CN103517982A - 源自多能干细胞的褐色脂肪细胞、源自多能干细胞的细胞凝聚物，其制造方法以及细胞疗法、内科疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用多能干细胞制备褐色脂肪细胞的方法、其中间产物细胞凝聚物的制造方法、以及通过该方法制造的源自多能干细胞的细胞凝聚物和源自多能干细胞的褐色脂肪细胞以及使用源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的细胞疗法。本发明是使用多能干细胞制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于，通过包括工序(A)的方法由多能干细胞形成细胞凝聚物，通过包括工序(B)的方法由细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞；(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序；(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。

Description

源自多能干细胞的褐色脂肪细胞、源自多能干细胞的细胞凝聚物,其制造方法以及细胞疗法、内科疗法
技术领域
本发明涉及使用多能干细胞制造褐色脂肪细胞的方法、其中间产物细胞凝聚物的制造方法、以及由该方法制造的源自多能干细胞的细胞凝聚物和源自多能干细胞的褐色脂肪细胞以及使用源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的细胞疗法、内科疗法。
背景技术
近年来，肥胖者的数量在世界范围内不断增加。“肥胖”可以说是所有生活习惯病的根源，与肥胖相关的诸多疾病（糖尿病、高脂血症、由高血压引起的动脉硬化症以及由其引起的缺血性心脏病、脑溢血等）在包括日本在内的发达国家的死因中占上位。尤其是对于日本人，虽然与欧美人相比肥胖程度较低，但糖尿病容易发病，所以应对肥胖越发变得紧急。另外，在中国、巴西、印度、俄罗斯等新兴国家中，肥胖者的增加率更为显著，已成为较大的社会问题。
肥胖治疗的基本自不必说是基于食物疗法和运动疗法的生活习惯的改善，然而肥胖者变瘦并不容易。不能遵守食物疗法的肥胖症患者并不稀少。而且因伴随肥胖的诸多疾病（变形性关节病、糖尿病性坏疽、心功能不全等）而无法实施运动疗法的困难病例也不少。
另一方面，如同俗话所说的“越吃越瘦”，很早之前已指出作为肥胖的原因除了摄食过度、运动不足以外还存在“重要因素”。
以往的肥胖研究中，白色脂肪组织（WAT）是主要的研究对象。
然而，最近在解析核医学检查（PET/CT）的数据之际偶然发现一直认为只有啮齿类才会有的褐色脂肪组织（BAT）在人体中也存在（非专利文献1）。同样的报道相继被公开，也报道了BAT量与肥胖代谢综合征的发病呈逆相关。并且，现在已经认识到在考虑肥胖的病态方面，BAT是极其重要的组织。
BAT与WAT在产生上也极其不同。BAT在胎儿期已经形成，而WAT主要是在出生后发展。并且，已知包括人在内的大型哺乳类中，在出生后2天以内大半BAT会消失（生理性消失），而该机理尚不明确。而且，残余的BAT也随着年龄的增加渐渐消减，其机理也尚不明确。
如此，为了正确理解BAT，解明出生后出现的生理性消失、伴随年龄的增加而消失的机理变得重要。尤其是对于解明生理性消失的机理而言，应明确的是小鼠等小型哺乳类没有用处。
WAT是蓄积脂肪的能量储藏组织，相对于此，BAT是使脂肪积极燃烧的能量产生组织。两者在细胞形态和基因表达上也呈现完全不同的特性。
形态学上，白色脂肪细胞含有单房性大脂肪滴，缺乏线粒体（仅少量的线粒体存在于核周围），其形态反映氧化磷酸化的低活性状态，分裂化。另一方面，褐色脂肪细胞含有多房性小脂肪滴、线粒体丰富（在脂肪滴周围局部存在），其形态反映氧化磷酸化的高活性化状态，以纵长绳状融合，内部具有多个发达的梯子状嵴。
关于基因表达，作为对WAT特征性的物质可举出抵抗素（resistin）、磷酸丝氨酸转氨酶-1（phosphoserine aminotransferase1，PSAT1)等。作为对BAT特征性的物质可举出解偶联蛋白-1（uncoupling protein1，UCP1)、PR结构域蛋白16（PR domain containing16，PRDM16)，除此之外还可以举出极长链脂肪酸样延长因子-3（elongation of very long chain fattyacids-like3，ELOVL3)、细胞死亡诱导DFFA样效应因子A（celldeath-inducing DFFA-like effector A，CIDE-A)、过氧化物酶体增殖物激活受体-α（peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)、共激活因子1α（coactivator1α，PGC1α)、细胞色素C（cytochrome C，Cyt-c)、上皮“V”型抗原（epithelial V-like antigen，EVA1)、酪氨酸激酶3型受体（neurotrophictyrosine kinase receptor type3，NTRK3)等。
其中，UCP1具有使线粒体中的氧化磷酸化与ATP产生解耦联的作用，所以具有能够阻止不可避免地伴随氧化磷酸化产生活性氧的效果。即，BAT通过UCP1的表达，发挥消除伴随生命活动的氧化应激这样的应特别指出的效果。
另外，已知WAT和BAT在生物体中具有相反的生理效果。WAT在脂肪蓄积过度而细胞肥大化时诱发氧化应激。其结果，在脂肪组织中引起炎症，因炎症性细胞因子等的影响而在个体水平上诱发胰岛素抵抗性。另一方面，BAT因高度表达UCP1，所以不会诱发氧化应激，个体水平上的胰岛素敏感性高。
如此地，BAT不仅具有抗肥胖作用，还具有胰岛素抵抗性的改善作用，所以期待对Ⅱ型糖尿病的预防效果和治疗效果。
并且，最近报道了BAT从血中积极地摄取脂质，将其燃烧而积极地消耗，具有高脂血症的治疗效果（非专利文献2）。
并且，冠状动脉搭桥手术中，通过将患者本人的WAT移植到手术部分，从而至少短期提高成效，但需要进行冠状动脉搭桥手术的患者大多已经并发有代谢综合征，所以因移植的脂肪细胞中的炎症反应为诱因、氧化应激的诱发而从长期来看有可能发生手术后的血管再狭窄。实际上，冠状动脉狭窄病例中也已知冠状动脉周围WAT较多。
所以，若能将不引起氧化应激的BAT移植到冠状动脉搭桥手术部分，则可期待长期成效的提高。
如此地，可期待对肥胖、胰岛素抵抗性、Ⅱ型糖尿病、高脂血症的治疗效果以及冠状动脉搭桥手术的成效提高效果的BAT，对于代谢综合征相关诸多疾病的根治而言，是重要且贵重的组织。
然而，关于人体中的BAT的产生、增殖机制、功能控制等尚有很多不明点。而且，作为源自脂肪组织的荷尔蒙与代谢调节相关而被周知的脂肪因子均是由WAT鉴定的，可期待发挥比现有脂肪因子还优异的抗肥胖和代谢改善作用的“BAT特异性脂肪因子”还未被鉴定出来。
作为这样的有关BAT的重要发现仍欠缺的理由是因如下的原因基本无法从正常人志愿者得到BAT标本。即，可举出1）鉴定BAT的部位需要大暴露量的PET/CT检查；2）并非所有的受试者通过PET/CT检查就能使BAT可见化；3）人成体内BAT在多个部位（后颈部、各胸椎的肋等）分散存在，其量并不多（总重量在300g以下）；4）关于去除如此微小组织的BAT时产生的不利点（代谢综合征发病风险增大等）没有充分的评价资料这4点。
为了克服这样的问题，提供用来对研究目的和临床应用（细胞疗法等）的使用足够量的褐色脂肪细胞，从兼具无限自我增殖能力和多能性分化能力的多能干细胞制备褐色脂肪细胞极为有用。
作为人多能干细胞，可将人胚胎干细胞（ES细胞）、人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem(iPS)细胞）作为通用性最高的细胞举出，然而还没有使用这些人多能干细胞成功制备褐色脂肪细胞的例子。
另一方面，有关于从小鼠的骨髓、皮肤、脂肪组织中存在的成体干细胞制备褐色脂肪细胞，以及从小鼠ES细胞制备褐色脂肪细胞的报道（专利文献1），其对利用体外试验的褐色脂肪细胞制备的确认是仅通过UCP1基因的信号表达来进行的，未调查对褐色脂肪细胞功能表达重要的其他基因群（PRDM16、ELOVL3、CIDE-A、PPARα等）的表达。并且，完全没有进行从细胞形态学观点上的评价。因此，所制备的褐色脂肪细胞的品质存有疑虑。
并且，该方法是否适合人多能干细胞也完全不清楚。小鼠属于BAT多的动物，鉴于通过慢性寒冷刺激而频繁观察到WAT的BAT化，极其难以想象将小鼠中的结果直接应用于人。
而且，如上所述，即使使用以该方法制备的源自小鼠干细胞的褐色脂肪细胞，也无法解明在包括人在内的大型哺乳类中观察到的生理性消失的机制。
并且，还有从小鼠的BAT回收的脂肪前体细胞、源自小鼠胎儿的10T1/2细胞株，通过在含BMP7的培养基中进行培养来制备褐色脂肪细胞的报道（非专利文献3）。然而，完全不清楚该方法是否不仅对小鼠多能干细胞可用，对人多能干细胞也能应用。
并且，还有向人新生儿成纤维细胞导入2个基因（CCAAT/增强子结合蛋白β（enhancer binding proteinβ）；C/EBPβ、和PRDM16）而制备了褐色脂肪细胞的报道（非专利文献4）。然而，考虑人成纤维细胞的寿命，难以进行以提供研究材料和细胞疗法工具为目的的褐色脂肪细胞的大量配制。并且，由于通过导入基因而强制性地制备褐色脂肪细胞，所以也难以适用到上述生理性消失的机理解明中。
由此，开发出可以应用于包括人ES细胞、人iPS细胞的人多能干细胞，不进行利用基因导入的强制性分化诱导的，用于从多能干细胞制备褐色脂肪细胞的技术，对于发达国家和新兴国家中成为大的社会问题的代谢综合征相关诸多疾病的基础研究的推进以及预防法和治疗法的开发已成为当务之急。
专利文献
专利文献1：特开2010－130968
专利文献2：WO2008／056779
非专利文献
非专利文献1:Cypess等、New England Journal of Medicine、第360卷、第1509-1517页、2009年
非专利文献2:Bartelt等、Nature Medicine、第17卷、第200-205页、2011年
非专利文献3:Tseng等、Nature、第454卷、第1000-1004页、2008年
非专利文献4:Kajimura等、Nature、第460卷、第1154-1158页、2009年
非专利文献5:实验医学、Vol.26,No.5（增刊）、第35-40页、2008年
非专利文献6:Journalof Cell Physiology、第9卷、第335-344页、1977年
非专利文献7:Krings,A.等、Bone、journal homepage:www.elsevier.com/locate/bone、BON-09309、第7页4C、1stEdition、2011年
非专利文献8:Kushida T等、Blood97、第3292-9329页、2001年
