CN103189508B

CN103189508B - 用于诱导多能性干细胞的组合物及其用途

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Publication number: CN103189508B
Application number: CN201180052632.7A
Authority: CN
Inventors: 伴浩志; 上田泰次; 房木野惠美; 佐伯晃; 佐伯晃一; 长谷川护
Original assignee: Dnavec Corp
Current assignee: Dnavec Corp
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2031-08-30
Also published as: US9090909B2; US20130210150A1; EP2612911A1; KR20130093624A; EP2612911A4; JPWO2012029770A1; AU2011297075B2; EP2612911B1; AU2011297075A1; CN103189508A; CA2809515A1; WO2012029770A1; JP5908838B2

Abstract

本发明提供以特定的顺序导入了编码用于诱导多能性干细胞的重编程因子的基因的仙台病毒载体；包含这些载体的用于在多能性干细胞的诱导中使用的基因导入用组合物，以及它们的用途。通过将KLF基因、OCT基因、以及SOX基因以一定的顺序组入到一个仙台病毒载体中，成功地提高了多能性干细胞的诱导效率。通过将多个重编程因子搭载到一个载体上，使得减少必需的载体数、进一步提高多能性干细胞的诱导效率成为可能。

Description

用于诱导多能性干细胞的组合物及其用途

技术领域

本发明涉及在多能性干细胞的诱导中使用的用于基因投递的组合物及其用途。此外，本发明涉及在多能性干细胞的诱导中使用的基因投递载体。具体地，本发明涉及以特定的顺序导入了编码重编程因子的基因的仙台病毒载体，包含这些载体的、供在多能性干细胞的诱导中使用的基因投递用组合物，以及它们的用途。

背景技术

自从由体细胞诱导多能干细胞(诱导的多能干细胞(iPS)细胞；又称“人工多能干细胞”或“诱导多能性干细胞”)被报道以来(非专利文献1)，已经通过将重编程因子导入到多种哺乳动物细胞，包括人和小鼠细胞中来产生iPS细胞(非专利文献1至9)。它们中的许多使用逆转录病毒来导入重编程因子。然而，由于逆转录病毒具有由于整合入宿主基因组而致瘤的风险，它们的用途受到限制(非专利文献3)。为了解决这个问题，人们已经尝试了利用腺病毒来诱导iPS细胞，但是只要使用DNA型载体，就不可能完全消除整合到基因组中的担忧。此外，这些载体的iPS细胞诱导效率极低(非专利文献10至13)。

为了解决这些问题，本发明人先前开发了一种利用RNA型病毒仙台病毒载体来诱导iPS细胞的系统(专利文献1)。利用仙台病毒载体的iPS细胞诱导效率显著高于使用其他载体的先前案例。由于仙台病毒在其生命周期中不具有DNA期，它们没有整合到宿主基因组中的担忧，而且它们就安全性而言是极为优越的。而且，所述载体在iPS细胞诱导后可以容易地去除。然而，利用仙台病毒载体来进一步提高iPS细胞诱导效率的技术尚属未知。

现有技术文献

[专利文献]

[专利文献1]国际公布WO2010/008054

[非专利文献]

[非专利文献1]Takahashi,K.and Yamanaka,S.(2006)Cell126,663-676

[非专利文献2]Maherali,N.et al.,(2007)Cell Stem Cell1,55-70

[非专利文献3]Okita,K.et al.,(2007)Nature448,313-317

[非专利文献4]Wernig,M.et al.,(2007)Nature448,318-324

[非专利文献5]Takahashi,K.et.al.,(2007)Cell131,861-872

[非专利文献6]Yu,J.et al.,(2007)Science318,1917-1920

[非专利文献7]Lowry,W.E.et al.,(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105,2883-2888

[非专利文献8]Park,I.H.et al.,(2008)Nature451,141-146

[非专利文献9]Masaki,H.et al.,(2008)Stem Cell Res.1,105-115

[非专利文献10]Stadtfeld,M.et al.,(2008)Science322,945-949

[非专利文献11]Okita,K.et al.,(2008)Science322,949-953

[非专利文献12]Yu,J.et al.,(2009)Science324,797-801

[非专利文献13]Zhou,W.etal.,(2009)stem cells27,2667-2674

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的一个目的是提供在多能干细胞的诱导中使用的新的基因投递用组合物及其用途。此外，本发明的一个目的是提供在多能干细胞的诱导中使用的新的基因投递载体。具体地说，本发明的一个目的是提供以特定的顺序组入有编码重编程因子的、用于诱导多能干细胞的仙台病毒载体，包含这些载体的在多能性干细胞的诱导中使用的基因投递用组合物，及其用途。

解决问题的手段

本发明人发现，使用KLF基因、OCT基因和SOX基因(即重编程因子)位于仙台病毒基因组上的仙台病毒载体，与使用各别的载体导入这三种基因时相比，可以以显著更高的效率诱导iPS细胞。此外，发现当这种载体与表达MYC基因的载体组合使用时，与将KLF基因、OCT基因和SOX基因搭载到各别的仙台病毒载体时相比，可以以显著高的效率诱导iPS细胞。或者，代替MYC基因表达载体，可以与表达Glis1基因(Maekawa et al.,Nature,474:225-229,2011)的载体组合。

尤其是，通过将KLF基因、OCT基因和SOX基因按此顺序插入单一仙台病毒载体，或者将OCT基因、SOX基因和KLF基因按此顺序插入单一仙台病毒载体，并使用该载体，能够显著提高iPS细胞诱导的效率。此外，当组合使用另外的具有插入到仙台病毒L基因紧邻上游的MYC基因的仙台病毒载体时，iPS细胞集落以极高的速率(rate)出现，如图1所示(条件2)。此外，当使用将OCT基因、SOX基因和KLF基因按此顺序插入单一仙台病毒载体中而得到的载体时，还可以组合使用携带KLF基因的仙台病毒载体。

这样，使用将KLF基因、OCT基因和SOX基因插入到单一仙台病毒载体中而得到的载体，能够显著提高iPS细胞诱导的效率。

具体地说，本发明涉及在多能干细胞的诱导中使用的新的基因投递用组合物及其用途，以及基因投递载体等，更具体地涉及各权利要求中描述的发明。由引用同一权利要求的多个权利要求中描述的两项或更多项发明的任意组合所构成的发明也是本申请意图要求保护的发明。更具体地说，本发明涉及下述：

[1]一种供在用于多能干细胞诱导的基因投递中使用的组合物，其包含仙台病毒载体，所述载体中在仙台病毒P基因的紧邻后方依次插入了KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了OCT基因、SOX基因和KLF基因；

[2][1]的组合物，其与插入有MYC基因或Glis1基因的另外的仙台病毒载体组合使用；

[3][2]的组合物，其中MYC基因或Glis1基因插入到仙台病毒L基因的紧邻前方；

[4]一种在多能干细胞的诱导中产生转基因细胞的方法，其包括向细胞中导入仙台病毒载体，所述载体中在仙台病毒P基因的紧邻后方依次插入了KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了OCT基因、SOX基因和KLF基因；

[5][4]的方法，其还包括向细胞中导入插入有MYC基因或Glis1基因的另一仙台病毒载体；

[6][5]的方法，其中MYC基因或Glis1基因插入到仙台病毒L基因的紧邻前方；

[7]一种仙台病毒载体，其中在仙台病毒P基因的紧邻后方依次插入了KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次插入了OCT基因、SOX基因和KLF基因；

[8]一种核酸，其编码[7]的仙台病毒载体的基因组或反基因组；

[9]一种供在用于多能干细胞诱导的基因投递中使用的试剂盒，其包含[7]的仙台病毒载体以及插入有MYC基因或Glis1基因的另外的仙台病毒载体；和

[10][9]的试剂盒，其中所述MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒L基因的紧邻前方。

本申请意图涵盖本申请描述的发明的任何事项及其任何组合。本申请还意图涵盖在这些发明中排除了任何本申请中描述的事项或其任何组合的发明。此外，本申请中描述的本发明的相关特定具体实施方案不但公开了这些实施方案，还公开了从本申请中公开的包含这些实施方案的上位发明中排除这些实施方案而得到的发明。

发明的效果

仙台病毒不存在会整合到宿主基因组中的担忧，因此它们是非常安全的载体。故而如果能够利用这些载体以更高的效率诱导iPS细胞，则它们的实用将会极高。本发明使得人们能够进一步提高仙台病毒载体的iPS细胞诱导效率，同时实现了将多个重编程基因集成在单一仙台病毒载体中，从而为iPS细胞的诱导操作的简化和再现性的提高作出贡献。

附图简介

图1显示载体感染14日之后的细胞状况。左边的小图显示使用常规载体时的情况(条件11)，右边小图显示使用本发明的载体的情况(条件2)。

图2显示了对载体感染21日后的细胞(BJ细胞)进行针对碱性磷酸酶的染色时的结果。当使用依次插入了KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因的仙台病毒载体时，在所有的测试条件下(条件1至5)均检测到了碱性磷酸酶阳性集落。此外，与使用以不同顺序插入所述基因的仙台病毒时(条件6至10)以及使用各别的仙台病毒载体导入每种基因时(条件11)相比，碱性磷酸酶阳性集落的出现频率格外地高。尤其是，当组合使用在仙台病毒L基因紧邻前方或后方插入有c-MYC基因的另外的仙台病毒载体时(条件2至4)，碱性磷酸酶集落的出现频率显著地高。

图3显示碱性磷酸酶染色的集落。在条件6、10和12下未检测到碱性磷酸酶阳性集落。

图4为显示碱性磷酸酶阳性集落的诱导效率的图。显示了自BJ细胞诱导多能干细胞的效率。条件与图3所示的相同。

图5显示了对载体感染27日后的细胞(MRC-5细胞)进行碱性磷酸酶染色时的结果。与常规方法(条件9)相比，人ES细胞样集落当在搭载3种基因的条件下(条件1至8)，尤其是在MOI小于90的条件下(条件1-3和5-7)以显著高的频率出现。此外，当使用依次插入了KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因的仙台病毒载体时，以显著高效率诱导了碱性磷酸酶阳性集落。此外，当使用依次插入了OCT3/4基因、SOX2基因和KLF4基因的仙台病毒载体时，与使用各别的仙台病毒载体导入这些基因时相比，诱导碱性磷酸酶阳性集落的效率明显更高。

图6是显示碱性磷酸酶阳性集落诱导效率的图。显示了从MRC-5细胞诱导多能干细胞的效率。条件与图5中所示一样。

图7显示了对载体感染后的细胞进行针对碱性磷酸酶的染色时的结果。

图8显示了碱性磷酸酶阳性集落的诱导效率。

图9显示了分析ES标志物基因的表达的结果。

图10显示了分析ES标志物基因的表达的结果。

图11显示了分析ES标志物基因的表达的结果。

图12显示了分析iPS细胞克隆中ES标志物蛋白的表达的结果。

图13显示了分析iPS细胞克隆中ES标志物蛋白的表达的结果。

图14显示了分析iPS细胞克隆中ES标志物蛋白的表达的结果。

图15显示了iPS细胞克隆的胚状体的形成。

图16显示了iPS细胞克隆的畸胎瘤的形成。

图17显示了iPS细胞克隆的畸胎瘤的形成。

图18显示了iPS细胞克隆的畸胎瘤的形成。

图19显示了iPS细胞克隆的核型分析的结果。

图20显示了OCT3/4启动子的甲基化分析的结果。

图21显示了自iPS细胞的载体去除。

图22显示了自iPS细胞的载体天然丢失。

发明的实施方式

下面将详细说明实施本发明的方式。

本发明提供以特定顺序组入了核重编程因子(KLF、OCT和SOX)基因的仙台病毒载体，以及使用这些载体的用于在已分化细胞的重编程诱导中投递重编程因子基因的方法，尤其是用于在从体细胞生成多能干细胞中投递重编程因子基因的方法。具体地，所述方法包括将经分化的细胞(如体细胞)接触其中组入了至少三种编码重编程因子的基因，即编码KLF、OCT和SOX的基因依此次序，或者OCT基因、SOX基因和KLF基因依此次序，的仙台病毒载体。更具体地说，本发明提供用于在细胞重编程中投递重编程因子基因的方法，其中所述方法包括使用所述仙台病毒载体将三种重编程因子基因导入有需要的细胞中；以及供在该方法中使用的、包含所述仙台病毒载体的组合物。

在本发明中，“多能干细胞”是指从胚泡期的动物胚胎的内部细胞团块制备的干细胞或者具有与这些细胞相似的表型的细胞。此外，本发明中诱导的多能干细胞是表达碱性磷酸酶(一种ES样细胞的指示物)的细胞。此外，优选地，当培养多能干细胞时，它们形成含有核容量比例高于细胞质的细胞的扁平的集落。可适宜地与滋养细胞(feeder)一起进行培养。此外，与MEF等经培养的细胞在数周时间内停止增殖相对的是，多能干细胞可以长时间传代，这可以基于它们的增殖性在例如每三日一次传代至少15次，优选至少20次，至少25次、至少30次、至少35次、或至少40次时仍不丧失来加以确认。此外，多能干细胞优选表达内源OCT3/4或Nanog，或更优选地，它们表达OCT3/4和Nanog二者。此外，多能干细胞优选表达TERT，并且显示端粒酶活性(合成端粒重复序列的活性)。此外，多能干细胞优选具有分化成三个胚层(内胚层、中胚层、和外胚层)的能力(例如在畸胎瘤形成和/或胚状体形成的过程中)。更优选地，多能干细胞当被移植到胚泡中时产生种系嵌合体。能够种系转播(germline transmission)的多能干细胞称为种系能(germline-competent)多能干细胞。这些表型的确认可以通过已知方法进行(WO2007/69666；Ichisaka T.et al.,Nature448(7151):313-7,2007)。

此外，在本发明中，“(已)分化的”是指细胞的分化阶段较之以前已经进展，可指例如与多能干细胞相比更为分化，并包括仍然保有分化成多种细胞谱系(例如体性干细胞)的能力的状态，以及终末分化的状态。已分化的细胞是衍生自多能干细胞的细胞(除多能干细胞之外)。已分化的细胞可以是例如不具有分化成三胚层(内胚层、中胚层、和外胚层)的能力的细胞。这样的细胞除非经过重编程，否则不会具有形成三胚层的能力。此外，已分化的细胞可以是例如这样的细胞，其无法生成自身所属的胚层型之外的细胞。已分化的细胞可以是体细胞，并且例如它们可以是生殖细胞以外的细胞。

在本发明中，本发明中重编程(reprogramming)是指：使某细胞的分化状态成为较之未分化的状态，包括例如已分化的细胞脱分化，例如从不具有分化多能性的细胞诱导具有分化多能性的细胞、例如多能干细胞。此外，本发明中脱分化是指：使特定细胞成为更不成熟的(例如未分化的)状态。脱分化也可以是指特定细胞返回其分化的最初状态或中间状态。此外，脱分化也可以是指从不能生成自身所属的胚层类型以外的细胞的细胞变成能够分化成其它胚层的细胞的变化。脱分化还包括例如，不具有三胚层分化能力的细胞获得三胚层分化能力。此外，脱分化包括多能干细胞的生成。

