WO2010008054A1 - 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)Oct3/4遺伝子を含むガンマレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター(以下、これらを合わせて「レトロウイルスベクター」と総称する)
(2)Klf4遺伝子を含むレトロウイルスベクター
(3)c-Myc遺伝子を含むレトロウイルスベクター
(4)Sox2遺伝子を含むレトロウイルスベクター
すなわち本発明は、染色体非組み込み型ベクターを用いた多能性幹細胞の製造方法、および本発明の方法により作製されたES様細胞等に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の2つまたはそれ以上の任意の組み合わせからなる発明も、本明細書において意図された発明である。すなわち本発明は、
〔1〕細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための方法であって、染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて細胞に該遺伝子を導入することを特徴とする方法、
〔2〕リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、〔1〕に記載の方法、
〔3〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔4〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔3〕に記載の方法、
〔5〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔4〕に記載の方法、
〔6〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔5〕に記載の方法、
〔7〕該遺伝子が下記(1)~(8)からなる群より選択される、〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の方法、
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子
〔8〕染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための組成物、
〔9〕リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、〔8〕に記載の組成物、
〔10〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔8〕または〔9〕に記載の組成物、
〔11〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔10〕に記載の組成物、
〔12〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔11〕に記載の組成物、
〔13〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔12〕に記載の組成物、
〔14〕該遺伝子が下記(1)~(8)からなる群より選択される、〔8〕から〔13〕のいずれかに記載の組成物、
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子
に関する。また本発明は、
〔1〕リプログラムされた細胞の製造方法であって、分化した細胞に少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターを接触させる工程を含むことを特徴とする方法、
〔2〕リプログラムされた細胞が人工多能性幹細胞である、〔1〕に記載の方法、
〔3〕該ベクターが、核初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも一つ搭載する、少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターである、〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔4〕該遺伝子が、下記(1)~(8)からなる群より選択される、〔3〕に記載の方法、
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子
〔5〕細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の3種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の4種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の方法、
〔6〕細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子およびMyc遺伝子の4種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、〔5〕に記載の方法、
〔7〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の方法、
〔8〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔7〕に記載の方法、
〔9〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔8〕に記載の方法、
〔10〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔9〕に記載の方法、
〔11〕〔1〕から〔10〕のいずれかに記載の方法により製造された細胞を分化させる工程をさらに含む、分化した細胞の製造方法、
〔12〕〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の方法により製造された細胞、
〔13〕リプログラミングの工程によりベクターが染色体に組み込まれていない、〔12〕に記載の細胞、
〔14〕染色体非組み込み型ウイルスベクターを発現ベクターとして含む、細胞のリプログラミングに用いるための組成物、
〔15〕リプログラミングが、分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導である、〔14〕に記載の組成物、
〔16〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔14〕または〔15〕に記載の組成物、
〔17〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔16〕に記載の組成物、
〔18〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔17〕に記載の組成物、
〔19〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔18〕に記載の組成物、
〔20〕ベクターが、下記(1)~(8)からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、〔14〕から〔19〕のいずれかに記載の組成物、
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子
〔21〕染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための薬剤の製造における使用、
〔22〕リプログラミングが、分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導である、〔21〕に記載の使用、
〔23〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔21〕または〔22〕に記載の使用、
〔24〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔23〕に記載の使用、
〔25〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔24〕に記載の使用、
〔26〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔25〕に記載の使用、
〔27〕ベクターが、下記(1)~(8)からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、〔21〕から〔26〕のいずれかに記載の使用、
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子、
に関する。また本発明は、
〔1〕下記(1)~(8)からなる群より選択される遺伝子を搭載する、染色体非組み込み型ウイルスベクター、
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子
〔2〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔1〕に記載のベクター、
〔3〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔2〕に記載のベクター、
〔4〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔3〕に記載のベクター、
〔5〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔4〕に記載のベクター、に関する。
ラッサウィルスなどのアレナウイルス科(Arenaviridae)
インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)
SARSウイルスなどのコロナウイルス科(Coronaviridae)
風疹ウイルスなどのトガウイルス科(Togaviridae)
ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、RSウイルスなどのパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)
ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなどのピコルナウイルス科(Picornaviridae)
マールブルグウイルス、エボラウイルスなどのフィロウイルス科(Filoviridae)
黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルスなどのフラビウイルス科(Flaviviridae)
ブンヤウイルス科(Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovirus属等を含む)
狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科(Rhabdoviridae)
レオウイルス科(Reoviridae)
またP蛋白質の変異としては、SeV P蛋白質の433位(D433)、434位(R434)、および437位(K437)から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAla (A) への置換、434番目のアミノ酸のAla (A) への置換、437番目のアミノ酸のAla (A) への置換などが例示できる。特にこれら3つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
1)コロナウイルス
Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.
Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression.
Curr Top Microbiol Immunol. 2005;287:161-97. Review.
2)トガウイルス
Yamanaka R, Zullo SA, Ramsey J, Onodera M, Tanaka R, Blaese M, Xanthopoulos KG.
Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.
Cancer Gene Ther. 2001 Oct;8(10):796-802.
Datwyler DA, Eppenberger HM, Koller D, Bailey JE, Magyar JP.
Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.
J Mol Med. 1999 Dec;77(12):859-64.
3)ピコルナウイルス
Lee SG, Kim DY, Hyun BH, Bae YS.
Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus: the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.
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Mueller S, Wimmer E.
Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion: analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.
J Virol. 1998 Jan;72(1):20-31.
4)フラビウイルス
Yun SI, Kim SY, Rice CM, Lee YM.
Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.
J Virol. 2003 Jun;77(11):6450-65.
Arroyo J, Guirakhoo F, Fenner S, Zhang ZX, Monath TP, Chambers TJ.
Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).
J Virol. 2001 Jan;75(2):934-42.
5)レオウイルス
Roner MR, Joklik WK.
Reovirus reverse genetics: Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 3;98(14):8036-41. Epub 2001 Jun 26.
