAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATGGCAGATATCTATAG-3’)(SEQID NO:10)和PMNOTI-R(5’-CTATAGATATCTGCCATTGCGGCCGCTTAGGTGAAATTTC-3’)(SEQ IDNO:11)。所得的大约11-kb PCR产物用DpnI处理，然后将大肠杆菌DH5α(ToYoBo编码号DNA-903)用20μL的该反应液转化。通过NotI消化选出具有NotI序列的质粒。然后通过测序选出具有正确序列的克隆。如此，得到Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNts(PM)-dF。然后，将LitmusSalINheIfrgPmutMtsHNts(PM)-dF用SalI和NheI消化，将收集的片段(大约8kbp)连接于用SalI/NheI消化在L基因中具有两个突变的pSeV/ΔSalINheIfrgLmut质粒(国际公布号WO2003/025570)后收集到的片段(大约8kbp)。如此，得到pSeV(PM)/TS F。该载体在P基因和M基因之间具有一个用于基因导入的插入位点(NotI位点)。从该载体的转录产物生成的仙台病毒称为SeV(PM)/TSΔF。

[实施例2]

pSeV18+KLF4/TSΔF的构建

通过使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio Inc.,Catalogue,catalogNo.R010A)进行PCR，从Jurkat cDNA文库扩增KIF4基因，并将这插入BlueScript质粒载体的NotI位点以获得质粒pBS-KS-KLF4(WO2010/008054)。使用NotI消化pBS-KS-KLF4(37℃,3小时)，并通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离。将约1.5kbp的条带切下，并使用Qiaquick GelExtraction Kit(Quiagen,Catalogue)纯化。将含有该KLF4基因的NotI片段克隆到pSeV18+/TSΔF载体的NotI位点，且通过测序选择具有正确序列的克隆以获得SeV18+KLF4/TSΔF。从pSeV18+/TSΔF载体的转录产物生成的仙台病毒称为SeV18+/TSΔF，而从pSeV18+KLF4/TSΔF载体的转录产物生成的仙台病毒称为SeV18+KLF4/TSΔF。

[实施例3]

pSeV(PM)/TS12ΔF的构建

使用PrimeStar以pSeV(PM)/TSΔF为模板以及引物F3208(5’-AGAGAACAAGACTAAGGCTACC-3’(SEQ ID NO:12))和R3787(5’-ACCTTGACAATCCTGATGTGG-3’(SEQ ID NO:13))实施PCR(94℃3分钟，以及30个[98℃10秒,55℃15秒,及72℃15分钟]循环,然后是72℃5分钟，且于4℃∞)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化大约600bp的扩增条带。使用PrimeStar以pSeV18+Oct3/4/TS12ΔF(WO2010/008054；WO2012/029770)作为模板,以及引物F2001(5’-CCATCAACACTCCCCAAGGACC-3’(SEQ ID NO:14))和R3390(5’-AGACGTGATGCGTTTGAGGCCC-3’(SEQ ID NO:15))实施PCR(94℃3分钟，以及30个[98℃10秒,55℃15秒,及72℃1.5分钟]循环,然后是72℃5分钟,且于4℃∞)。将大约1.4kbp的扩增条带用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。将这些PCR产物混合，使用PrimeStar和F2001及R3787引物实施PCR(94℃3分钟，以及30个循环[98℃10秒,55℃15秒,及72℃2分钟],然后是72℃5分钟,且于4℃∞)。PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化，用SalI和NotI消化，然后用琼脂糖凝胶电泳分离。然后切出大约1.6kbp的条带，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。用SalI和NotI消化pSeV(PM)/TSΔF，然后用琼脂糖凝胶电泳分离。然后切出大约14.8kbp的条带，并用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。使用这两个经SalI和NotI消化并纯化的产物进行连接，通过测序选出一个具有正确序列的克隆以得到pseV(PM)/TS12ΔF。该载体在P基因和M基因之间具有一个用于基因导入的插入位点(NotI位点)。从该载体的转录产物生成的仙台病毒称为SeV(PM)/TS12ΔF。

[实施例4]

