JP2003009854A - エンブリオイドボディ形成方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血清培地、無血清培地のいずれを用いても、
また胚性幹細胞の密度が比較的低くとも、高効率で安定
的にエンブリオイドボディを形成できる、胚性幹細胞か
らエンブリオイドボディを形成する方法を提供するこ
と、さらに細胞及び臓器移植医療に利用可能である機能
性細胞を胚性幹細胞から分化誘導する方法、該方法のた
めに用いる培地及び分化誘導剤、該分化誘導した細胞、
並びにこれらの利用方法を提供すること。 【解決手段】 胚性幹細胞を、特定の因子を含む培地を
用いて培養する工程を含むことを特徴とする、胚性幹細
胞からエンブリオイドボディを形成する方法、該方法の
ために用いるための培地及び分化誘導剤、該方法を用い
た分化細胞の誘導方法、該分化誘導した細胞、並びにそ
れらの利用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、胚性幹細胞からエ
ンブリオイドボディを形成する方法、及び／又は胚性幹
細胞から機能性細胞を分化誘導する方法に関する。さら
に詳細には、本発明は、血清培地、無血清培地のいずれ
を用いても、また胚性幹細胞の密度が比較的低くとも、
高効率で安定的にエンブリオイドボディを形成する方
法、さらには分化細胞を誘導可能な胚性幹細胞の培養方
法、該方法のために用いる培地及び分化誘導剤、該分化
誘導した細胞、並びにそれらの利用法に関する。

【０００２】

【従来の技術】胚性幹細胞（embryonic stem cell）と
は、インビトロ（in vitro）において培養することが可
能で、かつ、他の個体の着床以前の胚、例えば、胚盤胞
腔中に注入すると生殖細胞をも含むすべての細胞に分化
できる細胞である。

【０００３】胚性幹細胞は胚幹細胞あるいはＥＳ細胞と
も呼ばれ、胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である
内部細胞塊を構成している細胞を培養に移し、頻繁に細
胞塊の解離と継代を繰り返すことで樹立できる。この細
胞は正常核型を維持しながらほぼ無限に増殖と継代を繰
り返すことが可能であり、内部細胞塊と同じようにあら
ゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を保つ
ことが知られている。以下、本明細書においてＥＳ細胞
と記載した場合は、胚性幹細胞のうち、胚盤胞の内部細
胞塊より樹立された狭義の胚性幹細胞をさすものとす
る。

【０００４】胚盤胞の内部細胞塊を通常の初代培養のよ
うに培養すると、ほとんどの場合、直に上皮様細胞に分
化してしまう。しかし、胎児から調整した初代繊維芽細
胞やＳＩＨＭマウス由来のＳＴＯ細胞などをフィーダー
細胞として用い（Gene Targeting, A Practical Approa
ch, IRL Press at Oxford University Press (1993);バ
イオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング,
ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995)）、
フィーダー細胞の上で適切な細胞密度を保ち、頻繁に培
養液を交換しながら細胞の解離と継代を繰り返すことで
未分化幹細胞の性質を保持したまま未分化状態を維持す
ることが可能となる（Manipulating theMouse Embryo A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press (1994)）。ＥＳ細胞の未分化状
態を維持する因子として白血病阻害因子（leukaemia in
hibitory factor; 以下ＬＩＦとも略す）が同定されて
おり（A. G. Smith and M. L. Hooper; Dev. Biol., 12
1, 1, 1987; A. G. Smithら; Nature, 336, 688, 1988;
P. D. Rathjenら; Genes Dev., 4, 2308, 1990）、培
養液中にＬＩＦを添加することによって、フィーダー細
胞を用いなくても全能性をもつＥＳ細胞を単離し培養す
ることが可能なことが報告されている（J.Nicholsら; D
evelopment, 110, 1341, 1990; S. Peaseら; Dev. Bio
l., 141, 344, 1990）。

【０００５】ＥＳ細胞を、ＥＳ細胞と同系統の動物の皮
下などに移植すると、様々な組織が混ざり合った奇形腫
が形成されることが知られている（Manipulating the M
ouseEmbryo A Laboratory Manual, Second Edition, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press (1994)）。しかし
ながら、インビトロの培養において、ＥＳ細胞を凝集さ
せ、いったん擬似胚状態にしたエンブリオイドボディと
呼ばれる細胞塊（embryoid body; 以下、ＥＢとも略
す）を形成させることによって分化を誘導し、内胚葉細
胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟
骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細
胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイ
ト、脂肪細胞など様々な各種分化細胞を出現させること
が可能であることが報告されている（G. M. Keller; Cu
rr. Opin. Cell Biol., 7, 862,1995; P. D. Rathjen
ら; Reprod. Fertil. Dev., 10, 31, 1998; C. Daniら;
J.Cell Sci., 110, 1279, 1997; S.-H. Leeら; Nat. B
iotechnol., 18, 675, 2000）。

【０００６】通常、ＥＳ細胞からのＥＢの形成は、ＬＩ
Ｆおよび１０〜２０％のウシ胎児血清を含む培地中で未
分化状態で維持増殖させたＥＳ細胞を、トリプシン−Ｅ
ＤＴＡ処理等でばらばらにした後、培養ディッシュに付
着しないように、何もコートしていないプラスチックデ
ィッシュ上で、ＬＩＦを除いた１０〜２０％のウシ胎児
血清を含む培地を用いて培養することにより行われてい
る。ＥＢの形成は培地中に含まれる血清のロットによっ
て左右されることが経験的に知られており、血清中の何
らかの因子がＥＳ細胞からのＥＢの形成に影響を与えて
いることが示唆されている。このような因子の同定は未
だなされておらず、無血清培養状態でＥＳ細胞の分化増
殖を維持し、効率的にＥＢを形成させることは難しい。
ジョハンソン（Johansson）らは蛋白成分としてインス
リン、トランスフェリン、アルブミンを含有する無血清
培地を用いてＥＢの形成を試み、５，０００個／ｍＬの
細胞濃度で細菌培養用の培養器にＥＳ細胞を播種した結
果、約１０〜２０個のＥＢの形成が観察されるが７２時
間以内に死滅してしまうことを報告している（B. M. Jo
hansson & M. V. Wiles; Mol. Cell. Biol., 15, 141,
1995）。この際、極微量のＬＩＦの添加は生存率の延長
に有効だが長期の維持は難しい。また、彼らは、無血清
培地を用いてＥＢを形成させ分化を誘導する場合には播
種細胞密度が重要であり、10,000個／ｍｌ以上の細胞密
度ではＥＳ細胞の分化が阻害されることを明らかにして
いる。

【０００７】最近、血清代替物として２０％ノックアウ
トＳＲ（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologie
s）社製）を含有する培地中で、ＥＳ細胞からＥＢを形
成させたとする報告（M. Schuldinerら；Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 97, 11307, 2000）がなされたが、１０
０ｍｍ径のプレートあたり１０⁷個、すなわち約１，０
００，０００個／ｍＬという高密度でＥＳ細胞を使用し
ており、効率的な分化誘導には成功していない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】以上のような背景か
ら、多分化能を保持したまま培養可能な未分化幹細胞か
ら目的とする機能性細胞を選択的に、かつ効率的に分化
誘導するための方法の開発が注目され様々な試みがなさ
れている。またその際、細胞医療の観点から、目的とす
る機能細胞を人為的にコントロールされた環境下、例え
ば、血清を用いない培養条件で誘導する方法の開発が望
まれている。しかしながら、胚性幹細胞を様々な機能性
細胞に分化させる為に重要なステップであるＥＢの形成
のメカニズムには不明な点が多く残されており、血清を
用いない培養状態で効率的にＥＢを誘導する方法は開発
されていない。無血清条件下で効率的に、かつ長期間培
養できるＥＢの形成が可能になれば、あるいは、血清を
用いる場合でも血清のロットに左右されず効率的に、か
つ長期間培養できるＥＢの形成が可能になれば、様々な
機能細胞の分化機構のより詳細な解析及び機能細胞自身
の供給が可能になり、細胞医療や再生医療に有用であ
る。

【０００９】そこで本発明では、上述の観点を踏まえ、
血清培地、無血清培地のいずれを用いても、また胚性幹
細胞の密度が比較的低くとも、高効率で安定的にＥＢを
形成できる、胚性幹細胞からＥＢを形成する方法を提供
すること、さらに、細胞及び臓器移植医療に利用可能で
ある機能性細胞を胚性幹細胞から分化誘導する方法、該
方法のために用いる培地及び分化誘導剤、該分化誘導し
た細胞、並びにこれらの利用方法を提供することを解決
すべき課題とした。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、胚性幹細
胞の分化を引き起こす様々な培養条件を鋭意検討した結
果、無血清培養条件及び／又は血清培養条件で胚性幹細
胞からＥＢを効率的に形成する方法、それを用いた、外
胚葉、中胚葉、内胚葉由来の細胞を分化誘導する効率的
な方法を見出すことに成功し、本発明を完成するに至っ
た。

【００１１】即ち、本発明は、以下の（１）〜（６２）
に関する。 （１） 胚性幹細胞を造血幹細胞増殖因子（stem cell
growth factor）を含む培地を用いて培養する工程を含
むことを特徴とする、胚性幹細胞からエンブリオイドボ
ディを形成する方法。 （２） 該培地が血清を含む培地である（１）に記載の
方法。 （３） 該培地がさらに細胞外マトリックス蛋白質を含
む無血清培地である（１）に記載の方法。 （４） 該培地がさらに骨形成因子４（bone morphogen
etic protein 4）を含む培地である（３）に記載の方
法。

【００１２】（５） 胚性幹細胞を骨形成因子４（bone
morphogenetic protein 4）および細胞外マトリックス
蛋白質を含む無血清培地で培養する工程を含むことを特
徴とする、胚性幹細胞からエンブリオイドボディを形成
する方法。 （６） 該培地が白血病阻害因子（leukaemia inhibito
ry factor）を含まない培地である（１）〜（５）のい
ずれか１項に記載の方法。 （７） 細胞外マトリックス蛋白質が以下の（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）からなる群から選
ばれる少なくとも一つの蛋白質である（３）〜（６）の
いずれか１項に記載の方法。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。

【００１３】（８） 細胞外マトリックス蛋白質がフィ
ブロネクチン（fibronectin）である（７）に記載の方
法。 （９） 該培地がさらに以下の（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）、（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも一つ
の蛋白質を含む培地である（１）、（２）および（６）
のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。

【００１４】（１０） 該培地がさらに以下の（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）からなる群から選ばれる少なく
とも一つの蛋白質を含む培地である（３）、（４）、
（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。 （１１） 該培地が、細胞外マトリックス蛋白質、造血
幹細胞増殖因子（stemcell growth factor）および造血
幹細胞因子（stem cell factor）を含む培地である（１
０）に記載の方法。 （１２） 該培地が、細胞外マトリックス蛋白質、造血
幹細胞増殖因子（stemcell growth factor）、ｆｌｋ−
２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 ligand）、インタ
ーロイキン３（interleukin 3）およびトロンボポイエ
チン（thrombopoietin）を含む培地である（１０）に記
載の方法。

【００１５】（１３） 細胞外マトリックス蛋白質が以
下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）から
なる群から選ばれる少なくとも一つの蛋白質である（１
０）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。 （１４） 細胞外マトリックス蛋白質がフィブロネクチ
ンである（１３）に記載の方法。

【００１６】（１５） 該培地が無血清培地であり、胚
性幹細胞を播種する工程で、播種する細胞の濃度が２５
００細胞／ｍＬ以上の細胞濃度であることを特徴とする
（７）または（８）に記載の方法。 （１６） 該培地が無血清培地であり、胚性幹細胞を播
種する工程で、播種する細胞の濃度が２０００細胞／ｍ
Ｌ以上の細胞濃度であることを特徴とする（１０）〜
（１４）のいずれか１項に記載の方法。 （１７） 該培地が無血清培地であり、胚性幹細胞を播
種する工程で、播種する細胞の濃度が１５００細胞／ｍ
Ｌ以上の細胞濃度であることを特徴とする（１０）〜
（１４）のいずれか１項に記載の方法。 （１８） 該培地が無血清培地であり、胚性幹細胞を４
日間以上培養する工程を含むことを特徴とする、（３）
〜（８）、（１０）〜（１７）のいずれか１項に記載の
方法。

【００１７】（１９） （１）〜（１８）のいずれか１
項に記載の方法を工程として含む胚性幹細胞より分化細
胞を誘導する方法。 （２０） 分化細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）及び
（ｃ）からなる群から選ばれる細胞である、（１９）に
記載の方法。 （ａ）外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞； （ｂ）中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞； （ｃ）内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞。 （２１） 外胚葉由来の細胞が神経組織、松果体、副腎
髄質、色素体および表皮組織からなる群から選ばれる部
位を構成する細胞である、（２０）に記載の方法。 （２２） 中胚葉由来の細胞が筋組織、結合組織、骨組
織、軟骨組織、循環器、血液組織、真皮、泌尿器および
生殖器からなる群から選ばれる部位を構成する細胞であ
る、（２０）に記載の方法。 （２３） 内胚葉由来の細胞が、消化管、呼吸器、胸
腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、肝臓および膵臓か
らなる群から選ばれる部位を構成する細胞である、（２
０）に記載の方法。