その他のRNAウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版(国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982)を参照のこと。
本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製方法を以下に示す。特に断らない限り、外来遺伝子の導入にはこのベクターを用いた。尚、下記SeV18+/TSΔFとは、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである(WO2003/025570)。このベクターは、NP遺伝子の上流(ゲノムの3'側;「18+位」とも言う)に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。
c-Myc遺伝子、Sox2遺伝子、KLF4遺伝子、及びOct3/4遺伝子を単離するために、Jurkat細胞からトータルRNAを抽出した。1.0×106(個)細胞のJurkat細胞(Schneider U et al (1977) Int J Cancer 19 (5): 621-6)を8000rpm室温で1分間遠心して集めた。細胞溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH7.5), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.65 % NP-40)を200μl 添加し、ピペッティング後、ボルテクスにより懸濁した。6000rpm、で3分間遠心分離し、上清を別の1.5mlエッペンドルフチューブに移し、200μlの抽出緩衝液を添加した。ボルテクスで十分に懸濁した後、400μlのフェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール(25:24:1)を添加し、さらにボルテクスにより十分懸濁した。15000rpm、4℃、5分間遠心分離を行い、上清を別の1.5mlエッペンドルフチューブに移し、400μlのイソプロパノールを添加し、ボルテクスにより十分に懸濁後、-20℃にて30分間冷やした。15000rpm、4℃、15分間遠心分離を行い、上清を除き、沈殿物に70%エタノールを1ml添加し、ボルテクスにより懸濁後、15000rpm、4℃、5分間遠心分離を行った。上清を除き室温で乾燥後、100μlのヌクレアーゼフリー水に溶解し、Jurkat細胞のトータルRNA溶液を得た。
KLF4遺伝子を単離するために、ヒト胎児腎細胞由来の293T/17細胞(Human embryonic kidney subclone 17, ATCC CRL-11286, Pear, W. S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396)より上記と同じ方法でトータルRNAを回収した。
Oct3/4遺伝子を単離するために、ヒト胚性癌細胞のNCCIT細胞(ATCC number CRL-2073; Damjanov I, et al., Lab. Invest. 1993, 68(2):220-32)より上記と同じ方法でトータルRNAを回収した。
JurkatのcDNAライブラリーからPrimeStar(商標) HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてc-Myc -21F(5’-AACCAGCAGCCTCCCGCGACG-3’(配列番号:1))およびc-Myc 1930R(5’-AGGACATTTCTGTTAGAAGGAATCG-3’(配列番号:2))のプライマーによりPCR(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を40サイクル→72℃-7分)を行った。このPCR産物をTEを用いて100倍希釈後、1μlをc-Myc-F(5’-GATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACC-3’(配列番号:3))およびc-Myc-R(5’-GTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTG-3’(配列番号:4))のプライマーを使用して、PCRを行った。PCR産物を1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.3 kbpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat. No. 28706) で精製した。pCAGGS-BSX (WO2005/071092) のSwaIサイトにクローニングし、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択し、pCAGGS-BSX-c-Mycを得た。次に、pCAGGS-BSX-c-Mycを鋳型にして、NotI-c-Myc F(5’-ATTGCGGCCGCATGCCCCTCAACGTTAGCTTCAC-3’(配列番号:5))およびNotI-c-Myc R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTCAAGTTTGTGTTTC-3’(配列番号:6))のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化(37℃で3時間)を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-c-Mycを得た。pBS-KS-c-MycをNot Iで消化(37℃で3時間)し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.5k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、 カタログ番号28706) で精製した。このc-Myc遺伝子を含むNot I断片を、センダイウイルスベクター(SeV18+/TSΔF)のアンチゲノムをコードするpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+c-Myc/TSΔFを得た。
JurkatのcDNAライブラリーからPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてSOX2-64F(5’- CAAAGTCCCGGCCGGGCCGAGGGTCGG-3’(配列番号:7))およびSOX2-1404R(5’- CCCTCCAGTTCGCTGTCCGGCCC-3’(配列番号:8))のプライマーによりPCR(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を40サイクル→72℃-7分)を行った。このPCR産物をTEを用いて100倍希釈後、1μlをSox2-F(5’-GATGTACAACATGATGGAGACGGAGC-3’(配列番号:9))および、Sox2-R(5’-GTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTG-3’(配列番号:10))のプライマーを使用して、PCRを行った。PCR産物を1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約0.95 k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat. No. 28706) で精製した。pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングし、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択し、pCAGGS-BSX-SOX2を得た。次に、pCAGGS-BSX-SOX2を鋳型にして、Not I Sox-2F(5’-ATTGCGGCCGCATGTACAACATGATGGAGACG-3’(配列番号:11))およびNot I Sox-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’(配列番号:12))のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化(37℃で3時間)を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-Sox2を得た。pBS-KS-Sox2をNot Iで消化(37℃で3時間)し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約1k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。このSox2遺伝子を含むNot I断片をpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+Sox2/TSΔFを得た。
JurkatのcDNAライブラリーからPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてKIF-4 -35F(5’-CCACATTAATGAGGCAGCCACCTGGC-3’(配列番号:13))およびKIF-4 1772R(5’-GCAGTGTGGGTCATATCCACTGTCTG-3’(配列番号:14))のプライマーによりPCR(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を40サイクル→72℃-7分)を行った。このPCR産物をTEを用いて100倍希釈後、1μlをKIF4-F(5’-GATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCC-3’(配列番号:15))およびKIF4-R(5’-GTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAG-3’(配列番号:16))のプライマーを使用して、PCRを行った。PCR産物を1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.4 k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat. No. 28706) で精製した。pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングし、pCAGGS-BSX-KLF4#19を得た。シークエンスの結果、pCAGGS-BSX-KLF4#19は1箇所にサイレント変異(c19t)が認められた。そこで、pCAGGS-BSX-KLF4#19を鋳型にして、NotI-KIF4-F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’(配列番号:17))およびNotI-KIF4-R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAGGTGGTC-3’(配列番号:18))のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングした。シークエンスの確認を行い配列の正しいクローンを選択し、pCAGGS-BSX-KLF4を得た。次に、pCAGGS-BSX-KLF4を鋳型にして、NotI-KIF4-F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’(配列番号:17))およびNotI-KIF4-R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAGGTGGTC-3’(配列番号:18))のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化(37℃で3時間)を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-KLF4を得た。pBS-KS-KLF4をNot Iで消化(37℃で3時間)し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.5k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。このKLF4遺伝子を含むNot I断片をpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+KLF4/TSΔFを得た。
NCCITのcDNAライブラリーからPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてOct-3 -28F(5’-CACCATGCTTGGGGCGCCTTCCTTCC-3’(配列番号:19))およびOCT3/4 R301(5’-CATCGGAGTTGCTCTCCACCCCGAC-3’(配列番号:20))のプライマー、OCT3/4 F192(5’-CCCGCCGTATGAGTTCTGTGG-3’(配列番号:21))およびNotI-Oct-3/4R-DPN(5’-GCCGCGGCCGCGTTATCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3’(配列番号:22))のプライマーによりPCR(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1分を35サイクル→72℃-7分)を行いOct3/4を2つの領域に分けて増幅した。これら2つのPCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。溶出液をTEを用いて50倍に希釈した。これらのPCR産物1μlを混合し、 Not I-Oct-3/4F(5’-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’(配列番号:23))およびNot I-Oct-3/4R-DPN(5’-GCCGCGGCCGCGTTATCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3’(配列番号:22))のプライマーを使用して、PCRを行った(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1.5分を35サイクル→72℃-7分)。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングし、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択しpCAGGS-BSX-Oct3/4を得た。次に、pCAGGS-BSX-Oct3/4を鋳型にして、Not I-Oct-3/4F(5’-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’(配列番号:23))およびNot I-Oct-3/4R(5’- GCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAGAGTGGTGAC-3’(配列番号:24))のプライマーでPCR (94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を25サイクル→72℃-7分)を行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化(37℃で2時間)を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、Oct3/4遺伝子を含むNot I断片をpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+Oct3/4/TSΔFを得た。
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター(5%CO2条件下)で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085) および上記で示したヒト転写因子を搭載したセンダイウイルスベクタープラスミド(pSeV18+c-Myc/TSΔFまたはpSeV18+Sox2/TSΔFまたはpSeV18+KLF4/TSΔFまたはpSeV18+Oct3/4/TSΔF)をそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μg および5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus)を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質(Fタンパク質)を発現する細胞LLC-MK2/F/A (Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070) を1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地(以下PS/MEM)1mlで細胞を1度洗浄し、2.5 μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地(以下Try/PS/MEMとする)を1ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。3~4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit (キアゲン カタログ番号52906)を用いてRNAを回収し、搭載した転写因子の領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、下記(a)から(d)のベクターを作製できた。
(a)Oct3/4遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター(以下「SeV18+Oct3/4/TSΔFベクター」という。)
(b)Sox2遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター(以下「SeV18+ Sox2/TSΔFベクター」という。)
(c)Klf4遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター(以下「SeV18+ Klf4/TSΔFベクター」という。)
(d)c-Myc遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター(以下「SeV18+ c-Myc/TSΔFベクター」という。)
先ず、ヒト新生児包皮由来線維芽細胞(BJ)( ATCC(http://www.atcc.org), CRL-2522) (ヒト成人皮膚由来線維芽細胞HDF(Applications, Inc. 106-05A-1388; 36歳成人白人女性頬由来), ヒト胎児肺細胞由来線維芽細胞(MRC5;ATCC, CCL-171)8.0x 105(個)を DMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (GIBCO-BRL) 中で一日37℃、0.5 % CO2インキュベータにて培養した (DMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (GIBCO-BRL))。