SeV(PM)KOS/TS12ΔF的构建

用于产生携带KLF4-OCT3/4-SOX2基因的SeV/TS12ΔF载体的质粒如下所示产生。pSeV(PM)/TSΔF用NotI消化，然后用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAGEN目录号28106)纯化，然后进行BAP处理。然后，将这用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化。用NotI消化pSeV(PM)KOS/TSΔF，用1％琼脂糖凝胶电泳分离,切出大约3.6kbp的条带,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,目录号28706)进行纯化。使用100μL试剂盒附带的洗脱液进行洗脱。将含有KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因的NotI片段克隆到载体pSeV(PM)/TS12ΔF的NotI位点中，通过测序选择了一个具有正确序列的克隆。如此，得到了pSeV(PM)KOS/TS12ΔF。从该载体的转录产物生成的仙台病毒称为SeV(PM)KOS/TS12ΔF。

[实施例5]

pSeV(HNL)c-rMyc/TS15ΔF的生成

使用SalI-NheI分别消化Litmus38TSΔF-P2ΔGFP和pSeV/TSΔF-接头L1361CL1558I(WO2010/008054；WO2012/029770)，通过琼脂糖凝胶电泳分离，分别切下8.0kbp和8.3kbp的条带并纯化。将这些纯化的片段连接以获得pSeV(HNL)/TS15ΔF(一种编码SeV(HNL)/TS15ΔF的反基因组的质粒)。向该pSeV(HNL)/TS15ΔF的NotI位点引入含有c-rMyc基因的NotI片段，其是通过NotI消化从pBS-KS-c-rMyc切下并纯化的，以获得pSeV(HNL)c-rMyc/TS15ΔF。c-rMyc的核苷酸序列和氨基酸序列示于SEQ IDNO:8和9。c-rMyc具有a378g，t1122c，t1125c，a1191g，和a1194g突变。从该载体的转录产物生成的仙台病毒称为SeV(HNL)c-rMyc/TS15ΔF。

[实施例6]

通过保持细胞重编程-1的基因的仙台病毒载体诱导的多能干细胞(iPS细胞)的产生

在37℃下在5％CO₂培养箱中，将来自ATCC的人新生儿包皮来源的成纤维细胞(BJ)(CRL-2522；www.atcc.org)在含有10％FBS(GIBCO-BRL)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml；Nacalai Tesque,Code 26253-84)，10％FBS(Cell Culture Bioscience,Cat.No.171012)的DMEM(GIBCO-BRL,11995)(下文称为10％FBS/PS/DMEM)中以5x10⁵培养过夜。然后，使用载体在以下条件下感染细胞。

条件1:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝3

条件2:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝10

条件3:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

SeV18+/TSΔF MOI＝3

条件4:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

SeV18+/TSΔF MOI＝10

条件5:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

条件6:不施用载体组(对照组)

在上述载体施用到细胞后，将它们在37℃下在5％CO₂培养箱中培养。以n＝2进行评估。培养基几乎每天使用10％FBS/PS/DMEM更换。在感染的第6天，将使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液分离的1.0×10⁴个(细胞)上述引入载体的细胞添加到制备于明胶包被的6孔板中的1.25×10⁵个(细胞)丝裂霉素处理的饲养细胞(例如，MEF)，并将它们在CO₂培养箱中培养。次日，将培养基从10％FBS/PS/DMEM更换为具有4ng/ml的bFGF添加的灵长类ES细胞培养基(ReproCell,RCHEMD001)，并将细胞在37℃下在5％CO₂培养箱中培养。每天或每两天一次进行培养基更换。该培养基可以是饲养细胞的条件培养基。

在感染的第28天，使用NBCT/BCIP((PIERCE；NBT/BCIP,1-Step,#34042)通过染色碱性磷酸酶的活性观察iPS细胞诱导的效率，所述碱性磷酸酶是ES细胞未分化的标志物(图1)。与没有添加SeV18+KLF4/TSΔF载体的测试组(以上条件5)相比，具有SeV18+KLF4/TSΔF载体添加的测试组(以上条件1和2)表现出以依赖于添加的SeV18+KLF4/TSΔF载体的量的方式的iPS细胞诱导效率的改进。图2示出了n＝2的平均诱导效率的图表。当以MOI＝3添加SeV18+KLF4/TSΔF载体时，iPS细胞诱导的效率改进约6.9倍，当其以MOI＝10添加时改进约12倍。当以MOI＝3添加SeV18+/TSΔF载体时，iPS细胞诱导的效率改进约3.2倍，而当其以MOI＝10添加时改进约6倍。