【００１８】（２４） さらに以下の（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、
（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）及び（ｒ）からなる群から選ば
れる因子を単独あるいは複数含む培地を用いて培養する
ことを特徴とする、（１９）〜（２３）のいずれか１項
に記載の方法。 （ａ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｂ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。 （ｃ）血管内皮増殖因子（vascular endothelial growt
h factor）； （ｄ）エリスロポイエチン（erythropoietin）； （ｅ）インターロイキン６（interleukin 6）； （ｆ）インターロイキン１１（interleukin 11）； （ｇ）アクチビンＡ（activin A）； （ｈ）骨形成因子４（bone morphogenetic protein
4）； （ｉ）塩基性繊維芽細胞増殖因子（basic fibroblast g
rowth factor）； （ｊ）インターロイキン１（interleukin 1）； （ｋ）マクロファージコロニー刺激因子（macrophage c
olony-stimulating factor）； （ｌ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granul
ocyte-macrophage colony- stimulating factor）； （ｍ）インターロイキン７（interleukin 7）； （ｎ）インターロイキン２（interleukin 2）； （ｏ）トランスフォーミング増殖因子β（transforming
growth factor-β）； （ｐ）神経成長因子（nerve growth factor）； （ｑ）レチノイン酸（retinoic acid）； （ｒ）ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）。

【００１９】（２５） （１）〜（１８）に記載の方法
で形成したエンブリオイドボディに由来する細胞を、血
清、インターロイキン３（interleukin 3）、エリスロ
ポイエチン（erythropoietin）、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony- s
timulating factor）およびトロンボポイエチン（throm
bopoietin）を含む培地を用いて培養することを特徴と
する、（２２）に記載の方法。 （２６） （１）〜（１８）に記載の方法で形成したエ
ンブリオイドボディに由来する細胞を、血清およびイン
ターロイキン７（interleukin 7）を含む培地を用いて
培養することを特徴とする、（２２）に記載の方法。 （２７） （１）〜（１８）に記載の方法で形成したエ
ンブリオイドボディに由来する細胞を、血清および血管
内皮増殖因子（vascular endothelial growthfactor）
を含む培地を用いて培養することを特徴とする、（２
２）に記載の方法。

【００２０】（２８） （１）〜（１８）に記載の方法
で形成したエンブリオイドボディに由来する細胞を、血
清、インターロイキン３（interleukin 3）、エリスロ
ポイエチン（erythropoietin）、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony- s
timulating factor）およびトロンボポイエチン（throm
bopoietin）を含む培地を用いて培養することを特徴と
する、胚性幹細胞より造血幹細胞を誘導する方法。 （２９） （１）〜（１８）に記載の方法で形成したエ
ンブリオイドボディに由来する細胞を、血清およびイン
ターロイキン７（interleukin 7）を含む培地を用いて
培養することを特徴とする、胚性幹細胞よりＢ細胞を誘
導する方法。 （３０） （１）〜（１８）に記載の方法で形成したエ
ンブリオイドボディに由来する細胞を、血清および血管
内皮増殖因子（vascular endothelial growthfactor）
を含む培地を用いて培養することを特徴とする、胚性幹
細胞より血管内皮細胞を誘導する方法。 （３１） 胚性幹細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）及び
（ｃ）からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜
（３０）のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細
胞； （ｂ）体細胞の核を移植することによって作製された初
期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞； （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の胚性幹細胞の染色体上の遺伝
子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞。

【００２１】（３２） （１）〜（４）、（６）〜（１
８）のいずれか１項に記載の方法で用いる、造血幹細胞
増殖因子（stem cell growth factor）を含む胚性幹細
胞を培養するための培地。 （３３） 該培地がさらに血清を含む（３２）に記載の
培地。 （３４） 該培地がさらに細胞外マトリックス蛋白質を
含む無血清培地である（３２）に記載の培地。 （３５） 該培地がさらに骨形成因子４（bone morphog
enetic protein 4）を含む（３４）に記載の培地。 （３６） （５）記載の方法で用いる、骨形成因子４
（bone morphogenetic protein 4）および細胞外マトリ
ックス蛋白質を含む無血清培地である胚性幹細胞を培養
するための培地。 （３７） 該培地が白血病阻害因子（leukaemia inhibi
tory factor）を含まない培地である（３２）〜（３
６）のいずれか１項に記載の培地。

【００２２】（３８） 細胞外マトリックス蛋白質が以
下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）からなる
群から選ばれる少なくとも一つの蛋白質である（３４）
〜（３７）のいずれか１項に記載の培地。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。 （３９） 細胞外マトリックス蛋白質がフィブロネクチ
ン（fibronectin）である（３８）に記載の培地。 （４０） 該培地がさらに以下の（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）、（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも一つ
の蛋白質を含む培地である（３２）、（３３）または
（３７）に記載の培地。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。

【００２３】（４１） 該培地が、細胞外マトリックス
蛋白質、造血幹細胞増殖因子（stemcell growth facto
r）および以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）から
なる群から選ばれる少なくとも一つの蛋白質を含む培地
である（３４）、（３５）および（３７）〜（３９）の
いずれか１項に記載の培地。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。 （４２） 該培地が、細胞外マトリックス蛋白質、造血
幹細胞増殖因子（stemcell growth factor）および造血
幹細胞因子（stem cell factor）を含む培地である（４
１）に記載の培地。 （４３） 該培地が、細胞外マトリックス蛋白質、造血
幹細胞増殖因子（stemcell growth factor）、ｆｌｋ−
２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 ligand）、インタ
ーロイキン３（interleukin 3）およびトロンボポイエ
チン（thrombopoietin）を含む培地である（４１）に記
載の培地。 （４４） 細胞外マトリックス蛋白質が以下の（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）からなる群から選ばれ
る少なくとも一つの蛋白質である（４１）〜（４３）に
記載の培地。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。 （４５） 細胞外マトリックス蛋白質がフィブロネクチ
ンである（４４）に記載の培地。

【００２４】（４６） 造血幹細胞増殖因子（stem cel
l growth factor）を有効成分として含む胚性幹細胞か
ら分化細胞を誘導するための分化誘導剤。 （４７） さらに以下の（ａ）〜（ｙ）からなる群から
選ばれる少なくとも一つの因子を有効成分として含む
（４６）に記載の分化誘導剤。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）; （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）； （ｅ）血管内皮増殖因子（vascular endothelial growt
h factor）； （ｆ）エリスロポイエチン（erythropoietin）； （ｇ）インターロイキン６（interleukin 6）； （ｈ）インターロイキン１１（interleukin 11）； （ｉ）アクチビンＡ（activin A）； （ｊ）骨形成因子４（bone morphogenetic protein
4）； （ｋ）塩基性繊維芽細胞増殖因子（basic fibroblast g
rowth factor）； （ｌ）インターロイキン１（interleukin 1）； （ｍ）マクロファージコロニー刺激因子（macrophage c
olony-stimulating factor）； （ｎ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granul
ocyte-macrophage colony- stimulating factor）； （ｏ）インターロイキン７（interleukin 7）； （ｐ）インターロイキン２（interleukin 2）； （ｑ）トランスフォーミング増殖因子β（transforming
growth factor-β）； （ｒ）神経成長因子（nerve growth factor）； （ｓ）レチノイン酸（retinoic acid）； （ｔ）ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）； （ｕ）ゼラチン（gelatin）; （ｖ）ラミニン（laminin）; （ｗ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｘ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｙ）フィブロネクチン（fibronectin）。

【００２５】（４８） （１）〜（１８）のいずれか１
項に記載の方法により得られるエンブリオイドボディ。 （４９） （１９）〜（３１）のいずれか１項に記載の
方法を用いることにより誘導される分化細胞。

【００２６】（５０） 被験物質存在下および該被験物
質非存在下で、（１）〜（３１）のいずれか１項に記載
の方法を用い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下
での胚性幹細胞から分化細胞までの分化過程を比較する
ことを特徴とする、胚性幹細胞から分化細胞までの分化
過程における調節に関する物質の評価方法。 （５１） 被験物質存在下および該被験物質非存在下
で、（１）〜（３１）のいずれか１項に記載の方法を用
い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での胚性幹
細胞から分化細胞までの分化過程を比較することを特徴
とする、胚性幹細胞から分化細胞までの分化過程におけ
る調節に関する物質のスクリーニング方法。 （５２） 被験物質存在下および該被験物質非存在下
で、（４９）に記載の細胞を培養し、該被験物質存在下
と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から分化した細胞
の機能を比較することを特徴とする、該分化細胞の機能
の調節に関連する物質の評価方法。 （５３） 被験物質存在下および該被験物質非存在下
で、（４９）に記載の細胞を培養し、該被験物質存在下
と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から分化した細胞
の機能を比較することを特徴とする、該分化細胞の機能
の調節に関連する物質のスクリーニング方法。

【００２７】（５４） （４６）または（４７）に記載
の分化誘導剤を含む医薬。 （５５） （４９）に記載の分化細胞を含む医薬。 （５６） 以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群
から選ばれる細胞の障害に基づく疾患の診断、予防およ
び／または治療のための医薬である、（５４）または
（５５）に記載の医薬。 （ａ）外胚葉由来の細胞； （ｂ）中胚葉由来の細胞； （ｃ）内胚葉由来の細胞 。 （５７） 外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患が、神
経組織、松果体、副腎髄質、色素細胞および表皮組織か
らなる群から選ばれる部位を構成する細胞の障害に基づ
く疾患である、（５６）に記載の医薬。 （５８） 中胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患が、筋
組織、結合組織、骨組織、軟骨組織、循環器、血液組
織、真皮、泌尿器および生殖器からなる群から選ばれる
部位を構成する細胞の障害に基づく疾患である、（５
６）に記載の医薬。 （５９） 内胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患が、消
化管、呼吸器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、
肝臓および膵臓からなる群から選ばれる部位を構成する
細胞の障害に基づく疾患である、（５６）に記載の医
薬。

【００２８】（６０） 神経組織を構成する細胞の障害
に基づく疾患がアルツハイマー病、ハンチントン舞踏
病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、ダウン
症候群、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経外傷
または神経毒物の障害に起因する疾患であり、松果体を
構成する細胞の障害に基づく疾患が松果体症または松果
体機能不全であり、副腎髄質を構成する細胞の障害に基
づく疾患が副腎機能欠如症または副腎炎であり、色素細
胞の障害に基づく疾患が色素異常症または色素過剰症で
あり、表皮組織を構成する細胞の障害に基づく疾患が火
傷、外傷、創傷治癒、床擦れ、皮膚炎、表皮症または乾
せんである、（５７）に記載の医薬。

【００２９】（６１） 筋組織を構成する細胞の障害に
基づく疾患が筋肉不全症、筋無緊張症または重症筋無力
症であり、結合組織を構成する細胞の障害に基づく疾患
が結合組織病、結合組織炎または糖尿病であり、骨組織
を構成する細胞の障害に基づく疾患が骨粗鬆症、骨関節
炎、骨形成異常症、骨硬化症、骨髄炎または骨形成不全
症であり、軟骨組織を構成する細胞の障害に基づく疾患
が変形関節炎、慢性関節リウマチ、軟骨形成不全症、軟
骨発育不全症または軟骨形成異常症であり、循環器を構
成する細胞の障害に基づく疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末
梢血管閉鎖症、ＳＬＥ、狭心症、高血圧症、高脂血症、
糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、再狭
窄、血栓、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ
血または脈絡膜循環障害であり、血液組織を構成する細
胞の障害に基づく疾患がＨＩＶ感染、敗血症、移植片―
対―宿主疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、
気道過敏または自己免疫疾患であり、真皮を構成する細
胞の障害に基づく疾患が火傷、外傷、皮膚炎または乾せ
んであり、泌尿器を構成する細胞の障害に基づく疾患が
溶血性尿毒症症候群または腎炎であり、生殖器を構成す
る細胞の障害に基づく疾患が性器発育不全症または性器
発育異常である、（５８）に記載の医薬。

【００３０】（６２） 消化管を構成する細胞の障害に
基づく疾患が胃潰瘍、胃炎または十二指腸潰瘍であり、
呼吸器を構成する細胞の障害に基づく疾患が肺気腫、肺
水腫、肺炎、気管支炎または気管支喘息であり、胸腺を
構成する細胞の障害に基づく疾患が胸腺炎、胸腺リンパ
形成不全症または胸腺機能減退症であり、甲状腺を構成
する細胞の障害に基づく疾患が甲状腺無形成症または甲
状腺機能不全症であり、副甲状腺を構成する細胞の障害
に基づく疾患が副甲状腺機能低下症であり、膀胱を構成
する細胞の障害に基づく疾患が膀胱炎または膀胱破裂で
あり、中耳を構成する細胞の障害に基づく疾患が中耳炎
であり、肝臓を構成する細胞の障害に基づく疾患が肝臓
紫斑病、慢性Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎であり、膵臓を構
成する細胞の障害に基づく疾患が糖尿病である、（５
９）に記載の医薬。

【００３１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様および実
施方法について詳細に説明する。

【００３２】本発明において、胚性幹細胞とは、インビ
トロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成
するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞を
包含する。その例としては、（ａ）：初期胚を培養する
ことによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞が挙げら
れ、具体的には、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立
された細胞であるＥＳ細胞、始原生殖細胞から樹立され
た細胞であるＥＧ細胞（embryonic germ cell）、着床
以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原
始外胚葉）を培養することによって得られる細胞、悪性
奇形腫より樹立された細胞である胚性癌腫細胞（embryo
nal carcinoma cell; 以下ＥＣ細胞とも略す）等が挙げ
られる。本発明における胚性幹細胞としては、上記
（ａ）の胚性幹細胞、（ｂ）体細胞の核を核移植するこ
とによって作製された初期胚を培養することによって樹
立した胚性幹細胞、または（ｃ）（ａ）あるいは（ｂ）
の胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を
用いて改変した胚性幹細胞を包含する。