发明内容
发明所要解决的问题
本发明以提供由多能干细胞不进行基因导入操作就稳定地制备褐色脂肪细胞的技术为主要课题。尤其是由人多能干细胞制备高品质的褐色脂肪细胞为课题。
并且，本发明以提供由人多能干细胞，在无血清的环境下，无人多能干细胞的株间差异地稳定制备可对与代谢综合征相关的诸多疾病使用细胞疗法的褐色脂肪细胞的技术为课题。
并且，本发明以提供由人多能干细胞，在无血清的环境下，无人多能干细胞的株间差异地稳定制备可成为褐色脂肪细胞的产生与消失（可在大型哺乳类中观察到的出生后的生理性消失和随年龄的增加的消失）的适当模型的褐色脂肪细胞的技术为课题。
并且，本发明还鉴于个性化医疗，通过提供使用从任意个人的体细胞不进行外源基因的基因组插入而建立的人多能干细胞，用来在无血清的环境下，无株间差异地稳定制备可对与代谢综合征相关的诸多疾病使用细胞疗法且可成为褐色脂肪细胞的产生与消失的适当模型的褐色脂肪细胞的技术，也以提供用于人褐色脂肪细胞相关基础研究的推进和代谢综合征相关诸多疾病的预防以及治疗的工具为课题。
解决课题的技术手段
本发明人等对以前本研究组确立的有关人多能干细胞的血球分化诱导的技术（专利文献2）进一步构建改良（无血清培养化、添加的细胞因子组合的低价化为目的的组成变更等）之际，发现培养基中悬浮的造血细胞以外的、与培养皿粘附的细胞集团中，其过半数呈类似褐色脂肪细胞的细胞形态（多房性脂肪滴、丰富的线粒体等）。进而，解析其基因表达，结果确认到了属于褐色脂肪细胞特征基因的UCP1和PRDM16的表达被诱导。
关于这种造血细胞与褐色脂肪细胞间的意外关系，造血干前体细胞的长期培养法的确立者Dexter等，在报道骨髓造血基质（具备支持造血功能的细胞）的形态学特征的论文（非专利文献6）中记载了启示其的内容。形态学上，将源自骨髓的粘附细胞分类为上皮样细胞、吞噬细胞、巨大脂肪细胞三种，其中，显示造血基质活性的细胞为巨大脂肪细胞已得到证明。并且，作为该巨大脂肪细胞的形态学特征记载了具有丰富的多房性脂肪滴，线粒体置于脂肪滴上。
虽然已报道了如此重要的发现，但至今为止还没有关于造血细胞与褐色脂肪细胞之间的关系的研究。
相对于此，本发明人等从上述实验事实发现造血细胞分化与褐色脂肪细胞分化有紧密的关联性，发现通过对造血细胞分化诱导体系施加改变从而可确立优异的褐色脂肪细胞分化诱导体系。
本发明人等对上述造血细胞分化诱导培养技术施加以下变更而实现了褐色脂肪细胞分化诱导法的最优化。
具体而言，发现通过1）所有的工序中不添加血清；2）在由两个步骤形成的分化诱导培养法中，使第一步骤（用于制备细胞凝聚物的悬浮培养工序）的培养时间延长（将原方法中3天的培养时间延长为8～10天）；3）关于在第1步骤中使用的细胞因子组合，使SCF和Flt3L的浓度设为以往的1/10～1/100左右的低容量；4）在第二步骤（细胞凝聚物的粘附培养工序）中，将构成第一步骤中使用的细胞因子组合的细胞因子中的骨形态生成蛋白4(BMP4)变更为BMP7；从而可飞跃性提高褐色脂肪细胞产生效率。
基于这些见解，本发明具有如下的构成。
即，本发明的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法是使用多能干细胞制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于，通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞形成细胞凝聚物，通过包括工序(B)的方法，由细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序，
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
并且，本发明的源自多能干细胞的细胞凝聚物的制造方法是使用多能干细胞制造细胞凝聚物的方法，其特征在于，通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞得到细胞凝聚物；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序。
并且，本发明的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法是使用源自多能干细胞的细胞凝聚物制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于，通过包括工序(B)的方法，由源自多能干细胞的细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞；
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
在此，作为在工序(A)中使用的造血性细胞因子可举出BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2，特别优选BMP4。
也可以仅使用BMP4等一种细胞因子，但优选混合使用三种以上的细胞因子，更优选混合使用全部6种细胞因子。
作为所使用的浓度，例如可举出BMP4(1～50ng/ml、优选10～30ng/ml)、VEGF(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)、SCF(1～50ng/ml、优选10～30ng/ml)、Flt3L(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IL6(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IGF2(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)。
作为在工序(B)中使用的造血性细胞因子可举出BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2，特别优选BMP7。
也可以仅使用BMP7等一种的细胞因子，但优选混合使用三种以上的细胞因子，更优选混合使用全部6种细胞因子。
作为所使用的浓度，例如可举出BMP7(1～50ng/ml、优选5～20ng/ml)、VEGF(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)、SCF(1～50ng/ml、优选10～30ng/ml)、Flt3L(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IL6(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IGF2(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)。
作为工序(A)中的非粘附培养，可举出使用通用的低吸附培养皿、半固形培养基等，将细胞以不粘附于培养皿底面而保持在培养基中悬浮的状态，同时在培养装置（例如，5%CO2恒温箱内、37℃）中进行培养。
作为工序(B)中的粘附培养，可举出使用通用的细胞培养用容器，向其直接或进行覆盖（例如，0.1％的源自猪的凝胶等蛋白）后接种、培养（例如，5%CO2恒温箱内、37℃）。
其中，无血清的环境是指在培养基中不添加胎牛血清等血清，添加胰岛素、转铁蛋白、清蛋白等蛋白成分，血清代替品（GIBCO PFHM-IIProtein-Free Hybridoma Medium（注册商标）、Life Technologies,Inc.等）进行培养。
细胞凝聚物是在将多能干细胞等在培养基中悬浮的状态进行培养而形成的球状（或不定形）的细胞集块，其大小、组织结构可以是各种各样的，并且可以相互连接。
并且，多能干细胞可以使用ES细胞或iPS细胞。
iPS细胞可以使用由仙台病毒载体建立的iPS细胞。
多能干细胞可以使用人多能干细胞。
本发明的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞是使用多能干细胞制造的褐色脂肪细胞，其特征在于，是通过包括工序(A)、(B)的方法而得到的；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序；
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
并且，本发明的源自多能干细胞的细胞凝聚物是使用多能干细胞制造的细胞凝聚物，其特征在于，是通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞得到的；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序。
并且，本发明的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞是使用源自多能干细胞的细胞凝聚物制造的褐色脂肪细胞，其特征在于，通过包括工序(B)的方法，由细胞凝聚物得到；
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
并且，本发明的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞是使用多能干细胞制造的褐色脂肪细胞，其特征在于，至少基因UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3的基因表达被诱导，同时具有多房性脂肪滴。
其中，基因表达被诱导是指，使用规定的引物，进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，将其产物用琼脂糖凝胶电泳可见化时，源自各基因信号的谱带在未分化多能干细胞时完全不被检测到，而分化诱导细胞则被检测到。
多房性脂肪滴是指在细胞质中存在的多个小的球状脂肪滴，可通过光学显微镜观察、电子显微镜观察等来确认其存在。脂肪滴的数量是在用电子显微镜进行观察时，在包括核的截面中的细胞切片照片中，以被检测出15个以上为基准。
并且，本发明的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞可以在多房性脂肪滴周围具有含多个梯子状嵴的纵长融合的绳状线粒体。
含多个梯子状嵴的纵长融合的绳状线粒体是指线粒体彼此相互在长轴方向进行融合而变长，呈类似绳子的形态的同时，线粒体内部相对于长轴方向铅直地从内膜的端到端为止全周性扩展的圆盘状的嵴相互平行并严密地并列。
并且，多能干细胞可以为ES细胞或iPS细胞。
多能干细胞可以为人多能干细胞。
本发明的细胞疗法是用于预防或治疗肥胖的细胞疗法，其特征在于，移植上述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