此外，本发明中，体细胞是例如多能干细胞及生殖细胞以外的细胞。体细胞包括例如，构成多细胞生物的细胞中的多能干细胞以外的细胞、及其培养细胞。体细胞包括例如体性干细胞和终末分化的细胞。

本发明中，病毒载体是具有病毒来源的基因组核酸，并能够通过在该核酸中组入转基因而表达该转基因的载体。由于仙台病毒载体是染色体非整合性病毒载体并在细胞质中表达，不存在导入的基因会变得整合到宿主的染色体(核源染色体)中的风险。因此，所述载体是安全的，并且在重编程完成之后可以去除。在本发明中，仙台病毒载体包括感染性病毒颗粒，以及病毒核心、病毒基因组和病毒蛋白质的组合物，以及包含非感染性病毒颗粒等的复合物，它们是具有导入细胞中而表达加载的基因的能力的复合物。例如，在仙台病毒中，由仙台病毒基因组及与之结合的仙台病毒蛋白质(NP、P和L蛋白)构成的核糖核蛋白(病毒的核心部分)能够在导入细胞后在细胞中表达转基因(WO00/70055)。针对细胞的导入可以使用转染试剂等来适当地进行。这样的核糖核蛋白(RNP)也包括在本发明的仙台病毒载体中。

仙台病毒是单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)(包括副粘病毒属(Paramyxovirus),麻疹病毒属,腮腺炎病毒属，和肺病毒属)，并含有单链负链(编码病毒蛋白的有义链的反义链)RNA作为基因组。负链(minus-strand)RNA又称为负链(negative-strand)RNA。

单分子负链RNA病毒目除了副粘病毒(副粘病毒科病毒)之外还包括属于如弹状病毒科(包括水泡性病毒属、狂犬病毒属和短暂热病毒属属等属)，和纤丝病毒科等科的病毒(Virus,vol.57,No.1:pp29-36,2007；Annu.Rev.Genet.32,123-162,1998；Fields virology fourthedition,Philadelphia,Lippincott-Raven,1305-1340,2001；Microbiol.Immunol.43,613-624,1999；FieldVirology,Thirdedition pp.1205-1241,1996)。仙台病毒之外的其他副粘病毒科病毒的实例包括新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞病毒(RS病毒)、牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distempervirus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒I、II、III型、属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等。其他例子包括仙台病毒(SeV),人副流感病毒-1(HPIV-1),人副流感病毒-3(HPIV-3),海豹瘟热病毒(PDV),猫瘟热病毒(CDV),海豚麻疹病毒(DMV),小反刍动物瘟病毒(PDPR),麻疹病毒(MV),牛瘟麻疹病毒(RPV),Hendra病毒(Hendra),Nipah病毒(Nipah),人副流感病毒-2(HPIV-2),猿副流感病毒5(SV5),人副流感病毒-4a(HPIV-4a),人副流感病毒-4b(HPIV-4b),腮腺炎病毒(Mumps),和新城疫病毒(NDV)。更优选地，例子包括选自下组的病毒：仙台病毒(SeV),人副流感病毒-1(HPIV-1),人副流感病毒-3(HPIV-3),海豹瘟热病毒(PDV),猫瘟热病毒(CDV),海豚麻疹病毒(DMV),小反刍动物瘟病毒(PDPR),麻疹病毒(MV),牛瘟麻疹病毒(RPV),Hendra病毒(Hendra)，和Nipah病毒(Nipah)。

仙台病毒的核苷酸序列在数据库中的登录号的例子可见：NP基因为M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046、和X17218；P基因为M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007、和X17008；M基因为D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、和X53056；F基因为D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152、和X02131；HN基因为D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、和X56131；L基因为D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587、和X58886。由其他病毒编码的病毒基因的例子包括：对于NP基因(又称N基因)有CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1,D01070；HPIV-2,M55320；HPIV-3,D10025；Mapuera,X85128；Mumps，D86172；MV,K01711；NDV，AF064091；PDPR,X74443；PDV,X75717；RPV,X68311；SeV，X00087；SV5,M81442；和Tupaia,AF079780；对于P基因有CDV,X51869；DMV,Z47758；HPIV-1,M74081；HPIV-3,X04721；HPIV-4a,M55975；HPIV-4b,M55976；Mumps,D86173；MV,M89920；NDV,M20302；PDV,X75960；RPV,X68311；SeV,M30202；SV5,AF052755；和Tupaia,AF079780；对于C基因有CDV,AF014953；DMV,Z47758；HPIV-1.M74081；HPIV-3,D00047；MV,ABO16162；RPV,X68311；SeV,AB005796；和Tupaia,AF079780；对于M基因有CDV,M12669；DMV Z30087；HPIV-1,S38067；HPIV-2,M62734；HPIV-3,D00130；HPIV-4a,D10241；HPIV-4b,D10242；Mumps,D86171；MV,AB012948；NDV,AF089819；PDPR,Z47977；PDV,X75717；RPV,M34018；SeV,U31956；和SV5,M32248；对于F基因有CDV,M21849；DMV,AJ224704；HPN-1,M22347；HPIV-2,M60182；HPIV-3.X05303,HPIV-4a,D49821；HPIV-4b,D49822；Mumps,D86169；MV,AB003178；NDV,AF048763；PDPR,Z37017；PDV,AJ224706；RPV,M21514；SeV,D17334；和SV5,AB021962；以及对于HN(H或G基因)有CDV,AF112189；DMV,AJ224705；HPIV-1,U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3,AB012132；HPIV-4A,M34033；HPIV-4B,AB006954；Mumps,X99040；MV,K01711；NDV,AF204872；PDPR,Z81358；PDV,Z36979；RPV,AF132934；SeV,U06433；和SV-5,S76876。但是，对于所说的每种基因都已知有多种株系，而由于株系的差异可能存在由不同于上面例举的那些的序列组成的基因。携带源自这些基因中的任意者的病毒基因的仙台病毒可用作本发明的载体。例如，本发明的仙台病毒载体包含与上述任意病毒基因的编码序列具有90％或更高，优选95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。此外，本发明的仙台病毒载体包含例如编码与上述任一病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列具有90％或更高，优选95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，或99％或更高同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。此外，本发明的仙台病毒载体包含例如编码在上述任一病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列中具有10个或更少，优选9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的氨基酸序列的核苷酸序列。

本说明书中记载的核苷酸序列和氨基酸序列等的数据库登录号所参考的序列例如参考本申请的申请日及优先权日的序列，可以确定为本申请的申请日或者优先权日的序列，优选确定为本申请的申请日的序列。各个时间点上的序列可以通过参照数据库的修订历史来加以确定。

本发明中使用的仙台病毒载体可以是衍生物，所述衍生物包括具有修饰的病毒基因的病毒，以及化学修饰的病毒等，使得病毒导入基因的能力不受损。

此外，仙台病毒可源自天然株系，野生型株系，突变株系，实验室传代的株系，以及人工构建的株系等。一个例子是Z株系(Medical Journal of OsakaUniversity Vol.6,No.1,March1955p1-15)。即，这些病毒可以是与分离自自然界的病毒类似的结构的病毒载体，或者通过基因重组人工修饰的病毒，只要能够诱导期望的重编程。例如，它们在野生型病毒的任何基因中可能具有突变或缺失。此外，还可以使用不完整病毒如DI颗粒(J.Virol.68:8413-8417,1994)。例如，可以优选地使用在至少一个编码病毒包膜蛋白或包壳蛋白的基因中具有突变或缺失的病毒。此类病毒为，例如，在感染细胞中能复制基因组但不能形成感染性病毒颗粒的病毒载体。由于不存在将感染扩散到周围的担忧，这样的转播缺陷病毒载体是高度安全的。例如，可以使用这样的负链RNA病毒，其不含有至少一种编码包膜蛋白(如F和/或HN或刺突蛋白，或其组合)的基因(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14):6564-6569(2000))。如果基因组RNA中编码对于基因组复制而言必要的蛋白(例如，N、P和L蛋白)，则基因组可以在被感染的细胞中复制。为了产生缺陷型的病毒，例如，从外部向产生病毒的细胞供应缺陷型基因产物或能够补全它的蛋白质(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14):6564-6569(2000))。此外，还已知在不完全补全缺陷的病毒蛋白质的条件下，以非感染病毒颗粒(VLP)的形式收集病毒载体的方法(WO00/70070)。此外，当以RNP的形式(例如，含有N、L和P蛋白的RNP和基因组RNA)收集病毒载体时，可以在不补全包膜蛋白的条件下产生载体。

此外，还优选使用携带突变病毒蛋白基因的载体。本发明尤其提供利用在病毒基因中有突变和/或缺失的仙台病毒载体的重编程中基因投递方法、重编程细胞的产生方法、组合物、以及试剂盒。例如，在包膜蛋白和包壳蛋白中已知有多种突变，包括减毒突变和温度敏感突变。具有这些突变蛋白质基因的仙台病毒可以有利地在本发明中使用。在本发明中，理想地使用具有降低的细胞毒性的载体。细胞毒性可以例如通过对来自细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放进行定量来加以测量。例如，可以使用与野生型相比具有显著降低的细胞毒性的载体。关于细胞毒性降低的程度，例如可以使用这样的载体：以MOI(感染复数)3使之感染源自人的Hela细胞(ATCC CCL-2)或源自猴的CV-1细胞(ATCC CCL70)，培养3日后所得的培养基中的LDH释放水平的相比于野生型显著减少，例如减少20％或更多，25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，或50％或更多者。此外，减少细胞毒性的突变还包括温度敏感突变。温度敏感突变是指与低温(例如30℃至32℃)相比，显著降低在病毒宿主的通常温度(例如37℃至38℃)下的活性的突变。这样的具有温度敏感突变的蛋白质是有用的，因为病毒能够在容许温度(低温)下制备。具有本发明中有用的温度敏感性突变的病毒载体当在37℃感染时，与在培养细胞中32℃感染时相比，显示的生长速率或基因表达水平为例如1/2或更少，优选1/3或更少，更优选1/5或更少，更优选1/10或更少，更优选1/20或更少。

本发明中使用的仙台病毒载体可以是野生型，只要它不抑制重编程并且能够通过诱导重编程因子所致的重编程或者支持重编程的诱导，并且优选在至少一个，更优选至少2、3、4、5或更多个病毒基因中具有缺失或突变。缺失和突变可以任意组合并导入各个基因中。这里，突变可以是功能障碍型突变或温度敏感型突变，并且是这样的突变，其至少在37℃下与野生型相比将病毒增殖速率或任何携带的基因的表达水平降低至优选1/2或更少，更优选1/3或更少，更优选1/5或更少，更优选1/10或更少，且更优选1/20或更少。使用这样的修饰型病毒载体尤其对于多能干细胞的诱导而言可能是有用的。例如，在本文中优选使用的仙台病毒载体具有至少两个缺失或突变的病毒基因。这样的病毒包括那些缺失至少两个病毒基因者、至少两个病毒基因中具有突变者、以及在至少一个病毒基因中具有突变且缺失了至少一个病毒基因者。所述至少两个被突变或缺失的病毒基因优选为编码构成包膜的蛋白的基因。例如，具有F基因缺失、且进一步具有M和/或HN基因缺失或进一步在M和/或HN基因中有突变(例如温度敏感性突变)的载体是本发明中优选使用的。此外，例如F基因缺失、且M或HN基因也缺失、而余下的M和/或HN基因中具有突变(例如温度敏感性突变)的载体，也是本发明中优选使用的。本发明中使用的载体更优选具有至少3个缺失或突变的病毒基因(优选至少3个编码包膜构成蛋白质的基因，F、HN、和M)。这样的病毒载体包括：至少3个基因缺失的载体、至少3个基因中具有突变的载体、至少1个基因中有突变且至少2个基因缺失的载体、至少2个基因中有突变且至少1个基因缺失的载体。作为更优选的实施方式的例子，缺失F基因、且M和HN基因也缺失或M和HN基因中还具有突变(例如温度敏感性突变)的载体是本发明中优选使用的。此外，例如F基因缺失、且M或者HN基因也缺失、而余下的M或者HN基因中有突变(例如温度敏感性突变)的载体，本发明中也是优选的。这样的突变型病毒可以根据已知方法制备。

例如，仙台病毒的M基因的温度敏感性突变包括选自M蛋白质中的69位(G69)、116位(T116)和183位(A183)中的任意位点的氨基酸取代(Inoue,M.等，J.Virol.2003,77:3238-3246)。具有编码突变M蛋白质的基因组的病毒，其中仙台病毒M蛋白质中上述3个位点中的任一个位点、优选任意2个位点的组合、更优选全部3个位点上的氨基酸被其它氨基酸取代，是本发明中优选使用的。

优选的氨基酸突变是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸，例如取代成BLOSUM62矩阵(Henikoff,S.and Henikoff,J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)的分值为3以下、优选2以下、更优选1以下、甚至更优选为0的氨基酸。具体地，可以将仙台病毒M蛋白质的G69、T116和A183分别取代成Glu(E)、Ala(A)和Ser(S)。此外，还可以利用与温度敏感P253-505麻疹病毒株(Morikawa,Y.等，Kitasato Arch.Exp.Med.1991:64；15-30)的M蛋白质的突变同源的突变。突变例如可以使用寡核苷酸等采用公知的突变方法来实施导入。

此外，HN基因的温度敏感性突变包括任意选自仙台病毒的HN蛋白质的262位(A262)、264位(G264)和461位(K461)中的位点的氨基酸取代(Inoue,M.等，J.Virol.2003,77:3238-3246)。具有编码这3个位点中的任何1个、优选任意2个位点的组合、更优选全部3个位点的氨基酸被取代成其它氨基酸的突变HN蛋白质的基因组的病毒是本发明中优选使用的。如上述，优选的氨基酸取代是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。作为优选的一个例子，将仙台病毒HN蛋白质的A262、G264和K461分别取代成Thr(T)、Arg(R)和Gly(G)。此外，例如，使用流行性腮腺炎病毒的温度敏感性疫苗株UrabeAM9为参照，可突变HN蛋白质的464以及468位的氨基酸(Wright,K.E.等，Virus Res.2000:67；49-57)。

此外，仙台病毒可以在P基因和/或L基因中具有突变。这样的突变的例子具体有：SeV P蛋白质的86位的Glu(E86)的突变、以及SeV P蛋白质的511位的Leu(L511)到其它氨基酸的取代。同上述，优选的氨基酸取代是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的例子包括86位的氨基酸到Lys的取代、以及511位的氨基酸到Phe的取代。此外，L蛋白质中的例子包括SeV L蛋白质的1197位的Asn(N1197)和/或1795位的Lys(K1795)到其它氨基酸的取代，且同上述，优选的氨基酸是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的例子是1197位的氨基酸到Ser的取代、以及1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突变能够显著提高持续感染性、2次粒子释放的抑制或细胞毒性的抑制的效果。而且，通过组合包膜蛋白质基因的突变和/或缺失，能够急剧地提升这些效果。此外，对于L基因，例子包括SeV L蛋白质的1214位的Tyr(Y1214)和/或1602位的Met(M1602)到其它氨基酸的取代，且同上述，优选的氨基酸是取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地可以示例出：1214位的氨基酸到Phe的取代、以及1602位的氨基酸到Leu的取代等。以上示例的突变可以任意组合。