【００３３】ＥＳ細胞と同様の機能を有するＥＧ細胞お
よびＥＣ細胞について、ＥＳ細胞との関係を以下に説明
する。

【００３４】ＥＧ細胞は、始原生殖細胞を培養する際に
塩基性繊維芽細胞増殖因子（basicfibroblast growth f
actor）を加えることにより出現したＥＳ細胞に類似し
た細胞から樹立された細胞株である（Y. Matsuiら; Cel
l, 70, 841, 1992; J. L. Resnicら; Nature, 359, 55
0, 1992）。このＥＧ細胞は、生殖系列キメラの形成に
寄与できる能力を有しており（C. L. Stewartら; Dev.
Biol., 161, 626, 1994;P. A. Laboskyら; Developmen
t, 120, 3197, 1994）、ＥＳ細胞が有する未分化幹細胞
としての性質を有していることが明らかにされている。
未分化幹細胞と生殖細胞にはかなり共通した性質があ
り、増殖や分化の制御状態変化によって比較的容易に相
互変換できると考えられている。

【００３５】ＥＣ細胞は、悪性奇形腫（teratocarcinom
a）よりＥＳ細胞と同様の多分化能を有する細胞株とし
て樹立された細胞である（M. J. Evans; J. Embryol. E
xp.Morph., 28, 163, 1972）。ＥＣ細胞は、ＥＳ細胞の
マーカーとなる遺伝子を発現していること（E. G. Bern
stineら; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3899,197
3; S. B. Diwan and L. C. Steven; J. Natl. Cancer I
nst., 57, 937, 1976; D. Solter and B. B. Knowles;
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5565, 1978; B. A.
Hoslerら; Mol. Cell. Biol., 9, 5623, 1989; S. C. P
ruitt; Development, 120, 37, 1994）、インビトロに
おいて様々な細胞に分化する能力を有していること（G.
R. Martin and M. J. Evans; Cell, 6, 467, 1975; G.
R. Martin and M. J. Evans; Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 72, 1441, 1975; M. W.McBurney; J. Cell. Phys
iol., 89, 441, 1976）、同系個体への移植において様
々な組織からなる奇形種が形成されること（L. J. Klei
nsmith and G. B. Pierce; Cancer Res., 24, 797, 196
4）、胚盤胞の中に注入すると胎児形成に寄与しキメラ
個体を形成すること（B. Mintz and K. Illmensee; Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3538, 1975; V. E. Pap
aioannouら; Nature, 258, 70, 1975; M.J. Deweyら; P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5564, 1977）、極め
て稀ではあるがＥＣ細胞株の中には生殖系列キメラを作
製する能力を持つものがあること（T. A. Stewart and
B. Mintz; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 19
81）から、ＥＳ細胞が有する未分化幹細胞としての性質
を基本的には有した細胞と考えられている。

【００３６】本発明において、ＥＢとは、胚性幹細胞を
インビトロで培養した場合に観察される、胚性幹細胞が
集合して凝集した細胞塊を意味する。この細胞塊は、通
常、略球形の形態で浮遊状態で出現し、細胞塊を構成す
る個々の胚性幹細胞同士が相互に影響しあうことで、細
胞塊内部で外胚葉、中胚葉、内胚葉系細胞への分化誘導
が引き起こされている。本発明におけるＥＢとしては、
このような胚性幹細胞の分化誘導が引き起こされている
凝集状態の胚性幹細胞の細胞塊を包含する。

【００３７】本発明は、血清培地、無血清培地のいずれ
を用いても、また、胚性幹細胞の密度が比較的低くと
も、高効率で安定的に胚性幹細胞からＥＢを形成する方
法を提供し、さらにはそれを用いた分化細胞を誘導する
方法を提供する。

【００３８】胚性幹細胞については、下記の様々な方法
で得ることができ、例えばフィーダー細胞上で培養する
ことで未分化状態で維持／増殖させることができる。そ
の後、維持／増殖されている胚性幹細胞を本発明のＥＢ
形成方法に付すが、トリプシン等の酵素処理などにより
胚性幹細胞をフィーダー細胞から分離して細胞が凝集し
ていない状態で本発明のＥＢ形成方法に付すことが好ま
しい。

【００３９】本発明のＥＢ形成方法において、造血幹細
胞増殖因子（stem cell growth factor；以下ＳＣＧＦ
とも略す。）を含む培地を用いて培養することにより、
胚性幹細胞の密度が比較的低くとも高効率で安定的に胚
性幹細胞からＥＢを形成することができる。本発明に用
いる培地は、血清培地でも無血清培地でもよい。本発明
のＥＢ形成方法において、特に血清培地を使用する場合
には、ＳＣＧＦを含む培地を使用することにより、血清
のロットに左右されず高効率で安定的にＥＢを形成する
ことが可能となる。さらに、ＳＣＧＦに造血幹細胞因子
（stem cell factor; 以下ＳＣＦとも略す）、ｆｌｋ―
２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 ligand; 以下ＦＬ
とも略す）、インターロイキン３（interleukin 3; 以
下ＩＬ−３とも略す）、トロンボポイエチン（thrombop
oietin; 以下ＴＰＯとも略す）から選ばれる単独あるい
は複数の蛋白質を適宜組み合わせて用いることができ
る。さらに下記の細胞外マトリックス蛋白質を適宜組み
合わせて用いてもよい。

【００４０】本発明のＥＢ形成方法において無血清培地
を使用する場合、基礎培地にＳＣＧＦの他に細胞外マト
リックス蛋白質を加えて培養することが好ましい。細胞
外マトリックス蛋白質を含む培地を使用することによ
り、無血清培養でありながら比較的低い胚性幹細胞密度
の培養でも安定的にＥＢを形成することができる。さら
に骨形成因子４（bone morphogenetic protein 4; 以下
ＢＭＰ−４とも略す）を加えてもよい。細胞外マトリッ
クス蛋白質とは、生体内で細胞と細胞の間を埋める高分
子構造の構成成分となっている蛋白質であるが、本発明
においては、該蛋白質および該蛋白質が変性した蛋白質
も包含する。細胞外マトリックス蛋白質の例としては、
ゼラチン（gelatin）、ラミニン（laminin）、コラーゲ
ンタイプＩ（collagen type I）、コラーゲンタイプＩ
Ｖ（collagen type IV）あるいはフィブロネクチン（fi
bronectin）があげられるが、特にフィブロネクチンが
好ましい。

【００４１】無血清培地を使用する場合、さらにＳＣ
Ｆ、ＦＬ、ＩＬ−３、ＴＰＯから選ばれる少なくとも１
つの蛋白質を添加して用いるのが好ましい。特に（i）
ＳＣＦ、（ii）ＦＬとＩＬ−３とＴＰＯを添加するのが
好ましい。また、ＳＣＧＦを含まない細胞外マトリック
ス蛋白質およびＢＭＰ−４を含む無血清培地でも安定的
にＥＢを形成することができる。なお、細胞外マトリッ
クス蛋白質のみを添加した基礎培地による無血清培養で
もＥＢは形成されるが、このＥＢからは、後述する分化
細胞の誘導を効率的に行うことができない。

【００４２】本発明において、ＳＣＧＦとは、国際公開
ＷＯ９８／０８８６９に造血幹細胞増殖因子として記載
されている因子を意味する。ＳＣＧＦの遺伝子の染色体
上の位置は決定されており１遺伝子であることが明らか
にされているが、２種類のスプライシング形態αとβが
存在することが知られている（H. Mioら; Biochem. Bio
phys. Res. Commun., 249, 124, 1998）。本発明におい
てＳＣＧＦとは、全長型であるスプライシング形態αが
有する活性を有するすべてのスプライシング形態を包含
する。また、この蛋白質において１以上のアミノ酸が欠
失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ増殖因子としての活性を有する蛋白質、並
びにこの蛋白質とアミノ酸配列の相同性が、ＢＬＡＳＴ
（S.F. Altzshulら；J. Mol. Biol., 215, 403, 1990）
やＦＡＳＴＡ（W.R. Pearsonら；Methods Enzymol., 18
3, 63, 1990）等の解析プログラムを用いて計算したと
きに、６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有
し、かつ増殖因子としての活性を有する蛋白質も本発明
においてＳＣＧＦとして用いることができる。

【００４３】本発明において、ＳＣＦとしては、ＮＣＢ
Ｉの公的な蛋白質データーベースにP21583（ヒトＳＣ
Ｆ）、CAA67698（マウスＳＣＦ）、AAD02827（ラットＳ
ＣＦ）、BAA09445（ネコＳＣＦ）、Q06220（イヌＳＣ
Ｆ）、AAB49491（ヒツジＳＣＦ）、Q29030（ブタＳＣ
Ｆ）、S47571（ウシＳＣＦ）、JN0637（ニワトリＳＣ
Ｆ）としてアミノ酸配列が登録されている蛋白性因子等
が挙げられる。ＦＬとしては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質
データーベースにP49771（ヒトＦＬ）、A49265（マウス
ＦＬ）、AAF87089（ネコＦＬ）、AAF87088（イヌＦ
Ｌ）、AAF99322（ウシＦＬ）としてアミノ酸配列が登録
されている蛋白性因子等が挙げられる。ＩＬ−３として
は、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにP08700
（ヒトＩＬ−３）、P01586（マウスＩＬ−３）、P04823
（ラットＩＬ−３）、JC4266（ウシＩＬ−３）、I46407
（ヒツジＩＬ−３）A60159（サルＩＬ−３）としてアミ
ノ酸配列が登録されている蛋白性因子等が挙げられる。
ＴＰＯとしては、公的データーベースＮＣＢＩにAAA740
83（ヒトＴＰＯ）、P40226（マウスＴＰＯ）、P49745
（ラットＴＰＯ）、P42706（ブタＴＰＯ）、P42705（イ
ヌＴＰＯ）としてアミノ酸配列が登録されている蛋白性
因子等が挙げられる。これらの因子は増殖因子としての
活性を有するが、これら蛋白質において１以上のアミノ
酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ
酸配列を有し、かつ増殖因子としての活性を有する蛋白
質、並びにこれらの蛋白質と、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ
等の解析プログラムを用いて計算したときに、６０％以
上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ増殖因子
としての活性を有する蛋白質も本発明においてＳＣＦ、
ＦＬ、ＩＬ−３あるいはＴＰＯとして用いることができ
る。

【００４４】１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入およ
び／または付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質は、
これらの蛋白質をコードするＤＮＡを以下に示す方法で
取得し、J. Sambrookら；Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab
oratory, 1989等に記載された遺伝子組換え法、即ち該
ＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入して得られ
た形質転換体を培養し、該培養物より取得することがで
きる。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡクローニング（J.Sambrook
ら；Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second
Edition, ColdSpring Harbor Laboratory, 1989）やＲ
Ｔ−ＰＣＲ法（M. Innisら；PCR Protocols, Academic
Press, 1990)等の方法により得られた上記のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡに対し、T.A. Kunkel;Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 82, 488, 1985、W. Itoら；Gene, 1
02, 67, 1991、M. J. Zoller and M. Smith; Nucleic A
cids Res., 10, 6487, 1982, T. Hashimoto-Gotohら；G
ene, 152, 271, 1995等に記載の方法を用いて、部位特
異的変異を導入することにより、取得することができ
る。また、目的の変異（欠失、置換、付加または挿入）
を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライ
マーを用いたＰＣＲ［Ho. SN et al., Gene 77, 51(198
9)］によっても、取得することができる。

【００４５】本発明において、ゼラチンとは、水溶性の
変性したコラーゲンを意味し、例えば、シグマ社の製品
番号G9391、G1393、G1890、G9136などのゼラチンが挙げ
られるが、これに限定されず様々なゼラチンが使用でき
る。

【００４６】本発明において、ラミニンは、α、β、γ
鎖の３量体からなる蛋白性因子であり、α鎖としては、
ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにアクセス番号
P25391（ヒトラミニンα１）、P19137（マウスラミニン
α１）、P24043（ヒトラミニンα２）、Q60675（マウス
ラミニンα２）、Q16787（ヒトラミニンα３）、Q61789
（マウスラミニンα３）、AAB17053（ラットラミニンα
３）、Q16363（ヒトラミニンα４）、CAA70970（マウス
ラミニンα４）、CAC22310（ヒトラミニンα５）、Q610
01（マウスラミニンα５）としてアミノ酸配列が登録さ
れている蛋白質等、β鎖としては、ＮＣＢＩの公的な蛋
白質データーベースにアクセス番号P07942（ヒトラミニ
ンβ１）、AAA39407（マウスラミニンβ１）、P55268
（ヒトラミニンβ２）、Q61292（マウスラミニンβ
２）、P15800（ラットラミニンβ２）、BAA22263（ヒト
ラミニンβ３）、Q61087（マウスラミニンβ３）、とし
てアミノ酸配列が登録されている蛋白質等、γ鎖として
は、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにアクセス
番号AAA59488（ヒトラミニンγ１）、P02468（マウスラ
ミニンγ１）、Q13753（ヒトラミニンγ２）、Q61092
（マウスラミニンγ２）、AAD36991（ヒトラミニンγ
３）、AAF08983（マウスラミニンγ３）としてアミノ酸
配列が登録されている蛋白質等をそれぞれ挙げることが
できる。組織から精製したもの（例えば、シグマ・アル
ドリッチ社のカタログ番号L6274、L2020のラミニン）も
用いることができる。