[实施例7]

通过保持细胞重编程-2的基因的仙台病毒载体诱导的多能干细胞(iPS细胞)的产生

在37℃下在5％CO₂培养箱中，将来自ATCC的人新生儿包皮来源的成纤维细胞(BJ)(CRL-2522；www.atcc.org)在含有10％FBS(GIBCO-BRL)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml；Nacalai Tesque,Code 26253-84)，10％FBS(Cell Culture Bioscience,Cat.No.171012)的DMEM(GIBCO-BRL,11995)中(下文称为10％FBS/PS/DMEM)以5x10⁵(细胞)培养过夜。然后，使用载体在以下条件下感染细胞。以n＝2进行评估。

条件1:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝5

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝5

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝5

条件2:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝10

条件3:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝5

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝5

条件4:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

条件5:不施用载体组1(对照组1)

条件6:不施用载体组2(对照组2)

在上述载体施用到细胞后，条件1，2和5在37℃下在5％CO₂培养箱中培养，而条件3，4和6在35℃下在5％CO₂培养箱中培养。培养基几乎每天使用10％FBS/PS/DMEM更换。在感染的第6天，将使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液分离的1.0×10⁴个(细胞)上述引入载体的细胞添加到制备于明胶包被的6孔板中的1.25×10⁵个(细胞)丝裂霉素处理的饲养细胞(例如，MEF)，并将它们在37℃下在5％CO₂培养箱中培养。次日，将培养基从10％FBS/PS/DMEM更换为具有4ng/ml的bFGF添加的灵长类ES细胞培养基(ReproCell,RCHEMD001)，并将细胞在37℃下在5％CO₂培养箱中培养。每天或每两天一次进行培养基更换。该培养基可以饲养细胞的条件培养基。

在感染的第28天，使用NBCT/BCIP((PIERCE；NBT/BCIP,1-Step,#34042)通过染色碱性磷酸酶的活性观察iPS细胞诱导的效率，所述碱性磷酸酶是ES细胞未分化的标志物(图3)。与没有添加SeV18+KLF4/TSΔF载体的测试组(以上条件3和4)相比，具有SeV18+KLF4/TSΔF载体添加的测试组(以上条件1和2)表现出iPS细胞诱导的高效率。在不施用载体组(以上条件5和6)中，没有观察到iPS细胞的诱导。图4示出了以n＝2获得的结果的平均值的图。

[实施例8]

通过保持细胞重编程-3的基因的仙台病毒载体诱导的多能干细胞(iPS细胞)的产生

在37℃下在5％CO₂培养箱中，将人成体皮肤来源的成纤维细胞HDF(Applications,Inc.106-05A-1388)在含有10％FBS(GIBCO-BRL)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml；Nacalai Tesque,Code 26253-84)，10％FBS(Cell Culture Bioscience,Cat.No.171012)的DMEM(GIBCO-BRL,11995)(下文称为10％FBS/PS/DMEM)中以5x10⁵(细胞)培养过夜。然后，使用载体在以下条件下感染细胞。以n＝2进行评估。

条件1:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝5

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝5

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝5

条件2:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝10

条件3:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

条件4:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝5

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝5

条件5:不施用载体组1(对照组1)

条件6:不施用载体组2(对照组2)

在上述载体施用到细胞后，条件1，2和5在37℃下在5％CO₂培养箱中培养，而条件3，4和6在35℃下在5％CO₂培养箱中培养。培养基几乎每天使用10％FBS/PS/DMEM更换。在感染的第6天，将使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液分离的1.0×10⁵个(细胞)上述引入载体的细胞添加到制备于明胶包被的6孔板中的1.25×10⁵个(细胞)丝裂霉素处理的饲养细胞(例如，MEF)，并将它们在37℃下在5％CO₂培养箱中培养。次日，将培养基从10％FBS/PS/DMEM更换为具有4ng/ml的bFGF添加的灵长类ES细胞培养基(ReproCell,RCHEMD001)，并将细胞在37℃下在5％CO₂培养箱中培养。每天或每两天一次进行培养基更换。该培养基可以是饲养细胞的条件培养基。