例如，SeV M蛋白质的至少69位的G、116位的T以及183位的A，SeV HN蛋白质的至少262位的A、264位的G以及461位的K，SeV P蛋白质的至少511位的L，SeV L蛋白质的至少1197位的N以及1795位的K分别被取代成其它氨基酸，且F基因缺损或缺失的仙台病毒载体；以及F基因缺损或缺失、且具有与上述的那些同样或更低的细胞毒性和/或具有与上述的那些同样或更高的温度敏感性的仙台病毒载体，在本发明中特别优选用于表达核重编程因子。具体的取代实例包括：M蛋白质的G69E、T116A以及A183S取代，HN蛋白质的A262T、G264R以及K461G的取代，P蛋白质的L511F取代，以及L蛋白质的N1197S和K1795E取代。

L蛋白质的突变包括选自SeV L蛋白质的942位(Y942)、1361位(L1361)和1558位(L1558)中的任意位点的氨基酸到其它氨基酸的取代。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的例子包括942位的氨基酸到His的取代、1361位的氨基酸到Cys的取代、和1558位的氨基酸到Ile的取代。特别可以优选使用至少942位或1558位发生了取代的L蛋白质。例如，优选除了1558位以外、1361位也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质。此外，还优选除了942位以外、1558位和/或1361位也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质。这些突变能够提高L蛋白质的温度敏感性。

P蛋白质的突变的例子包括选自SeV P蛋白质的433位(D433)、434位(R434)和437位(K437)中的任意位点的氨基酸到其它氨基酸的取代。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体的示例包括：433位的氨基酸到Ala(A)的取代、434位的氨基酸到Ala(A)的取代、437位的氨基酸到Ala(A)的取代等。特别可以优选使用上述3个位点全部发生取代的P蛋白质。这些突变可以提高P蛋白质的温度敏感性。

编码SeV P蛋白质的至少433位的D、434位的R和437位的K这3个位置被取代成其它氨基酸的突变P蛋白质、和SeV L蛋白质的至少1558位的L被取代的突变L蛋白质(优选至少1361位的L也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质)的F基因缺损或缺失的仙台病毒载体；以及具有与上文所述的那些同样或更低的细胞毒性和/或与之同样或更高的温度敏感性的F基因缺损或缺失的仙台病毒载体优选在本发明中使用。除了上述突变以外，各病毒蛋白质中在其它氨基酸上(例如10个以下、5个以下、4个以下、3个以下、2个以下或1个氨基酸)上也可以具有突变。由于包含上述所示突变的载体显示高的温度敏感性，因此在重编程完成后，可通过将细胞在稍微的高温(例如37.5～39℃、优选38～39℃或38.5～39℃)下进行培养，简便地将载体除去。

更具体地，可优选地使用具有例如下述突变的仙台病毒载体(国际公布号WO2010/008054)：

TS7:L(Y942H/L1361C/L1558I)；

TS12:P(D433A/R434A/K437A)；

TS13:P(D433A/R434A/K437A),L(L1558I)；

TS14:P(D433A/R434A/K437A),L(L1361C)；和

TS15:P(D433A/R434A/K437A),L(L1361C/L1558I)。

具体的载体可以为例如：其中M蛋白质具有G69E、T116A以及A183S突变，HN蛋白质具有A262T、G264R以及K461G突变；P蛋白质具有L511F突变，且L蛋白质具有N1197S和K1795E突变的F基因缺失的仙台病毒载体(例如Z株)；且通过向该载体中进一步导入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突变而产生的载体是更优选的。具体地，例子包括SeV18+/TS　F(WO2010/008054和WO2003/025570)和SeV(PM)/TSΔF，以及通过进一步向这些载体中导入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15突变而产生的载体，但不限于此。

“TSΔF”意思是在M蛋白中携带G69E、T116A和A183S突变，在HN蛋白中携带A262T,G264R,和K461G突变，P蛋白中携带L511F突变，以及L蛋白中携带N1197S和K1795E突变，以及缺失F基因。具体的，优选的载体的例子包括SeV(PM)KOS/TSΔF,SeV(PM)KOS/TS7ΔF,SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(PM)OSK/TS，但不限于此。在此情况下，MYC基因可以使用SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF,SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF,SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF等来导入。此外，还可额外导入表达KLF基因的仙台病毒载体。具体地，通过与按顺序携带OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体组合可获得有利的结果。KLF基因可以插入仙台病毒载体N基因的上游(基因组上N基因的3’侧)。本文中描述的F基因缺失的载体和/或F基因突变的载体可以如期望地用作载体；一个具体的例子是SeV18+KLF4/TSΔF，但不限于此。

具体地，本发明还提供：

[1]一种供在用于多能干细胞诱导的基因投递中使用的组合物，其包含在仙台病毒P基因的紧邻后方依次插入了OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体，其是与插入有KLF基因的另外的仙台病毒载体组合使用的组合物；

[3][2]的组合物，其中所述MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒L基因的紧邻前方；

[4]一种在多能干细胞的诱导中产生转基因细胞的方法，其中所述方法包括向细胞中导入在仙台病毒P基因紧邻后方依次插入了OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体，以及插入有KLF基因的另外的仙台病毒载体；

[5][4]的方法，其进一步包括向细胞中导入插入有MYC基因或Glis1基因的另外的仙台病毒载体；

[6][5]的方法，其中所述MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒L基因的紧邻前方；

[7]一种供在用于多能干细胞诱导的基因投递中使用的试剂盒，其包含在仙台病毒P基因紧邻后方依次插入了OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体，以及插入有KLF基因的另外的仙台病毒载体；

[8][7]的试剂盒，其包含插入有MYC基因或Glis1基因的另外的仙台病毒载体；和

[9][8]的试剂盒，其中所述MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒L基因的紧邻前方。

载体的细胞毒性例如可以通过对从细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)进行定量来测定。具体地，例如，以MOI3感染HeLa(ATCC CCL-2)或猴CV-1(ATCC CCL70)，并测量培养3天后的培养液中的LDH释放量。释放的LDH量越低，细胞毒性越低。此外，温度敏感性可以通过测量病毒宿主的通常温度(例如，37℃至38℃)下病毒增殖的速度或搭载的基因的表达水平来加以测定。与无突变者相比病毒扩增速度和/或搭载的基因的表达水平越低，则判断为温度敏感性越高。

此外，当使用包膜病毒时，可以使用这样的病毒，其在包膜中含有与该病毒原本携带的包膜蛋白质不同的蛋白质。例如，在制造病毒时，通过使病毒产生细胞表达希望的外源性包膜蛋白质，能够制造含该外源性包膜蛋白质的病毒。这样的蛋白质没有特殊限制，可以使用赋予对哺乳动物细胞的感染能力的希望的粘附因子、配体、受体等蛋白质。具体实例包括水疱性口炎病毒(VSV)的G蛋白质(VSV-G)。VSV-G蛋白质可以来源于任意的VSV株，例如可以使用Indiana血清型株(J.Virology39:519-528(1981))来源的VSV-G蛋白，但不限于此。本发明中使用的仙台病毒载体可以包含其它病毒来源的包膜蛋白质任意组合。

携带有核重编程因子的重组仙台病毒的重建可以利用公知方法进行。作为具体的规程，典型地，仙台病毒可以通过下述步骤来制造：(a)在表达病毒粒子形成所必需的病毒蛋白质(N、P、和L)的细胞中转录编码仙台病毒基因组RNA(负链)或其互补链(正链)的cDNA，和(b)回收含有生成的病毒的培养上清。粒子形成所必需的病毒蛋白质可以由转录后的病毒基因组RNA表达，也可以从基因组RNA以外的来源反式供给它们。例如，可以将编码N、P和L蛋白质的表达质粒导入细胞来供给。在基因组RNA中粒子形成所必需的病毒基因缺损的情况下，可在病毒产生细胞中另行表达那些病毒基因，以补全粒子的形成。为了在细胞内表达病毒蛋白质或RNA基因组，将编码所述蛋白质或基因组RNA的DNA连接在能够在宿主细胞中发挥功能的适当启动子的下游的载体导入宿主细胞。转录的基因组RNA在病毒蛋白质的存在下得以复制，并形成感染性病毒粒子。在制造基因(如包膜蛋白质的基因等)缺损的缺损型病毒时，可以在病毒产生细胞中表达缺损的蛋白质、能够补偿那些蛋白质或其功能的其它病毒蛋白质、等等。

例如，仙台病毒的制造可以采用以下的公知方法来实施(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；WO03/025570；WO2005/071092；WO2006/137517；WO2007/083644；WO2008/007581；Hasan,M.K.等，J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997、Kato,A.等，1997,EMBO J.16:578-587以及Yu,D.等，1997,Genes Cells2:457-466；Durbin,A.P.等，1997,Virology235:323-332；Whelan,S.P.等，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:8388-8392；Schnell.M.J.等，1994,EMBO J.13:4195-4203；Radecke,F.等，1995,EMBO J.14:5773-5784；Lawson,N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:4477-4481；Garcin,D.等，1995,EMBO J.14:6087-6094；Kato,A.等，1996,Genes Cells1:569-579；Baron,M.D.与Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271；Bridgen,A.与Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:15400-15404；Tokusumi,T.等.Virus Res.2002:86；33-38、Li,H.-O.等，J.Virol.2000:74；6564-6569)。关于其它的RNA病毒的增殖方法和重组病毒的制造方法，可以参照病毒实验学各论改订第二版(ウイルス実験学各論、改訂二版)(国立预防卫生研究所学友会编，丸善，1982)。

在上述的仙台病毒中依次组入了KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者，或者依次组入了OCT基因、SOX基因和KLF基因。一般地，这些外源基因可以插入任何病毒基因(NP,P,M,F,HN,或L)的紧邻前方(基因组上的3’侧)或紧邻后方(基因组上的5’侧)。优选地，在仙台病毒P基因紧邻后方，即在P基因的紧邻下游(在负链RNA基因组上紧邻5’侧)依次组入了KLF基因、OCT基因和SOX基因，或依次组入了OCT基因、SOX基因和KLF基因。例如，在前一顺序中，转录起始信号(S序列)、转录终止信号(E序列)、以及间隔序列(居间序列(I序列)等)可以包含在P基因和KLF基因之间(在后一情况下，在P基因和OCT基因之间)；但不包含其他转录单位(例如编码蛋白编码基因的转录单位)。由于仙台病毒携带负链RNA作为基因组，与通常情况相反，3’侧对应于基因组的上游，5’侧对应于基因组的下游。当KLF基因、OCT基因和SOX基因以此顺序定位于仙台病毒基因组中时，在这三个基因中KLF基因位于最接近3’侧的位置，而SOX基因位于最接近5’侧的位置。由于负链RNA以反义方向编码基因，KLF基因、OCT基因和SOX基因在基因组上是作为反义链而不是作为蛋白编码链(有义链)编码的。当仙台病毒基因组进入细胞中，它使用该基因组作为模板产生反基因组RNA。反基因组是正链，而KLF基因、OCT基因和SOX基因作为蛋白编码链(有义链)加载。在反基因组RNA中，KLF基因、OCT基因和SOX基因的定位使得在这三个基因中，KLF基因位于最接近5’侧，而SOX基因位于最接近3’侧。

这三个基因优选彼此相邻(即这三个基因之间没有其他的基因存在)。这三个基因中每一个都可以合适地被包夹在仙台病毒S(起始)序列和E(终止)序列之间。S序列是起始转录的信号序列，E序列则终止转录。S序列和E序列之间的区域成为单个转录单位。当合适时，在特定基因的E序列和下一基因的S序列之间可以插入充当间隔物(居间序列)的序列。例如，可以有利地使用含有这样的核酸的仙台病毒载体，所述核酸具有如下组成：S-KLF基因-E-I-S-OCT基因-E-I-S-SOX基因-E(S,I,和E分别指S序列、I(居间,intervening)序列，和E序列)。仙台病毒基因组上的P基因和KLF基因将以下述方式连接：P基因-E-I-S-KLF基因-，等等。

当OCT基因、SOX基因和KLF基因以此顺序定位时，例如，可以有利地使用这样的仙台病毒载体，其基因组中含有具有S-OCT基因-E-I-S-SOX基因-E-I-S-KLF基因-E(S、I和E分别指S序列、I(居间)序列、和E序列)构成的核酸。仙台病毒基因组上的P基因和SOX基因将以如下方式连接：P基因-E-I-S-SOX基因-，等等。

可使用仙台病毒的期望的S序列作为S序列，但可优选使用例如3’-UCCCWVUUWC-5’(W＝A或U；V＝A、C或G)序列(SEQ ID NO:1)。尤其是，3’-UCCCAGUUUC-5’(SEQ ID NO:2)、3’-UCCCACUUAC-5’(SEQ IDNO:3)、和3’-UCCCACUUUC-5’(SEQ ID NO:4)是优选的。当这些序列以编码正链的DNA序列表示时，它们分别为5’-AGGGTCAAAG-3’(SEQ ID NO:5)、5’-AGGGTGAATG-3’(SEQ ID NO:6)、和5’-AGGGTGAAAG-3’(SEQ IDNO:7)。仙台病毒载体的E序列优选为例如3’-AUUCUUUUU-5’(SEQ ID NO:8)(编码正链的DNA为5’-TAAGAAAAA-3’(SEQ ID NO:9))。I序列可以为例如任何三个碱基，具体可以使用3’-GAA-5’(正链DNA中为5’-CTT-3’)。

野生型仙台病毒的基因组在3'的短前导区域之后，依次包含核壳(N)基因、磷(P)基因、基质(M)基因、融合(F)基因、血凝素-神经氨酸酶(HN)基因和大(L)基因、以及短的5'-后随序列(trailer)区域。在仙台病毒载体中也可以按照该顺序配置病毒基因。与野生型病毒相当的重组载体以及各种突变型载体的制备是已知的。而且还显示，使用没有其包膜的单独RNP也可能实现基因导入(WO00/70055)。因此，可以使用仙台病毒RNP作为病毒载体进行重编程。

仙台病毒如果携带NP基因、P基因和L基因就足以作为载体发挥功能，它们可以在细胞中复制基因组并表达搭载的外源基因(KLF、OCT和SOX)。在携带NP基因、P基因和L基因这三个基因作为病毒基因的仙台病毒中，KLF、OCT及SOX基因的组插入例如P基因和L基因之间。在含有M基因的载体中，KLF、OCT和SOX基因的组插入例如P基因和M基因之间(WO97/16539)。当M基因缺失的仙台病毒载体中包含F基因时，KLF、OCT和SOX基因的组插入P基因和F基因之间(WO00/70070)。对于缺失M和F基因的仙台病毒载体，插入的位置在P基因和HN基因之间；而对于缺失F、M和HN基因的仙台病毒载体，插入的位置在P基因和L基因之间(WO2003/025570,WO2006/137517)。缺失病毒基因的载体由于非常安全所以是优选的。在本发明中，可以优选使用具有至少F基因缺失的载体。