培養後、MOI=3の濃度の下記(a)~(d)のベクターを上記培養した細胞に投与した。
(a)SeV18+ Oct3/4/TSΔFベクター
(b)SeV18+ Sox2/TSΔFベクター
(c)SeV18+ Klf4/TSΔFベクター
(d)SeV18+ c-Myc/TSΔFベクター
上記ベクターを投与後、翌日に培地交換を行った(DMEM(GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (GIBCO-BRL))。
その後、7日~8日間、37℃、0.5 % CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート10cm培養皿に用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞(例えばMEF) 5.0×105(個)に対し、0.25 %トリプシンで剥がした上記導入細胞の5.0×104(個)から1.0×106(個)をその上で培養した。翌日、DMEM, 10 % FBSから霊長類ES用培地(ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した)に培地交換し、3 % CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
コロニーは数日後から現れ、ほぼ20日程度培養することで、ヒトES細胞様のコロニーが出現した(図1;BJ由来)。
図1の写真を見ると、誘導前の線維芽細胞(BJ)と明らかに異なる、ヒトES細胞に見られるのと同様の扁平なコロニーが見られた(実験医学 Vol.26, No.5 (増刊): pp. 35-40, 2008)。このコロニーは、ピックアップし、新しいフィーダー細胞上で培養し、ES細胞様剥離液で剥がし(トリプシン、コラゲナーゼ混合:ReproCell社、RCHETP002)継代し、増殖することが可能であった。
上記初期化実験により得られた細胞が、ES細胞の特徴である未分化マーカーを発現しているか否かを明らかにするために、更に下記実験を行った。
ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP(PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042)にて染色すると、アルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された(図2)。
上記実施例2で示したアルカリホスファターゼ陽性の複数のコロニー(ALP(+))をまとめてRNAを抽出した(図3(a)のALP(+))。ランダムプライマーにて逆転写反応を行い、それぞれのプライマーでPCRを行った(図3(a))。プライマー配列は、Oct3/4については Fw:5'-GATCCTCGGACCTGGCTAAGC-3'(配列番号:25)および Rv:5'-GCTCCAGCTTCTCCTTCTCCAGC-3'(配列番号:26)、Sox2については Fw:5'-AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC-3'(配列番号:27)および Rv:5'-ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG-3'(配列番号:28)、KLF4については Fw:5'-GCTGCACACGACTTCCCCCTG-3'(配列番号:29)および Rv:5'-GGGGATGGAAGCCGGGAGGAAGCGG-3'(配列番号:30)、c-mycについては Fw:5'-TCTCAACGACAGCAGCTCGC-3'(配列番号:31)および Rv:5'-CAGGAGCCTGCCTCTTTTCCACAGA-3'(配列番号:32)、Nanogについては Fw:5'-TACCTCAGCCTCCAGCAGAT-3'(配列番号:33)および Rv:5'-TGCGTCACACCATTGCTATT-3'(配列番号:34)、β-アクチンについては Fw:5'-CAACCGCGAGAAGATGAC-3'(配列番号:35)および Rv:5'-AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'(配列番号:36)を用いた。
また単一のES様細胞コロニーを単離し、上記と同様の方法によりRT-PCRを行った(図3(b)の4BJ-1iPS)。このとき、プライマー Fw: 5'-tgcccggacctccatcagagccag-3'(配列番号:37)および Rv: 5'-tcagtccaggatggtcttgaagtctg-3’(配列番号:38)を用いてhTERTの発現も検出した。
サイレント変異導入ヒト転写因子c-Myc(以下c-rMycとする)の作製
pBS-KS-c-Mycを鋳型にして、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A) を用いて変異導入用の6種類のプライマー(c-rMyc1-F(5'-CGGACGACGAGACCTTCATCAAGAACATCATCATCCAGGACTG-3' (配列番号:39))、c-rMyc1-R(5'-CAGTCCTGGATGATGATGTTCTTGATGAAGGTCTCGTCGTCCG-3' (配列番号:40))、c-rMyc2-F(5'-GAACGAGCTAAAACGGAGCTTCTTCGCCCTGCGTGACCAGATCC-3' (配列番号:41))、c-rMyc2-R(5'-GGATCTGGTCACGCAGGGCGAAGAAGCTCCGTTTTAGCTCGTTC-3' (配列番号:42))、c-rMyc3-F(5'-CCCAAGGTAGTTATCCTTAAGAAGGCCACAGCATACATCCTGTC-3' (配列番号:43))およびc-rMyc3-R(5'-GACAGGATGTATGCTGTGGCCTTCTTAAGGATAACTACCTTGGG-3' (配列番号:44)))を入れ、PCR(94℃-3分→98℃-30秒、55℃-30秒、72℃-6分を25サイクル→72℃-7分)を行った。PCR産物をDpn Iで37℃、2時間処理した。この反応液5μl大腸菌DH5α(ToYoBo Code No. DNA-903)を用いてトランスフォーメーションを行った。16個の大腸菌のコロニーをピックアップし、ミニプレップを行い、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pBS-KS-c-rMycを得た。pBS-KS-c-rMycをNot Iで消化(37℃で3時間)し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.5k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。このc-rMyc遺伝子を含むNot I断片をpSeV(HNL)/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TSΔFを得た。c-rMycの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号:45および46に示した。c-rMycは、a378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194gの変異を有する。
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター(5%CO2条件下)で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5Rおよび上記で示したヒト転写因子c-rMycを搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeV(HNL)-c-rMyc/TSΔFをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus) を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質(Fタンパク質)を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地(以下PS/MEM)1 mlで細胞を一度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地(以下Try/PS/MEMとする)を1ウェル当たり1 ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。3~4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit(キアゲン カタログ番号52906)を用いてRNAを回収し、搭載したc-rMycの領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeV(HNL)-c-rMyc/TSΔFベクターを得た。