在感染的第28天，使用NBCT/BCIP((PIERCE；NBT/BCIP,1-Step,#34042)通过染色碱性磷酸酶的活性观察iPS细胞诱导的效率，所述碱性磷酸酶是ES细胞未分化的标志物(图5)。与没有添加SeV18+KLF4/TSΔF载体的测试组(以上条件3和4)相比，具有SeV18+KLF4/TSΔF载体添加的测试组(以上条件1和2)表现出iPS细胞诱导的高效率。在不施用载体组(以上条件5和6)中，没有观察到iPS细胞的诱导。图6示出了以n＝2获得的结果的平均值的图表。

[实施例9]

通过保持细胞重编程-4的基因的仙台病毒载体诱导的多能干细胞(iPS细胞)的产生

在37℃下在5％CO₂培养箱中，将人胎儿肺细胞来源的成纤维细胞(MRC-5；ATCC,CCL-171)在含有10％FBS(GIBCO-BRL)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml；Nacalai Tesque,Code 26253-84)，10％FBS(Cell CultureBioscience,Cat.No.171012)的DMEM(GIBCO-BRL,11995)中(下文称为10％FBS/PS/DMEM)以2x 10⁵(细胞)中培养过夜。然后，使用载体在以下条件下感染细胞。以n＝2进行评估。

条件1:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝5

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝5

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝5

条件2:

SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

SeV18+KLF4/TSΔF MOI＝10

条件3:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝5

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝5

条件4:SeV(PM)KOS/TS12ΔF+SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF

SeV(PM)KOS/TS12ΔF MOI＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF MOI＝30

条件5:不施用载体组1(对照组1)

条件6:不施用载体组2(对照组2)

在感染的第28天，使用NBCT/BCIP((PIERCE；NBT/BCIP,1-Step,#34042)通过染色碱性磷酸酶的活性观察iPS细胞诱导的效率，所述碱性磷酸酶是ES细胞未分化的标志物(图7)。与没有添加SeV18+KLF4/TSΔF载体的测试组(以上条件3和4)相比，具有SeV18+KLF4/TSΔF载体添加的测试组(以上条件1和2)表现出iPS细胞诱导的高效率。在不施用载体组(以上条件5和6)中，没有观察到iPS细胞的诱导。图8示出了以n＝2获得的结果的平均值的图表。

[实施例10]

对诱导的人工多能干细胞的体内多能性评估

在免疫功能不全的小鼠中通过畸胎瘤形成确认了体内多能性。将BJ细胞来源的iPS细胞克隆BJ-1215K#1或HDF细胞来源的iPS细胞克隆HDF-1215K#1皮下接种到SCID小鼠，并在约一个月后确认肿瘤块的形成。约2个月后，收集样本，在10％福尔马林中固定，并包埋在石蜡中。组织切片使用苏木精和曙红染色，并确认了三胚层分化(图9)。

[实施例11]

核型分析

在对Nihon Gene Research Laboratories Inc的请求中进行了第9次传代的BJ细胞来源的iPS细胞克隆BJ-1215K#1，HDF细胞来源的iPS细胞克隆HDF-1215K#1，和MRC-5细胞来源的iPS细胞克隆MRC5-1215K#1的核型分析。结果表明它们具有46条染色体，且核型是正常的(图10)。

[实施例12]