上述的含有KLF、OCT及SOX基因的仙台病毒可以适宜地单独用于重编程中的基因投递，但其更优选用于还涉及MYC基因或Glis1基因导入的重编程。MYC基因或Glis1基因可以插入上述的含有KLF、OCT及SOX基因的仙台病毒，但也可以插入别的载体后使用。当将MYC基因或Glis1基因插入别的载体时，可以使用如质粒、病毒载体、以及非病毒载体(例如脂质体)等期望的载体。病毒载体的例子包括腺病毒载体和逆转录病毒载体，但不限于此。更优选的是，MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒载体。在本发明中，上述的含有KLF、OCT及SOX基因的仙台病毒优选与插入了MYC基因或Glis1基因的另外的仙台病毒载体组合使用。上述的仙台病毒载体可以用作起始仙台病毒载体来插入MYC基因或Glis1基因。

当将MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒基因组时，载体中的基因插入位置可以选择期望的位点。例如，MYC基因或Glis1基因优选位于靠负链RNA基因组的后方(5’侧)，例如，比负链RNA病毒基因组的中心更靠5’端(位置比位于中央的基因更靠5’端)。换言之，在位于基因组上的多个蛋白编码序列中，其优选位于距5’端比距3’端更近的位置(见实施例)。MYC基因或Glis1基因可以位于例如最5’侧(即自5’端起的第一个位置)，或者自5’端起的第二或第三个位置。MYC基因或Glis1基因可以位于自基因组的5’端起的第二个位置，具体地，当L基因位于基因组最5’侧，接着是HN基因时，其可位于HN基因和L基因之间(HN-L间)。具体地，优选将MYC基因或Glis1基因插入仙台病毒基因组中的L基因的紧邻上游(3’侧，例如HN基因与L基因之间)，或者紧邻下游(5’侧，例如L基因与5’-后随序列之间)。仙台病毒载体可以是例如这样的F基因缺失仙台病毒载体，其中M蛋白具有G69E、T116A和A183S突变，HN蛋白具有A262T,G264R和K461G突变，P蛋白具有L511F突变，而L蛋白具有N1197S和K1795E突变(例如，Z株)；且通过向该载体中进一步导入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS1突变而产生的载体是更优选的。例子包括SeV(HNL)c-rMYC/TSΔF,SeV(L)c-rMYC/TSΔF,SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF(WO2010/008054；Fusakietal.,ProcJpnAcadSer B PhysBiol Sci.Vol.85,p348-362(2009))，特别是优选SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF，但不限于此。

MYC基因，不仅包括野生型c-MYC还包括T58A突变体、N-MYC和L-MYC，能够诱导多能干细胞(WO2007/69666；Blelloch R.et al.,Cell StemCell,1:245-247,2007)。如此，由于可以通过各种方式选择家族基因并使用，可以合适地选择MYC家族基因来诱导重编程。此外，可以通过合适地导入不改变被编码的氨基酸序列的沉默突变来替换MYC基因中的连续A或T核苷酸序列。

例如，已发现仙台病毒载体等RNA病毒载体表达的野生型c-MYC的量少。然而，通过向野生型c-MYC中导入选自a378g、t1122c、t1125c、a1191g、和a1194g中的一个或多个，优选两个或更多个，三个或更多个，或四个或更多个，或全部5个突变，可以从载体稳定地高表达基因。在本发明中，例如，可以适当地使用WO2010/008054的SEQ ID NO:45所示的修饰的c-MYC基因。

当适宜时，可以在上述的携带KLF、OCT和SOX基因的仙台病毒载体和/或携带MYC基因的仙台病毒载体中进一步搭载用于细胞重编程的基因等。此外，也可以将搭载了用于细胞重编程的基因等的其他载体与上述的仙台病毒载体组合。要搭载的基因可以是从已分化的细胞诱导多能干细胞等各种干细胞的诱导中涉及的期望的基因。例如，可以搭载增加重编程效率的基因。

本发明提供本发明的仙台病毒载体用于在细胞重编程中导入基因的用途，以及这些载体用于在细胞中表达重编程因子以诱导这些细胞的重编程的用途。此外，本发明提供含有本发明的仙台病毒载体的、用于在细胞重编程中导入基因的作用剂(转移剂、基因转移剂)，以及含有这些载体的用于在细胞中表达重编程因子的作用剂。此外，本发明涉及含有本发明的仙台病毒载体的、用于在细胞中表达重编程因子以诱导该细胞的重编程的作用剂。此外，当实施细胞的重编程时，本发明的载体还可以用于在这些细胞中表达期望的基因。本发明的仙台病毒载体可以依照本发明来用于细胞重编程。重编程的诱导具体可以是多能干细胞的诱导。本发明可以用于医学用途和非医学用途，并可以在医学和非医学实施方案中使用。例如，本发明可以用于治疗、手术、和/或诊断目的，或者非治疗、非手术、和/或非诊断目的。

在本发明中，核重编程因子是指能够单独或与多个因子共同用于将某细胞的已分化状态诱导至相对未分化的状态的基因或其产物，包括例如用于诱导已分化的细胞脱分化的基因或其产物。本发明中，核重编程因子(a nuclearreprogramming factor)包括：核的重编程所必需的因子、和提高核重编程的效率的辅助性因子(辅助因子)。本发明中，可以使载体携带用于核重编程(nuclear reprogramming)的希望的基因。例如，可以进一步加载用于多能干细胞的制造的基因。具体地，作为用于诱导多能干细胞的核重编程因子，可以使用例如：在ES细胞、初期胚等中表达、但在分化的多种体细胞中不表达或表达降低的基因(ES细胞特异性基因等)。这样的基因优选是编码转录因子、核蛋白质等的基因。鉴定核重编程基因的方法是已知的(WO2005/80598)，实际上，已证明采用该方法鉴定出的基因显示对于向多能干细胞的重编程(reprogramming)是有用的(WO2007/69666)。

作为这样的基因的例子，可以列举出：DPPA5(发育多能性相关5,ES细胞特异性基因1(ESG1)；登录号NM_001025290,NM_025274,XM_236761)、F-框蛋白15(Fbx15,NM_152676,NM_015798)、Nanog(NM_024865,AB093574)、ECAT1(ES细胞相关转录物1；AB211062,AB211060)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532,NM_181548)、DNMT3L(DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3-样；NM_013369,NM_019448)、ECAT8(AB211063,AB211061)、GDF3(生长分化因子3；NM_020634,NM_008108)、SOX15(SRY(性别决定区Y)-框15；NM_006942,NM_009235)、DPPA4(发育多能性相关4；NM_018189,NM_028610)、DPPA2(NM_138815,NM_028615)、FTHL17(运铁蛋白,重链多肽-样17；NM_031894,NM_031261)、SALL4(sal-样4；NM_020436,NM_175303)、OCT3/4(也称POU5F1；NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、SOX2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、Rex-1(ZFP42(锌指蛋白42同源物)；NM_174900,NM_009556)、Utf1(未分化的胚胎细胞转录因子1；NM_003577,NM_009482)、TCL1A(T细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966,NM_009337)、DPPA3(也称Stella,NM_199286,NM_139218,XM_216263)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235,NM_010637)、联蛋白β1(钙粘蛋白-相关蛋白β1；NM_001904,NM_007614；含S33Y突变体)、c-MYC(NM_002467,NM_010849；含T58A突变体)、STAT3(信号转导者和转录活化者3；NM_139276,NM_213659)、GRB2(结合于生长因子受体的蛋白2；NM_002086,NM_008163)，Glis1基因(Maekawa et al.,Nature,474:225-229,2011；NM_147193,NM_147221)以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。这些基因导入细胞时可诱导多能干细胞(WO2007/69666)。因此，可以在依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的本发明的仙台病毒载体中进一步搭载上述基因中尚未搭载于该载体中的基因，或者可以将搭载那些基因的其他载体与依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的本发明的仙台病毒载体组合使用。这些基因可以分别组入不同的载体中，或者可以将多个基因一起组入单个载体中。此外，各个基因可以组入单独一种载体中，或者可以将不同类型的载体(包括染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)与上述的本发明的依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体组合使用。此外，各病毒载体可以分别包装，而在使用时组合使用它们。或者，可以将携带不同基因的多个病毒载体预先组合成试剂盒，或者混合成组合物。此外，在细胞的重编程、特别是多能干细胞的制造中也优选使用包含这些基因的任意组合(或全部)的1个或其以上的非整合型病毒载体、以及包含该载体的试剂盒或组合物。对于组合物的情况，载体可以适宜与可药用的担载体和/或媒介物组合，例如混合在灭菌水、pH缓冲液、生理盐水、培养液等中。在这些体系中，还可以将核重编程基因的一部分或大部分替换成作为蛋白质的其表达产物。更具体地，本发明的组合物和试剂盒也可以含有表达重编程因子的其他载体(染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)和/或诱导重编程的化合物、蛋白质等，只要它们包括上述的依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体。重编程的必要因子可以全部由仙台病毒载体表达，或者也可以仅一部分由仙台病毒载体表达而其它部分由其它载体和/或化合物(例如蛋白质或低分子化合物)供给。此外，本发明的经重编程的细胞的制造方法并不限于全部的基因导入均使用仙台病毒载体来进行的方法。更具体地说，本发明的方法只需使用依次包含KLF基因、OCT基因和SOX基因或者依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的上述仙台病毒载体，还包括组合使用表达重编程因子的其它载体(染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)和/或诱导重编程的化合物等。优选地，它们与含有MYC基因或Glis1基因的上述仙台病毒载体组合使用。

此外，当使用依次包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体时，与含有KLF基因的其他仙台病毒载体组合是有用的。

本发明涉及用于细胞重编程中的组合物，其包含上述的依次含有KLF基因、OCT基因和SOX基因，或依次含有OCT基因、SOX基因和KLF基因的仙台病毒载体作为表达载体。此外，本发明涉及所述仙台病毒载体在已分化的细胞的重编程中的用途。例如，本发明提供所述仙台病毒载体在细胞重编程中将重编程因子基因(KLF、OCT和SOX)导入有此需要的细胞的用途。此外，本发明涉及在细胞重编程中导入这些基因的方法，其使用所述病毒载体来将这些基因导入有此序列的细胞。本发明还涉及包含上述病毒载体的、在细胞重编程中用于导入该基因的组合物、在细胞重编程中用于导入该基因的作用剂(在细胞重编程中用于导入该基因的转移剂，以及用于在细胞重编程中导入基因的作用剂)。此外，本发明涉及所述病毒载体在制备用于在细胞重编程中向有需要的细胞导入所述基因的药剂中的用途。本发明还提供包含所述病毒载体的、供细胞重编程中使用的用于导入基因的作用剂(基因表达剂或表达载体)。此外，本发明提供包含所述病毒载体的、用于导入重编程基因的作用剂(基因表达剂或表达载体)。本发明还提供包含所述病毒载体的用于表达核重编程因子KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次OCT基因、SOX基因和KLF基因的作用剂(即核重编程基因转移剂、核重编程基因表达载体)。此外，本发明还提供含有所述病毒载体的多能干细胞诱导剂以及多能干细胞诱导辅助剂。本发明还提供所述病毒载体用于已分化细胞的重编程的用途。本发明还提供所述病毒载体在制备用于已分化细胞的重编程的药剂、试剂和/或医药中的用途。此外本发明还涉及所述病毒载体在制备用于向已分化细胞中导入核重编程因子(KLF基因、OCT基因、以及SOX基因)的作用剂中的用途。

这里，重编程可以是例如从已分化的细胞诱导多能干细胞。通过组入编码用于重编程的因子的基因(KLF基因、OCT基因和SOX基因)来使用载体。编码重编程因子的基因的例子包括编码上述任一种因子的基因或如下所示的基因。

导入的因子(KLF基因、OCT基因、SOX基因等)可根据要重编程的细胞的来源来合适地选择，且它们可来源于人类或其他哺乳动物诸如小鼠、大鼠、猪，或灵长类例如猴。此外，基因和蛋白质序列并不一定必须是野生型序列，只要它们能够诱导重编程，它们可以具有突变。使用突变体基因产生多能干细胞的例子是已知的(WO2007/69666)。例如，编码具有一个或少数个(例如数个，不超过3个、不超过5个、不超过10个、不超过15个、不超过20个或不超过25个)氨基酸添加、缺失、取代和/或插入，且能够诱导重编程的氨基酸序列的基因可以在本发明中使用。此外，只要生物学活性(诱导重编程的能力)得以维持，可以使用例如在N末端和/或C末端缺失或添加一个至数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸的多肽，取代了一个至数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸的多肽等。可以使用的变体包括例如天然蛋白质的片段、类似物和衍生物，以及天然蛋白质与其他多肽的融合蛋白(例如添加有异源信号肽或抗体片段者)。具体地，包括这样的多肽：其包含在野生型氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，并具有与野生型蛋白等同的生物学活性(例如诱导重编程的活性)。当使用野生型蛋白质的片段时，通常，该片段含有野生型多肽(在分泌型蛋白的情况下为成熟形式)的70％以上、优选80％以上、85％以上、更优选90％以上、95％以上或98％以上的连续区域。

氨基酸序列的变体例如可以通过在编码天然多肽的DNA中导入突变来制备(Walker and Gaastra,eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company,New York,1983)；Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492,1985；Kunkel等，Methods Enzymol.154:367-382,1987；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Plainview,N.Y.),1989；U.S.Pat.No.4,873,192)。关于进行氨基酸取代而不影响生物学活性的指导的例子包括Dayhoff等的报道(Dayhoff等，收录于Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.),1978)。

对于进行修饰的氨基酸的数目没有特殊限制，但例如是天然的成熟型多肽的全部氨基酸的30％以下、优选25％以下、更优选20％以下、更优选15％以下、更优选10％以下、5％以下或3％以下，且为例如15个氨基酸以下、优选10个氨基酸以下、更优选8个氨基酸以下、更优选5个氨基酸以下、更优选3个氨基酸以下。在对氨基酸氨基酸进行取代时，通过取代成侧链性质相似的氨基酸可以期待保持蛋白质的活性。这样的取代在本发明中称作保守取代。保守取代的例子包括诸如下列各组中的氨基酸之间的取代等：碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等各组内的氨基酸之间的取代等。此外，可以列举出例如，BLOSUM62取代矩阵(S.Henikoff and J.G.Henikoff,Proc.Acad.Natl.Sci.USA89:10915-10919,1992)中处于正值关系的氨基酸之间的取代。