初期化因子搭載センダイウイルスベクターによるiPS誘導効率を表に示した。フィーダー細胞に載せるセンダイウイルス感染細胞数に対し、ES様コロニーの出現数を示している。実験は、ベクターとして上記のc-rMyc搭載ベクターも用いた以外は実施例1と同様に行った。初期化因子Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycのうち、ベクターのHNL部位に搭載した改変型c-Myc (c-rMyc) を用いた場合に最大のコロニー出現数が得られた。これはレトロウイルスベクターを用いた誘導効率に比べ約10倍高い効率である。また、Myc無しの3因子でもセンダイウイルスベクターによるiPS誘導が可能であった。さらに、ヒト新生児包皮由来細胞(BJ)のみならず、ヒト成人皮膚由来細胞HDFからもセンダイウイルスベクターによりiPSの誘導がBJと類似の効率で可能であった。この結果は、本発明の方法が高効率でiPS細胞を誘導できる、従来に比較して簡易な方法であることを示している。
初期化因子搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞のESマーカーの発現を確認した。iPS細胞の誘導は、ベクターとして上記のc-rMyc搭載ベクターも用いた以外は実施例1と同様に行った。それぞれES細胞様コロニーをステムセルナイフ(日本医化器械)を用いて顕微鏡下で単離し、継代した。それぞれの株からRNAを抽出し、RT反応およびPCRを図3同様に行った。ES細胞マーカーであるOct3/4, NanogおよびTert, ほか8遺伝子: GDF3, TDGF1, Zfp42, Sal4F, Dmmt3b, CABRB3, CYP26A1, FoxD3(Adewumi, O. et al, Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816, 2007)の発現および初期化因子Sox2, Klf4, c-Mycの発現をRT-PCRで確認した。方法は実施例3の通りである。5つすべてのクローンに於いて、すべてのマーカーの発現が確認された(図4)。
なお使用した各プライマーは以下の通りである。TERTについてはTERT F2847(TGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAG (配列番号:37))およびTERT R3399(TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTG (配列番号:38))、GDF3についてはGDF3 F(GGCGTCCGCGGGAATGTACTTC (配列番号:51))およびGDF3 R(TGGCTTAGGGGTGGTCTGGCC (配列番号:52)、TDGF1についてはTDGF1-F1(ATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGC (配列番号:53))およびTDGF1-R567(TTAATAGTAGCTTTGTATAGAAAGGC (配列番号:54))、Zfp42についてはZfp42-F1(ATGAGCCAGCAACTGAAGAAACGGGCAAAG (配列番号:55))およびZfp42-R933(CTACTTTCCCTCTTGTTCATTCTTGTTCG (配列番号:56))、Sall4についてはSall4 F(AAACCCCAGCACATCAACTC (配列番号:57))およびSall4 R(GTCATTCCCTGGGTGGTTC (配列番号:58))、Dmmt3bについてはDnmt3b F(GCAGCGACCAGTCCTCCGACT (配列番号:59))およびDnmt3b R(AACGTGGGGAAGGCCTGTGC (配列番号:60))、GABRB3についてはGABRB3 F(CTTGACAATCGAGTGGCTGA (配列番号:61))およびGABRB3 R(TCATCCGTGGTGTAGCCATA (配列番号:62))、CYP26A1についてはCYP26A1 F(AACCTGCACGACTCCTCGCACA (配列番号:63))およびCYP26A1 R(AGGATGCGCATGGCGATTCG (配列番号:64))、FOXD3についてはFoxD3-F418(GTGAAGCCGCCTTACTCGTAC (配列番号:65))およびFoxD3-R770(CCGAAGCTCTGCATCATGAG (配列番号:66))、SeV-Oct3/4についてはF6(ACAAGAGAAAAAACATGTATGG (配列番号:67))およびOCT3/4 R259(GAGAGGTCTCCAAGCCGCCTTGG (配列番号:68))、SeV-Sox2についてはSox2-F294(AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC (配列番号:27))およびR150(AATGTATCGAAGGTGCTCAA (配列番号:69))、SeV-Klf4についてはF6(ACAAGAGAAAAAACATGTATGG (配列番号:67))およびKIF4-R405(CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC (配列番号:70))、SeV-c-MycについてはF6(ACAAGAGAAAAAACATGTATGG (配列番号:67))およびc-rMyc406(TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG (配列番号:71))、c-Myc/HNLについてはF8424(TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG (配列番号:72))およびc-rMyc406(TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG (配列番号:71))。
初期化因子搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の無限増殖能を確認するため、テロメラーゼ活性の測定を行った。iPS細胞の誘導は、ベクターとして上記のc-rMyc搭載ベクター(HNLと表記)も用いた以外は実施例1と同様に行った。テロメラーゼ活性の検出には、TRAPEZE(商標) Telomerase Detection Kit (CHEMICON Cat. No. S7700) を使用した。細胞を回収し、キットに付属の1X CAPS Lysis bufferを200μl添加し、ピペッティングにより懸濁した。氷上で30分間培養し、冷却微量遠心機にて4℃で12000rpm 20分間遠心を行った。上清160μlを別のエッペンドルフチューブに移し、この細胞溶解液のタンパク質濃度を測定した。アッセイを行う前に細胞溶解液の1μgタンパク質に相当する量をエッペンドルフチューブに採り、85℃で10分間熱処理を行った。熱処理を行ったサンプル、熱処理を行っていないサンプル1μgをTRAPアッセイに使用した。各アッセイ当たり、10X TRAP Reaction Buffer 5.0μL, 50X dNTP Mix 1.0μL, TS Primer 1.0μL, TRAP Primer Mix 1.0μL, H2O+細胞溶解液(1μgタンパク質)=40.6μL, Taq Polymerase 0.4μLの割合で反応液を調製し、PCR(30℃-30分、94℃-30秒、59℃-30秒、72℃-60秒を30サイクル)を行った。PCR反応液に6Xローディングダイを添加し、10%または12.5%のポリアクリルアミドゲルに20μLアプライし、電気泳動を行いエチジウムブロマイドにより染色を行った。
すべてのiPSクローンに於いてテロメラーゼ活性が認められ、対照である親株のBJ, HDFおよび熱処理後のiPS細胞では活性が認められなかった(図5)。
初期化因子搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の多分化能を確認するため、in vitroの胚様体形成実験を行った。iPS細胞の誘導は実施例1と同様に行った。3つのiPSクローン4BJ1, B1(BJ由来)、および7H5(HDF由来)コロニーをコラゲナーゼIV (Invitrogen, 17104-019)でシャーレから剥がし、細胞塊をMPCコートのウェル(Nunc, 145383)に移しRPMI1640, 10 % FBSにて数日間浮遊培養を行い、胚様体の形成を顕微鏡下で確認した。センダイウイルスベクター誘導iPSは分化能を持っており、いずれのiPSも胚様体を形成し、7日目ではさらに分化の進んだ、多数の嚢胞状の胚様体が認められた(図6)。
ES細胞で発現する遺伝子プロモーターOct3/4とNanogのiPS細胞における活性化状況について、以下のバイサルファイトシークエンス法によりメチル化解析を行った。その結果、対照の親株BJおよびHDFではOct3/4プロモーター (-2330~-2110領域) およびNanogプロモーター (-685~-120領域) のメチル化が多く認められたが、SeV-iPS細胞の各クローンに於いては、多くの脱メチル化が認められ、SeV-iPS細胞はES細胞同様にOct3/4とNanogプロモーターの活性化が起きている事が明らかになった (図9)。