【００４７】コラーゲンタイプＩは、α鎖の３量体から
なる蛋白性因子であり、α鎖としては、ＮＣＢＩの公的
な蛋白質データーベースにCAA98968（ヒトコラーゲンタ
イプＩα１）、P11087（マウスコラーゲンタイプＩα
１）、P08123（ヒトコラーゲンタイプＩα２）、Q01149
（マウスコラーゲンタイプＩα２）、AAD41775（ラット
コラーゲンタイプＩα２）、P02465（ウシコラーゲンタ
イプＩα２）としてアミノ酸配列が登録されている蛋白
質等が挙げられる。組織から精製したもの（例えば、シ
グマ・アルドリッチ社のカタログ番号C9791、C8919、C7
661、C1809のコラーゲンタイプＩ）も用いることができ
る。

【００４８】コラーゲンタイプＩＶは、α鎖の３量体か
らなる蛋白性因子であり、α鎖としては、ＮＣＢＩの公
的な蛋白質データーベースにP02462（ヒトコラーゲンタ
イプＩＶα１）、P02463（マウスコラーゲンタイプＩＶ
α１）、P08572（ヒトコラーゲンタイプＩＶα２）、P0
8122（マウスコラーゲンタイプＩＶα２）、CAA56335
（ヒトコラーゲンタイプＩＶα３）、AAD50449（マウス
コラーゲンタイプＩＶα３）、P53420（ヒトコラーゲン
タイプＩＶα４）、AAD50450（マウスコラーゲンタイプ
ＩＶα４）、S22917（ヒトコラーゲンタイプＩＶα
５）、I48304（マウスコラーゲンタイプＩＶα５）、CG
HU6B（ヒトコラーゲンタイプＩＶα６）、BAB13674（マ
ウスコラーゲンタイプＩＶα６）としてアミノ酸配列が
登録されている蛋白質等が挙げられる。組織から精製し
たもの（例えば、シグマ・アルドリッチ社のカタログ番
号C5533、C0543のコラーゲンタイプＩＶ）も用いること
ができる。

【００４９】フィブロネクチンとしては、ＮＣＢＩの公
的な蛋白質データーベースにP02751（ヒトフィブロネク
チン）、P11276（マウスフィブロネクチン）、P04937
（ラットフィブロネクチン）、P07589（ウシフィブロネ
クチン）としてアミノ酸配列が登録されている蛋白質等
が挙げられる。組織から精製したもの（例えば、シグマ
・アルドリッチ社のカタログ番号F4759、F2006、F114
1、F0895、F0635のフィブロネクチン）も用いることが
できる。

【００５０】これらの因子は細胞外マトリックス蛋白質
としての機能を有するが、上記アミノ酸配列において１
以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加
されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞外マトリックス蛋
白質としての機能を有する蛋白質、並びにこれらの蛋白
質と、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析プログラムを用
いて計算したときに、６０％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列を有し、かつ細胞外マトリックス蛋白質として
の機能を有する蛋白質も本発明においてラミニン、コラ
ーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＩＶあるいはフィブ
ロネクチンとして用いることができる。１以上のアミノ
酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ
酸配列を有する蛋白質は、上記ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３
あるいはＴＰＯについて記載した方法と同様の方法によ
り取得することができる。

【００５１】本発明のＥＢ形成方法においては、ＬＩＦ
を含まない培地を用いることが好ましい。培地にＬＩＦ
を含まないとは、成分としてＬＩＦを培地に人為的に添
加しないことを意味する。ＬＩＦとしては、A. G. Smit
h and M. L. Hooper; Dev. Biol., 121, 1, 1987、A.
G. Smithら; Nature, 336, 688, 1988、P. D. Rathjen
ら; Genes Dev., 4,2308, 1990、ＮＣＢＩ（National C
enter for Biotechnology Information）の公的な蛋白
質データーベースにアクセス番号P15018（ヒトＬＩ
Ｆ）、P09056（マウスＬＩＦ）、P17777（ラットＬＩ
Ｆ）等で公知化されている蛋白性因子等が挙げられる。

【００５２】本発明のＥＢ形成方法により得られたＥＢ
は、分化誘導される分化細胞の分離源として用いること
ができる。また、ＥＢあるいはその一部分も医薬や、細
胞分化などの胚性幹細胞の動態に影響を及ぼす物質のス
クリーニング方法や評価方法に用いることができる。本
発明のＥＢ形成方法によりＥＢを形成した後、さらに培
養を続けることで分化誘導された細胞を形成することが
できる。分化誘導に際しては、後述の分化因子を加える
ことや、また接着培養を行うことが好ましいが、これら
が必須ではない。分化因子の添加や接着培養を行う場合
は、ＥＢ形成前、ＥＢ形成後のどちらでも行うことがで
きるが、ＥＢ形成後に行うことが好ましい。

【００５３】本発明において、外胚葉とは、発生の過程
で神経管、神経冠、表皮をつくる能力を有した細胞から
構成される胚葉を包含する。その例としては、原始外胚
葉から分化した胎児の外胚葉が挙げられる。

【００５４】本発明において、外胚葉由来の細胞とは、
外胚葉から分化した細胞で、かつ生体を構成する機能細
胞を包含する。その例としては、神経組織、松果体、副
腎髄質、色素体あるいは表皮組織を構成する細胞が挙げ
られる。神経組織としては、神経管あるいは神経冠より
分化誘導される脳、眼杯、脳下垂体後葉、運動性脳神
経、脊髄、運動性脊髄神経、感覚性脳神経、感覚性脊髄
神経、交感神経などが挙げられる。松果体を構成する細
胞としては、神経管より分化誘導される松果腺を構成す
る細胞などが挙げられる。色素体を構成する細胞として
は、神経冠より分化誘導される色素細胞などが挙げられ
る。表皮組織としては、発生の過程の表皮より分化誘導
される毛、爪、歯、腺、水晶体などが挙げられる。副腎
髄質は神経冠より分化誘導される。

【００５５】本発明において、中胚葉とは、発生の過程
で側板、腎節、体節、頭部中胚葉をつくる能力を有した
細胞から構成される胚葉を包含する。その例としては、
原始外胚葉から分化した胎児の中胚葉が挙げられる。

【００５６】本発明において、中胚葉由来の細胞とは、
中胚葉から分化した細胞で、かつ生体を構成する機能細
胞を包含する。その例としては、筋組織、結合組織、骨
組織、軟骨組織、循環器、血液組織、真皮、泌尿器ある
いは生殖器を構成する細胞が挙げられる。筋組織として
は、側板より分化誘導される平滑筋、体節より分化誘導
される胴部の筋肉、横紋筋、頭部中胚葉より分化誘導さ
れる頭部の筋肉などが挙げられる。結合組織としては、
側板より分化誘導される結合織や腹膜などが挙げられ
る。骨組織および軟骨組織としては、体節より分化誘導
される脊椎、四肢の骨格、頭部中胚葉より分化誘導され
る頭骨、歯の骨質などが挙げられる。循環器としては、
側板より分化誘導される心臓、血管内膜、腎節より分化
誘導される前腎、中腎、後腎などが挙げられる。血液組
織としては、側板より分化誘導される血球などが挙げら
れる。泌尿器としては、腎節より分化誘導される前腎、
中腎、後腎などが挙げられる。生殖器としては、腎節よ
り分化誘導される輸精管、輸卵管などが挙げられる。真
皮は体節より分化誘導される。

【００５７】本発明において、内胚葉とは、発生の過程
で前腸、中腸、後腸、尿膜をつくる能力を有した細胞か
ら構成される胚葉を包含する。その例としては、原始外
胚葉から分化した胎児の内胚葉が挙げられる。

【００５８】本発明において、内胚葉由来の細胞とは、
内胚葉から分化した細胞で、かつ生体を構成する機能細
胞を包含する。その例としては、消化管、呼吸器、胸
腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、肝臓あるいは膵臓
を構成する細胞が挙げられる。消化管としては、前腸よ
り分化誘導される食道、胃、膵臓、十二指腸、中腸より
分化誘導される小腸、後腸より分化誘導される大腸、肛
門などが挙げられる。呼吸器としては、前腸より分化誘
導される肺、気管などが挙げられる。胸腺、甲状腺、副
甲状腺、中耳、肝臓、膵臓は前腸より、膀胱は尿嚢より
分化誘導される。

【００５９】本発明の具体的な培養方法、培養条件につ
いて以下に詳述するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。

【００６０】１．胚性幹細胞の調製 （１）胚性幹細胞の調製 本発明のＥＢ形成方法に付す胚性幹細胞は、Manipulati
ng the Mouse EmbryoA Laboratory Manual, Second Edi
tion, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)、
J. A. Thomsonら; Science, 282, 1145, (1998)、M. J.
Shamblottら;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1372
6, (1998)、J. A. Thomsonら; Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 92, 7844, (1996)、米国特許 5,453,357号、米国
特許 5,670,372号等に記載された方法に従って調製する
ことができる。例えば、マウス（M.J. Evansら；Natur
e, 292, 154, 1981; G. R. Martin; Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 78, 7634, 1981)、ラット（P.M. Iannaccon
eら；Dev. Biol., 163, 288, 1994) 、ニワトリ（B. P
ainら；Development, 122, 2339, 1996; 米国特許第5,3
40,740号；米国特許第5,656,479号）、ブタ（M.B. Whee
ler; Peprod. Fertil. Dev., 6, 563, 1994; H. Shim
ら；Biol. Reprod., 57, 1089, 1997)、サル（J.A. Tho
msonら；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 199
6)、ヒト（J.A. Thomsonら；Science, 282, 1145, 199
8; M.J. Shamblottら；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9
5, 13726, 1998)についての胚性幹細胞の樹立方法が知
られており、各々に記載の方法に従って、本発明に用い
られる胚性幹細胞を調製することができる。

【００６１】得られた胚性幹細胞の培養方法としては、
Manipulating the Mouse Embryo ALaboratory Manual,
Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s (1994)、Methods in Enzymology volume 225, Guide
to Techniques in Mouse Development, Academic Press
(1993)、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッ
ティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社
(1995)）等に記載の胚性幹細胞を培養するための方法が
挙げられる。無血清培養することも可能で、例えば、Du
lbecco MEM培地に１５〜２０％のKNOCKOUT^TM SR（ Life
Technologies社製）、２ｍＭグルタミン、１００μＭ
MEM Non-Essential Amino Acids溶液、５０Ｕ/ｍＬペニ
シリン、５０Ｕ/ｍＬストレプトマイシン、１００μＭ
２−メルカプトエタノール、および１、０００Ｕ/ｍＬ
ＬＩＦを加えた培地を用い、未分化な胚性幹細胞とし
ての形質を保ったまま継代培養することができる（M.
D. Goldsboroughら; Focus, 20, 8, 1998）。

【００６２】本発明においては、単一細胞状態とした胚
性幹細胞を用いて本発明のＥＢ形成方法を行いＥＢ形成
を行うことが好ましいが、単一細胞状態とした胚性幹細
胞を得る方法としては、組織細胞培養で用いられる既に
公知の酵素消化の方法が挙げられる。その具体的例とし
ては、ほぼコンフルエント状態にまで増殖した胚性幹細
胞を培養している培養皿から培地を除き、ＰＢＳを用い
て数回、好ましくは２〜３回洗浄し、適当な酵素消化液
（例えば、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．２５％トリプシ
ンを含むＰＢＳ）を加え、３７℃で数十分間、好ましく
は５〜２０分間培養し、下記２の培地にけん濁し、遠心
操作（例えば、４℃、２００ｘｇで５分間）を行ない、
再び下記２の培地にけん濁することで単一細胞状態とし
た胚性幹細胞を回収することができる。

【００６３】単一細胞状態とした胚性幹細胞の培養に使
用できる培養器としては、 胚性幹細胞を培養できるもの
であればいかなる培養器でも用いることができるが、好
ましくは細胞培養用に用いられる培養器が望ましい。細
胞培養用の培養器としては、例えば、フラスコ、細菌培
養用フラスコ、細胞培養用フラスコ、デッシュ、ペトリ
デッシュ、組織培養用デッシュ、コンツアーデッシュ、
パーマノックスデッシュ、マルチデッシュ、マイクロプ
レート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マ
ルチウエルプレート、セパレートストリップウエル、テ
ラサキプレート、組織培養用チャンバースライド、シャ
ーレ、細胞培養用シャーレ、組織培養用チューブ、トレ
イ、細胞培養用トレイ、セルファクトリー、培養バッ
グ、テクノポット、ローラーボトル、スピンナー、フォ
ロファイバー等が挙げられる。培養器と細胞との接着性
を制御するために、培養器の細胞と接触する側の表面を
人工的に処理を施すこともできる。培養器の表面を人工
的に処理する例としては、コラーゲンコート、ゼラチン
コート、ポリーＬ−リジンコート、フィブロネクチンコ
ート、ラミニンコート、プロテオグリカンコート、グリ
コプロテインコート、マトリゲルコート、シリコンコー
ト等が挙げられる。また、プライマリア（Primaria; B
ecton Dickinson社製）などのように負の電荷を持つよ
うに処理することもできる。これらの処理を施した培養
器の中で特に、コラーゲンタイプＩコート、コラーゲン
タイプＩＶコート、ゼラチンコート、フィブロネクチン
コート、ラミニンコートした培養器が好ましく用いられ
る。

【００６４】（２）体細胞の核を核移植した胚性幹細胞
の作製 本発明においては、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞
を用いることができる。

【００６５】哺乳類動物細胞の体細胞の核を移植し正常
な発生を開始した卵は、Wilmutら（Nature, 385, 810,
1997）、Cibelliら（Science, 280, 1256, 1998）、入
谷明ら（蛋白核酸酵素, 44, 892, 1999）、Baguisiら
（Nature Biotechnology, 17,456, 1999）、Wakayamaら
（Nature, 394, 369, 1998; Nature Genetics, 22, 12
7, 1999; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984, 19
99）、; Rideout IIIら（Nature Genetics, 24, 109, 2
000）等によって報告された方法を用い、例えば以下の
ように作製することができる。