经修饰的蛋白质与野生型蛋白质的氨基酸序列之间显示高同源性。高同源性是指：具有例如70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或96％以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如BLASTP程序(Altschul,S.F.等，J.Mol.Biol.215:403-410,1990)来确认。例如，可以在NCBI(National Center for BiothchnologyInformation)的BLAST的网页上，使用默认参数来进行检索(Altschul S.F.等，Nature Genet.3:266-272,1993；Madden,T.L.等，Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul S.F.等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Zhang J.&Madden T.L.,Genome Res.7:649-656,1997)。例如，通过进行2个序列的比较的Blast2序列程序(Tatiana A等，FEMS Microbiol Lett.174:247-250,1999)，制作2个序列的比对，可以确定序列的同一性。空位和错配类似对待，计算出例如相对于天然型细胞因子(分泌后的成熟型的形态)的氨基酸序列全体的同一性的值。具体地，计算出野生型蛋白质(若为分泌蛋白质则为成熟型)的全部氨基酸数中的一致的氨基酸数的比例。

此外，基因可以导入沉默突变，使得所编码的氨基酸序列不改变。特别是，在富含AT的基因中，将5个以上的连续的A或T核苷酸取代成G或C，而不改变所编码的氨基酸序列，从而能够稳定地获得基因的高表达。

修饰蛋白质或者用于重编程的蛋白质的例子是与编码野生型蛋白质的基因的编码区域的一部分或全部在严格条件下杂交的核酸所编码的、具有与野生型蛋白质等同的活性(诱导重编程的活性)的蛋白质。在杂交中，例如，可以从包含野生型蛋白质基因的编码区域序列或其互补序列的核酸或作为杂交对象的核酸中的任何一方制备探针，并可以通过检测其是否与另一方的核酸杂交来进行鉴定。严格杂交的条件例如是：在含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑鱼精DNA、5xDenhardt液(1xDenhardt溶液含0.2％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白以及0.2％Ficoll)的溶液中，于60℃、优选65℃、更优选68℃进行杂交，然后在与杂交相同的温度下，于2xSSC中、优选1xSSC中、更优选0.5xSSC中、更优选0.1xSSC中振荡洗涤2小时的条件。

为了诱导细胞的重编程特别优选的基因的例子通常包括：F-框蛋白15(Fbx15,NM_152676,NM_015798)、Nanog(NM_024865,AB093574)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532,NM_181548)、DPPA2(NM_138815,NM_028615)、OCT3/4(也称POU5F1；NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、SOX2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、TCL1A(T细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966,NM_009337)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235,NM_010637)、联蛋白β1(钙联蛋白相关蛋白beta1；NM_001904,NM_007614；包括S33Y突变体)、c-MYC(NM_002467,NM_010849；包括T58A突变体)、以及Glis1基因(Maekawaet al.,Nature,474:225-229,2011；NM_147193,NM_147221)，以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。有报导称，在导入这些基因的情况下，显示出诱导多能干细胞的形态的集落的比例高于导入4种基因(OCT3/4、SOX2、KLF4、和c-MYC)时的比例(WO2007/69666)。因此，除了KLF基因、OCT基因和SOX基因之外进一步携带上述基因中的任何一个或其组合的仙台病毒载体，或本发明的携带KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体与一个或多个携带上述任一种基因或其组合的仙台病毒载体的组合在本发明中可以用于诱导细胞的重编程，特别是它们可以有利地用于诱导多能干细胞。各个病毒载体可以在使用时进行组合来使用。此外，也可以预先做成试剂盒，或者混合起来作为组合物。此外，本发明还包括：包含这些基因的任意组合(或全部)的、1个或其以上的染色体非整合型病毒载体，以及包含该载体的试剂盒或组合物。

优选将用于表达KLF基因、OCT基因和SOX基因的本发明的载体组合，特别是与表达MYC和/或Glis1基因的载体组合(Takahashi,K.and YamanakaS.,Cell126,663-676,2006；Lowry WE等，Proc Natl Acad Sci U S A,105(8):2883-8,2008；Masaki,H.等，Stem Cell Res.1:105-115,2008；Maekawaet al.,Nature,474:225-229,2011；WO2007/69666)。此处，SOX蛋白质、KLF蛋白质、MYC蛋白质和OCT蛋白质、以及它们的基因是指分别属于SOX家族、KLF家族、MYC家族和OCT家族的成员的蛋白质和基因。有报告称，通过进行调整使得分别表达1个以上的这4个家族的成员，可以从各种已分化的细胞诱导多能干细胞。例如，有报告称，对于SOX家族的基因，使用SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX17中的任何一个基因，均可以诱导多能干细胞(WO2007/69666)。此外，对于KLF家族，使用KLF4或KLF2均能够诱导多能干细胞(WO2007/69666)。对于MYC家族，不仅是使用野生型c-MYC、使用T58A突变体或N-MYC、L-MYC也能够诱导多能干细胞(WO2007/69666；Blelloch R.等，Cell Stem Cell,1:245-247,2007)。这样，由于可以通过多种方式选择家族的基因然后使用，可以适宜地选择上述的4种家族基因来诱导重编程。

具体地，KLF家族包括KLF1(NM_006563,NM_010635)、KLF2(NM_016270,NM_008452)、KLF4(NM_004235,NM_010637)、和KLF5(NM_001730,NM_009769)；MYC家族包括c-MYC(NM_002467,NM_010849,含T58A突变体)、N-MYC(NM_005378,NM_008709)、和L-MYC(NM_005376,NM_005806)；OCT家族包括OCT1A(NM_002697,NM_198934)、OCT3/4(NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、和OCT6(NM_002699,NM_011141)；SOX家族包括SOX1(NM_005986,NM_009233)、SOX2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、SOX3(NM_005634,NM_009237)、SOX7(NM_031439,NM_011446)、SOX15(NM_006942,NM_009235)、SOX17(NM_022454,NM_011441)、和SOX18(NM_018419,NM_009236)。依照本发明的顺序携带这些基因中的任一个的仙台病毒载体，在本发明中可以用于诱导细胞的脱分化，特别优选用于诱导多能干细胞。

MYC家族的基因对于多能干细胞的诱导并非必需，仅使用除MYC家族基因以外的3个家族的基因也能够诱导多能干细胞(Nakagawa M.等，NatBiotechnol.26(1):101-6,2008；Wering M.等，Cell Stem Cell2(1):10-2,2008)。在不表达MYC基因的情况下，例如，使用p53siRNA和UTF1能够使多能干细胞的诱导效率显著地提高(Y.Zhao等，Cell Stem Cell,3(5):475-479,2008；N.Maherali,and K.Hochedlinger,Cell Stem Cell,3(6):595-605,2008)。此外，有报告称，仅使用除KLF家族的基因之外的3个家族的基因也能够诱导多能干细胞(Park IH等，Nature,451(7175):141-6,2008)。此外，有报告称，通过结合使用G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂(BIX-01294；Kubicek,S.等，Mol.Cell25,473-481,2007)，仅使用3个基因，即KLF基因、SOX基因和MYC基因就可以从胚胎NPC诱导多能干细胞(Shi Y等，Cell Stem Cell,2(6):525-8,2008)。编码各基因的病毒载体可以分别单独制备。它们可以在使用时组合使用。可以将它们任意组合或全部组合在一起作为试剂盒，或者混合起来形成组合物。除了本发明的携带KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体之外，本发明还涉及包含这三种基因和化合物之外的基因的任意组合(或全部)的1种或多种染色体非整合型病毒载体，以及包含这些载体的用于重编程的试剂盒或组合物。而且，还可以将该试剂盒中所含的一部分重组载体替换成具有相当功能的蛋白质、合成化合物等。

在以上描述的基因的组合中，还可以进一步组合其它基因，来提高重编程的诱导效率。这样的基因的例子包括TERT(NM_198253,NM_009354)和/或SV40大T抗原(NC_001669.1,Fiers,W.(05-11-1978)Nature273:(5658)113-120)(Park IH.等，Nature,451(7175):141-6,2008)。可以进一步组合选自HPV16E6、HPV16E7、和Bmil(NM_005180,NM_007552)中的1个或多个基因。此外，可以表达选自Fbx15(Mol Cell Biol.23(8):2699-708,2003)、Nanog(Cell113:631-642,2003)、Eras(Nature423,541-545,2003)、DPPA2(Development130:1673-1680,2003)、TCL1A(Development130:1673-1680,2003)、以及β-联蛋白(Nat Med10(1):55-63,2004)中的基因的1个或任意组合。而且，可以组合选自ECAT1(AB211062,AB211060)、DPPA5(NM_001025290,NM_025274,XM_236761)、DNMT3L(NM_013369,NM_019448)、ECAT8(AB211063,AB211061)、GDF3(NM_020634,NM_008108)、SOX15(NM_006942,NM_009235)、DPPA4(NM_018189,NM_028610)、FTHL17(NM_031894,NM_031261)、SALL4(NM_020436,NM_175303)、Rex-1(NM_174900,NM_009556)、Utf1(NM_003577,NM_009482)、DPPA3(NM_199286,NM_139218,XM_216263)、STAT3(NM_139276,NM_213659)、和GRB2(NM_002086,NM_008163)中的1个或多个基因。除了KLF基因、OCT基因和SOX基因之外还包含NANOG基因(NM_024865,AB093574)和LIN28基因(NM_024674)的各基因的组合对于诱导多能干细胞是有用的(Yu J.et al.,Science,318(5858):1917-20,2007)。此外，优选再与MYC基因组合(Liao J等，Cell Res.18(5):600-3,2008)。通过额外表达这些基因，可促进多能干细胞的诱导(WO2007/69666)。在以成熟B细胞作为对象的情况下，例如，可以异处表达髓细胞转录因子C/EBPα(CCAAT/增强子结合蛋白α)(NM_004364)，或者抑制B细胞转录因子Pax5(成对框5；NM_016734)的表达，来促进重编程(Hanna J,Cell.133(2):250-64,2008)。这些因子也可以使用本发明中的染色体非整合型病毒载体进行表达。而且，该试剂盒中所包含的一部分重组载体可以替换成具有相当功能的蛋白质、合成化合物等。

此外，除了表达上述的因子以外，例如，通过与添加化合物组合，也能够提高重编程的效率。例如，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和/或SCF(干细胞因子)可促进多能干细胞的诱导，而且能够在多能干细胞的诱导中代替c-MYC的功能(WO2007/69666)。此外，MAP激酶抑制剂(PD98056)也可以用于建立更接近于ES细胞的多能干细胞等用途(WO2007/69666)。此外，有报告称DNA甲基化酶(Dnmt)抑制剂和/或组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂能够改善多能干细胞的诱导效率(Huangfu D等，Nat Biotechnol.(在线发表2008年6月22日,doi:10.1038/nbt1418)；Nat.Biotechnol.26,795-797(2008))。例如，通过组合使用HDAC(VPA)，仅导入OCT4和SOX2这2个基因就能够诱导多能干细胞(Huangfu,D.等，Nat Biotechnol.200826(11):1269-75)。本发明的载体可以用于与这些化合物的施用组合使用。作为Dnmt抑制剂，可以使用例如5-氮杂胞苷等；作为HDAC抑制剂，可以使用例如N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)、丙戊酸(VPA)等。此外，在使用5-氮杂胞苷时，组合使用糖皮质激素(地塞米松)可以提高效率。

为了重编程细胞，例如，(1)本发明的用于表达KLF基因、OCT基因和SOX基因的载体，(2)(1)的载体与用于表达MYC基因或Glis1基因的仙台病毒载体的组合，(3)通过对(2)进一步加入用于表达NANOG基因的仙台病毒载体以及用于表达LIN28的仙台病毒载体而产生的组合，(4)通过对(2)的组合进一步添加一种或两种分别单独表达KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体而产生的组合(例如，携带OCT3/4-SOX2-KLF4基因的SeV载体、携带MYC基因的载体，以及携带KLF基因的载体等的组合)，或者(5)(1)的载体与携带其他期望的如上所述的重编程因子的载体和/或期望的重编程诱导性化合物的组合等，可以导入细胞中。(1)的载体包括本发明的仙台病毒载体，其依次含有KLF基因、OCT基因和SOX基因，或者依次含有OCT基因、SOX基因和KFL基因。在组合并导入多个载体和/或化合物的情况下，导入优选同时进行，具体地，优选在添加最初的载体或化合物等后的48小时以内、优选36小时以内、更优选24小时以内、18小时以内、12小时以内、10小时以内、8小时以内、6小时以内、3小时以内、2小时以内或1小时以内，将全部编码重编程因子的载体和/或化合物添加完毕。载体的剂量可以适宜制备，且MOI为例如0.1或更多，优选0.3或更多，0.5或更多，1或更多，2或更多，或3或更多，且100或更少，优选90或更少，80或更少，70或更少，60或更少，50或更少，40或更少，30或更少，20或更少，10或更少，或5或更少。优选以例如MOI0.3～100、更优选MOI0.5～50、更优选MOI1～40、更优选MOI1～30、更优选MOI2～30、例如MOI3～10进行感染。诱导出的多能干细胞形成与ES细胞十分相似的扁平集落，并表达碱性磷酸酶。此外，诱导出的多能干细胞可以表达未分化细胞标志物Nanog、OCT4和/或SOX2等。此外，诱导出的多能干细胞优选表达TERT和/或显示端粒末端转移酶活性。本发明还涉及表达碱性磷酸酶、优选还表达未分化细胞标志物Nanog和/或TERT的细胞的制造方法，以及仙台病毒载体在制作这些细胞和制造用于诱导这些细胞的药剂中的用途。

根据本发明，能够从希望的细胞(包括成人皮肤细胞和新生儿周皮细胞)诱导出多能干细胞集落，例如至少对于某些细胞以0.03×10^-5以上、0.1×10^-5以上、0.3×10^-5以上、0.5×10^-5以上、0.8×10^-5以上、或1×10^-5以上(例如1×10^-5～1×10^-3)的出现率，优选以1.5×10^-5以上、1.7×10^-5以上、2.0×10^-5以上、2.5×10^-5以上、3×10^-5以上、4×10^-5以上、5×10^-5以上、8×10^-5以上、1×10^-4以上、2×10^-4以上、3×10^-4以上、5×10^-4以上、8×10^-4以上、1×10^-3以上、1.5×10^-3以上、2×10^-3以上、5×10^-3、1×10^-2以上、1.5×10^-2以上、2×10^-2以上、2.5×10^-2以上、3×10^-2以上、4×10^-2以上、或5×10^-2以上的出现率诱导出多能干细胞的集落。此外，至少对于某些细胞，本发明的载体的多能干细胞集落出现的效率为例如与对照相比的1.5倍以上，优选2倍以上，2.5倍以上，三倍以上，3.5倍以上，4倍以上，4.5倍以上，或5倍以上，所述对照中KLF基因、OCT基因和SOX基因分别搭载到不同的仙台病毒载体中。此外，至少对于某些细胞，本发明的依次含有KLF基因、OCT基因和SOX基因的载体的多能干细胞集落出现的效率为例如与对照相比的1.5倍以上，优选2倍以上，2.5倍以上，三倍以上，3.5倍以上，4倍以上，4.5倍以上，或5倍以上，所述对照中KLF基因、OCT基因和SOX基因以其他顺序搭载到单一仙台病毒载体中，例如以OCT基因、SOX基因和KLF基因的顺序。当使用依次插入OCT基因、SOX基因和KLF基因的本发明的载体时，一个特征性的优点是iPS细胞的快速生长(集落的快速生长)。