从小鼠成纤维细胞的iPS细胞诱导

将来自129+TER/SvJcl小鼠的成纤维细胞以5x10⁵细胞/孔接种到6孔板，并在CO₂培养箱中培养过夜(37℃,5％CO₂)。使用胰蛋白酶-EDTA溶液分离用于细胞计数测量的孔中的细胞，并测量每孔细胞的数量。基于该细胞计数计算载体的量。将SeV(PM)KOS/TS12ΔF载体，SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体和SeV18+KLF4/TSΔF载体的每一种以MOI＝5添加到10％FBS/PS/DMEM培养基，并将载体溶液制备为1ml的终溶液。将培养溶液从6孔板去除，接着通过添加制备的载体溶液，并在CO₂培养箱中进行培养约24个小时(37℃,5％CO₂)。接着去除细胞培养溶液，添加10％FBS/PS/DMEM培养基(2mL/孔)，并在CO₂培养箱中进行培养约24个小时(37℃,5％CO₂)。去除细胞培养溶液，添加ES细胞培养基(通过混合250ml的ES细胞培养基(Neurobasal medium；Life technologies,Cat.No.21103-049)，250ml的DMEM/F12,GlutaMAX(Life technologies,Cat.No.10565-018),10ml的B27(Life technologies,Cat.No.17504044),5ml的N2(Life technologies.Cat.No.17502-048),3.5μl的2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M3148-100ML),2.5ml的L-谷氨酸(Life technologies,Cat.No.25030-0841),5ml的青霉素-链霉素(Nacalai Tesque,Cat.No.26253-84),100μl的PD0325901(以5mM制备；Funakoshi,Cat.No.Axon1408),和100μl的CT99021(以15mM制备；Funakoshi,Cat.No.Axon1386)制备2i培养基)。将LIF(Millipore,Cat.No.ESG1106)以终浓度1000U/ml添加到2i培养基，并且这这用作小鼠ES细胞培养基(下文称为2i/LIF培养基))，并在CO₂培养箱中进行培养(37℃,5％CO₂)。在下文中，直到载体感染的第5天，在用在2i/LIF培养基更换培养基的情况下进行培养。感染的第5天，将饲养细胞以1.4x10⁵细胞/孔/2ml 10％FBS/PS/DMEM接种到用0.1％明胶溶液包被的6孔板，并以7x10⁵细胞/皿/10ml 10％FBS/PS/DMEM接种到10cm皿，并将它们在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。在感染的第6天，使用胰蛋白酶-EDTA溶液将载体感染的细胞分离，将2i/LIF培养基添加到准备的饲养细胞，将细胞以1x10⁴细胞/孔和1x10⁵细胞/孔的比例铺板到6孔板中，或以1x10⁴细胞/皿和1x10⁵细胞/皿的比例到10cm培养皿中，并在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。此后，进行iPS细胞的诱导，使用2i/LIF培养基几乎每天进行培养基更换。在感染的第21天，进行碱性磷酸酶染色(图11)。测量了iPS细胞样的碱性磷酸酶阳性细胞，且所得的诱导效率为约0.1％。

[实施例13]

获得小鼠iPS细胞的克隆

在感染的第16天，从实施例12中以1x10⁴细胞/皿和1x10⁵细胞/皿接种细胞的10cm皿中，分别挑出6个克隆和18个克隆，并将它们传代和培养。通过使用抗SeV抗体染色确认了仙台病毒的去除(图12)。结果表明，获得了9个仙台病毒载体阴性的克隆(克隆号：5-2，5-6，5-7，5-11，5-13，5-14，5-15，5-16和5-17)。

[实施例14]

通过免疫染色的基因表达分析

使用抗NANOG抗体和抗OCT4抗体通过免疫染色评估了实施例12中诱导的并在实施例13中确认为仙台病毒载体阴性的小鼠iPS细胞(图13)。结果表明，三个iPS细胞克隆(5-2，5-7和5-17)的NONOG和OCT4与作为阳性对照的小鼠ES细胞相似地染色。作为阴性对照的小鼠成纤维细胞的NANOG和OCT4没有染色。因而，显示了评估的iPS细胞在蛋白水平上表达NANOG和OCT基因。

[实施例15]

多能性的评估

对实施例12中诱导并在实施例13中确认为仙台病毒载体阴性的小鼠iPS细胞评估了它们的多能性。

通过在不含有LIF的血清培养基中培养形成了拟胚体(图14)。与小鼠ES细胞相同。

拟胚体形成后，将细胞在明胶包被的平板上传代并在不含有LIF的血清培养基中培养，在第4天通过GATA(一种转录因子，其为内胚层的标志物)染色对细胞核染色(图15)。

在不含有LIF的血清培养基中继续进行培养，并在明胶包被的培养板中完成传代。在第10天，观察到认为是搏动性心肌(pulsating cardiac muscles)的组织。在第14天，将细胞固定并使用针对α-辅肌动蛋白的抗体免疫染色(图16)。细胞整体染色。在它们之中，在一些区域观察到了强染色的细胞。