【００６６】哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を
再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操
作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を
用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養するこ
とによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を
開始した卵が得られる。

【００６７】体細胞の核を初期化する方法としては、複
数の方法が知られているが、例えば以下のようにして行
うことができる。核を提供する側の細胞を培養している
培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血
清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から０〜１％、好ま
しくは０.５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変
えて３〜１０日間、好ましくは５日間、培養することで
細胞周期を休止期状態（G0期もしくはG1期）に誘導する
ことで初期化することができる。この方法は、哺乳動物
が、例えばヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合に好適であ
る。また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を
提供する側の細胞の核を注入し数時間、好ましくは約１
〜６時間培養することで初期化することができる。この
方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適で
ある。

【００６８】初期化された核は除核された未受精卵中で
発生を開始することが可能となる。初期化された核を除
核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複
数の方法が知られている。例えば、細胞周期を休止期状
態（G0期もしくはG1期）に誘導し初期化した核を、電気
融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵
に移植することで卵子を活性化し発生を開始させること
ができる。この方法は、哺乳動物が、例えばヒツジ、ヤ
ギ、ウシなどの場合に好適である。また、同種の哺乳動
物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した
核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法など
によって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、
卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激
後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢな
ど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開
始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例え
ばマウスなどの場合に好適である。

【００６９】いったん発生を開始した卵が得られれば、
Manipulating the Mouse Embryo ALaboratory Manual,
Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s (1994)、Gene Targeting, A Practical Approach, IR
L Press at Oxford University Press (1993)、バイオ
マニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング, ＥＳ
細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995)等に記載
の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができ
る。

【００７０】（３）染色体上の遺伝子を改変した胚性幹
細胞の作製 染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞（例えば、組織
適合性抗原を改変した胚性幹細胞）は、相同組換え技術
を用いることによって作製することができる。

【００７１】染色体上の標的遺伝子の改変（例えば、組
織適合性抗原の改変）は、 Manipulating the Mouse Em
bryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spr
ingHarbor Laboratory Press (1994)、Gene Targeting,
A Practical Approach, IRL Press at Oxford Univers
ity Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ８ ジー
ンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作
製,羊土社 (1995)等に記載の方法を用い、例えば以下の
ように行なうことができる。

【００７２】改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性
抗原の遺伝子）のゲノム遺伝子を単離する。

【００７３】単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子
（例えば、組織適合性抗原の遺伝子）を相同組換えする
ためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲ
ットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子（例え
ば、組織適合性抗原の遺伝子）とターゲットベクターの
間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、
染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製すること
ができる。

【００７４】標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法
としては、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory (198
9)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）
や カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biolo
gy, John Wiley & Sons）等に記載された公知の方法が
あげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリー
ニングシステム（Genome Systems社製）やUniversal Ge
nomeWalker^TM Kits（CLONTECH社製）などを用いること
により、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することがで
きる。

【００７５】標的遺伝子を相同組換えするためのターゲ
ットベクターは、 Gene Targeting,A Practical Approa
ch, IRL Press at Oxford University Press (1993)、
バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング,
ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995)）
等に記載の方法にしたがって作製することができる。タ
ーゲットベクターは、リプレースメント型、インサーシ
ョン型いずれでも用いることができる。

【００７６】相同組換え体を効率的に選別する方法とし
て、例えば、Gene Targeting, A Practical Approach,
IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイ
オマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング, Ｅ
Ｓ細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995)等に記
載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選
択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別
した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する
方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダ
イゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）
やＰＣＲ法［PCR Protocols、Academic Press (1990)］
等が挙げられる。

【００７７】２．本発明の培地 上記のようにして得られて維持／増殖されている胚性幹
細胞を、本発明のＥＢ形成方法に付してＥＢを形成させ
るが、その際に用いる培地とは、動物細胞の培養に用い
られる培地を基礎培地として調製することができる。

【００７８】基礎培地としては、BME培地（Proc. Soc.
Exp. Biol. Med., 89, 362, 1965）、BGJb培地（Exp. C
ell Res., 25, 41, 1961）、CMRL 1066培地（N. Y. Aca
demyof Sciences, 5, 303, 1957）、Glasgow MEM培地
（Virology, 16, 147, 1962）、Improved MEM Zinc Opt
ion培地（J. National Cancer Inst., 49, 1705, 197
2）、IMDM培地（In Vitro, 9, 6, 1970）、Medium 199
培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1, 1950）、E
agle MEM培地（Science, 130, 432, 1959）、AlphaMEM
培地（Nature New Biology, 230, 310, 1971）、Dulbec
co MEM培地（Virology, 8, 396, 1959）、ハム培地（Ex
p. Cell Res., 29, 515, 1963; Proc. Natl.Acad. Sci.
USA, 53, 288, 1965）、RPMI 1640培地（J. A. M. A.,
199, 519,1967）、Fischer's培地（Methods in Med. R
es., 10, 1964）、McCoy's培地（Proc. Soc. Exp. Bio
l. Med., 100, 115, 1959）、ウイリアムスＥ培地（Ex
p. Cell Res., 69, 106, 1971; Exp. Cell Res., 89, 1
39, 1974）およびこれらの混合培地など、動物細胞の培
養に用いることのできる培地であればいずれも用いるこ
とができる。

【００７９】また、Manipulating the Mouse Embryo A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Har
bor Laboratory Press (1994)、Methods in Enzymology
volume 225, Guide to Techniques in Mouse Developm
ent, Academic Press (1993)、バイオマニュアルシリー
ズ８ ジーンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異
マウスの作製,羊土社 (1995)等に記載の胚培養のための
培地、例えば、Ｍ２培地、Ｍ１６培地、Whitten培地、
体外受精用培地など、胚の培養に用いることのできる培
地であればいずれも基礎培地として用いることができ
る。

【００８０】さらに、これら培地に、血清を添加した培
地、血清代替物としての各種増殖因子を添加した培地、
ストローマ細胞などが産生する因子を添加した培地、あ
るいは無蛋白培地であっても動物細胞や胚の培養が可能
であるものであればいずれも用いることができる。その
具体的例として、市販のKNOCKOUT^TM SRを添加した無血
清培地（M. D. Goldsboroughら; Focus, 20, 8, 199
8）、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無
血清培地[例えば、CHO-S-SFM II（ Life Technologies
社製）、Hybridoma-SFM（ Life Technologies社製）、e
RDF Dry Powdered Media（ Life Technologies社製）、
UltraCULTURE^TM（BioWhittaker社製）、UltraDOMA^TM（B
ioWhittaker社製）、UltraCHO^TM（BioWhittaker社
製）、UltraMDCK^TM（BioWhittaker社製）、ITPSG培地
（S. Hosoiら; Cytotechnology, 5, S17, 1991）、ＩＴ
ＳＦｎ培地（A. Rizzino and C. Growley; Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77, 457, 1980）、ｍＮ３培地（S. O
kabeら; Mech. Dev., 59, 89, 1996）など]、細胞由来
の因子を添加した培地［例えば、多能性奇形癌腫細胞PS
A1の培養上清を添加した培地（G. R. Martin; Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981）］、または無蛋
白培地［例えば、CD-CHO（ Life Technologies社製）、
PFHM-II（ Life Technologies社製）、UltraDOMA-PF^TM
（BioWhittaker社製）など］が挙げられる。

【００８１】これら基礎培地の好適な例として、実施例
１に記載した無血清基本培地（５０μＭ２−メルカプト
エタノール、２ｍＭグルタミン、１％牛血清アルブミ
ン、１０μｇ／ｍＬ牛膵インスリン、２００μｇ／ｍＬ
ヒトトランスフェリンおよび４０μｇ／ｍＬ低比重リポ
プロテイン（low density lipoprotein; ＬＤＬ）を含
むＩＭＤＭ培地）が挙げられる。この無血清基本培地に
おいて、ＩＭＤＭ培地に加えられる各添加物の濃度は上
述の濃度の１００倍〜１００分の１、好ましくは１０倍
〜１０分の１に変更しても構わない。

【００８２】本発明において、血清培地とは、上記の基
礎培地にさらに哺乳動物あるいはニワトリ等の血清を含
む培地を意味する。哺乳動物としては、例えば、ヒト、
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イ
ヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、サル等が挙げら
れる。

【００８３】これら基礎培地あるいは血清培地に、ＳＣ
ＧＦを培地中の濃度が１ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、
好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ、より好ましく
は１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬになるように添加
することで、本発明の、胚性幹細胞を培養するための培
地を調製することができる。無血清培地の場合はさらに
１００ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの細胞外マトリックス
蛋白質を添加するのが好ましい。細胞外マトリックス蛋
白質としては、ゼラチン、ラミニン、コラーゲンタイプ
Ｉ、コラーゲンタイプＩＶまたはフィブロネクチンが挙
げられる。また、細胞外マトリックス蛋白質は基礎培地
に直接添加せず、培養器の細胞が接触する表面にコート
することで、培養する胚性幹細胞に作用させても構わな
い。このような細胞外マトリックス蛋白質の用い方も、
広義に、基礎培地にＳＣＧＦおよび細胞外マトリックス
蛋白質を添加した培地に含まれる。この培地にさらに１
ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ
〜１μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１０
０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４を添加してもよい。

【００８４】更に好ましくは、上記の培地にＳＣＧＦと
ともに、以下の(vii)〜(x)に示した蛋白質を培地中の濃
度が１ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ
／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ
〜１００ｎｇ／ｍＬになるように単独あるいは複数添加
することで、本発明の、胚性幹細胞を培養するための培
地を調製することができる。 （vii）ＳＣＦ； （viii）ＦＬ； （ix）ＩＬ−３； （x）ＴＰＯ。

【００８５】本発明のＥＢ形成方法において、特に血清
培地を使用する場合には、培地にＳＣＧＦを加えて培養
することにより、血清のロットに左右されず高効率で安
定的にＥＢを形成することができる。さらに、細胞外マ
トリックス蛋白質を適宜組み合わせてもよい。

【００８６】本発明のＥＢ形成方法において無血清培地
を使用する場合、基礎培地にＳＣＧＦとともに上記細胞
外マトリックス蛋白質を加えて培養することにより、無
血清培養でありながら比較的低密度の培養でも安定的に
ＥＢを形成することができる。細胞外マトリックス蛋白
質としては、特にフィブロネクチンが好ましい。無血清
培養の場合、特に（i）ＳＣＦ、（ii）ＦＬとＩＬ−３
とＴＰＯの添加が好ましい。

【００８７】また、基礎培地に１ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ
／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ、より
好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ
−４および１００ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの細胞外マ
トリックス蛋白質を添加することによっても本発明の、
胚性幹細胞を培養するための培地を調製することができ
る。細胞外マトリックス蛋白質としては、ゼラチン、ラ
ミニン、コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＩＶま
たはフィブロネクチンが挙げられるが、特にフィブロネ
クチンが好ましい。細胞外マトリックス蛋白質は基礎培
地に直接添加せず、培養器の細胞が接触する表面にコー
トすることで、培養する胚性幹細胞に作用させても構わ
ない。このような細胞外マトリックス蛋白質の用い方
も、広義に、基礎培地にＢＭＰ−４および細胞外マトリ
ックス蛋白質を添加した培地に含まれる。

【００８８】また、胚性幹細胞より目的とする分化細胞
をより効率的に誘導するために、上述の培地に、さら
に、以下の（xi）〜（xxviii）に示した因子を培地中の
濃度が１ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎ
ｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍ
Ｌ〜１００ｎｇ／ｍＬになるように単独あるいは複数添
加することができる。以下の因子を含んだ培地も、本発
明の、胚性幹細胞を培養するための培地として用いるこ
とができる。

【００８９】（xi）インターロイキン３（interleukin
3）； （xii）トロンボポイエチン（thrombopoietin）； （xiii）血管内皮増殖因子（vascular endothelial gro
wth factor）； （xiv）エリスロポイエチン（erythropoietin）； （xv）インターロイキン６（interleukin 6）； （xvi）インターロイキン１１（interleukin 11）； （xvii）アクチビンＡ（activin A）； （xviii）ＢＭＰ−４； （xix）塩基性繊維芽細胞増殖因子（basic fibroblast
growth factor）； （xx）インターロイキン１（interleukin１）； （xxi）マクロファージコロニー刺激因子（macrophage
colony-stimulating factor）； （xxii）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（gran
ulocyte-macrophage colony- stimulating factor）； （xxiii）インターロイキン７（interleukin７）； （xxiv）インターロイキン２（interleukin２）； （xxv）トランスフォーミング増殖因子β（transformin
g growth factor-β）； （xxvi）神経成長因子（nerve growth factor）； （xxvii）レチノイン酸（retinoic acid）； （xxviii）ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxid
e）。

【００９０】本発明において、血管内皮増殖因子（vasc
ular endothelial growth factor;以下ＶＥＧＦとも略
す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベース
にAAC63102（ヒトＶＥＧＦ）、Q00731（マウスＶＥＧ
Ｆ）、AAF19211（ラットＶＥＧＦ）、P26617（モルモッ
トＶＥＧＦ）、AAG16241（ハムスターＶＥＧＦ）、CAB8
2426（イヌＶＥＧＦ）、S57956（ヒツジＶＥＧＦ）、S5
2130（ブタＶＥＧＦ）、B40080（ウシＶＥＧＦ）として
アミノ酸配列が登録されている蛋白性因子等が挙げられ
る。エリスロポイエチン（erythropoietin; 以下ＥＰＯ
とも略す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データー
ベースにCAA26094（ヒトＥＰＯ）、P07321（マウスＥＰ
Ｏ）、P29676（ラットＥＰＯ）、P33708（ネコＥＰ
Ｏ）、P33707（イヌＥＰＯ）、I46401（ヒツジＥＰ
Ｏ）、P49157（ブタＥＰＯ）、P48617（ウシＥＰＯ）、
AAG36962（ウサギＥＰＯ）、Q28513（サルＥＰＯ）とし
てアミノ酸配列が登録されている蛋白性因子等が挙げら
れる。