对于作为诱导重编程的对象的经分化的细胞，没有特殊限制，可以使用希望的体细胞等。不仅可以从小鼠胚胎来源的细胞生成多能干细胞已证明是可能的，从采集自成体小鼠尾部的经分化的细胞、或肝细胞和胃粘膜细胞生成也显示是可行的，这提示该生成并非依赖于细胞类型或分化状态(WO2007/069666；Aoi T.等，Science[2008年2月14日网上发表]；Science.2008；321(5889):699-702)。此外，对于人类，也已经确认可以从成人的面部皮肤来源的成纤维细胞、成人滑膜细胞、新生儿周皮来源成纤维细胞、成人间充质干细胞、成人手掌的皮肤细胞、胚胎细胞等多种多样的细胞诱导多能干细胞(Takahashi K et al.(2007)Cell131:861-872；Park IH等，Nature,451(7175):141-6,2008)。此外，有报告称，从胰脏β细胞、B淋巴细胞这样的终末分化细胞同样可以诱导多能干细胞(Stadtfeld M等，Curr Biol.2008May21.[PubMed,PMID:18501604]；Curr Biol.2008；18(12):890-4；Hanna J.等，Cell.133(2):250-64,2008)。这些认识提示，多能干细胞的诱导不依赖于作为来源的细胞。本发明的方法可以适用于从这些希望的体细胞诱导多能干细胞的过程中。具体地，作为重编程的对象的已分化的细胞包括成纤维细胞、滑膜细胞、口腔或胃等的粘膜细胞、肝细胞、骨髓细胞、牙胚细胞、血细胞(例如淋巴细胞和白细胞)、以及其它希望的细胞。此外，细胞可以是来源于例如胚、胚胎、新生儿、小儿、成人或老年人的细胞。此外，对动物的来源没有特殊限制，包括哺乳动物，例如人和非人灵长类(猴等)、小鼠、大鼠等啮齿类和牛、猪、山羊等非啮齿类。

可以从重编程完成后的细胞的集落适宜选择出除去了载体的细胞。例如可以选择自然除去载体的细胞。为此目的，例如可以使用对病毒载体特异性的抗体(例如抗HN抗体)进行负选择。此外，在使用温度敏感性载体时，通过在高温(例如37.5～39℃、优选38～39℃或38.5～39℃)下进行培养，可以简便地除去载体。当使用SeV(PM)/TSΔF，或向SeV(PM)/TSΔF中导入了更多突变如TS7,TS12,TS13,TS14,TS15而得到的载体时，传代导致载体的自然丢失。优选载体的例子包括但不限于SeV(PM)KOS/TS12ΔF。此外，在此情况下，可以使用SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF等导入MYC基因。此外，通过不将MYC基因加载到携带有KLF基因、OCT基因和SOX基因的仙台病毒载体中，可以在不使用与癌发生相关的MYC基因的同时有利地进行重编程。这一点有利的原因还在于可以从c-MYC、L-MYC、Glis1等中自由地选择在KLF基因、OCT基因和SOX基因之外的第四种因子。

采用本发明的方法制造的细胞可用于导致分化成各种组织或细胞，并可用于希望的检查、研究、诊断、试验、治疗等。例如，预期诱导出的干细胞可用于干细胞疗法。例如，可以使用采集自患者的体细胞，诱导重编程(reprogramming)，然后，将分化诱导所得的体性干细胞或其它体细胞移植给患者。对于细胞分化诱导的方法没有特殊限制，例如，可以通过视黄酸处理、各种增殖因子-细胞因子处理、利用激素进行的处理来诱导分化。此外，所得细胞可以用于检测希望的药物、化合物的效果，由此可以实施药物、化合物的筛选。

实施例

下面，参照实施例具体描述本发明；然而本发明不应理解为限于实施例。并入本文中引证的所有文件及其他参考资料作为本说明书的一部分。

实施例1pSeV(PM)/TSΔF的构建

下面显示了在本发明中使用的携带外源基因的仙台病毒载体的构建。除非另有说明，所有实施例中均使用这些载体导入外源基因。在本发明中，“(PM)”指插入重编程基因到P基因和M基因之间，“(HNL)”指插入重编程基因到HN基因和L基因之间。此外，在本发明中，“TS”指M蛋白中具有G69E,T116A和A183S突变，HN蛋白中具有A262T,G264R和K461G突变，P蛋白中具有L511突变，且在L蛋白中具有N1197S和K1795E突变；“ΔF”表示F基因缺失。下面，“SeV(PM)/TSΔF”是指在M蛋白中具有G69E,T116A和A183S突变、HN蛋白中具有A262T,G264R和K461G突变，P蛋白中具有L511F突变，且L蛋白中具有N1197S和K1795E突变的F基因缺失的仙台病毒载体(Z株)。该载体在P基因的紧邻下游(P基因和M基因之间)具有一个用于基因导入的插入位点(NotI位点)。但是，这些是示例性的，本发明不限于这些实例。

pSeV(PM)/TSΔF如下构建。实施PCR(94℃3分钟，25个[98℃10秒,55℃15秒,72℃12分钟]的循环，然后72℃7分钟)使用LitmusSalINheIfrgPmutMtsHNtsΔF-GFP delGFP(国际公布号WO2010/008054)作为模板，以及PMNOTI-F(5’-GAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATGGCAGATATCTATAG-3’)(SEQID NO:10)和PMNOTI-R(5’-CTATAGATATCTGCCATTGCGGCCGCTTAGGTGAAATTTC-3’)(SEQ IDNO:11)。所得的大约11-kb PCR产物用DpnI处理，然后将大肠杆菌DH5α(ToYoBo编码号DNA-903)用20μL的该反应液转化。挑取6个大肠杆菌集落进行小提。通过NotI消化选出具有NotI序列的质粒。然后通过测序选出具有正确序列的克隆。如此，得到Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNts(PM)-dF。然后，将Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNts(PM)-dF用SalI和NheI消化，将收集的片段(大约8kbp)连接于用SalI/NheI消化在L基因中具有两个突变的pSeV/ΔSalINheIfrgLmut质粒(国际公布号WO2003/025570)后收集到的片段(大约8kbp)。如此，得到pSeV(PM)/TSΔF。该载体在P基因和M基因之间具有一个用于基因导入的插入位点(NotI位点)。

实施例2用于制作携带KLF-OCT3/4-SOX2基因的SeV载体的质粒的制备

通过PCR扩增KLF4基因(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)；pSeV18+KLF4/TSΔF(WO2010/008054)作为模板；以及引物NotI-KIF-4F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’)(SEQ ID NO:12)和KOS-KO-R(5’-TCCGAAGCCAGGTGTCCCGCCATGGCGGCTGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTC-3’)(SEQ IDNO:13)。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化，并用100μl试剂盒附带的洗脱液洗脱。

通过PCR扩增OCT3/4基因(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)；pSeV18+OCT3/4/TSΔF(WO2010/008054)作为模板；以及引物KOS-KO-F(5’-GAGGCATTTTTAACCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACCTAACAGCCGCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGGA-3’)(SEQ ID NO:14)和KOS-OS-R(5’-CCGTCTCCATCATGTTGTACATGGCGGCGTGTTAGGTGAAATCTTTCACCCTAAGTTTTTCTTATTCTACGGTCAGTTTGAATGCATGGG-3’)(SEQID NO:15).PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化，并用100μl试剂盒附带的洗脱液洗脱。

通过PCR扩增SOX2基因(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)；pSeV18+SOX2/TSΔF(WO2010/008054)作为模板；以及引物KOS-OS-F(5’-CCCATGCATTCAAACTGACCGTAGAATAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGATTTCACCTAACACGCCGCCATGTACAACATGATGGAGACGG-3’)(SEQ ID NO:16)和Not I SOX-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’)(SEQ ID NO:17).PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化，并用100μl试剂盒附带的洗脱液洗脱。

使用这些纯化的PCR产物进行第二次PCR。使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)，并加入上述纯化的KLF4基因PCR产物、OCT3/4基因PCR产物、和SOX2基因PCR产物各1μL。使用NotI-KIF-4F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’)(SEQ ID NO:12)和Not I SOX-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’)(SEQ ID NO:17)作为引物，实施PCR(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)以进行扩增。

此外，作为另一条件，将上述的纯化KLF4基因PCR产物、OCT3/4基因PCR产物、和SOX2基因PCR产物用H₂O稀释10倍，加入各稀释液1μL；并使用NotI-KIF-4F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’)(SEQ ID NO:12)和Not I SOX-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’)(SEQ ID NO:17)作为引物。实施PCR(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)以进行扩增。

PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化，并用50μl试剂盒附带的洗脱液洗脱。该纯化产物用NotI消化，并用1％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，切出大约3.6kbp的条带，并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,目录号28706)实施纯化。使用100μL试剂盒附带的洗脱液进行洗脱。将包含KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因的NotI片段克隆到pSeV(PM)/TSΔF载体的NotI位点中，并通过测序选择具有正确序列的克隆以获得pSeV(PM)KOS/TSΔF。

实施例3携带人KLF4-OCT3/4-SOX2基因的SeV载体的纯化

在转化前一天，将10⁶个293T/17细胞接种到6孔板的每个孔中，在CO₂培养箱中(5％CO₂条件下)37℃培养。使用15μL TransIT-LT1(Mirus)，用下述的混合物转染293T/17细胞：

0.5μg pCAGGS-NP,0.5μg pCAGGS-P4C(-),2μg pCAGGS-L(TDK),0.5μg pCAGGS-T7,0.5μg pCAGGS-F5R(WO2005/071085)，和5.0μg上述的仙台病毒载体质粒pSeV(PM)KOS/TSΔF。将细胞在CO₂培养箱中37℃培养2天。然后，将10⁶个表达仙台病毒融合蛋白(F蛋白)的LLC-MK2/F/A细胞(Li,H.-O.et al.,J.Virology74.6564-6569(2000)；WO00/70070)覆盖到每个孔中经转染的293T/17细胞上。然后将细胞在CO₂培养箱中37℃培养一天。次日，移除细胞培养基，并用1ml加有青霉素-链霉素的MEM(下面简称PS/MEM)洗涤细胞1次。向每个孔中加入1ml含2.5μg/ml胰蛋白酶的PS/MEM(下面简称为Try/PS/MEM)。将细胞在CO₂培养箱中32℃培养2天。将细胞连续培养，每3-4天更换培养基，并在某些情况下用LLC-MK2/F/A细胞传代。取一份培养上清液通过血细胞凝集测定来评估载体收集。当观察到充分的血细胞凝集后回收培养上清液。使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(QIAGEN,目录号52906)从收集到的培养上清液提取RNA，然后对其进行以插入的KLF4-OCT3/4-SOX2基因的区域为目标的RT-PCR。通过测序确认获得的RT-PCR产物是否具有正确的核苷酸序列。如此，获得了SeV(PM)KOS/TSΔF载体。

实施例4用于制作携带OCT3/4-SOX2-KLF4基因的SeV载体的质粒的制备

通过PCR扩增OCT3/4基因(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)；pSeV18+OCT3/4/TSΔF(WO2010/008054)作为模板；以及引物F6(5’-ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’)(SEQID NO:18)和OSK-OS-R(5’-GGCGGCGTGTTAGGTGGATGACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGTTTGAATGC-3’)(SEQ ID NO:19)。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化，并用100μl试剂盒附带的洗脱液洗脱。

通过PCR扩增SOX2基因PCR(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)；pSeV18+SOX2/TSΔF(WO2010/008054)作为模板；以及引物OSK-OS-F(5’-TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTCATCCACCTAACACGCCGCCATGTACAACATGATGGAG-3’)(SEQ ID NO:20)和OSK-SK-R(5’-TGTTAGGTGGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGG-3’)(SEQ ID NO:21)。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化，并用100μl试剂盒附带的洗脱液洗脱。

通过PCR扩增KLF4基因(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃15秒，及72℃2分钟]循环,然后72℃7分钟)，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)；pSeV18+KLF4/TSΔF(WO2010/008054)作为模板；以及引物OSK-SK-F(5’-TAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACCTAACACGCCGCCATGGCTGTCAGCGACGC-3’)(SEQ ID NO:22)和R199(5’-GATAACAGCACCTCCTCCCGACT-3’)(SEQ ID NO:23)。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化，并用100ul试剂盒附带的洗脱液洗脱。

使用这些纯化的PCR产物进行第二次PCR。使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)，并加入上述纯化的OCT3/4基因PCR产物、SOX2基因PCR产物和KLF4基因PCR产物各1μL。使用F6(5’-ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’)(SEQ ID NO:18),SOX2-R470(5’-ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG-3’)(SEQ ID NO:24),或引物SOX2-F294(5’-AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC-3’)(SEQ ID NO:25)和KLF4-R405(5’-CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC-3’)(SEQ ID NO:26)作为引物，并实施PCR(95℃3分钟，以及30个[98℃10秒，55℃30秒，和72℃4分钟]循环,然后72℃7分钟)来进行扩增。

使用这些PCR产物和上述的纯化KLF4基因PCR产物(各0.5μL)，并以F6(5’-ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3’)(SEQ ID NO:18)和R150(5’-AATGTATCGAAGGTGCTCAA-3’)(SEQ ID NO:26)作为引物，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,目录号R010A)实施PCR。切出大约3.6kbp的扩增条带，使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,目录号28706)进行纯化。使用100μL该试剂盒附带的洗脱液进行洗脱。将该含有OCT3/4基因、SOX2基因和KLF4基因的PCR产物用NotI消化，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化。将该NotI片段克隆到pSeV(PM)/TSΔF载体的NotI位点中，通过测序选出具有正确序列的克隆，以得到pSeV(PM)OSK/TSΔF。

实施例5携带人OCT3/4-SOX2-KLF4基因的SeV载体的制作

0.5μg pCAGGS-NP、0.5μg pCAGGS-P4C(-)、2μg pCAGGS-L(TDK)、0.5μg pCAGGS-T7、0.5μg pCAGGS-F5R(WO2005/071085)、和5.0μg上述的仙台病毒载体质粒pSeV(PM)OSK/TSΔF。将细胞在CO₂培养箱中37℃培养2天。然后，将10⁶个表达仙台病毒融合蛋白(F蛋白)的LLC-MK2/F/A细胞(Li,H.-O.et al.,J.Virology74.6564-6569(2000)；WO00/70070)覆盖到每个孔中经转染的293T/17细胞上。然后将细胞在CO₂培养箱中37℃培养一天。次日，移出细胞培养基，并用1ml加有青霉素-链霉素的MEM(下面简称PS/MEM)洗涤细胞1次。向每个孔中加入1ml含2.5μg/ml胰蛋白酶的PS/MEM(下面简称为Try/PS/MEM)。将细胞在CO₂培养箱中32℃培养2天。将细胞连续培养，每3-4天更换培养基，并在某些情况下用LLC-MK2/F/A细胞传代。取一份培养上清液的通过血细胞凝集测定来评估载体收集。当观察到充分的血细胞凝集后回收培养上清液。使用QIAmp病毒RNA迷你试剂盒(QIAGEN,目录号52906)从收集到的培养上清液提取RNA，然后对其进行以插入的OCT3/4-SOX2-KLF4基因的区域为目标的RT-PCR。通过测序确认获得的RT-PCR产物是否具有正确的核苷酸序列。如此，获得了SeV(PM)OSK/TSΔF载体。