在不含有LIF的2i培养基中培养并在明胶包被的板中传代的第4天，示出了分化为βIII微管蛋白阳性(图17)和酪氨酸羟化酶阳性(图18)的神经细胞。这些结果表明通过使用本发明的仙台病毒载体，可以从小鼠细胞诱导具有三胚层分化能力的iPS细胞。

[实施例16]

从人单核细胞-1的iPS细胞的诱导

进行了从人CD14+单核细胞的iPS细胞的诱导。使用的单核细胞购自LONZA(Cat.No.2W-400C)。在含有10％胎牛血清和青霉素-链霉素的IMDM(此后称为10％FBS/PS/IMDM)中培养单核细胞。将冷冻的单核细胞在37℃水浴中解冻，转移到含有10ml的10％FBS/PS/IMDM的50ml Falcon管，并轻轻混合。在室温，100g离心5分钟后，去除上清液，添加并混合10ml的10％FBS/PS/IMDM。使用血细胞计数器计算细胞数量。将细胞以5x10⁵细胞/孔/2ml 10％FBS/PS/IMDM接种到6孔板中，并在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。

在管中收集细胞并离心后，去除上清液，添加并混合500μl的10％FBS/PS/IMDM，并计算细胞数量。从该细胞数量计算所需的载体的量，并将载体溶液制备为具有终体积为500μl的载体溶液，通过将10％FBS/PS/IMDM与三种类型的载体混合进行：SeV(PM)KOS/TS12ΔF载体，SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体和SeV18+KLF4/TSΔF载体，使得MOI变为5，10，30和50。混合细胞溶液和载体溶液并添加到6孔板，并在CO₂培养箱中培养过夜(37℃,5％CO₂)。次日，以1ml/孔添加10％FBS/PS/IMDM，并将细胞在CO₂培养箱中培养两天(37℃,5％CO₂)。使用10％FBS/PS/IMDM更换培养基，直到感染的第3天和第4天。在感染的第6天，使用胰蛋白酶-EDTA溶液分离细胞，重悬于10％FBS/PS/IMDM，添加到饲养细胞上，并在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。次日，将培养基更换为具有4ng/ml的bFGF添加的灵长类ES细胞培养基(ReproCell,RCHEMD001)。然后，在更换培养基的情况下继续培养直到载体感染的第28天。诱导过程期间细胞的状态示于图19中。在第28天，进行了碱性磷酸酶染色，并观察到了碱性磷酸酶阳性集落的诱导(图20)。iPS细胞的诱导效率以依赖于载体量的方法变得更高，并为约0.01％至0.03％(图21)。

[实施例17]

从人外周血单个核细胞的iPS细胞的诱导

通过Ficoll方法从两个自愿者(为供体1和2)提供的血液制备了外周血单个核细胞。使用通过向PBMC培养基(通过向StemPro-34SFM添加StemPro-34营养物，L-谷氨酸和青霉素-链霉素制备的培养基)添加细胞因子(100ng/mL SCF,100ng/mL FLT-3配体,20ng/mL血小板生成素,10ng/mLIL-6)制备的培养基(PBMC+培养基)进行培养。在培养的第4天进行载体感染。测量了外周血单个核细胞的细胞数量，并计算载体的量，使得MOI成为5，10，30和50。通过向PBMC+培养基添加计算的载体制备载体溶液。在PBMC培养溶液的去除和载体溶液添加后，将细胞在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。在载体感染的第3天，使用胰蛋白酶-EDTA分离细胞，重悬于PBMC+培养基，添加到饲养细胞上，并在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。从次日直到感染的第6天，使用PBMC培养基更换培养基，并将细胞在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。在感染的第7天，去除一半的培养基，并加入等量的具有4ng/ml的bFGF添加的灵长类ES细胞培养基(ReproCell,RCHEMD001)，并将细胞在CO₂培养箱中培养(37℃,5％CO₂)。此后，使用具有4ng/ml的bFGF添加的灵长类ES细胞培养基(ReproCell,RCHEMD001)完成培养，并在感染的第21天观察到iPS样细胞(图22和图23)。然后，进行了碱性磷酸酶染色(图24)。碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞诱导效率的计算结果表明，达到了0.1％-0.8％的诱导效率，虽然诱导效率随供体和载体的量而不同(图25)。