iPS細胞よりQIAamp DNA Mini Kit (50)(キアゲン、カタログ番号:51304)を用いて、キットのプロトコールに従いゲノムDNAを抽出した。次に、抽出したゲノムDNA 1μgを基にしてBisulFast DNA Modification Kit for Methylated DNA Detection(東洋紡、カタログ番号:MDD-101)を用いて、キットのプロトコールに従いバイサルファイト修飾を行った。バイサルファイト修飾ゲノムDNAを鋳型としてOct3/4遺伝子、Nanog遺伝子のプロモーター領域を標的として特異的プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて分離し、目的バンドをQIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン、カタログ番号:28704)にて精製した。精製したPCR産物は、pGEM-T Easy Vector System I(プロメガ、カタログ番号:A1360)を用いて、キットのプロトコールに従い、TA-クローニングを行った。次に、Oct3/4遺伝子、Nanog遺伝子のプロモーター領域を標的とした特異的プライマーを用いてコロニーPCRを行った。アガロースゲル電気泳動を行いバンドサイズの正しいクローンを約10クローン選択した。そのクローンについて、ミニプレップによりプラスミドDNAを抽出し、T7プライマー、SP6プライマーを用いてシークエンスを行った。バイサルファイト修飾後の標的配列との比較を行いプロモーター領域のメチル化状態を評価した。
mOct4-5F: 5’-AATAGATTTTGAAGGGGAGTTTAGG-3’(配列番号:73)
mOct4-5R: 5’-TTCCTCCTTCCTCTAAAAAACTCA-3’(配列番号:74)
Nanog遺伝子プロモーター領域増幅用およびコロニーPCR用プライマー(Stem cell Research, Vol. 1, 105-115; Cell, 2007, Vol. 131, 861-72)
Nanog-z1-L: 5’-GGAATTTAAGGTGTATGTATTTTTTATTTT-3’(配列番号:75)
mehNANOG-F1-AS: 5’-AACCCACCCTTATAAATTCTCAATTA-3’(配列番号:76)
シークエンス用のプライマー
T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(配列番号:77)
SP6: 5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’(配列番号:78)
使用キット
バイサルファストディ-エヌエ-モディフィケーションキットフォーメチレイテットディーエヌエーディテクション
BisulFast DNA Modification Kit for Methylated DNA Detection
(東洋紡、カタログ番号:MDD-101)
センダイウイルスベクターにより誘導したiPS細胞(SeV-iPS細胞)の遺伝子発現プロファイルを親株BJ細胞、ヒトES細胞および、すでに樹立されたヒトiPS細胞 (GSM241846; Takahashi, K. et al., Cell, 131, 1-12, 2007) と比較した。SeV-iPSとBJ細胞のトータルRNAはRNeasy Mini Kit (Qiagen) を用いて抽出し、Agilent社Quick Amp Labeling Kitを用いてcDNAからCyanine色素標識cRNAを合成し、Agilent社Gene Expression Hybridization Kitを用いてWhole Human Genome Oligo Microarray (4 x 44K) 上で17時間ハイブリダイズし、洗浄後、Agilent Microarray Scanner でDNAマイクロアレイのイメージを読み取り、Feature Extraction Software (v.9.5.3.1) にて各スポットの蛍光シグナルを数値化し、解析を行った。チップの総probe数は重複を除き、41078 probeを解析対象として行った(バイオマトリックス研究所)。対照の遺伝子発現情報はGEO DetaSetsから取得しSeV-iPS細胞の遺伝子発現と比較した:ヒトES細胞hES-H9 (GSM194390; Teser P. J., et al, Nature 448, 196-199, 2007)、およびヒトiPS細胞はHDFより誘導されたhiPS (GSM241846; Takahashi, K. et al., Cell, 131, 1-12, 2007)。その結果、SeV-iPSとBJとはr=8732, ヒトES細胞とはr=0.9658、ヒトiPS細胞とはr=0.9580の相関があり、ES細胞に発現するNanog, Sox2, Oct3/4遺伝子はSeV-iPSに発現し、BJとは非相関していたが、SeV-iPSとそれぞれヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞とは相関線上にあり、完全に一致していた(図9)。
(ベクターの作製方法)
温度依存不活化変異導入センダイウイルスベクター作製用プラスミドの構築
Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP(WO2003/025570)を基にL Y942H-F(5’- CAAATGTTGGAGGATTCAACCACATGTCTACATCTAGATG-3’(配列番号:79))、L Y942H-R (5’- CATCTAGATGTAGACATGTGGTTGAATCCTCCAACATTTG-3’(配列番号:80))の組み合わせ、およびL Y942H-F、L Y942H-R、P2-F(5'- CATCACAGCTGCAGGTGGCGCGACTGACAAC -3' (配列番号:81))、P2-R(5’- GTTGTCAGTCGCGCCACCTGCAGCTGTGATG -3’ (配列番号:82))の組み合わせでPCR(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-11分を25サイクル→72℃-7分)を行った。PCR産物をDpn Iで37℃で1時間消化し、この反応液20μlを大腸菌DH5α(ToYoBo Code No. DNA-903)を用いてトランスフォーメーションを行った。出てきたコロニーを拾って、ミニプレップ後、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択し、それぞれLitmus38TSΔF-GFP-LY942HおよびLitmus38TSΔF-GFP-P2LY942Hを得た。
Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFPおよびpSeV/ΔSalINheIfrg LmutをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS12ΔFを得た。このpSeV(HNL)/TS12ΔFのNot IサイトにpBS-KS-c-rMycより NotI消化により、切り出し、精製したc-rMyc遺伝子を含むNot I断片を導入し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TS12ΔFを得た。
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター(5%CO2条件下)で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085) および上記で示したヒト転写因子を搭載した温度依存不活化変異導入F遺伝子欠失型センダイウイルスベクタープラスミドをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus) を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2から3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質(Fタンパク質)を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地(以下PS/MEM)1mlで細胞を1度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地(以下Try/PS/MEMとする)を1ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで培養した。3~4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit (キアゲン カタログ番号52906)を用いてRNAを回収し、搭載した遺伝子の領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、各種ヒト転写因子を搭載した温度依存不活化変異導入F遺伝子欠失型センダイウイルスベクターを得た。
SeV-iPS細胞からSeVベクターが自然除去するコロニーが得られた。また温度感受性ベクターを使ってiPSを37℃で誘導したのち39℃に温度シフトするとセンダイウイルス陰性クローンが得られた。さらに、SeVに感染する事で細胞表面に発現するHN抗原を指標にし、抗HN抗体でネガティブセレクションすることで、SeVネガティブなクローンが得られた。
SeV-iPS細胞を継代培養するとベクターが自然に除去された細胞が増えていった。SeV-iPS細胞コロニーからRNAを抽出し、RT-PCRを行い、SeV由来の外来遺伝子発現を確認すると、18+の位置(ゲノムの最も3'側であるNP遺伝子の3'側)にSeV-Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc (c-rMycおよびc-Myc) を挿入した場合(それぞれSeV18+Oct3/4/TSΔF、SeV18+Sox2/TSΔF、SeV18+Klf4/TSΔF、SeV18+c-Myc/TSΔF (またはSeV18+c-rMyc/TSΔF))、外来遺伝子は細胞分裂に伴い希釈され、これらのうち1種類もしくは2種類の発現に減っていくことが多く、野生型c-Mycは複製の劣位から一番最初に除去された。またHNLの位置にc-rMycを挿入した場合(HNL-c-rMyc/TSΔF)は、18+の位置に目的因子を挿入したベクターに対する複製優位性から、Myc遺伝子を搭載したベクターのみ残存することが多く、さらに導入された外来性初期化因子がすべて完全に除去されたクローンも得られた。RT-PCRのみならず、蛋白レベルでも完全に除去されていることが抗SeV-NP抗体によるウェスタンブロットで示された(図10)。RT-PCRのプライマーは実施例6に示した通りである。