同样地，本发明的细胞疗法是用于改善胰岛素抵抗性或用于预防或治疗糖尿病的细胞疗法，其特征在于，移植上述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
同样地，本发明的细胞疗法是用于预防或治疗高脂血症的细胞疗法，其特征在于，移植上述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
同样地，本发明的细胞疗法是用于制备冠状动脉的侧支循环的手术的细胞疗法，其特征在于，移植上述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
同样地，本发明的细胞疗法是用于促进造血的细胞疗法，其特征在于，移植上述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
本发明的内科疗法是与用于预防或治疗肥胖、改善胰岛素抵抗性、预防或治疗糖尿病、预防或治疗高脂血症、用来促进造血的治疗、制备冠状动脉的侧支循环的手术中的任一个并用的内科疗法，其特征在于，给药上述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞所分泌的物质。
发明效果
通过本发明，可提供由多能干细胞在无血清且无喂养环境下稳定地制备褐色脂肪细胞的技术。
并且，通过本发明，可由人多能干细胞提供基因UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3的基因表达被诱导的同时，具有多房性脂肪滴而且在其周围具有多个梯子状嵴的纵长融合的绳状的线粒体的褐色脂肪细胞。
本发明所制得的褐色脂肪细胞由于实质上不含源自异种动物的细胞、外源病毒性成分，所以作为基础研究工具、细胞疗法工具均优异。
附图说明
图1是表示SeV-iPS细胞中的形态变化的显微镜照片。
图2是表示SeV-iPS细胞中的SSEA4、OCT3/4的各未分化标记的表达的FACS扫描结果坐标图。
图3是表示SeV-iPS细胞中的SSEA4、OCT3/4、Nanog的各未分化标记的表达的免疫染色照片。
图4（A）是表示SeV-iPS细胞中的源自SeV载体的除去外源基因的电泳照片，（B）相同，显微镜照片。
图5（A）是表示源自人ES细胞和人iPS细胞（SeV-iPS）的褐色脂肪细胞的位相差显微镜照片，（B）相同，油红O（oil red O）染色像。
图6是褐色脂肪细胞标记检测用的RT-PCR用引物的表。
图7A的（A）是从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的RT-PCR的电泳照片。
图7B的（B）是从人iPS细胞（SeV-iPS）分化诱导的褐色脂肪细胞的RT-PCR的电泳照片。
图8是从多能干细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的电子显微镜照片。
图9ABC的（A）是表示来自于人iPS细胞（SeV-iPS）的褐色脂肪细胞分化诱导中的造血性细胞因子的必要性与BMP7的有效性的RT-PCR的电泳照片，（B）相同，位相差显微镜照片、（C）是表示来自于人ES细胞的褐色脂肪细胞分化诱导中的BMP7的有效性的位相差显微镜照片。
图9DE的（D）是从多能干细胞的褐色脂肪细胞分化诱导中除去造血性细胞因子的条件下的褐色脂肪细胞的位相差显微镜照片，（E）是来自于多能干细胞的褐色脂肪细胞分化诱导中除去造血性细胞因子的条件下的RT-PCR的电泳照片。
图10是表示在从多能干细胞分化诱导的褐色脂肪细胞中，添加β肾上腺素能受体激动剂时的UCP1、PRDM16基因的表达增加的RT-PCR的电泳照片。
图11A的（A）是表示将从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞移植到小鼠背部皮下，添加β肾上腺素能受体激动剂时的体表面温度变化的照片。
图11B的（B）是表示将从人iPS细胞（SeV-iPS）分化诱导的褐色脂肪细胞移植到小鼠背部皮下，添加β肾上腺素能受体激动剂时的体表面温度变化的照片。
图12的（A）是表示从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的线粒体呼吸能力的评价的图表、（B）是表示从人iPS细胞（SeV-iPS）分化诱导的褐色脂肪细胞的线粒体呼吸能力的评价的图表、（C）是表示源自人MSC的白色脂肪细胞的线粒体呼吸能力的评价的图表。
图13A的（A）是表示将从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞移植到小鼠背部皮下，添加β肾上腺素能受体激动剂时的血中的中性脂肪变化的图表。
图13B的（B）是表示将从人iPS细胞（SeV-iPS）分化诱导的褐色脂肪细胞移植到小鼠背部皮下，添加β肾上腺素能受体激动剂和橄榄油时的血中的中性脂肪变化的图表。
图14A的（A）是葡萄糖耐量试验的量表的说明图。
图14B的（B）是表示将从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞移植到背部皮下的小鼠的空腹血糖值的图表。
图14C的（C）是表示将从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞移植到背部皮下的小鼠的葡萄糖耐量试验结果的图表。
图14D的（D）是表示将从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞移植到背部皮下的小鼠的糖代谢异常的治疗效果的图表。
图15是表示从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的活性氧产生抵抗性的显微镜照片。
图16A的（A）是从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的造血基质功能试验方法的说明图。
图16BCD的（B）是表示利用FACS的人CD45表达细胞的评价的图表、（C）是表示利用FACS的人CD33、人CD45表达细胞的评价的图表、（D）是表示从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的造血性细胞因子表达评价的电泳照片。
图16E的（E）是表示从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的造血性细胞因子表达量的基于褐色脂肪细胞兴奋剂的影响的电泳照片。
图16F的（F）是表示从人ES细胞分化诱导的褐色脂肪细胞的基于兴奋剂的骨髓抑制缓和效果的图表。
具体实施方式
以下，将本发明的实施方式基于附图中示出的实施例进行说明。其中，实施方式并不局限于下述的例示，在不脱离本发明主旨的范围内，可以使用上述文献等的现有公知技术进行适当的设计变更。
基于本发明的褐色脂肪细胞是使用多能干细胞制造的褐色脂肪细胞，通过包括工序(A)、(B)的方法得到；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序，
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
典型的是，为了从多能干细胞得到源自多能干细胞的褐色细胞，将多能干细胞从小鼠胎儿成纤维细胞等的喂养细胞分离后，使用添加了BMP4的细胞凝聚物制备用培养基，在通用的低吸附培养容器内，在保持使细胞悬浮的状态的同时培养8～10天左右，将由此制备的细胞凝聚物使用添加了BMP7的褐色脂肪细胞分化培养基，在通用的细胞培养容器或将其在用凝胶等的蛋白成分覆盖的容器内进行培养。由此，从多能干细胞制备源自多能干细胞的褐色脂肪细胞用10～15天左右完成。
下面，对各工序进行详细的说明。
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序：
起始原料的多能干细胞是指具有多能性的干细胞，例如可举出ES细胞、iPS细胞、睾丸干细胞、成体干细胞、Muse细胞等。
多能干细胞可以是人多能干细胞。此时，多能干细胞来源于人，是保持多能分化能力的细胞群。其包括人ES细胞、人iPS细胞、人睾丸干细胞、人成体干细胞、人Muse细胞等。
多能干细胞的获得方法和建立方法是公知的。例如，人ES细胞可在获得日本文部科学省的许可后从国内建立机关（京都大学、国立成育医疗研究中心）分得，从国外设施（私企、大学等）分得或购入。并且，对于人iPS细胞而言，优选使用仙台病毒（SeV）载体的方法，例如，将市售的人成纤维细胞等在添加有仙台病毒载体的培养基中进行培养而建立，所述仙台病毒载体负载有重编程因子表达单元。作为负载有重编程因子表达单元的仙台病毒载体，可以例举如CytoTune-iPS(日本生物载体公司（DNAVEC Corporation制备)等。使用逆转录病毒载体制备的人iPS细胞，可从理化学研究所生物资源中心购买，或由京都大学或国立成育医疗研究中心分得。
通常，多能干细胞是通过不使用维持未分化所需的添加物而是使用对维持多能干细胞的生存性有效的添加物，以通用的低吸附培养容器等进行悬浮培养，从而可形成细胞凝聚物。然而，源自多能干细胞的细胞凝聚物的分化指向性受制备细胞凝聚物时所使用的培养基的组成的控制。
制备褐色脂肪细胞时，细胞凝聚物制备用培养基中必须至少含有一种造血性细胞因子。换言之，制备褐色脂肪细胞时，对属于中间产物的细胞凝聚物的形态、大小没有特别的限制，但对细胞凝聚物的制备中所用的培养基的组成伴随规定的条件。其中，在血球分化时使用的那样的高容量（例如，使用100～300ng/ml SCF或Flt3L）下使用造血性细胞因子将会抑制褐色脂肪细胞的产生，所以不优选。
作为细胞凝聚物制备用培养基的基础成分，例如可使用在通用的基础培养基IMDM/F12中添加了如下物质的培养基等。即，5mg/ml牛血清蛋白（BSA）、1%体积的合成脂质溶液(美国生命技术公司（LifeTechnologies,Inc.）)、1%体积×100胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-A)(美国生命技术公司)、450μMα-硫代甘油（α-monothioglycerol，MTG）(西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich,Inc.）)、2mM L-谷氨酰胺(美国生命技术公司)、5%体积GIBCO PFHM-II无蛋白杂交瘤培养基（GIBCO PFHM-IIProtein-Free Hybridoma Medium(PFHII)（注册商标）(美国生命技术公司)、50μg/ml抗坏血酸。
在此，作为造血性细胞因子，添加BMP4(1～50ng/ml，优选10～30ng/ml)、VEGF(0.5～20ng/ml，优选1～10ng/ml)、SCF(1～50ng/ml，优选10～30ng/ml)、Flt3L(0.5～20ng/ml，优选1～5ng/ml)、IL6(0.5～20ng/ml，优选1～5ng/ml)、IGF2(0.5～20ng/ml，优选1～10ng/ml)来进行使用。