[实施例18]

从人单核细胞-2的iPS细胞的诱导

通过Ficoll方法从两个自愿者(为供体3和4)提供的血液制备了外周血单个核细胞。从这些外周血单个核细胞，通过使用EasySep阳性选择人CD14阳性选择试剂盒(Veritas,Cat.No.18058)分离了CD14+细胞作为起始材料。使用抗CD14抗体通过FACS分析，约15％的外周血单个核细胞是CD14+阳性细胞，并确认了在分离后，该纯度改进至85％或以上。这些细胞使用三种类型的载体感染：SeV(PM)KOS/TS12ΔF载体，SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体和SeV18+KLF4/TSΔF载体，使得MOI变为5，10，30和50，并通过实施例16中所示的相同的方法进行iPS细胞的诱导。这些结果确认了碱性磷酸酶染色阳性的iPS样细胞的诱导(图26，图27，图28)，且诱导效率最大为0.12％(图29)。

工业实用性

通过本发明，可以显著改善通过使用依次含有KLF基因，OCT基因和SOX基因的载体的多能干细胞的诱导效率。有用的是，在没有低温培养的情况下能够以高效率诱导多能干细胞，且特别地，温度敏感型载体的使用使得能够在多能干细胞的诱导中迅速去除载体。使用本发明的方法，可以预期获得更多的生理学上有利的多能干细胞，因为不对细胞应用低温刺激。

Claims

1.一种在没有低温培养的情况下诱导多能干细胞的方法中改进多能干细胞诱导效率的方法，所述诱导多能干细胞的方法导入在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体，其中所述方法包括进一步导入包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体。

2.权利要求1的方法，其中所述培养在约37℃进行。

3.权利要求1或2的方法，其中所述在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变。

5.权利要求1至4任一项的方法，其进一步包含导入插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体。

6.权利要求5的方法，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A和L511F突变，以及L蛋白中的L1361C，L1558I，N1197S和K1795E突变。

7.包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体在制造药物中的用途，所述药物用于在没有低温培养的情况下诱导多能干细胞的方法中改进多能干细胞诱导的效率，所述诱导多能干细胞的方法导入在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因，和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体。

8.权利要求7的用途，其中所述诱导多能干细胞的方法是涉及在约37°C培养的方法。

9.权利要求7或8的用途，其中所述在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变。

10.权利要求7至9任一项的用途，其中所述包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体是F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变。

11.一种用于通过在没有低温培养的情况下培养来诱导多能干细胞的组合物，其中所述组合物包含：

(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体。

12.一种用于诱导多能干细胞的组合物，其中所述组合物包含：

(a)在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体，其是F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；和

(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，其是F基因缺失的仙台病毒载体，所述F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变。

13.权利要求11或12的组合物，其进一步包含插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体。

14.权利要求13的组合物，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体为F基因缺失的仙台病毒载体，其包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的L1361C，L1558I，N1197S和K1795E突变。

15.权利要求12至14任一项的组合物，其是用于通过在没有低温培养的情况下培养来诱导多能干细胞的组合物。

16.一种用于通过在没有低温培养的条件下培养来诱导多能干细胞的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体。

17.一种用于诱导多能干细胞的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

(a)在一个载体中依次包含KLF基因，OCT基因和SOX基因的温度敏感型仙台病毒载体，其是F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A和L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变；和

(b)包含KLF基因但不包含OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体，其是F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R和K461G突变，P蛋白中的L511F突变，以及L蛋白中的N1197S和K1795E突变。

18.权利要求16或17的试剂盒，其进一步包含插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体。

19.权利要求18的试剂盒，其中所述插入有MYC基因的温度敏感型仙台病毒载体为F基因缺失的仙台病毒载体，该F基因缺失的仙台病毒载体包含M蛋白中的G69E，T116A和A183S突变，HN蛋白中的A262T，G264R，和K461G突变，P蛋白中的D433A，R434A，K437A，和L511F突变，以及L蛋白中的L1361C，L1558I，N1197S和K1795E突变。

20.权利要求17至19任一项的试剂盒，其为用于通过在没有低温培养的情况下培养来诱导多能干细胞的试剂盒。