【００９１】インターロイキン６（interleukin 6; 以
下ＩＬ−６とも略す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白
質データーベースにP05231（ヒトＩＬ−６）、P08505
（マウスＩＬ−６）、P20607（ラットＩＬ−６）、AAF8
6660（ウサギＩＬ−６）、I46084（ネコＩＬ−６）、AA
F86275（イヌＩＬ−６）、S29549（ヒツジＩＬ−６）I4
6590（ブタＩＬ−６）、A56610（ウシＩＬ−６）、Q283
19（ヤギＩＬ−６）、P51494（サルＩＬ−６）、T09216
（ウマＩＬ−６）としてアミノ酸配列が登録されている
蛋白性因子等が挙げられる。インターロイキン１１（in
terleukin 11; 以下ＩＬ−１１とも略す）としては、Ｎ
ＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにP20809（ヒトＩ
Ｌ−１１）、P47873（マウスＩＬ−１１）、A38285（サ
ルＩＬ−１１）としてアミノ酸配列が登録されている蛋
白性因子等が挙げられる。アクチビンＡ（activin A）
としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにP0
8476（ヒトインヒビンβＡ）、Q04998（マウスインヒビ
ンβＡ）、P18331（ラットインヒビンβＡ）、P43032
（ヒツジインヒビンβＡ）、P03970（ブタインヒビンβ
Ａ）、P07995（ウシインヒビンβＡ）、P55102（ウマイ
ンヒビンβＡ）、P27092（ニワトリインヒビンβＡ）と
してアミノ酸配列が登録されているインヒビンβＡ鎖前
駆体のＣ末より生ずるインヒビンβＡ鎖ポリペプチドの
ホモダイマーである蛋白性因子等が挙げられる。

【００９２】ＢＭＰ−４としては、ＮＣＢＩの公的な蛋
白質データーベースにP12644（ヒトＢＭＰ−４）、P212
75（マウスＢＭＰ−４）、Q06826（ラットＢＭＰ−
４）、O46576（ウサギＢＭＰ−４）、Q90752（ニワトリ
ＢＭＰ−４）としてアミノ酸配列が登録されている前駆
体のＣ末から生ずる成熟体ポリペプチドの二量体である
蛋白性因子等が挙げられる。塩基性繊維芽細胞増殖因子
（basic fibroblast growth factor; 以下ｂＦＧＦとも
略す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベー
スにP09038（ヒトｂＦＧＦ）、P15655（マウスｂＦＧ
Ｆ）、AAA41210（ラットｂＦＧＦ）、P48799（ウサギｂ
ＦＧＦ）、P20003（ヒツジｂＦＧＦ）、P03969（ウシｂ
ＦＧＦ）、A48834（ニワトリｂＦＧＦ）としてアミノ酸
配列が登録されている蛋白性因子等が挙げられる。イン
ターロイキン１（interleukin１; 以下ＩＬ−１とも略
す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベース
にP01583（ヒトＩＬ−１α）、CAA26372（ヒトＩＬ−１
β）、P01582（マウスＩＬ−１α）、P10749（マウスＩ
Ｌ−１β）、P16598（ラットＩＬ−１α）、Q63264（ラ
ットＩＬ−１β）、P04822（ウサギＩＬ−１α）、P146
28（ウサギＩＬ−１β）、O46613（ネコＩＬ−１α）、
P41687（ネコＩＬ−１β）、O46612（イヌＩＬ−１
α）、Q28579（ヒツジＩＬ−１α）、P21621（ヒツジＩ
Ｌ−１β）、P18430（ブタＩＬ−１α）、P26889（ブタ
ＩＬ−１β）、P08831（ウシＩＬ−１α）、P09428（ウ
シＩＬ−１β）、P79161（ヤギＩＬ−１α）、P79162
（ヤギＩＬ−１β）、P48089（サルＩＬ−１α）、P480
90（サルＩＬ−１β）、BAA07717（ウマＩＬ−１α）、
Q28386（ウマＩＬ−１β）、CAA75239（ニワトリＩＬ−
１β）としてアミノ酸配列が登録されている前駆体のＣ
末から生ずる蛋白性因子等が挙げられる。

【００９３】マクロファージコロニー刺激因子（macrop
hage colony-stimulating factor;以下Ｍ−ＣＳＦとも
略す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベー
スにP09603（ヒトＭ−ＣＳＦ）、P07141（マウスＭ−Ｃ
ＳＦ）、BAA31556（ウシＭ−ＣＳＦ）としてアミノ酸配
列が登録されている蛋白性因子等が挙げられる。顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrop
hage colony- stimulating factor; 以下ＧＭ−ＣＳＦ
とも略す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データー
ベースにP04141（ヒトＧＭ−ＣＳＦ）、P01587（マウス
ＧＭ−ＣＳＦ）、Q60481（モルモットＧＭ−ＣＳＦ）、
O62757（ネコＧＭ−ＣＳＦ）、P48749（イヌＧＭ−ＣＳ
Ｆ）、P28773（ヒツジＧＭ−ＣＳＦ）、Q29118（ブタＧ
Ｍ−ＣＳＦ）、P11052（ウシＧＭ−ＣＳＦ）、AAG16626
（サルＧＭ−ＣＳＦ）としてアミノ酸配列が登録されて
いる蛋白性因子等が挙げられる。インターロイキン７
（interleukin７; 以下ＩＬ−７とも略す）としては、
ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにP13232（ヒト
ＩＬ−７）、P10168（マウスＩＬ−７）、P56478（ラッ
トＩＬ−７）、Q28540（ヒツジＩＬ−７）、BAA96385
（ブタＩＬ−７）、P26895（ウシＩＬ−７）としてアミ
ノ酸配列が登録されている蛋白性因子等が挙げられる。
インターロイキン２（interleukin２; 以下ＩＬ−２と
も略す）としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベ
ースにP01585（ヒトＩＬ−２）、S37289（マウスＩＬ−
２）、P17108（ラットＩＬ−２）、O77620（ウサギＩＬ
−２）、Q07885（ネコＩＬ−２）、BAA06378（イヌＩＬ
−２）、P19114（ヒツジＩＬ−２）、P26891（ブタＩＬ
−２）、P05016（ウシＩＬ−２）、 P36835（ヤギＩＬ
−２）、Q29615（サルＩＬ−２）、P37997（ウマＩＬ−
２）、CAA12025（ニワトリＩＬ−２）としてアミノ酸配
列が登録されている蛋白性因子等が挙げられる。

【００９４】トランスフォーミング増殖因子β（transf
orming growth factor-β; 以下ＴＧＦ−βとも略す）
としては、ＮＣＢＩの公的な蛋白質データーベースにP0
1137（ヒトＴＧＦ−β１）、P08112（ヒトＴＧＦ−β
２）、P10600（ヒトＴＧＦ−β３）、P04202（マウスＴ
ＧＦ−β１）、P27090（マウスＴＧＦ−β２）、P17125
（マウスＴＧＦ−β３）、P17246（ラットＴＧＦ−β
１）、Q07258（ラットＴＧＦ−β３）、P54831（イヌＴ
ＧＦ−β１）、P50414（ヒツジＴＧＦ−β１）、1P0720
0（ブタＴＧＦ−β１）、P09858（ブタＴＧＦ−β
２）、P15203（ブタＴＧＦ−β３）、P18341（ウシＴＧ
Ｆ−β１）、WFMKB2（サルＴＧＦ−β２）、O19011（ウ
マＴＧＦ−β１）、P09531（ニワトリＴＧＦ−β１）、
P30371（ニワトリＴＧＦ−β２）、P16047（ニワトリＴ
ＧＦ−β３）としてアミノ酸配列が登録されている前駆
体のＣ末から生ずる成熟体ポリペプチドの二量体である
蛋白性因子等が挙げられる。神経成長因子（nerve grow
th factor; 以下ＮＧＦとも略す）としては、ＮＣＢＩ
の公的な蛋白質データーベースにP01138（ヒトＮＧ
Ｆ）、P01139（マウスＮＧＦ）、P25427（ラットＮＧ
Ｆ）、P19093（モルモットＮＧＦ）、Q29074（ブタＮＧ
Ｆ）、P13600（ウシＮＧＦ）、P05200（ニワトリＮＧ
Ｆ）としてアミノ酸配列が登録されている前駆体より生
ずる成熟体ポリペプチドの二量体である蛋白性因子等が
挙げられる。これらの因子はサイトカインとしての活性
を有するが、これら蛋白質において１以上のアミノ酸が
欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配
列を有し、かつサイトカインとしての活性を有する蛋白
質、並びにこれらの蛋白質とＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等
の解析プログラムを用いて計算したときに、６０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつサイトカイ
ンとしての活性を有する蛋白質も本発明においてＶＥＧ
Ｆ、ＥＰＯ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、アクチビンＡ、Ｂ
ＭＰ−４、ｂＦＧＦ、ＩＬ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＴＧＦ−βあるいはＮＧＦ
として用いることができる。１以上のアミノ酸が欠失、
置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有
する蛋白質は、上記ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３あるいはＴ
ＰＯについて記載した方法と同様の方法により取得する
ことができる。

【００９５】３．本発明のＥＢ形成方法による、胚性幹
細胞の培養 本発明の、胚性幹細胞からＥＢを形成するための具体的
培養方法としては、用いる胚性幹細胞の培養に適した培
養法であればいずれも用いることができ、単層培養法、
支持細胞との共培養法、高密度維持培養法、マイクロキ
ャリア培養法、還流培養法、軟寒天培養法等を挙げるこ
とができる。具体的な方法の例としては、例えば、単一
細胞状態（酵素消化等を施すことで細胞同士の接着がな
い個々の細胞がバラバラになった状態）とした胚性幹細
胞を上記２の培地に５細胞／ｍｌ〜５００,０００細胞
／ｍL、好ましくは１０細胞／ｍＬ〜１００,０００細胞
／ｍＬ、より好ましくは１００細胞／ｍＬ〜１０,００
０細胞／ｍＬ、さらに好ましくは５００細胞／ｍＬ〜５
０００細胞／ｍＬの細胞密度になるように懸濁し、培養
器に播種後、３〜３０日間、好ましくは４〜２０日間、
３７℃で数％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気した
ＣＯ₂インキュベーターにて培養する方法を挙げること
ができる。

【００９６】無血清培地に、ＳＣＧＦまたはＢＭＰ−４
および細胞外マトリックス蛋白質（好ましくは上記（i
i）〜（vi）の細胞外マトリックス蛋白質、特にフィブ
ロネクチン）を加えた培地を用いる場合は、播種する胚
性幹細胞の細胞密度が２５００細胞／ｍＬ以上で培養す
ることが好ましい。

【００９７】無血清培地にＳＣＧＦ及び細胞外マトリッ
クス蛋白質とさらにＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３及びＴＰＯ
から選ばれる少なくとも１つの蛋白質とを組み合わせて
用いる場合、特に、ＳＣＧＦ及び細胞外マトリックス蛋
白質と（i）ＳＣＦ、（ii）ＦＬとＩＬ−３とＴＰＯと
を組み合わせて用いる場合は、播種する胚性幹細胞の細
胞密度が１５００細胞／ｍＬ以上で培養することが好ま
しく、２０００細胞／ｍＬ以上で培養することがさらに
好ましい。

【００９８】血清培地にＳＣＧＦを加えた培地を用いる
場合は、播種する胚性幹細胞の細胞密度が５００細胞／
ｍＬ以上で培養することが好ましく、１０００細胞／ｍ
Ｌ以上で培養することがさらに好ましい。 胚性幹細胞
よりＥＢを形成させることで、ＥＢから目的とする分化
細胞へ誘導することができる。

【００９９】ＥＢから目的の分化細胞への誘導は、公知
の以下の報告に従って行うことができる。

【０１００】T. C. Doetschmanら（ J. Embryol. Exp.
Morphol., 87, 27, 1985）、M. M.Shen & P. Leder（ P
roc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 8240, 1992）、 G.
Kellerら（Mol. Cell. Biol., 13, 473, 1993）の報告
の方法によりＥＢから原始内胚葉（primitive endoder
m）細胞へ分化誘導することができる。D. G. Wilkinson
ら（EMBO J., 7, 691, 1988）、 F. Poirierら（Develo
pment, 113, 1105, 1991）、G. Kellerら（Mol. Cell.
Biol., 13, 473, 1993）の報告の方法により、ＥＢから
遠位内胚葉（parietal endoderm）細胞へ分化誘導する
ことができる。この分化誘導はレチノイン酸やＬＩＦの
添加により促進することができる（J. P. Fisherら; Ex
p. Cell Res., 182, 403, 1989）。T. C. Doetschmanら
（J. Embryol. Exp. Morphol., 87, 27, 1985）、M. M.
Shen & P. Leder（Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 89,
8240, 1992）、J. P. Fisherら（Exp. Cell Res., 182,
403, 1989）の報告の方法により、ＥＢから近位内胚葉
（visceral endoderm）細胞へ分化誘導することができ
る。ただし、この分化誘導は、レチノイン酸やＬＩＦの
添加により抑制される。T. C. Doetschmanら（J. Embry
ol. Exp. Morphol., 87, 27, 1985）、M. M. Shen & P.
Leder（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 8240, 199
2）の報告の方法により、ＥＢから原始外胚葉（primiti
ve ectoderm）細胞へ分化誘導することができる。ただ
し、この分化誘導は、ＬＩＦの添加により抑制される。