作为造血性细胞因子组合的一例可举出BMP4(20ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、SCF(20ng/ml)、Flt3L(2.5ng/ml)、IL6(2.5ng/ml)、IGF2(5ng/ml)。
使用细胞凝聚物制备用培养基，将多能干细胞加入通用的低吸附培养容器等，不粘附于容器底面而在培养基中保持悬浮的状态的同时，例如在5%CO2恒温箱内在37℃下培养8～10天。
期间，例如，每3天将培养基的半量更换为新鲜的培养基。更换培养基时，例如，将低吸附培养容器倾斜30度左右放置1分钟左右，确认细胞凝聚物完全下沉之后，仅将培养上清的半量用吸液管沉稳地吸出后，添加等量的新鲜的细胞凝聚物制备用培养基，轻轻摇动低吸附培养容器整体以使细胞凝聚物均匀地分散。
作为在悬浮培养中使用的低吸附培养容器，至少是多能干细胞不粘附于容器底面的容器即可，例如可举出，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)覆盖培养皿（赛默飞世尔公司（Thermo Fisher Scientific Inc.））、Hydrocell（注册商标）(CellSeed Inc.)等。
其中，为了从多能干细胞分离、去除喂养细胞，例如，优选将通过剥离液处理回收的多能干细胞的悬浊液在离心管内静置30秒左右，仅将多能干细胞选择性地沉降后，使用细胞凝聚物制备用培养基再次使细胞悬浊，在低吸附培养容器内进行悬浮培养。
源自多能干细胞的细胞凝聚物大多呈内部充满的球状或接近其的形态，但有时也呈不定形或相互融合。并且，虽然非常稀少但也有内部呈空洞状的情况。其大小是从用光学显微镜确认的级别（直径100～300μm）到可用肉眼容易地确认的级别（直径300～1000μm）的各种大小。
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序：
将工序(A)中制备的源自多能干细胞的细胞凝聚物，使用通用的细胞培养用容器进行。细胞培养用容器只要使用通常在细胞培养中所使用的容器即可。
作为通用的基础培养基可举出IMDM、IMDM/F12、DMEM、DMEM/F12、RPMI等。作为无血清培养用培养基可举出S-克隆SF-B（EIDIA Co.,Ltd.）、S-克隆SF-03（EIDIA Co.,Ltd.）、ASF-104（味之素公司）、ASF-104N（味之素公司）、X-VIVO10（龙沙集团（Lonza group Ltd.））、X-VIVO15（龙沙集团）等。
在此，作为造血性细胞因子，添加BMP7(1～50ng/ml、优选5～20ng/ml)、VEGF(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)、SCF(1～50ng/ml、优选10～30ng/ml)、Flt3L(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IL6(0.5～20ng/ml、优选1～5ng/ml)、IGF2(0.5～20ng/ml、优选1～10ng/ml)来进行使用。
作为造血性细胞因子组合的一个例子，可举出BMP7(10ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、SCF(20ng/ml)、Flt3L(2.5ng/ml)、IL6(2.5ng/ml)、IGF2(5ng/ml)。
分化诱导的培养条件可根据所用的人多能干细胞的种类进行适当设定，例如，在37℃、5%CO2恒温箱中培养1周左右。
为了提高细胞粘附性，可以实施覆盖处理。覆盖处理例如是将0.1%猪凝胶水溶液加入培养容器内，在室温下放置10分钟左右。并且，也可以使用通用的提高了细胞粘附性的培养容器（Corning CellBIND Surface（注册商标）、康宁公司等）。其中，优选的是，培养中每3天左右将培养基更换为新鲜的培养基。
源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的制备，可通过使用RT-PCR等调查UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3等的褐色脂肪细胞标记基因的表达诱导来进行确认。
另外，可通过位相差显微镜中对多房性脂肪滴的观察、电子显微镜观察中对多房性脂肪滴的观察、具有梯子状嵴的纵长地融合了的线粒体在细胞质中的观察来进行确认。
源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的功能可通过在添加作为β肾上腺素能受体激动剂的异丙肾上腺素等时，PRDM16、UCP1等的与线粒体扩增、热产生相关的基因的表达上升来进行确认。
源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的功能可通过添加作为β肾上腺素能受体激动剂的异丙肾上腺素等时，细胞温度的上升或氧消耗量的增大或将源自多能干细胞的褐色脂肪细胞移植到小鼠等，向其给药作为β肾上腺素能受体激动剂的异丙肾上腺素等时，移植部的温度上升来进行确认。
如此得到的褐色脂肪细胞是源自多能干细胞的褐色脂肪细胞，具有实质上没有异种动物细胞的混入、源自异种动物的病毒的感染这样的优异性质。如此得到的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞可作为褐色脂肪细胞的产生、脱分化等相关的基础研究工具使用，而且可作为对肥胖、高脂血症等的细胞疗法工具使用。
本发明中制备的褐色脂肪细胞表达用于将蓄积于脂肪滴内的中性脂肪中的化学能量转换为热能的基因群。
因此，将本发明中制备的褐色脂肪细胞移植于生物体内时，个体的总热产生量增加，与此相应，基础代谢将亢进，因此可期待长期改善肥胖。即，本发明中制备的褐色脂肪细胞作为对肥胖的细胞疗法工具有用。
本发明中制备的褐色脂肪细胞可将生物体内蓄积的化学能量作为热能消耗，所以可确保用于在脂肪组织内重新蓄积多余能量的空间。
因此，通过进餐摄取的能量将迅速地被脂肪组织收入。即，脂肪组织中，因脂肪蓄积到容量以上，结果导致没有用于蓄积源自进餐的剩余能量的预备容量，由此产生的胰岛素抵抗性，将因移植本发明中制备的褐色脂肪细胞而确保重新蓄积剩余能量的容量，得到改善。即，本发明中制备的褐色脂肪细胞作为对胰岛素抵抗性的细胞疗法工具有用。
并且，本发明中制备的褐色脂肪细胞通过将从外部进入的脂质成分在细胞质内作为多房性脂肪滴而蓄积，从而以总表面积大的状态进行保持。并且，在这些脂肪滴的附近，大多存在基于电子传导体系的氧化磷酸化高活性的线粒体以长轴方向延长融合，且在内部具有发达的梯子状嵴的形态。而且，本发明中制备的褐色脂肪细胞表达用于将氧化磷酸化中得到的能量转换为热能的基因群。
因此，将本发明中制备的褐色脂肪细胞移植于生物体内时，积极吸取血液中的脂质成分，发挥使其燃烧、消失的效果。即，本发明中制备的褐色脂肪细胞作为对高脂血症的细胞疗法工具有用。
其中，作为对高脂血症的细胞疗法工具的有用性可通过如下确认：对通过高脂肪食品等预先诱发成高脂血症状态的小鼠等中，移植本发明中制备的褐色脂肪细胞，一周时间跟踪血清中的脂肪值等来进行确认；或者，将移植了本发明中制备的褐色脂肪细胞的小鼠，绝食一昼夜后，经口加载橄榄油等的食用油脂，其后4小时左右经时跟踪血中的中性脂肪值来进行确认。
并且，本发明中制备的褐色脂肪细胞表达UCP1。UCP1通过在电子传导体系中引起解偶联，从而发挥阻止伴随线粒体中的氧化磷酸化反应而应不可避免地产生的活性氧的产生的作用。即，本发明中制备的褐色脂肪细胞不产生活性氧，并且不会引起炎症反应。
因此，将本发明中制备的褐色脂肪细胞移植于生物体内时，阻止移植部中的活性氧的产生。由此，例如，可克服冠状动脉搭桥手术中的脂肪移植疗法的窘境（因从移植的脂肪细胞产生活性氧，所以存在在血循环再建部位引起炎症反应，使血循环再建手术后的长期恢复变差的危险性），可提高血循环再建手术后的长期恢复。即，本发明中制备的褐色脂肪细胞作为用于冠状动脉搭桥手术中的脂肪移植疗法的细胞疗法工具有用。
已知在源自小鼠骨髓的脂肪细胞株中存在支持造血支持功能的“造血基质细胞”。并且，如上所述，小鼠骨髓中存在的造血基质细胞表现出作为褐色脂肪细胞的形态学特征。并且，就在最近还报道了小鼠骨髓中存在褐色脂肪细胞（非专利文献7）。另一方面，还已知从人骨髓间叶系干细胞制备的白色脂肪细胞中没有造血支持功能。即，给出了相对于白色脂肪细胞负面控制造血，褐色脂肪细胞正面控制造血的启示。由此认为，本发明中制备的褐色脂肪细胞作为对伴随抗癌剂治疗的骨髓抑制、造血障碍性疾病的细胞疗法工具有用。
并且，将本发明中制备的褐色脂肪细胞所分泌得脂肪因子等给药于生物体内时，其作用于肝脏、骨骼肌、白色脂肪细胞等，改善脂质、糖的代谢，或者间接作用于骨髓系造血前体细胞而可提高造血功能。即，本发明中制备的褐色脂肪细胞所分泌的物质，作为与肥胖的预防或治疗、胰岛素抵抗性的改善、糖尿病的预防或治疗、高脂血症的预防或治疗、用于促进造血的治疗、制备冠状动脉侧支循环的手术等并用的内科疗法工具有用。
实施例
[实施例1]使用仙台病毒载体的人诱导多能干细胞的诱导：
将2.5×105个/孔的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)（龙沙集团）接种于用0.1%猪凝胶覆盖的6孔型培养板上，使用EGM-2培养基（龙沙集团），在37℃、5%CO2恒温箱进行培养。培养后，将MOI=3浓度的下述（a）～（d）的载体感染到所培养的细胞。
（a）SeV18+OCT3/4／TSΔF载体
（b）SeV18+SOX2／TSΔF载体
（c）SeV18+KLF4／TSΔF载体
（d）SeV(HNL)c-MYC／TS15ΔF载体
感染载体后，次日以含有10%FBS的DMEM更换培养基。其后，在37℃、5%CO2恒温箱中培养6天。然后，在凝胶覆盖的10cm培养皿上准备的6.0×105（个）经X射线照射处理后的小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）之上，将用Accutase（Innovative Cell Technologies,Inc.）剥离的导入细胞以9.0×105～1.5×106（个）进行培养。次日，从含10%FBS的DMEM更换为灵长类ES细胞用培养基（ReproCELL Inc.）（添加了FGF2使其为5ng/ml），在3%CO2恒温箱中进行培养。每日进行培养基更换。
图1是表示源自HUVEC的人诱导多能干细胞（SeV-iPS细胞）中的形态变化的显微镜照片。
培养数日后出现集落，培养20天左右，出现了人胚胎干细胞样集落。如图1的照片所示，可以观察到与诱导前的HUVEC明显不同的、在人胚胎干细胞中可观察到的同样的扁平集落。该人胚胎干细胞样的集落与以往所报道的外观相同（非专利文献5）。