SeVベクターは細胞分裂による希釈と継代により、自然に減少していくが、積極的にSeVベクターネガティブ細胞を集めることも可能である。SeVに感染する事で細胞表面に発現するHN抗原を指標にし、抗HN抗体によりSeVベクターの除去クローンが取得可能である。コラゲナーゼIVとトリプシン処理、懸濁操作により小さな細胞集団にした細胞に、抗HNモノクローナル抗体(IL4.1)を氷上で30分間反応させ、培地で洗浄後、2次抗体として例えばマグネットビーズに結合した抗マウスIgG1抗体(Anti-Mouse IgG1 Particles, BD)を同様に氷上で30分間反応させ、磁石 (IMagnet Cell Separation Magnet, BD) に非結合画分を集めた(ネガティブセレクション)。その結果、SeVベクターの発現が減弱した細胞集団が得られ、同操作を繰り返すことによりベクターネガティブなiPS細胞が得られた(図11)。またFACSにより抗HN抗体陰性集団を集める事も可能である。
TS 7:L (Y942H/L1361C/L1558I)
TS 13:P(D433A/R434A/K437A), L(L1558I)
TS 14:P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C)
TS 15:P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C/L1558I)
これらの変異をSeV18+/TSΔFベクターに導入した。これらのベクターは温度感受性であり、温度シフトにより複製が阻害される。すなわち、搭載された遺伝子は32℃で最も高く発現し、35~36℃でも発現し、37℃で発現がやや弱く、38.5℃もしくは39℃で発現しない。
これらのベクターに初期化因子を同様(以前の記述)に搭載し、37℃でiPSを誘導し、iPS細胞が作製された後に温度シフトを行い、容易にSeVの除去を行うことができた。
1で示した通り、SeV-18+Oct3/4, Klf4, Sox2とSeV-HNL-c-rMycの組合せでiPS誘導を行った場合、c-rMyc遺伝子がHNとLの間に挿入されているSeV-HNL-c-rMycが、18+の位置(NP遺伝子の上流)に挿入した他の因子をもつSeVベクターに対して複製に有利であり、かつc-Mycが細胞増殖に有利であるという性質から、SeVに搭載した4因子のうちSeV-HNL-c-rMycだけが最後に残存した。またSeV-HNL-c-rMycで誘導したSeV-iPS細胞は、増殖能が優れているためクローンとして樹立しやすく、かつ最後に残ったベクターは1つだけであり、それも自然除去されやすかった。従って、温度感受性株を使った温度シフトによる除去を行うためには、HNL-c-rMycだけを温度感受性にすればよく、実際、最後に残ったHNL-c-rMycベクターは、温度シフトによって除去することができた(図12、13)。
上記TS7、TS13もしくはTS15のHN-Lの間にc-rMyc遺伝子を挿入したベクター(TS7ΔF、TS13ΔF、TS15ΔF)と、18+の位置にOct3/4, Klf4, Sox2をそれぞれ挿入したTSベクターを用いて線維芽細胞(BJ細胞)よりiPS誘導を行うと、上述のSeV-HNL-Myc複製優位により、温度感受性のSeV-HNL-Mycだけが残る。また温度感受性株は37℃での発現が弱いために、SeV-HNL-Mycだけになった場合、速やかに残存する最後のベクターも除去される。
このようにしてiPS誘導を行うと、TS/18+ Oct3/4, Sox2, Klf4/TSΔFと、TS13ΔF/HNL-c-rMycの組合せの場合、4/6クローンが、またTS15ΔF/HNL-c-rMycの組合せの場合、3/6のクローンが、TS7ΔF/HNL-c-rMycの場合、2/12のクローンが、誘導後1ヶ月以内にSeVベクター陰性となった(図13)。得られたSeV陰性クローンはすべてヒトES細胞特異的マーカーを発現していた(図14)。
この方法により、容易に染色体を傷つけず、かつSeV陰性な、無傷のiPS細胞を得る事が出来た。
上記TS ΔFベクター以外にも、実施例12の5にてTS7ΔF、TS13ΔF、TS15ΔFに初期化因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を載せてiPS細胞の誘導が可能であったが、別のΔFベクターバックボーンL変異体Y1214F(WO2008/096811)を用いても、同様にiPS細胞を誘導できることを以下のように確認した。
(LmΔF/SeVの構築)
プラスミド構築
pSeV18+LacZ/ΔF-1214(WO2008/096811)をNotIで消化後、精製した。そして、ライゲーションを行いLacZ遺伝子の入っていないプラスミドを選択し、pSeV18+/ΔF-1214を得た(「Lm(Y1214F) ΔF/SeV」または単に「LmΔF/SeV」とも表記する)。次にpSeV18+/ΔF-1214をNotIで消化後精製し、前出の初期化4因子Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-rMycのNotI断片をそれぞれ搭載し、ウイルスベクター作成用のプラスミドpSeV18+Oct3/4/ΔF-1214、pSeV18+Sox2/ΔF-1214、pSeV18+KLF4/ΔF-1214、pSeV18+c-rMyc/ΔF-1214を構築した。
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター(5%CO2条件下)で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085)および上記で示したヒト転写因子を搭載したLmΔF/SeVセンダイウイルスベクタープラスミドをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus)を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2から3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質(Fタンパク質)を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地(以下PS/MEM)1 mlで細胞を1度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地(以下Try/PS/MEMとする)を1ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで培養した。3~4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit (キアゲン カタログ番号52906)を用いてRNAを回収し、搭載した遺伝子の領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、各種ヒト転写因子を搭載したLmΔF/SeVセンダイウイルスベクターを得た。
ヒト線維芽細胞BJに4因子搭載LmΔF/SeVを感染させ、TSΔF SeVベクターと同様にiPS誘導を行った結果、TSΔF/SeVを用いた場合と同様、iPS様コロニーが出現し、ESマーカーであるALPを発現していた(図15A)。このことは、ひとつのベクターに限らずセンダイウイルスベクターの他の骨格でもiPS誘導可能であることを示す。
センダイウイルスベクターによる初期化因子発現が高いため、従来のフィーダー細胞上で誘導する方法だけでなく、フィーダーフリーでも誘導可能である。初期化因子搭載SeVを感染後15日まではそのままプラスチックシャーレ上で誘導し、iPS様コロニーが出現した頃から培養液をDMEM/10 % FBSからES細胞用の培地に変更し、コロニーが十分な大きさになった後、collagenase IVでシャーレから剥離し、新しいフィーダー細胞上にまき直し、iPS細胞を樹立できた。
Yamanakaの4因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)(Takahashi, K. and Yamanaka S., Cell 126, 663-676, 2006)以外に、Thomsonの4因子(Oct3/4, Sox2, Lin28, Nanog)(Yu J et al., Science. 2007, 318(5858):1917-20)をTSΔF/SeVに搭載しても、ヒト線維芽細胞からiPS細胞誘導が可能であった(図15B)。以下に、NanogおよびLin28ベクターの構築例を示した。
NCCIT細胞のcDNAライブラリーからPrimeStar(商標) HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A) を用いてNANOF-F(5’-CCACCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCC-3’(配列番号:87))およびNANOF-R(5’-CTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTC-3’(配列番号:88))のプライマーによりPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106) を用いて精製した。ブルースクリプトプラスミドベクターのEco RVサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-Nanogを得た。