【０１０１】M. M. Shen & P. Leder（Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 89, 8240, 1992）、G. Kellerら（Mol.
Cell. Biol., 13, 473, 1993）の報告の方法により、胚
性幹細胞から形成されたＥＢより中胚葉前駆細胞（meso
derm precursor）へ分化誘導することができる。この分
化誘導は、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ｂＦＧＦの添加
により促進することができる（G. Yamadaら; Biochem.
Biophys. Res. Commun., 199, 552, 1994; B. M. Johan
sson & M. V. Wiles; Mol. Cell. Biol., 15,141, 199
5）。R. Wang（Development, 114, 303, 1992）、Y. Sh
irayoshiら（Genes Cells 2, 213, 1997）の報告の方法
により、ＥＢから内皮細胞（endothelial cell）へ分化
誘導することができる。W. Risauら（Development, 10
2, 471, 1988）、R.Wang（Development, 114, 303, 199
2）、D. Vittetら（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94,
6273, 1997）の報告の方法によりＥＢから血管へ分化
誘導することができる。また、T. C. Doetschmanら（J.
Embryol. Exp. Morphol., 87, 27, 1985）、R. Wang
（Development, 114, 303, 1992）、M. V. Wiles & G.
Keller（Development, 111, 259, 1991）、H. R. Snodg
rassら（J. Cell Biochem., 49,225, 1992）、M. H. Li
ndenbaum & F. Grosveld（Genes Dev., 4, 2075, 199
0）の報告の方法によりＥＢから血島（blood island）
等の造血が行われている組織や造血細胞へ分化誘導する
ことができる。

【０１０２】この際、ＩＬ−１１、ＩＬ−１、ＳＣＦ、
ＩＬ−６、ＶＥＧＦの添加により造血前駆細胞への分化
誘導を促進することができ（G. Kellerら; Mol. Cell.
Biol., 13, 473, 1993; L. G. Biesecker & S. G. Emer
son; Exp. Hematol., 21, 774, 1993; M. Kennedyら; N
ature, 386, 488, 1997）、ＥＰＯの添加により赤血球
系造血細胞への分化誘導を促進することができ（U. Bur
ketら; New Biol., 3,698, 1991; M. V. Wiles & G. Ke
ller; Development, 111, 259, 1991）、ＩＬ−３、Ｍ
−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの添加により骨髄系造血細胞へ
の分化誘導を促進することができ（M. V. Wiles & G. K
eller; Development, 111, 259, 1991;M. H. Lindenbau
m & F. Grosveld; Genes Dev., 4, 2075, 1990）、ＩＬ
−７やＩＬ−２の添加、あるいは低酸素状態での培養に
よりリンパ球系造血細胞への分化誘導を促進することが
できる（U. Chenら; Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8
9, 2541, 1992; A. J. Potocnikら; EMBO J., 13, 527
4, 1994; N. Nakayamaら;Blood, 91, 2283, 1998）。ま
た、ＶＥＧＦの添加により、ＣＤ３４陽性細胞への分化
誘導を促進することができ、出現したＣＤ３４陽性細胞
をＭ−ＣＳＦ欠損マウス頭蓋冠由来のストローマ細胞Ｏ
Ｐ９と共培養することによりＢリンパ球やＮＫ細胞に分
化することができる（N. Nakayamaら; Blood, 91, 228
3, 1998）。さらに、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよび内皮細胞
株であるＤ４Ｔ細胞の培養上清の添加により、血液細胞
と内皮細胞の共通の前駆体細胞である血管芽細胞（hema
ngioblast）への分化誘導を促進することができる（A.
C. Schuhら; Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96, 2159,
1999; K. Choiら; Development, 125, 725, 1998; M.K
ennedyら; Nature, 386, 488, 1997）。

【０１０３】T. C. Doetschmanら（J. Embryol. Exp. M
orphol., 87, 27, 1985）、S. L. Leeら（J. Biol. Che
m., 270, 9971, 1995）の報告の方法により、ＥＢから
軟骨細胞（chondrocyte）へ分化誘導することができ
る。T. C. Doetschmanら（J. Embryol. Exp. Morphol.,
87, 27, 1985）、W. C. Miller-Hanceら（J. Biol. Ch
em., 268, 25244, 1993）の報告の方法によりＥＢから
骨格筋（skeletal muscle）へ分化誘導することができ
る。T. C. Doetschmanら（J. Embryol. Exp. Morphol.,
87, 27, 1985）、W. A. Ngら（Pediatr. Res., 41, 28
5, 1997）の報告の方法により、ＥＢから平滑筋（smoot
h muscle）へ分化誘導することができる。T. C. Doetsc
hmanら（J. Embryol. Exp. Morphol., 87, 27, 1985）
の報告の方法により、ＥＢから心筋（cardiac muscle）
へ分化誘導することができる。骨格筋、平滑筋、心筋へ
の分化誘導は、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfo
xide;ＤＭＳＯ）やＴＧＦ−βの添加により促進するこ
とができる（H. G. Slagerら;J. Cell. Physiol., 156,
247, 1993; J. Dinsmoreら; Cell Transplant., 5, 13
1, 1996）。

【０１０４】S. Okabeら（Mech. Dev., 59, 89, 199
6）、G. Yamadaら（Biochem. Biophys.Res. Commun., 1
99, 552, 1994）の報告の方法により、ＥＢから神経性
外胚葉（neural ectoderm）へ分化誘導することができ
る。T. C. Doetschmanら（J. Embryol. Exp. Morphol.,
87, 27, 1985）、G. Bainら（Dev. Biol., 168, 342,
1995）の報告の方法により、ＥＢから神経（neuron）へ
分化誘導することができる。S. Okabeら（Mech. Dev.,
59, 89, 1996）、G. Yamadaら（Biochem. Biophys. Re
s. Commun., 199, 552, 1994）、G. Bainら（Dev. Bio
l., 168, 342, 1995）の報告の方法により、ＥＢからグ
リア細胞（Glial cell）へ分化誘導することができる。
神経性外胚葉、神経、グリア細胞への分化誘導は、レチ
ノイン酸（retinoic acid）、ｂＦＧＦ、ＮＧＦの添加
により促進することができる。C. Baguttiら（Dev. Bio
l., 179, 184, 1996）の報告の方法により、ＥＢから上
皮細胞（epithelial cell）へ分化誘導することができ
る。C. Baguttiら（Dev. Biol., 179, 184, 1996）の報
告の方法により、ＥＢからケラチノサイト（keratinocy
te）へ分化誘導することができる。T. C. Doetschmanら
（J. Embryol. Exp. Morphol., 87, 27, 1985）の報告
の方法により、ＥＢからメラノサイト（melanocyte）へ
分化誘導することができる。C. Daniら（J. Cell Sci.,
110, 1279, 1997）の報告の方法により、ＥＢから脂肪
細胞（adipocyte）へ分化誘導することができる。脂肪
細胞への分化誘導は、レチノイン酸（retinoic acid）
の添加により促進することができる。

【０１０５】以上の報告に記載された方法を本発明のＥ
Ｂ形成方法の後に行う、あるいは、本発明のＥＢ形成方
法と組み合わせて同時に行うことで、目的とする分化細
胞を効率よく誘導することができる。本発明の方法で形
成したＥＢをトリプシン−ＥＤＴＡ処理等でばらばらに
した後、回収した細胞を血清、ＩＬ−３、ＥＰＯ、ＧＭ
−ＣＳＦおよびＴＰＯを含む培地で培養することによ
り、造血幹細胞を効率よく誘導することができる。同様
にして該ＥＢから回収した細胞を血清およびＩＬ−７を
含む培地で培養することにより、Ｂ細胞を誘導すること
ができる。また、同様にして該ＥＢから回収した細胞を
血清およびＶＥＧＦを含む培地で培養することにより血
管内皮細胞を効率よく誘導することができる。血管内皮
細胞を誘導する場合は、フィブロネクチンでコートした
培養器上で培養することが好ましい。また、以上の分化
細胞の誘導方法において、該ＥＢから回収した細胞の培
養により得られた細胞のコロニーを、トリプシン−ＥＤ
ＴＡ処理等でばらばらにした後、再度同じ組成の培地
（造血幹細胞の場合は血清、ＩＬ−３、ＥＰＯ、ＧＭ−
ＣＳＦおよびＴＰＯを含む培地、Ｂ細胞の場合は血清お
よびＩＬ−７を含む培地、血管内皮細胞の場合は血清お
よびＶＥＧＦを含む培地）で培養することにより、さら
に多数の造血幹細胞、Ｂ細胞および血管内皮細胞を誘導
することができる。以上の分化細胞の誘導方法において
は、胚性幹細胞をＳＣＧＦまたはＢＭＰ−４のいずれか
と細胞外マトリックス蛋白質を含む無血清培地で培養す
ることにより形成されたＥＢよりも、胚性幹細胞をＳＣ
ＧＦ、ＢＭＰ−４および細胞外マトリックス蛋白質を含
む無血清培地で培養することにより形成されたＥＢを用
いる方が、さらに効率的に造血幹細胞、Ｂ細胞および血
管内皮細胞を誘導することができる。

【０１０６】胚性幹細胞は初期胚より樹立され、全能性
を持つ未分化な幹細胞として一時的に発生を止めた状態
で維持されている。胚性幹細胞が凝集しＥＢを形成する
と、あたかも初期胚の状態に戻ったかのように分化が誘
導され外胚葉細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞などが出現
する。上述の報告の様に、ＥＢ形成後、あるいはその過
程において、特定の機能性細胞の分化や増殖を促進ある
いは抑制する因子が作用すると分化細胞出現数やその効
率に大きな影響を与えることが知られている。本発明の
ＥＢ形成方法により無血清培養条件及び／又は血清培養
条件において効率的なＥＢ形成が可能となり、上述の公
知の方法と組み合わせることにより所望の分化した機能
性細胞を効率的にかつ多量に得ることができる。以下、
本発明のＥＢ形成方法と、該方法を工程として含む胚性
幹細胞の分化誘導法をまとめて、本発明の培養方法とい
う。

【０１０７】分化した細胞の精製方法は、公知となって
いる細胞分離精製の方法であればいずれも用いることが
できるが、その具体的例として、フローサイトメーター
を用いた方法（Antibodies, A Laboratory manual, Col
d Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)；Mon
oclonal Antibodies: principles and practice, Third
Edition, Acad. Press (1993)；Antibody Engineerin
g, A Practical Approach, IRL Press at Oxford Unive
rsity Press (1996)；Int. Immunol., 10, 275,(199
8)、Exp. Hematol., 25, 972, (1997)）、パニング法
（Monoclonal Antibodies: principles and practice,
Third Edition, Acad. Press (1993)；Antibody Engine
ering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford U
niversity Press (1996)；J. Immunol., 141, 2797, (1
988)）、ショ糖濃度の密度差を利用した細胞分画法（組
織培養の技術（第三版）,朝倉書店（1996））を挙げる
ことができる。

【０１０８】４．本発明の培養方法、細胞、分化誘導剤
の利用 （１）本発明の培養方法の利用 本発明の培養方法では、外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚
葉細胞、外胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞または内
胚葉由来の細胞を胚性幹細胞から分化誘導することがで
き、これら細胞の分化過程における生理活性物質（例え
ば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価
および活性評価に有用である。また、特定の遺伝子を改
変した胚性幹細胞を用いることにより、幹細胞が外胚葉
および外胚葉由来の細胞へ分化していく過程における、
該遺伝子の機能評価にも有用である。

【０１０９】本発明の培養方法の利用方法としては、例
えば、以下のものが挙げられる。 （ａ）本発明の培養方法を用いた、胚性幹細胞から機能
性細胞への分化調節に関連する物質の評価方法および薬
剤のスクリーニング方法

【０１１０】本発明の培養方法を用いることにより、培
地中に添加した被験物質の胚性幹細胞から機能性細胞へ
の分化の過程に及ぼす影響を評価することができる。被
験物質としては、培養系に加えることができるものであ
ればどのようなものでもよく、例えば、低分子化合物、
高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、遺伝
子、ウイルス、細胞などが挙げられる。遺伝子を効率的
に培養系に導入する方法としては、レトロウイルス、ア
デノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイ
ルス、レンチウイルス等のウイルスベクターに乗せて培
養系に添加する方法、またはリポソームなどの人工的な
べジクル構造に封入して培養系に添加する方法などが挙
げられる。その具体的例としては、組換えウイルスベク
ターを用いた遺伝子解析に関する報告（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 92, 6733, 1995;Nucleic Acids Res., 1
8, 3587, 1990; Nucleic Acids Res., 23, 3816, 199
5）を挙げることができる。被験物質の評価は、例え
ば、胚性幹細胞から機能性細胞への分化効率の質的また
は量的な変化を測定することで行なうことができる。