将这些集落用微玻管分离后，在新的MEF上进行培养。并且，可通过使用人多能干细胞用剥离液（0.25%胰蛋白酶(美国生命技术公司)、1mg/ml胶原酶IV(和光纯化学工业公司)、20%KnockOut（注册商标）血清替代品(美国生命技术公司)、1mM CaCl2）的剥离操作，进行稳定的继代、增殖培养。
为了明确通过上述实验得到的细胞是否表达多能干细胞特征标记，进行了下述的实验。
[实施例2]使用仙台病毒载体的人诱导多能干细胞的保持未分化的确认：
使用流式细胞仪（FACSCalibur（注册商标））（美国BD公司（Becton,Dickinson and Company）），调查人多能干细胞的未分化标记SSEA4、OCT3/4的表达。
具体而言，关于SSEA4，将实施例1中得到的SeV-iPS细胞使用多能干细胞用剥离液（0.25%胰蛋白酶(生命技术公司)1mg/ml胶原酶IV(和光纯化学工业公司)、20%KnockOut（注册商标）血清代替品(美国生命技术公司)、1mM CaCl2）进行回收后，使用胰蛋白酶/EDTA液（西格玛奥德里奇公司）进行分散，然后在FACS缓冲液(×1PBS，0.05%NaN3，5%FBS)中进行悬浮。向其中添加2%小鼠BD Fc块(美国BD公司)后，添加抗人藻红蛋白标记小鼠IgG（SSEA4phycoerythrin conjugated mouse IgG）(R&DSystems Inc.)×1/10，在冰上静置60分钟后，以FACS缓冲液进行洗涤，用流式细胞仪分析SSEA4的表达。
并且，关于OCT3/4的表达，回收SeV-iPS细胞后，使用FIX&PERM细胞透化试剂盒（FIX&PERM CELL PERMEABILIZATION KIT）(美国生命技术公司)进行细胞的固定、细胞膜渗透处理，添加2%小鼠BD Fc块(美国BD公司)和抗人OCT3/4藻红蛋白标记大鼠IgG（OCT3/4phycoerythrin conjugated rat IgG）(R&D Systems Inc.)×1/10，在冰上静置60分钟后，以FACS缓冲液进行洗涤，通过流式细胞仪分析OCT3/4的表达。
其结果，如图2的FACS扫描结果所示，确认到了在实施例1中得到的SeV-iPS细胞将SSEA4和OCT3/4的各未分化标记均高度表达。
其中，上段的图表分别是SSEA4和OCT3/4的染色数据，左为对照抗体、右为目标抗体（抗SSEA4抗体、抗OCT3/4抗体）中的染色数据。与对照抗体相比，目标抗体中的染色数据向FL2增加方向偏移，所以可确认大多数细胞中表达了目标蛋白。下段的图表是将上段的图表以柱形图进行表示的，与对照抗体相比，可知目标抗体中的分布曲线向FL2增加方向偏移。
并且，对人多能干细胞的未分化标记SSEA4、OCT3/4、Nanog的表达，还使用免疫染色法进行了确认。
具体而言，将实施例1中得到的SeV-iPS细胞用丙酮/甲醇（1:3）固定，通过0.1%Triton-X-100/PBS进行了细胞膜渗透处理之后，使用抗人SSEA4抗体（ES细胞标记物样品试剂盒）（米利波公司（Millipore Co.））、抗人OCT3/4抗体（ES细胞标记物样品试剂盒）（米利波公司）、抗人Nanog抗体（ReproCELL Inc.）×1/100进行了一级抗体反应。其中，关于抗人SSEA4抗体、抗人OCT3/4抗体，按照试剂盒的流程进行。进而，使用Alexa Fluor488标记抗兔IgG抗体（美国生命技术公司）×1/2000进行了二级抗体反应后，利用荧光显微镜进行观察。
其结果，如图3的免疫染色结果所示，可确认实施例1中得到的SeV-iPS细胞将SSEA4、OCT3/4、Nanog的各未分化标记物均高度表达。
[实施例3]源自SeV载体的外源基因的去除：
为了从实施例1中得到的SeV-iPS细胞得到除去了源自SeV载体的外源基因的细胞株，进行了克隆。
作为除去源自SeV载体的外源基因的基准，进行了利用抗SeV抗体（日本生物载体公司（DNAVEC Corporation））的免疫染色。将SeV-iPS细胞用10%Mildform（和光纯化学工业公司）进行固定，作为一级抗体使用抗SeV抗体、作为二级抗体使用Alexa Fluor488标记抗兔IgG抗体（美国生命技术公司）进行染色后，利用荧光显微镜进行观察。
并且，为了检测转基因和SeV基因组，进行了RT-PCR。RT是使用Superscript III第一链合成系统（Superscript III First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR）（美国生命技术公司）进行的。PCR是使用GeneAmpR PCR系统9700(美国生命技术公司)，进行改性（95℃下5分钟）、扩增（95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒、30～35循环）、后延伸（72℃下7分钟）的各步骤。引物使用：
OCT3/4(Fw:CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG，
Rv:AATGTATCGAAGGTGCTCAA)；
SOX2(Fw:ACAAGAGAAAAAACATGTATGG，
Rv:ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG)；
KLF4(Fw:ACAAGAGAAAAAACATGTATGG，
Rv:CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC)；
cMYC(Fw:TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG，
Rv:TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG)；
SeV(Fw:GGATCACTAGGTGATATCGAGC，
Rv:ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC)。
其结果，如图4A的电泳结果和图4B的显微镜照片所示，确认到了实施例1中得到的SeV-iPS细胞株是SeV抗原阴性，未保持源自SeV载体的外源基因。因此，SeV-iPS细胞株，与用逆转录病毒载体制备的iPS细胞相比，适于临床使用、在药剂评价体系、疾病模型体系中的使用。
[实施例4]人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞的维持培养：
人胚胎干细胞（KhES-3）使用京都大学·再生医科学研究所所提供的细胞。KhES-3和实施例1～3所记载的SeV-iPS细胞株是在进行X射线照射处理后的MEF上，使用含有20%Knockout血清替代品（KSR）（美国生命技术公司）、5ng/ml FGF2、1%非必需氨基酸、100μM2-硫基乙醇、2mML-谷氨酰胺的DMEM/F12（美国生命技术公司）培养基进行维持培养。
[实施例5]从人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞诱导褐色脂肪细胞：
在进行向褐色脂肪细胞的分化诱导时，首先为了从KhES-3和SeV-iPS细胞株分离、去除MEF，将通过剥离液处理回收的多能干细胞的悬浮液在离心管内静置30秒左右，从而仅使多能干细胞选择性沉降。
通过以下两个阶段的工序进行向褐色脂肪细胞的分化诱导。
（1）将由实施例3中的多能干细胞形成的沉降物在4ml的细胞凝聚物制备用培养基（含有5mg/ml BSA、1%体积合成脂质溶液、1%体积×100ITS-A、450μM MTG、2mM L-谷氨酰胺、5%体积PFHII、50μg/ml抗坏血酸、20ng/ml BMP4、5ng/ml VEGF、20ng/ml SCF、2.5ng/ml Flt3L、2.5ng/ml IL6、5ng/ml IGF2的IMDM/F12培养基）中悬浮，将其移入6孔型的MPC覆盖培养皿，在37℃下5%CO2恒温箱内培养。其后，每3天更换半量的培养基，进行8～10天的培养。其中，培养基更换是如下进行的：将MPC覆盖培养皿整体倾斜30度放置1分钟左右，在确认细胞凝聚物完全沉下后，仅将培养上清的半量用吸液管小心地吸出后，添加等量的新鲜的细胞凝聚物制备用培养基，轻摇MPC覆盖培养皿整体以使细胞凝聚物均匀分散。
（2）将在上述中制备的源自多能干细胞的细胞凝聚物移入10ml左右的离心管，放置30秒～1分钟左右使细胞成分沉降后，去除上清并添加3ml的褐色脂肪细胞诱导培养基（含有5mg/ml BSA、1%体积合成脂质溶液、1%体积×100ITS-A、450μM MTG、2mM L-谷氨酰胺、5%体积PFHII、50μg/ml抗坏血酸、10ng/ml BMP7、5ng/ml VEGF、20ng/ml SCF、2.5ng/mlFlt3L、2.5ng/ml IL6、5ng/ml IGF2的IMDM/F12培养基），在1100rpm下离心5分钟。将其移入预先用0.1%猪凝胶水溶液在室温下反应10分钟的细胞培养皿中，在37℃、5%CO2恒温箱内进行培养。其后，每3天更换培养基，培养1周。
其结果，如图5A的位相差显微镜照片所示，得到了在细胞质中具有多房性脂肪滴（多个具有黄色光泽的球形物）的细胞。其中，如图5B所示，通过油红O染色（将中性脂肪显色为红色的试验）确认了该球形物为脂肪滴。
并且，通过使用图6所记载的引物的RT-PCR，按照如图7所示的电泳，确认了褐色脂肪细胞中特征基因群（UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3）的表达被诱导。而且，确认到了褐色脂肪细胞与白色脂肪细胞的共同标记PPARγ和脂联素的表达也被诱导。另一方面、确认到了白色脂肪细胞标记抵抗素、磷酸丝氨酸转氨酶1（PSAT1）、内皮素受体（EDNRA）的表达未被诱导。
其中，抵抗素不仅引起胰岛素抵抗性，还是与癌化、动脉硬化均相关的基因。在源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞中，抵抗素的表达未被诱导的情况，对使用源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞的药物开发研究自不必说，在考虑到使用源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞的细胞疗法中的安全性方面也是极其重要的。
并且，如图8的电子显微镜观察图像所示，确认了褐色脂肪细胞中作为特征微细结构的多房性脂肪滴、纵长融合的线粒体的存在。而且，在线粒体内部确认了褐色脂肪细胞中表现为特征梯子状的嵴。
[实施例6]从人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞诱导褐色脂肪细胞中的造血性细胞因子的必要性和BMP7的有效性的确认：