实施例6使用携带外源基因的仙台病毒载体制作ES样细胞

将1.5x10⁵个人新生儿包皮来源的成纤维细胞(BJ)(ATCC(www.atcc.org),CRL-2522)在含有10％FBS(Cell Culture Bioscience目录号171012)和青霉素(100u/mL)–链霉素(100μg/mL)(Nacalai Tesque,编码号26253-84)的DMEM(GIBCO-BRL,11995)(下称10％FBS/PS/DMEM)中在5％CO₂培养箱中37℃培养过夜。

培养后，将下示的载体以MOI＝3的浓度施用于上述的经培养的细胞。

条件1

SeV(PM)KOS/TSΔF载体

SeV18+c-rMYC/TSΔF载体(国际公布号WO2010/008054)

条件2

SeV(PM)KOS/TSΔF载体

SeV(HNL)c-rMYC/TSΔF载体(国际公布号WO2010/008054)

条件3

SeV(PM)KOS/TSΔF载体

SeV(L)c-rMYC/TSΔF载体(Fusaki et al.,Proc Jpn Acad Ser B Phys BiolSci.Vol.85,p348-362(2009))

条件4

SeV(PM)KOS/TSΔF载体

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体(国际公布号WO2010/008054)

条件5

SeV(PM)KOS/TSΔF载体

条件6

SeV(PM)OSK/TSΔF载体

SeV18+c-rMYC/TSΔF载体

条件7

SeV(PM)OSK/TSΔF载体

SeV(HNL)c-rMYC/TSΔF载体

条件8

SeV(PM)OSK/TSΔF载体

SeV(L)c-rMYC/TSΔF载体

条件9

SeV(PM)OSK/TSΔF载体

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体

条件10

SeV(PM)OSK/TSΔF载体

条件11

SeV18+OCT3/4/TSΔF载体(国际公布号WO2010/008054)

SeV18+SOX2/TSΔF载体(国际公布号WO2010/008054)

SeV18+KLF4/TSΔF载体(国际公布号WO2010/008054)

SeV(HNL)c-MYC/TS15ΔF载体

条件12

无载体

在施用了上述载体后，每天用10％FBS/PS/DMEM更换培养基，并将细胞在5％CO₂培养箱中37℃培养。然后，用0.25％胰蛋白酶解离1.0x10⁵个上述经转染的细胞，然后在明胶包被的六孔板中制备的1.25x10⁵个用丝裂霉素处理的滋养细胞(例如MEF)上培养。次日，将10％FBS/PS/DMEM更换为灵长类ES细胞培养基(ReproCell；RCHEMD001)(补充有4ng/ml bFGF)，并将细胞在5％CO₂培养箱中培养。培养基每天或每两天更换。培养基可以是滋养细胞条件化过的培养基。

感染14天后，即细胞在MEF上传代7天后，相比于常规方法(条件11)，在搭载有3种基因的条件下(条件2、3和4)人ES样细胞集落的出现效率明显更高。图1显示了常规型和条件2的细胞状态。从图1所示的照片可见，能观察到与诱导前的成纤维细胞(BJ)明显不同的、而与人ES细胞所见类似的扁平的集落(Jikken Igaku(Experimental Medicine)Vol.26,No.5(suppl.)pp.35-40,2008)。

在感染第21天，通过用NBCT/BCIP(PIERCE；NBT/BCIP,1-步,#34042)染色来显现ES细胞未分化标志物碱性磷酸酶的活性。与常规条件(上述的条件11)和OSK基因排列(OCT-SOX-KLF)相比，在使用KOS基因排列的载体(KLF-OCT-SOX)的条件2、3和4中观察到大量的碱性磷酸酶阳性蓝色染色集落(图2和图3)。这样，发现在具有KOS基因排列(KLF-OCT-SOX)的载体中碱性磷酸酶阳性iPS样细胞的诱导效率特别高(图4)。

实施例7

将1.5x10⁵个人胚胎来源的成纤维细胞(MRC-5)(ATCC(www.atcc.org),CCL-171)在含有10％FBS(Cell Culture Bioscience目录号171012)和青霉素(100u/mL)–链霉素(100μg/mL)(Nacalai Tesque,编码号26253-84)的DMEM(GIBCO-BRL,11995)(下称10％FBS/PS/DMEM)中在5％CO₂培养箱中37℃培养过夜。

培养后，将载体在下示的条件下施用于上述的经培养的细胞。

条件1

SeV(PM)KOS/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝3

条件2

SeV(PM)KOS/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝9

条件3

SeV(PM)KOS/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝30

条件4

SeV(PM)KOS/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝90

条件5

SeV(PM)OSK/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝3

条件6

SeV(PM)OSK/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝9

条件7

SeV(PM)OSK/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝30

条件8

SeV(PM)OSK/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝90

条件9

SeV18+OCT3/4/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+SOX2/TS15ΔF载体Moi＝3

SeV18+KLF4/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝3

条件10

SeV18+OCT3/4/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+SOX2/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+KLF4/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝9

条件11

SeV18+OCT3/4/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+SOX2/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+KLF4/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝30

条件12

SeV18+OCT3/4/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+SOX2/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+KLF4/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝90

条件13

无载体

感染27天后，即细胞在MEF上传代21天后，相比于常规方法(条件9-12)，在搭载有3种基因的条件下(条件1-8)人ES样可见集落的比率明显增加，尤其是在不到MIO90的条件下(条件1-3及5-7)，人ES细胞样集落出现的效率高。当用NBCT/BCIP(PIERCE；NBT/BCIP,1-步,#34042)染色来显现ES细胞未分化标志物碱性磷酸酶的活性时，与常规条件(上述条件9-12)相比，使用具有KOS((KLF-OCT-SOX)或OSK(OCT-SOX-KLF)顺序的基因排列的载体的条件1-8，尤其是条件1-3和5-7中，高效地观察到对碱性磷酸酶而言为阳性的蓝色染色集落(图5)。碱性磷酸酶阳性的iPS样细胞的诱导效率比常规条件更高(图6)。与基因按OSK(OCT-SOX-KLF)顺序排列的情形相比，载体中基因按KOS(KLF-OCT-SOX)的顺序排列时的诱导效率显著高。

实施例8pSeV(PM)/TS7ΔF的构建

用PmlI和XhoI消化pSeV(PM)/TSΔF，切出大约12.7kbp的条带，使用QIAquick凝胶提取试剂盒将其纯化。用NotI消化pSeV18+Oct3/4/TS7ΔF(国际公布号WO2010/008054)，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后，切出大约16.4Kbp的条带，使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。然后进行自连接，并选择出含有OCT3/4基因但不含有NotI片段的克隆而得到pSeV18+/TS7ΔF。用PmlI和XhoI消化pSeV18+/TS7ΔF，切出大约3.6kbp的条带，并用QIAquick凝胶提取试剂盒加以纯化。使用这两个纯化产物进行连接，通过测序选出具有正确序列的克隆以得到SeV(PM)/TS7ΔF。该载体在P基因和M基因之间具有用于进行基因导入的插入位点(NotI位点)。

实施例9用于生成携带KLF4-OCT3/4-SOX2基因的SeV/TS7ΔF载体的质粒的制作

用NotI消化pSeV(PM)/TS7ΔF，然后用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化，再进行BAP处理。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒将其纯化。用NotI消化pSeV(PM)KOS/TSΔF，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切出大约3.6kbp的条带，并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,目录号28706)进行纯化。使用100uL试剂盒附带的洗脱液进行洗脱。将含有KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因的NotI片段克隆到pSeV(PM)/TS7ΔF载体的NotI位点中。然后，通过测序选择具有正确序列的克隆。如此，得到了pSeV(PM)KOS/TS7ΔF。

实施例10携带人KLF4-OCT3/4-SOX2基因的SeV/TS7ΔF载体的制作

使用15uL TransIT-LT1(Mirus)，将293T/17细胞(人胚胎肾亚克隆17,ATCC CRL-11286,Pear,W.S.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8392-8396)用下述混合物转染：

0.5μg pCAGGS-NP,0.5μg pCAGGS-P4C(-),2μg pCAGGS-L(TDK),0.5μg pCAGGS-T7,0.5μg pCAGGS-F5R(WO2005/071085),和5.0μg上述的仙台病毒载体质粒pSeV(PM)KOS/TS7ΔF。将细胞在CO₂培养箱中37℃培养三天。然后，将10⁶个表达仙台病毒的融合蛋白(F蛋白)的LLC-MK2/F/A细胞覆盖到每个孔中经转染的293T/17细胞上。然后将细胞在CO₂培养箱中37℃培养一天。次日，移除细胞培养基，并用1ml加有青霉素-链霉素的MEM(下面简称PS/MEM)洗涤细胞1次。向每个孔中加入1ml含2.5μg/ml胰蛋白酶的PS/MEM(下面简称为Try/PS/MEM)。将细胞在CO₂培养箱中32℃培养2天。之后，将细胞连续培养，每3-4天更换培养基，并在某些情况下用LLC-MK2/F/A细胞传代。对培养上清液的一份通过血细胞凝集测定来评估载体收集。当观察到充分的血细胞凝集后回收培养上清液。使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(QIAGEN,目录号52906)从收集到的培养上清液提取RNA，然后对其进行以插入的KLF4-OCT3/4-SOX2基因的区域为目标的RT-PCR。通过测序确认获得的RT-PCR产物是否具有正确的核苷酸序列。如此，获得了SeV(PM)KOS/TS7ΔF载体。

实施例11pSeV(PM)/TS12ΔF的构建

使用PrimeSter实施PCR(94℃3分钟，以及30个[98℃10秒,55℃15秒,及72℃15分钟]循环,然后是72℃5分钟，且于4℃∞)，以pSeV(PM)/TSΔF为模板，以及引物F3208(5’-AGAGAACAAGACTAAGGCTACC-3’(SEQ ID NO:27))和R3787(5’-ACCTTGACAATCCTGATGTGG-3’(SEQ ID NO:28))。使用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化大约600bp的扩增条带。使用PrimeSter实施PCR(94℃3分钟，以及30个[98℃10秒,55℃15秒,及72℃1.5分钟]循环,然后是72℃5分钟,且于4℃∞)，以pSeV18+Oct3/4/TS12ΔF(WO2010/008054)作为模板,以及引物F2001(5’-CCATCAACACTCCCCAAGGACC-3’(SEQ IDNO:29))和R3390(5’-AGACGTGATGCGTTTGAGGCCC-3’(SEQ ID NO:30))。将大约1.4kbp的扩增条带用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。将这些PCR产物混合，使用PrimeSter和F2001及R3787引物实施PCR(94℃3分钟，以及30个循环[98℃10秒,55℃15秒,及72℃2分钟],然后是72℃5分钟,且于4℃∞)。PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化，用SalI和NotI消化，然后用琼脂糖凝胶电泳分离。然后切出大约1.6kbp的条带，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。用SalI和NotI消化pSeV(PM)/TSΔF，然后用琼脂糖凝胶电泳分离。然后切出大约14.8kbp的条带，并用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。使用这两个经SalI和NotI消化并纯化的产物进行连接，通过测序选出一个具有正确序列的克隆以得到pseV(PM)/TS12ΔF。该载体在P基因和M基因之间具有一个用于基因导入的插入位点(NotI位点)。

实施例12用于制作携带KLF4-OCT3/4-SOX2基因的SeV/TS12ΔF载体的质粒的制作

pSeV(PM)/TSΔF用NotI消化，然后用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAGEN目录号28106)纯化，再进行BAP处理。然后，将其用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。用NotI消化pSeV(PM)KOS/TSΔF，用1％琼脂糖凝胶电泳分离,切出大约3.6kbp的条带,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,目录号28706)进行纯化。使用100μL试剂盒附带的洗脱液进行洗脱。将含有KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因的NotI片段克隆到载体pSeV(PM)/TS12ΔF的NotI位点中，通过测序选择了一个具有正确序列的克隆。如此，得到了pSeV(PM)KOS/TS12ΔF。

实施例13携带人KLF4-OCT3/4-SOX2基因的SeV/TS12ΔF载体的制作

使用15uL TransIT-LT1(Mirus)，将293T/17细胞(人胚胎肾亚克隆17,ATCC CRL-11286,Pear,W.S.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8392-8396)用下列混合物转染：

0.5μg pCAGGS-NP,0.5μg pCAGGS-P4C(-),2μg pCAGGS-L(TDK),0.5μg pCAGGS-T7,0.5μg pCAGGS-F5R(WO2005/071085),和5.0μg上述的仙台病毒载体质粒pSeV(PM)KOS/TS12ΔF。将细胞在CO₂培养箱中37℃培养三天。然后，将10⁶个细胞的表达仙台病毒的融合蛋白(F蛋白)的LLC-MK2/F/A覆盖到每个孔中经转染的293T/17细胞上。然后将细胞在CO₂培养箱中37℃培养一天。次日，移除细胞培养基，并用1ml加有青霉素-链霉素的MEM(下面简称PS/MEM)洗涤细胞1次。向每个孔中加入1ml含2.5μg/ml胰蛋白酶的PS/MEM(下面简称为Try/PS/MEM)。将细胞在CO₂培养箱中32℃培养2天。之后，将细胞连续培养，每3-4天更换培养基，并在某些情况下用LLC-MK2/F/A细胞传代。取一份培养上清液通过血细胞凝集测定来评估载体收集。当观察到充分的血细胞凝集后回收培养上清液。使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(QIAGEN,目录号52906)从收集到的培养上清液提取RNA，然后对其进行以插入的KLF4-OCT3/4-SOX2基因的区域为目标的RT-PCR。通过测序确认获得的RT-PCR产物是否具有正确的核苷酸序列。如此，获得了SeV(PM)KOS/TS12ΔF载体。

实施例14利用携带外源基因的温度敏感性仙台病毒载体从人新生儿包皮来源的成纤维细胞(BJ)诱导iPS细胞

将2.0x10⁵个人新生儿包皮来源的成纤维细胞(BJ)(ATCC(www.atcc.org),CRL-2522)用补充有10％FBS(Cell Culture Bioscience目录号171012)和青霉素(100u/mL)–链霉素(100μg/mL)(Nacalai Tesque,编码号26253-84)的DMEM(GIBCO-BRL,11995)(下称10％FBS/PS/DMEM)铺板到12孔板上，然后在5％CO₂培养箱中将细胞37℃培养过夜。