NCCIT細胞のcDNAライブラリーからPrimeStar(商標) HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてLIN28-F(5’-CCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC-3’(配列番号:91))およびLIN28-R(5’-GTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGC-3’(配列番号:92))のプライマーによりPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのEco RVサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-Lin28を得た。次に、pBS-KS-Lin 28を鋳型にして、NotI-Lin28-F(5’- GCGCGGCCGCACCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC-3’(配列番号:93))およびNotI-Lin28-R(5’- GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGCAGGGTAGGGCTGTG-3’(配列番号:94))のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、pSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+Lin 28/TSΔFを得た。このプラスミドを用いて前出の方法にてLin 28遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター(「SeV18+ Lin 28/TSΔFベクター」という。)
Claims (39)
- 細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための方法であって、染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて細胞に該遺伝子を導入することを特徴とする方法。
- リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、請求項1に記載の方法。
- 染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項1または2に記載の方法。
- RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項3に記載の方法。
- マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項4に記載の方法。
- パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項5に記載の方法。
- 該遺伝子が下記(1)~(8)からなる群より選択される、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子 - 染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための組成物。
- リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、請求項8に記載の組成物。
- 染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項8または9に記載の組成物。
- RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項10に記載の組成物。
- マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項11に記載の組成物。
- パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項12に記載の組成物。
- 該遺伝子が下記(1)~(8)からなる群より選択される、請求項8から13のいずれかに記載の組成物。
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子 - 染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための薬剤の製造における使用。
- リプログラミングが、分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導である、請求項15に記載の使用。
- 染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項15または16に記載の使用。
- RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項17に記載の使用。
- マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項18に記載の使用。
- パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項19に記載の使用。
- ベクターが、下記(1)~(8)からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、請求項15から20のいずれかに記載の使用。
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子 - 下記(1)~(8)からなる群より選択される遺伝子を搭載する、染色体非組み込み型ウイルスベクター。
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子 - 染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項22に記載のベクター。
- RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項23に記載のベクター。
- マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項24に記載のベクター。
- パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項25に記載のベクター。
- リプログラムされた細胞の製造方法であって、分化した細胞に少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターを接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
- リプログラムされた細胞が人工多能性幹細胞である、請求項27に記載の方法。
- 該ベクターが、核初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも一つ搭載する、少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターである、請求項27または28に記載の方法。
- 該遺伝子が、下記(1)~(8)からなる群より選択される、請求項29に記載の方法。
(1)Oct遺伝子
(2)Klf遺伝子
(3)Myc遺伝子
(4)Sox遺伝子
(5)Nanog遺伝子
(6)Lin28遺伝子
(7)SV40 LargeT抗原遺伝子
(8)TERT遺伝子 - 細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の3種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の4種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、請求項27から30のいずれかに記載の方法。
- 細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子およびMyc遺伝子の4種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、請求項31に記載の方法。
- 染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項27から32のいずれかに記載の方法。
- RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項33に記載の方法。
- マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項34に記載の方法。
- パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項35に記載の方法。
- 請求項27から36のいずれかに記載の方法により製造された細胞を分化させる工程をさらに含む、分化した細胞の製造方法。
- 請求項27から37のいずれかに記載の方法により製造された細胞。
- リプログラミングの工程によりベクターが染色体に組み込まれていない、請求項38に記載の細胞。
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