按照实施例5所记载的方法，从KhES-3和SeV-iPS细胞株进行褐色脂肪细胞分化之际，在悬浮培养的工序（A）中使用未添加造血性细胞因子、作为细胞因子仅添加5ng/ml IGF2和20ng/ml BMP4的培养基进行培养时，诱发了大量的细胞死亡，完全没有形成细胞凝聚物。即，造血性细胞因子组合，在相当于人多能干细胞的褐色脂肪细胞分化过程的前半部的细胞凝聚物的制备工序（A）中是必须的。
因此，为了对人多能干细胞的褐色脂肪细胞分化过程的后半部中的造血性细胞因子以及BMP7的必要性进行评价，在悬浮培养的工序（A）中使用含有20ng/ml BMP4、5ng/ml VEGF、20ng/ml SCF、2.5ng/ml Flt3L、2.5ng/ml IL6、5ng/ml IGF2的、实施例5所记载的培养基，制备细胞凝聚物，在接下来的粘附培养的工序（B）中使用含有造血性细胞因子组合和BMP7的培养基或不含这些的培养基进行培养，检查了UCP1以及PRDM16的基因表达诱导状情况和细胞形态。
其结果，在使用人诱导多能干细胞的实验中，粘附培养的工序（A）中使用未含造血性细胞因子组合的培养基（图9A，泳道3）进行培养时，UCP1、RPDM16均未被诱导基因表达。并且，使用不含BMP7但含BMP4的培养基（图9A,泳道2）进行培养时，与使用含BMP7的培养基（图9A,泳道1）进行培养的情况相比，UCP1、RPDM16中基因表达的诱导均减弱。
并且，如图9B所示，将细胞用位相差显微镜进行观察，结果在粘附培养的工序（B）中使用未含造血性细胞因子组合的培养基进行培养时，完全未检测到在细胞质中含有脂肪滴的细胞。并且，使用不含BMP7但含BMP4的培养基进行培养时，虽然检测到了在细胞质中含有脂肪滴的细胞，但与使用添加有BMP7的培养基的情况相比，其含有脂肪滴的细胞的数量少。
该BMP7的作用效果在使用人胚胎干细胞的实验中也同样得到确认（图9C）。
而且，为了确认各个造血性细胞因子（VEGF、SCF、Flt3L、IL6）的必要性，使用将它们一个一个从细胞因子组合除去的分化培养基进行了分化诱导。
首先，在相当于人多能干细胞的褐色脂肪细胞分化过程的前半部的细胞凝聚物的制备工序（A）中，将上述4个细胞因子一个一个除去时，如图9D的上段（第8天）所示，与加入了所有的细胞因子的培养基（阳性对照）相比，细胞凝聚物的形态为不规则形状、未进入细胞凝聚物的死细胞在培养基上悬浮等，确认了细胞生存性降低。并且，在相当于人多能干细胞的褐色脂肪细胞分化过程的后半部的细胞凝聚物的粘附培养的工序（B）中，将上述4个细胞因子一个一个除去时，如图9D的下段（第10天）所示，与加入了所有的细胞因子的培养基（阳性对照）相比，持有多房性脂肪滴的细胞的比例下降。
为了对其进行定量评价，从以各自的分化诱导条件制备的产物萃取总RNA，进行了RT-PCR。结果，如图9E所示，与加入了所有的细胞因子的培养基（阳性对照）相比，在除去VEGF时，确认了PRDM16和UCP1的诱导显著减少。并且，在除去SCF、Flt3-L或IL6时，确认了PRDM16的表达虽然被诱导，但UCP1的表达的诱导显著减少。而且，在除去SCF、Flt3-L或IL6时，确认了作为白色脂肪细胞标记的PSAT1的表达被诱导，不仅降低作为褐色脂肪细胞的分化效率，所制备的褐色脂肪细胞的品质也会下降。
[实施例7]从人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞制备的褐色脂肪细胞中的基于β肾上腺素能受体激动剂的“热产生能力”的提高的确认：
按照实施例5所记载的方法，从KhES-3细胞株和SeV-iPS细胞制备褐色脂肪细胞，使属于肾上腺素受体激动药的异丙肾上腺素以（100μM）的浓度反应4小时。为了评价伴随添加肾上腺素受体激动药的褐色脂肪细胞的活化状况，通过RT-PCR检查了PRDM16和UCP1的基因表达。
其结果，如图10所示，确认了依存于异丙肾上腺素的添加，与PRDM16基因一起，对热产生所必须的UCP1基因的表达得到提高。
而且，为了确认从人多能干细胞制备的褐色脂肪细胞在生物体内的热产生功能，进行了以下实验。将从KhES-3细胞株和SeV-iPS细胞制备的褐色脂肪细胞（1×106个/100μl生理食盐水（生理盐水））移植于3天前预先进行了脱毛处理的6周龄的小鼠（ICR系统）的皮下（背部）。次日，给药异丙肾上腺素(30μmol/kg)，4小时后在麻醉条件下使用Thermo GEARG120（NEC Avio红外技术公司制）进行了热谱撮影。并且，作为阴性对照分别移植了生理盐水（100μl）和未分化KhES-3细胞（1×106个/100μl生理盐水）或生理盐水（100μl）和未分化SeV-iPS细胞（1×106个/100μl生理盐水）。
结果，如图11（图11A右,11B右）所示，只有移植了源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞的小鼠中，在移植部确认到了皮肤温度的升高。
[实施例8]从人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞制备的褐色脂肪细胞中的、基于β3肾上腺素能受体激动剂的线粒体呼吸能力亢进的确认：
按照实施例5所记载的方法，从KhES-3细胞株和SeV-iPS细胞株使褐色脂肪细胞分化诱导。在此，分化诱导的粘附培养的工序（B）中是将XF96海马生物能量测定仪(海马生物科学公司（Seahorse Bioscience Inc.）,比勒利卡（Billerica），MA)专用96孔板以0.1%凝胶进行覆盖而使用的。并且，接种的细胞凝聚物的量为每一孔当中为30个。将在96孔板中接种的细胞凝聚物在5%CO2恒温箱内37℃培养2天后，一半的孔中添加异丙肾上腺素（100μM）或CL316,243（100nM），进而在5%CO2恒温箱内37℃培养4小时后，使用XF96海马生物能量测定仪(海马生物科学公司,比勒利卡，MA)测定了每分钟的氧消耗量（OCR）。
结果，如图12所示，在未分化人ES细胞（图12A左）、未分化人iPS细胞（图12B左）中未确认到伴随给药CL316,243的OCR值的变化，而源自人ES细胞的褐色脂肪细胞（图12A右）和源自人iPS细胞的褐色脂肪细胞（图12B右）中，确认到了依存于给药CL316,243，OCR值的显著升高。同样的结果在异丙肾上腺素刺激中也得到了确认。并且，从人间叶系干细胞（MSC）制备的白色脂肪细胞中，未确认到伴随CL316,243给药的OCR值的变化（图12C），在异丙肾上腺素给药中也相同。
[实施例9]从人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞制备的褐色脂肪细胞的从血中去除中性脂肪（Triglyceride;TG）效果的确认：
首先，最先对空腹时的血中TG的除去效果进行验证。具体而言，通过实施例5记载的方法，从人ES细胞（hES-3细胞株）制备褐色脂肪细胞。将该源自人ES细胞的褐色脂肪细胞（1×106个）移植于6周龄的小鼠（ICR系统）的皮下（背部）。绝食16小时后给药异丙肾上腺素(30μmol/kg)，进而2小时后从外侧足根静脉采样少量的血液样品(～5μl)，使用AccutrendPlus(注册商标)(豪夫迈-罗氏公司（F.Hoffmann-La Roche,Ltd.），巴塞尔，瑞士)测定了TG值（mM/L）。并且，作为阴性对照使用未分化人ES细胞（KhES-3株）。并且，作为阳性对照使用从人间叶系干细胞(mesenchymalstem cells;MSC,龙沙集团，巴塞尔，瑞士)用脂肪细胞分化诱导试剂盒（hMSC Differentiation BulletKitTM，Adipogenic,龙沙集团）制备的白色脂肪细胞(WA)进行实验。
结果，如图13A所示，确认到了通过源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的移植，使空腹时的血中TG值显著下降。且，源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的TG值的下降效果，比源自人MSC的白色脂肪细胞的该效果还显著。
接着，对经口脂肪负载后的血中TG的除去效果进行验证。具体而言，按照实施例5记载的方法，从人iPS细胞（SeV-iPS细胞株）制备褐色脂肪细胞。将该源自人iPS细胞褐色脂肪细胞（1×106个）移植于6周龄的小鼠（ICR系统）的皮下（背部）。绝食16小时后，给药异丙肾上腺素(15μmol/kg)，2小时后将橄榄油（200μl）用探针经口给药。异丙肾上腺素给药以后，每2小时从外侧足根静脉采样少量的血液样品(～5μl)，通过Accutrend Plus(注册商标)(豪夫迈-罗氏公司)测定TG值（mM/L）。作为阴性对照移植未分化人iPS细胞（SeV-iPS株）（1×106个），进行同样的实验。
结果，如图13B所示，确认到了通过源自人iPS细胞的褐色脂肪细胞的移植，显著抑制橄榄油负载后的血中TG值的上升。
由此，表明在源自人ES细胞的褐色脂肪细胞和源自人iPS细胞的褐色脂肪细胞中有除去血中TG的作用，确认到了其在生物体内发挥脂质代谢改善效果。
其中，作为这样的脂质代谢改善效果的基础可认为是源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞直接吸入血中TG的可能性、源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞所分泌的脂肪因子作用于其他脏器（肝脏、骨骼肌、白色脂肪细胞等）改善了脂质代谢的可能性或这两种可能性。
[实施例10]从人胚性干（ES）细胞制备的褐色脂肪细胞的糖代谢改善效果的确认：
按照实施例5记载的方法，从KhES-3细胞株制备了褐色脂肪细胞。将该源自人ES细胞的褐色脂肪细胞（1×106个）移植于6周龄的小鼠（ICR系统）的皮下（背部）。绝食16小时后给药异丙肾上腺素(30μmol/kg)，进而在3小时45分钟后使用探针经口给药葡萄糖（2mg/小鼠体重(g)）。在葡萄糖给药前、给药后15分钟、30分钟、60分钟后采血，测定血中葡萄糖浓度（血糖值）（图14A）。并且，作为对照使用从人MSC制备的白色脂肪细胞进行同样的实验。
结果，如图14B所示，确认到了在移植源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的个体中，与移植源自人MSC的白色脂肪细胞的个体相比，空腹血糖值显著下降。并且，如图14C所示，关于葡萄糖负载30分钟后的血糖值，确认到了移植源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的个体中，与移植源自人MSC的白色脂肪细胞的个体相比，血糖值显著下降。
而且，为了验证源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞对伴随肥胖的糖代谢异常的治疗效果，检查了基于源自人MSC的白色脂肪细胞的移植的耐糖能力变差状态是否可通过源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的共同移植而得到改善。如图14D所示，证实了在源自人MSC的白色脂肪细胞的移植个体中上升的葡萄糖负载30分后的血糖值，通过将同等数量（1×106个）的源自人ES细胞的褐色脂肪细胞同时进行移植而显著下降。即，表示源自人ES细胞的褐色脂肪细胞，对源自人MSC的白色脂肪细胞引起的耐糖能力异常即肥胖状态中的糖代谢异常发挥明显的治疗效果。