条件1:常规型

SeV18+OCT3/4/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+SOX2/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+KLF4/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝3

条件2

SeV(PM)OSK/TSΔF载体Moi＝3

SeV18+KLF4/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝3

条件3

SeV(PM)KOS/TSΔF载体Moi＝3

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝3

条件4

SeV(PM)KOS/TS7ΔF载体Moi＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝30

条件5

SeV(PM)KOS/TS12ΔF载体Moi＝30

SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF载体Moi＝30

条件6

无载体

在施用了上述载体后，每天用10％FBS/PS/DMEM更换培养基，并将细胞在5％CO₂培养箱中36℃或37℃培养。然后，用0.25％胰蛋白酶解离1.0x10⁵个上述经转染的细胞，并在明胶包被的六孔板中制备的1.25x10⁵个用丝裂霉素处理的滋养细胞(例如MEF)上培养。次日，将10％FBS/PS/DMEM培养基更换为灵长类ES细胞培养基(ReproCell；RCHEMD001)(补充有4ng/mlbFGF)，并将细胞在5％CO₂培养箱中36℃或37℃培养。培养基每天或每两天更换。培养基可以是滋养细胞条件化过的培养基。

在感染第28天，通过用NBCT/BCIP(PIERCE；NBT/BCIP,1-步,#34042)染色来显现ES细胞未分化标志物碱性磷酸酶的活性。与常规条件(上述的条件1)相比，在使用携带KOS(KLF-OCT-SOX)的载体的条件中观察到碱性磷酸酶阳性蓝色染色集落(图7)。当使用温度敏感型载体时，在36℃诱导碱性磷酸酶阳性iPS样细胞的效率更高。碱性磷酸酶阳性iPS样细胞在各个条件下的诱导效率如图8所示。即使当使用同时搭载了3种重编程因子的温度敏感型仙台病毒载体时，也显示碱性磷酸酶阳性iPS样细胞的诱导效率高于常规条件下的那些。除了此处显示的条件之外，使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF载体和SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF载体(用WO2010/008054中记载的pSeV18+c-rMyc/TS12ΔF制作的、在HN和L之间搭载有c-rMYC且携带TS12突变的载体)，以及使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF载体和SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF载体(用WO2010/008054中记载pSeV18+c-rMyc/TS13ΔF制作的、在HN和L之间搭载有c-rMYC且携带TS13突变的载体)也成功地高效诱导了碱性磷酸酶阳性iPS样细胞。此外，从BJ细胞之外的细胞，诸如人成体皮肤来源的成纤维细胞HDF(Applications,Inc.106-05A-1388；来源于36岁成人白人女性的脸颊)和人胚胎肺细胞来源的成纤维细胞(MRC5；ATCC CCL-171)也成功地诱导了iPS细胞。

实施例15RT-PCR测定的ES标志物在iPS细胞中的表达

为了确认通过同时携带三种重编程因子诱导的iPS细胞是否表达ES标志物基因，从下述株系提取总RNA：通过使用SeV(PM)KOS/TSΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF诱导建立的iPS克隆KOS-O1,KOS-O6,KOS-O7,和KOS-O10(来源于BJ细胞)，和通过使用SeV(PM)OSK/TSΔF,SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF,和SeV18+KLF4/TSΔF诱导建立的iPS克隆OSKK1,OSKK2,和OSKK4(来源于BJ细胞)。使用随机引物实施RT反应；并使用用于检测各基因的引物进行PCR。评估的ES细胞标志物为NANOG、TERT、SALL4、ZFP42、TDGF1、DNMT3B、LIN28、GABRA3、CYP26A1、FOXD3、和GDF3。作为内部对照，使用β-肌动蛋白。此外，实施了PCR来检测仙台病毒载体。如图9中所示，在用同时携带三种重编程因子的仙台病毒载体诱导的iPS细胞中确认了被评估的所有ES标志物基因的表达。同时，未检测到仙台病毒载体RNA。

类似地，在通过使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF在36℃诱导而建立的iPS克隆(来源于BJ细胞和HDF细胞的)中也确认了所有ES标志物基因的表达(图10)。

在通过使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF在37℃诱导，并在39℃培养7天而建立的iPS克隆(来源于BJ细胞和HDF细胞的)中也确认了所有ES标志物基因的表达(图11)。同时，未检测到仙台病毒载体RNA。

所使用的各引物显示如下。

NANOG

NANOG-F(CCACCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCC(SEQ ID NO:31))；和

NANOG-R(CTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTC(SEQ ID NO:32))

TERT

TERT F2847(TGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAG(SEQ ID NO:33))；和

TERT R3399(TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTG(SEQ ID NO:34))

Sall4

Sall4F(AAACCCCAGCACATCAACTC(SEQ ID NO:35))；和

Sall4R(GTCATTCCCTGGGTGGTTC(SEQ ID NO:36))

Zfp42

Zfp42-F1(ATGAGCCAGCAACTGAAGAAACGGGCAAAG(SEQ IDNO:37))；和

Zfp42-R933(CTACTTTCCCTCTTGTTCATTCTTGTTCG(SEQ ID NO:38))

TDGF1

TDGF1-F1(ATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGC(SEQ ID NO:39))；和

TDGF1-R567(TTAATAGTAGCTTTGTATAGAAAGGC(SEQ ID NO:40))

Dmmt3b

Dnmt3b F(GCAGCGACCAGTCCTCCGACT(SEQ ID NO:41))；和

Dnmt3b R(AACGTGGGGAAGGCCTGTGC(SEQ ID NO:42))

LIN28

LIN28-F(CCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC(SEQ ID NO:43))；和

LIN28-R(GTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGC(SEQ ID NO:44))

GABRB3

GABRB3F(CTTGACAATCGAGTGGCTGA(SEQ ID NO:45))；和

GABRB3R(TCATCCGTGGTGTAGCCATA(SEQ ID NO:46))

CYP26A1

CYP26A1F(AACCTGCACGACTCCTCGCACA(SEQ ID NO:47))；和

CYP26A1R(AGGATGCGCATGGCGATTCG(SEQ ID NO:48))

FOXD3

FoxD3-F418(GTGAAGCCGCCTTACTCGTAC(SEQ ID NO:49))；和

FoxD3-R770(CCGAAGCTCTGCATCATGAG(SEQ ID NO:50))

GDF3

GDF3F(GGCGTCCGCGGGAATGTACTTC(SEQ ID NO:51))；和

GDF3R(TGGCTTAGGGGTGGTCTGGCC(SEQ ID NO:52))

β-肌动蛋白

beta-肌动蛋白-F(CAACCGCGAGAAGATGAC(SEQ ID NO:53))；和

beta-肌动蛋白-R(AGGAAGGCTGGAAGAGTG(SEQ ID NO:54))

仙台病毒载体

F15204(GGATCACTAGGTGATATCGAGC(SEQ ID NO:55))；和

R15397e(ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC(SEQ ID NO:56))

实施例16通过免疫染色测定的iPS细胞中ES标志物的表达

对于通过同时携带三种重编程因子的仙台病毒载体诱导的BJ来源的iPS细胞克隆KOS-O1、KOS-O6、KOS-O7、和KOS-O10的培养细胞，使用Mildform10N(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,目录号133-10311)进行固定。使用抗Nanog抗体(ReproCELL,目录号RCAB0003P)、抗OCT3/4抗体(Santa Cruz,目录号sc-5279)、和抗SSEA4(Cell signaling,目录号4755S)抗体实施免疫染色。同时进行DAPI染色来对细胞核染色，并在荧光显微镜下进行观察。结果，对于评估的所有同时携带三种重编程因子的仙台病毒载体，在诱导出的BJ来源的iPS细胞克隆中均确认了ES标志物蛋白的表达(图12)。

使用不同抗体对下述iPS克隆进行了免疫染色：通过使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF在36℃诱导并建立的HDF细胞来源的iPS克隆(图13)，以及通过使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF在39℃诱导，然后在37℃培养7天而建立的HDF细胞来源的iPS克隆(图14)。同时进行了DAPI染色，并在荧光显微镜下进行观察。使用了下述抗体来免疫学地确认ES细胞标志物蛋白表达：抗Nanog抗体(CST,Inc.,目录号#4893S)；抗OCT3/4抗体(Santa Cruz,目录号sc-5279)；抗SSEA4(Cell signaling,目录号4755S)；抗Tra-1-60抗体(Stemgent,目录号09-0068)；和抗Tra-1-81抗体(Stemgent,目录号09-0069)。结果，对于评估的所有同时携带三种重编程因子的仙台病毒载体，在诱导出的成人(HDF)来源的iPS细胞克隆中均确认了ES标志物蛋白的表达。

实施例17核型分析

委托日本遗传子研究所(Nihon Gene Research Laboratories Inc.)进行了BJ细胞来源的iPS克隆KOS-O6和OSKK4的核型分析。结果显示它们都具有46条染色体，且核型正常(图19)。

实施例18iPS细胞的启动子分析

为了评估OCT3/4基因启动子(其在ES细胞中表达)在iPS细胞中是否活化，通过下述的亚硫酸氢盐测序法进行了甲基化分析。结果显示OCT3/4启动子在亲本BJ和HDF(对照)中高度甲基化，表明基因表达被阻遏。另一方面，通过同时携带三种重编程因子的仙台病毒载体诱导的iPS细胞的各克隆均发现被高度去甲基化，发现OCT3/4启动子在SeV-iPS细胞中与ES细胞类似地是活化的(图20)。

(亚硫酸氢盐测序法)

使用DNAzol试剂(Invitrogen,目录号10503027)或Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega目录号A1120)，根据试剂盒随附的操作规程从iPS细胞提取基因组DNA。然后，使用MethylEasy Xceed快速DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒(Takara,编号:GE004)依照随附的操作规程用亚硫酸氢盐修饰所提取的基因组DNA。使用该亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA作为模板，以及靶向OCT3/4基因的启动子区的特异性引物来实施PCR。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化PCR产物。使用pGEM-T简易载体系统I(Promega,目录号A1360)根据随附的操作规程将纯化的PCR产物TA克隆。然后，使用菌落PCR用引物进行菌落PCR。菌落PCR使用GoTaq绿色主预混物(GoTaq Green Master Mix)(Promega,目录号M7123)实施。对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并选择10个或更多给出正确大小的条带的克隆。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)纯化这些克隆的菌落PCR产物，并使用T7和SP6引物对它们测序。通过将序列与经亚硫酸氢盐修饰后的目标序列进行比较来评估启动子区的甲基化状态。

用于扩增OCT3/4基因启动子区和菌落PCR的引物(J.Biol.Chem.,2005,Vol.280,6257-6260)：

mOCT4-3F:5’-ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT-3’(SEQ ID NO:57)

mOCT4-3R:5’-CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC-3’(SEQ IDNO:58)

用于菌落PCR的引物：

PGEMT-F:5’-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3’(SEQ ID NO:59)

PGEMT-R:5’-CAGCTATGACCATGATTACGCC-3’(SEQ ID NO:60)

用于测序的引物：

T7:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO:61)

SP6:5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’(SEQ ID NO:62)

实施例19载体去除

为了评估从通过同时携带三种重编程基因的温度敏感型仙台病毒载体诱导的iPS细胞的载体去除，将通过使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF诱导的iPS细胞在39’C培养1,2,3,4,5,6,和7天后传代，再培养7天。将所得的iPS细胞使用抗仙台病毒抗体进行免疫学染色来评估载体是否已被去除。图21中展示的结果显示从39℃培养的第3天起，仙台病毒载体去除的百分比以依赖于培养时间的方式增加，且显示通过培养6-7天载体几乎可以完全去除。

实施例20载体的自然丢失

已经证明，用常规方法诱导的iPS细胞通过用一般方法传代和培养，仙台病毒载体会自然从该细胞去除(Fusaki N.et al.(2009)Proc Jpn Acad Ser BPhys Biol Sci85(8):348-362)。使用同时携带三种重编程因子的仙台病毒载体、以及同时携带三种重编程因子的温度敏感型仙台病毒载体诱导的iPS细胞也观察到了自然去除。尤其是，发现使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF于36℃诱导的iPS细胞与使用常规方法进行诱导时相比，载体的自然丢失的效率非常高。

从通过常规方法诱导的BJ-iPS细胞以及使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF于36℃诱导的BJ-iPS细胞各自选择3个克隆，并在37℃传代。在第三、第五和第七代，使用抗仙台病毒抗体对一部分细胞进行了免疫染色，并检查仙台病毒去除。结果，用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF于36℃诱导的BJ-iPS细胞的所有三个第三代的克隆对仙台病毒载体均为阴性。而对于常规型，三个克隆中的一个是载体阴性，但其余两个克隆即使在第7代也未成为完全的载体阴性(图22)。

此外，对于从BJ以外的细胞，例如成人皮肤来源的成纤维细胞(Applications,Inc.106-05A-1388；来源于36岁的成年白人女性的脸颊)，以及人胚胎肺细胞来源的成纤维细胞(MRC5；ATCC CCL-171)使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF在36℃诱导出的iPS细胞，也确认了在第3代至第5代去除了载体。

由此可见，使用SeV(PM)KOS/TS12ΔF和SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF在36℃诱导iPS细胞是一种载体去除效率非常优秀的iPS诱导方法。

工业实用性

依照本发明，通过将多个重编程因子搭载在1个载体中，使得减少必需的仙台病毒载体的数目，大大增加重编程效率称为可能。由于外源基因不整合到所产生的多能干细胞的基因组中，这些细胞对于测试和研究都是有利的。此外，也可以期待在疾病治疗中也可以回避免疫排斥问题和伦理方面的问题，还可回避基于遗传毒性的癌化的危险性。

Claims

1.一种供在用于多能干细胞诱导的基因投递中使用的组合物，其包含仙台病毒载体，所述载体中在仙台病毒P基因的紧邻后方依次插入了KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因。

2.一种仙台病毒载体，其中在仙台病毒P基因的紧邻后方依次插入了KLF4基因、OCT3/4基因和SOX2基因。

3.权利要求2的载体在制备用于基因投递以诱导多能干细胞的组合物中的用途，其中所述载体与插入有MYC基因的不同的仙台病毒载体组合使用。

4.权利要求3的用途，其中所述MYC基因插入在仙台病毒L基因的紧邻前方。

5.权利要求3或4的用途，其中所述载体还与插入有KLF4基因的不同的仙台病毒载体组合使用。

6.权利要求5的用途，其中所述KLF4基因插入在仙台病毒N基因的上游。

7.一种核酸，其编码权利要求2的仙台病毒载体的基因组或反基因组。

8.一种供在用于多能干细胞诱导的基因投递中使用的试剂盒，其包含权利要求2的仙台病毒载体以及插入有MYC基因的另外的仙台病毒载体。

9.权利要求8的试剂盒，其中所述MYC基因插入在仙台病毒L基因的紧邻前方。

10.权利要求8或9的试剂盒，其还包含插入有KLF4基因的不同的仙台病毒载体。

11.权利要求10的试剂盒，其中所述KLF4基因插入在仙台病毒N基因的上游。