如上所述，虽然源自人ES细胞的褐色脂肪细胞和源自人MSC的白色脂肪细胞均确认到了脂肪代谢改善效果，但关于糖代谢，确认到了只有源自人ES细胞的褐色脂肪细胞有改善效果。
其中，作为这样的糖代谢改善效果的基础，可认为是源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞直接吸入血中葡萄糖的可能性、源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞所分泌的脂肪因子作用于其他脏器（肝脏、骨骼肌、白色脂肪细胞、胰岛β细胞等）而改善糖代谢的可能性或这两种的可能性。
[实施例11]从人胚胎干细胞制备的褐色脂肪细胞中的活性氧非产生性的确认：
按照实施例5记载的方法，从KhES-3细胞株分化诱导褐色脂肪细胞。然后，添加200μM作为细胞内活性氧种的探针而通用的2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸酯（DCFDA），通过荧光显微镜观察评价活性氧种的产生情况。并且，作为阳性对照，使用确认了活性氧种的长期产生的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC），进行了同样的实验。
结果，如图15所示，HUVEC中，检测到了因细胞内活性氧种而获得荧光活性的DCFDA的信号，但源自人ES细胞的褐色脂肪细胞中完全没有检测到信号。
由此可确认源自人胚胎干细胞的褐色脂肪细胞因其高的UCP-1表达，不产生活性氧种。该事实强烈地表明在冠状动脉搭桥手术中的脂肪移植疗法中，使用源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞具有安全性和有效性。
[实施例12]从人胚胎干细胞制备的褐色脂肪细胞中的造血基质功能的确认：
按照实施例5记载的方法，使用直径6cm的培养皿，从人ES细胞（KhES-3细胞株）制备了褐色脂肪细胞。然后，通过图16A记载的方法评价源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的造血支持能力。具体而言，将源自人ES细胞的褐色脂肪细胞通过γ射线照射（40Gy）停止增殖，进而将培养基更换为含10%胎牛血清的RPMI1640培养基（重组子·细胞因子均未添加）后，将6×105个人脐带血CD34阳性细胞（造血干/前体细胞）在源自人ES细胞的褐色脂肪细胞上进行培养。7天后回收悬浮细胞，以生理食盐水（生理盐水）清洗1次后，制备2×105个细胞/10μl（生理盐水）的细胞悬浮液，移植于6周龄的雌非肥胖型糖尿病/重症综合性免疫缺陷(NOD/SCID)/γcnull(NOG)小鼠的大腿骨骨髓内。其中，骨髓内细胞移植（intra-bone marrow transplantation）是按照通用的方法进行的（详细可参照非专利文献8等）。移植后，在6周、8周、12周后使小鼠安乐死，从骨髓、脾脏、胸腺回收造血细胞，使用人特异性CD45抗体（泛白血球标记）、人特异性CD33抗体（骨髓系细胞标记）、人特异性CD19抗体（B细胞标记）、人特异性CD3抗体（T细胞标记），通过流式细胞仪计算嵌合率（小鼠个体内的人血球的阳性率）。并且，作为对照，还进行了不培养人脐带血CD34阳性细胞而直接进行移植的实验（下面，记载为直接移植）。
结果，确认到了1）脾脏中的人CD45阳性细胞的阳性率，在与源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的共同培养组中，与直接移植组相比显著增加（图16B）；2）脾脏中的人CD33阳性细胞的阳性率，在与源自人ES细胞的褐色脂肪细胞的共同培养组中，与直接移植组相比显著增加（图16C）。这表明源自人ES细胞的褐色脂肪细胞作为支持骨髓系造血前体细胞（顆粒球、巨噬细胞的前体细胞）的增殖和分化的基质发挥功能。
上述见解从对源自人ES细胞的褐色脂肪细胞中的细胞因子基因的表达的调查结果也得到了验证。如图16D所示，源自人ES细胞的褐色脂肪细胞中表达多种类的造血性细胞因子（促血小板生成素;TPO，IL6，IL3，粒细胞集落刺激因子；G-CSF，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子;GM-CSF，红细胞生成素;EPO），但源自人MSC的白色脂肪细胞中仅表达IL6等有限的细胞因子。而且，如图16E所示，确认到了源自人ES细胞的褐色脂肪细胞中的这些细胞因子（TPO,IL6,IL3,G-CSF,GM-CSF,EPO）的表达量，通过用作为褐色脂肪细胞兴奋剂的异丙肾上腺素进行处理来增加。
而且，对于作为抗癌剂给药时重大副作用的骨髓抑制，调查了褐色脂肪细胞兴奋剂是否发挥缓和效果。具体而言，对10周龄的小鼠（雄、ICR系统），以100mg/kg的用量给药作为抗癌剂的5-氟尿嘧啶(5-FU)，3～6天后给药异丙肾上腺素（30μmol/kg）或生理盐水，经时地从大腿骨回收骨髓细胞并计量细胞数。结果，如图16F所示，5-FU给药3天后骨髓抑制成为最大，而给药作为褐色脂肪细胞兴奋剂的异丙肾上腺素（ISO）的小鼠中，5-FU给药7天后的骨髓细胞数显著上升（P=0.032）。即，表明褐色脂肪细胞兴奋剂可缓和伴随抗癌剂给药的骨髓抑制，加速从骨髓抑制的恢复。
在以往的有关造血支持细胞的研究中，仅以造血干细胞的壁龛(niche)（是有助于使细胞周期止于G0期的细胞集团，由未成熟成骨细胞、肝窦内皮细胞构成）为对象，并未注意有助于“定向为特定系列的造血前体细胞”的造血支持的基质细胞。然而，通过本结果，表明褐色脂肪细胞作为骨髓系造血前体细胞的基质发挥功能。这表明对于造血障碍性疾病、为了缩短抗癌剂治疗后的骨髓抑制（感染防御功能的下降而成为败血症等的重症感染的起因）时间的细胞疗法，源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞非常有用。
其中，该造血功能的提高效果，可认为是通过源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞与骨髓系造血前体细胞的直接的细胞间相互作用来获得的可能性、源自人多能干细胞的褐色脂肪细胞所分泌的脂肪因子间接作用于骨髓系造血前体细胞而提高了造血功能的可能性或这两种可能性。
工业实用性
基于本发明，可稳定地提供至今为止完全没有提供方法的人褐色脂肪细胞，可提供用于对人体中的褐色脂肪细胞的产生、分化、脱分化等解析的研究工具，以及对肥胖、胰岛素抵抗性、高脂血症等的细胞疗法工具，对冠状动脉搭桥手术的成效提高的移植材料，乃至对造血障碍疾病、抗癌剂给药后的骨髓抑制的细胞疗法工具。并且，可提供对于以肥胖、胰岛素抵抗性、高脂血症，冠状动脉搭桥手术的成效提高，对造血障害疾病、抗癌剂给药后的骨髓抑制的新型内科疗法的开发为目的的、用于探索褐色脂肪细胞特异性脂肪因子的研究工具。
基于本发明的褐色脂肪细胞的起始材料之一的人ES细胞、人iPS细胞等，具有无限增殖能力，因此以工业级别进行稳定地生产极其容易。并且，以2周左右就可从人多能干细胞制备褐色脂肪细胞，也可根据需要进行提供。并且，该褐色脂肪细胞的制备技术仅使用通用的细胞培养设备，所以在全世界任何国家和地区均能实施，可开展为巨大工厂设备产业，极为实用，产业上的利用价值高。
Figure IDA0000402432010000011
Figure IDA0000402432010000021
Figure IDA0000402432010000031
Figure IDA0000402432010000041
Figure IDA0000402432010000061

Claims (20)

1.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法，其是使用多能干细胞制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于，
通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞形成细胞凝聚物，通过包括工序(B)的方法，由细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序，
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
2.一种源自多能干细胞的细胞凝聚物的制造方法，其是使用多能干细胞制造细胞凝聚物的方法，其特征在于，
通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞得到细胞凝聚物；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序。
3.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法，其是使用源自多能干细胞的细胞凝聚物制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于，
通过包括工序(B)的方法，由源自多能干细胞的细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞；
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，工序(A)中使用的造血性细胞因子为BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2中的任一种。
5.如权利要求1或3所述的方法，其中，工序(B)中使用的造血性细胞因子为BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2中的任一种。
6.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，多能干细胞使用ES细胞或iPS细胞。
7.如权利要求6所述的制造方法，其中，iPS细胞使用通过仙台病毒载体建立的iPS细胞。
8.如权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，多能干细胞使用人多能干细胞。
9.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞，其是使用多能干细胞制造的褐色脂肪细胞，其特征在于，
其是通过包括工序(A)、(B)的方法得到的；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序，
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
10.一种源自多能干细胞的细胞凝聚物，其是使用多能干细胞制造的细胞凝聚物，其特征在于，
是通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞得到的；
(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序。
11.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞，其是使用源自多能干细胞的细胞凝聚物制造的褐色脂肪细胞，其特征在于，
其是通过包括工序(B)的方法，由细胞凝聚物得到的；
(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
12.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞，其是使用多能干细胞制造的褐色脂肪细胞，其特征在于，
至少在诱导基因UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3的基因表达的同时，具有多房性脂肪滴。
13.如权利要求9～12中任一项所述的源自多能干细胞的细胞凝聚物或源自多能干细胞的褐色脂肪细胞，其中，多能干细胞为ES细胞或iPS细胞。
14.如权利要求9～13中任一项所述的源自多能干细胞的细胞凝聚物或源自多能干细胞的褐色脂肪细胞，其中，多能干细胞为人多能干细胞。
15.一种细胞疗法，其是用于预防或治疗肥胖的细胞疗法，其特征在于，移植权利要求9、11～14中任一项所述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
16.一种细胞疗法，其是用于改善胰岛素抵抗性，或预防或治疗糖尿病的细胞疗法，其特征在于，移植权利要求9、11～14中任一项所述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
17.一种细胞疗法，其是用于预防或治疗高脂血症的细胞疗法，其特征在于，移植权利要求9、11～14中任一项所述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
18.一种细胞疗法，其是用于制备冠状动脉侧支循环的手术的细胞疗法，其特征在于，移植权利要求9、11～14中任一项所述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
19.一种细胞疗法，其是用于促进造血的细胞疗法，其特征在于，移植权利要求9、11～14中任一项所述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞。
20.一种内科疗法，其是与预防或治疗肥胖、改善胰岛素抵抗性、预防或治疗糖尿病、预防或治疗高脂血症、用于促进造血的治疗、制备冠状动脉的侧支循环的手术中的任一个并用的内科疗法，其特征在于，
给药权利要求9、11～14中任一项所述的源自多能干细胞的褐色脂肪细胞所分泌的物质。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255748A (zh) * 2014-02-24 2016-12-21 释放能量医药股份有限公司 诱导人褐色脂肪细胞祖细胞分化的方法和组合物
CN106574248A (zh) * 2014-08-19 2017-04-19 细胞动力国际有限公司 由源自多能干细胞的细胞形成的神经网络
CN110484566A (zh) * 2019-08-29 2019-11-22 中国人民解放军第四军医大学 一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用
US11419916B2 (en) 2012-09-11 2022-08-23 Energesis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inducing differentiation of human brown adipocyte progenitors

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6285861B2 (ja) * 2012-07-12 2018-02-28 京都府公立大学法人 褐色脂肪細胞及びその調製方法
CA2917674A1 (en) * 2012-08-10 2014-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Injectable brown adipose microtissues for treatment and prevention of obesity and diabetes
KR101542850B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 지방세포로 분화시키는 방법
FR3024462A1 (fr) * 2014-07-29 2016-02-05 Univ Pierre Et Marie Curie Paris 6 Procede de production in vitro de progeniteurs adipocytaires et d'adipocytes
WO2017009263A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Etablissement Francais Du Sang Method for obtaining human brown/beige adipocytes
KR20200105664A (ko) 2017-12-29 2020-09-08 아나제네시스 바이오테크놀로지스 에스.에이.에스. Bap 또는 ba 세포를 제조하는 방법
US20210177909A1 (en) * 2018-08-14 2021-06-17 National Center For Global Health And Medicine Supernatant of brown adipocytes, method for preparing same and utilization thereof
JP7519700B2 (ja) * 2019-04-29 2024-07-22 バイオリストーラティブ セラピーズ， インコーポレイテッド 天然に存在しない三次元（３ｄ）褐色脂肪由来幹細胞凝集物、およびこれを生成し、使用する方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003009854A (ja) * 2001-04-09 2003-01-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd エンブリオイドボディ形成方法及びその用途
WO2009148170A1 (ja) * 2008-06-06 2009-12-10 独立行政法人理化学研究所 幹細胞の培養方法
WO2010008054A1 (ja) * 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
JP2010131373A (ja) * 2008-10-30 2010-06-17 Japan Health Science Foundation 血管平滑筋細胞増殖を抑制する血管狭窄部挿入用基材
JP2010130968A (ja) * 2008-12-05 2010-06-17 Nippon Menaade Keshohin Kk 幹細胞の褐色脂肪細胞への分化誘導方法
WO2010140698A1 (ja) * 2009-06-03 2010-12-09 国立大学法人東北大学 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
JP2010140698A (ja) * 2008-12-10 2010-06-24 Chugoku Electric Power Co Inc:The 配線盤端子の絶縁カバー
WO2011126790A1 (en) * 2010-03-29 2011-10-13 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003009854A (ja) * 2001-04-09 2003-01-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd エンブリオイドボディ形成方法及びその用途
WO2009148170A1 (ja) * 2008-06-06 2009-12-10 独立行政法人理化学研究所 幹細胞の培養方法
WO2010008054A1 (ja) * 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
JP2010131373A (ja) * 2008-10-30 2010-06-17 Japan Health Science Foundation 血管平滑筋細胞増殖を抑制する血管狭窄部挿入用基材
JP2010130968A (ja) * 2008-12-05 2010-06-17 Nippon Menaade Keshohin Kk 幹細胞の褐色脂肪細胞への分化誘導方法
WO2010140698A1 (ja) * 2009-06-03 2010-12-09 国立大学法人東北大学 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11419916B2 (en) 2012-09-11 2022-08-23 Energesis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inducing differentiation of human brown adipocyte progenitors
CN106255748A (zh) * 2014-02-24 2016-12-21 释放能量医药股份有限公司 诱导人褐色脂肪细胞祖细胞分化的方法和组合物
CN106574248A (zh) * 2014-08-19 2017-04-19 细胞动力国际有限公司 由源自多能干细胞的细胞形成的神经网络
CN110484566A (zh) * 2019-08-29 2019-11-22 中国人民解放军第四军医大学 一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用

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