【０１１１】（ｂ）本発明の培養方法を用いた、胚性幹
細胞から分化誘導した機能性細胞の機能の調節に関連す
る物質の評価方法および薬剤のスクリーニング方法。本
発明の培養方法を用いることにより、培地中に添加した
被験物質の胚性幹細胞から分化誘導した機能性細胞の機
能の調節に及ぼす影響を評価することができる。被験物
質としては、培養系に加えることができるものであれば
どのようなものでもよく、例えば、低分子化合物、高分
子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、遺伝子、
ウイルス、細胞などが挙げられる。遺伝子を効率的に培
養系に導入する方法としては、レトロウイルス、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイル
ス、レンチウイルス等のウイルスベクターに乗せて培養
系に添加する方法、またはリポソームなどの人工的なべ
ジクル構造に封入して培養系に添加する方法などが挙げ
られる。その具体的例としては、組換えウイルスベクタ
ーを用いた遺伝子解析に関する報告（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 92, 6733, 1995; Nucleic Acids Res., 1
8, 3587, 1990; Nucleic Acids Res., 23, 3816, 199
5）を挙げることができる。被験物質の評価は、胚性幹
細胞から分化誘導した機能性細胞の機能の質的または量
的な変化を測定することで行なうことができる。具体的
な例としては、例えば、胚性幹細胞から分化誘導した神
経細胞を用いて活動電位を測定するvan Inzenらの方法
（Biochim. Biophys. Acta., 1312,21, 1996）が挙げら
れる。

【０１１２】（２）本発明の細胞を含有する医薬 発生工学技術により、個々人の胚性幹細胞を作成するこ
とも可能である。1997年、Wilmutらによって哺乳動物で
はじめて、体細胞の核由来のクローン個体である羊ドリ
ーが作出されて以来（I. Wilmutら; Nature, 385, 810,
1997）、胎児細胞の核を用いたクローンウシ（J. B. C
ibelliら; Science, 280, 1256, 1998）、皮膚、筋肉、
耳殻、卵管、卵丘細胞の核を用いたクローンウシ（入谷
明; 蛋白核酸酵素, 44, 892, 1999）、クローンヤギ
（A. Baguisiら; Nature Biotechnology, 17, 456, 199
9）、卵丘細胞の核を用いたクローンマウス（T. Wakaya
maら; Nature, 394, 369, 1998）、雄の尾の細胞を用い
たクローンマウス（T. Wakayamaら; Nature Genetics,
22, 127, 1999）、胚性幹細胞の核を用いたクローンマ
ウス（T. Wakayamaら; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9
6, 14984, 1999; W.M. Rideout IIIら; Nature Genetic
s, 24, 109, 2000）の作出が報告されており、体細胞の
核を脱核した受精卵に導入することで哺乳動物のクロー
ン個体を作成することが可能であることが示されてい
る。この核移植の技術と胚性幹細胞を樹立する技術を組
み合わせることで個々人の胚性幹細胞の作成が可能であ
り、個々人の胚性幹細胞から分化させた細胞は臓器移植
へ応用することができる（R. P. Lanzaら; Nature Medi
cine, 5, 975, 1999）。また、胚性幹細胞に遺伝子操作
を加えることで、より効果的な遺伝子治療を行うこと
や、組織適合性抗原の改変が可能となる（P. D. Rathje
nら; Reprod. Fertil. Dev., 10, 31, 1998）。

【０１１３】本発明の、胚性幹細胞から分化誘導した外
胚葉および外胚葉由来の細胞は、外胚葉由来の細胞の障
害に基づく疾患の治療薬として用いることができる。ま
た、本発明の、胚性幹細胞から分化誘導した中胚葉およ
び中胚葉由来の細胞は、中胚葉由来の細胞の障害に基づ
く疾患の治療薬として用いることができる。さらに、本
発明の、胚性幹細胞から分化誘導した内胚葉および内胚
葉由来の細胞は、内胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患
の治療薬として用いることができる。

【０１１４】外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患とし
ては、神経組織、松果体、副腎髄質、色素細胞あるいは
表皮組織を構成する細胞の障害に基づく疾患が挙げられ
る。

【０１１５】神経組織を構成する細胞の障害に基づく疾
患としては、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、
パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、ダウン症候
群、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経外傷、神
経毒物の障害に起因する疾患などが、松果体を構成する
細胞の障害に基づく疾患としては、松果体症、松果体機
能不全などが、副腎髄質を構成する細胞の障害に基づく
疾患としては、副腎機能欠如症、副腎炎などが、色素細
胞の障害に基づく疾患としては、色素異常症、色素過剰
症などが、表皮組織を構成する細胞の障害に基づく疾患
としては火傷、外傷、創傷治癒、床擦れ、皮膚炎、表皮
症、乾せんなどが挙げられる。

【０１１６】中胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患とし
ては、筋組織、結合組織、骨組織、軟骨組織、循環器、
血液組織、真皮、泌尿器あるいは生殖器を構成する細胞
の障害に基づく疾患が挙げられる。

【０１１７】筋組織を構成する細胞の障害に基づく疾患
としては、筋肉不全症、筋無緊張症、重症筋無力症など
が、結合組織を構成する細胞の障害に基づく疾患として
は、結合組織病、結合組織炎、糖尿病などが、骨組織を
構成する細胞の障害に基づく疾患としては、骨粗鬆症、
骨関節炎、骨形成異常症、骨硬化症、骨髄炎、骨形成不
全症などが、軟骨組織を構成する細胞の障害に基づく疾
患としては、変形関節炎、慢性関節リウマチ、軟骨形成
不全症、軟骨発育不全症、軟骨形成異常症などが、循環
器を構成する細胞の障害に基づく疾患としては、心筋梗
塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、ＳＬＥ、狭心症、高血圧
症、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、
動脈硬化、再狭窄、血栓、虚血性心疾患、虚血性脳疾
患、心不全、うっ血、脈絡膜循環障害などが、血液組織
を構成する細胞の障害に基づく疾患としては、ＨＩＶ感
染、敗血症、移植片―対―宿主疾患、アレルギー、アト
ピー、喘息、花粉症、気道過敏、自己免疫疾患などが、
真皮を構成する細胞の障害に基づく疾患としては、火
傷、外傷、皮膚炎、乾せんなどが、泌尿器を構成する細
胞の障害に基づく疾患としては、溶血性尿毒症症候群、
腎炎などが、生殖器を構成する細胞の障害に基づく疾患
としては、性器発育不全症、性器発育異常などが挙げら
れる。

【０１１８】内胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患とし
ては、消化管、呼吸器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀
胱、中耳、肝臓あるいは膵臓を構成する細胞の障害に基
づく疾患が挙げられる。

【０１１９】消化管を構成する細胞の障害に基づく疾患
としては、胃潰瘍、胃炎、十二指腸潰瘍などが、呼吸器
を構成する細胞の障害に基づく疾患としては、肺気腫、
肺水腫、肺炎、気管支炎、気管支喘息などが、胸腺を構
成する細胞の障害に基づく疾患としては、胸腺炎、胸腺
リンパ形成不全症、胸腺機能減退症などが、甲状腺を構
成する細胞の障害に基づく疾患としては、甲状腺無形成
症、甲状腺機能不全症などが、副甲状腺を構成する細胞
の障害に基づく疾患としては、副甲状腺機能低下症など
が、膀胱を構成する細胞の障害に基づく疾患としては、
膀胱炎、膀胱破裂などが、中耳を構成する細胞の障害に
基づく疾患としては、中耳炎などが、肝臓を構成する細
胞の障害に基づく疾患としては、肝臓紫斑病、慢性Ｂ型
肝炎、Ｃ型肝炎などが、膵臓を構成する細胞の障害に基
づく疾患としては、糖尿病などが挙げられる。

【０１２０】外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治
療薬、中胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療薬、
又は内胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療薬とし
ては、移植医療に利用可能な、障害を受けた細胞の機能
と同じ機能を有する細胞、障害を受けた細胞の前駆細
胞、障害を受けた細胞の機能を代償する細胞、障害を受
けた細胞の再生を促進する機能を有する細胞が用いられ
る。該治療薬は、本発明の方法を用いることにより、Ｅ
Ｓ細胞より分化誘導し精製することにより製造できる。

【０１２１】該治療薬は、移植医療の目的に用いられる
場合、血清やウイルス等の不純物の混入が無いことが求
められる。本発明の方法によれば、無血清培養条件下
で、外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞、外胚葉由来
の細胞、中胚葉由来の細胞または内胚葉由来の細胞を分
化誘導することができるため、移植医療の目的に適して
いる。

【０１２２】細胞の精製方法は、公知となっている細胞
分離精製の方法であればいずれも用いることができる
が、その具体的例として、フローサイトメーターを用い
た方法（Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)；Monoclona
l Antibodies: principles and practice, Third Editi
on, Acad. Press (1993)；Antibody Engineering, A Pr
actical Approach, IRLPress at Oxford University Pr
ess (1996)；Int. Immunol., 10, 275, (1998)、Exp. H
ematol., 25, 972, (1997)）、パニング法（Monoclonal
Antibodies: principles and practice, Third Editio
n, Acad. Press (1993)；Antibody Engineering, A Pra
ctical Approach, IRL Press at Oxford University Pr
ess (1996)；J. Immunol., 141, 2797, (1988)）、ショ
糖濃度の密度差を利用した細胞分画法（組織培養の技術
（第三版）,朝倉書店（1996））を挙げることができ
る。

【０１２３】移植の方法としては、対象となる疾患に適
した方法であればいずれの方法も用いることができ、疾
患ごとにそれぞれの疾患に適した公知の方法が知られて
いる。例えば、パーキンソン病患者に対する中絶胎児の
脳細胞を移植する方法として知られている、Nature Neu
roscience 2, 1137, 1999等に記載の方法が挙げられ
る。

【０１２４】（３）本発明の分化誘導剤を含有する医薬 本発明の分化誘導剤は、外胚葉由来の細胞の障害に基づ
く疾患の治療薬、中胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患
の治療薬、あるいは内胚葉由来の細胞の障害に基づく疾
患の治療薬として用いることができる。

【０１２５】外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患、中
胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患、内胚葉由来の細胞
の障害に基づく疾患としては、４．（２）に記載した疾
患が挙げられる。

【０１２６】本発明の分化誘導剤を有効成分として含有
する医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能で
はあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一
つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技
術分野においてよく知られている任意の方法により製造
した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは
水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブ
ミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が
用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるた
めの緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容され
る添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、
乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等
を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、
使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。

【０１２７】投与経路は、治療に際し最も効果的なもの
を使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、
気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口
投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧
剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座
剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。

【０１２８】経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シ
ロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげら
れる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物
は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエ
チレングリコール、プロピレングリコール等のグリコー
ル類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒ
ドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリー
フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤
として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆
粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の
賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、
ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビ
ニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラ
チン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリ
セリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

【０１２９】非経口投与に適当な製剤としては、注射
剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、
塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる
担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪
またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、
噴霧剤は該有効成分そのもの、ないしは受容者の口腔お
よび気道粘膜を刺激せず、かつ該有効成分を微細な粒子
として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製
する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示
される。該有効成分および用いる担体の性質により、エ
アロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。ま
た、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として
例示した成分を添加することもできる。

【０１３０】投与量または投与回数は、目的とする治療
効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なる
が、通常成人１日当たり10μｇ/kg〜８mg/kgである。

【０１３１】本発明に係わる適用動物としては、脊椎動
物、中でも温血動物、さらにはマウス、ラット、モルモ
ット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳動物あるいはニワ
トリが挙げられる。

【０１３２】以下の実施例により本発明をより具体的に
説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものに
すぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

【０１３３】

【実施例】実施例１ ＥＢの無血清培養 胚性幹細胞として、129/SvJマウスの胎生3.5日胚の内部
細胞塊より樹立されたＥＳ細胞GSI-1（Genome Systems
Inc.社製）（以下、単に「ＥＳ細胞」ともいう）を用
い、各種無血清培養条件下でＥＢを形成させその培養の
持続性を試験した。

【０１３４】ＥＳ細胞GSI-1は、Dulbecco MEM培地（ Li
fe Technologies社製）に１６％の牛胎児血清（fetal c
alf serum; Hyclone社製）、２ｍＭグルタミン、１００
μＭ MEM Non-Essential Amino Acids溶液、１０ｍＭ
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１００μＭ ２―メルカ
プトエタノールおよび１，０００Ｕ／ｍＬ ＬＩＦ（ESG
RO Murine LIF;ライフテックオリエンタル株式会社製）
を加えた培地（以下、「ＥＳ培地」と呼ぶ）を用い、Mani
pulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Sec
ond Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1
994)に記載の方法に従い、フィーダー細胞上で未分化な
形質を保ちながら培養したものを実験に供した。

【０１３５】フィーダー細胞は、Manipulating the Mou
se Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Col
d Spring Harbor Laboratory Press (1994)に記載の方
法に準じ、Dulbecco MEM培地（ Life Technologies社
製）に１０％の牛胎児血清（fetal calf serum; Hyclon
e社製）、２ｍＭグルタミン、１００μＭ MEM Non-Esse
ntial Amino Acids溶液および１００μＭ ２−メルカ
プトエタノールを加えた培地（以下、「ＭＥＦ培地」と呼
ぶ）を用いてほぼコンフルエント状態にまで培養したマ
ウス胎児初代培養繊維芽細胞ＭＥＦ（mouse embryonic
fibroblast;ライフテックオリエンタル株式会社製 商品
番号YE9284600）を、Dulbecco MEM培地（GIBCO/BRL社
製）に５％の牛胎児血清（fetal calf serum; Hyclone
社製）、２ｍＭグルタミン、１００μＭ MEM Non-Essen
tial Amino Acids溶液、１００μＭ２−メルカプトエタ
ノールおよび１０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣを加えた
培地で２.５時間培養し、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺不含リン酸バ
ッファー（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製、以下「ＰＢＳ
（−）」と呼ぶ）溶液で３回洗浄後、１ｍＭＥＤＴＡお
よび０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ（−）溶液を加
え単一細胞状態にし、ＭＥＦ培地に懸濁後、約１００,
０００細胞／ｃｍ²の細胞密度でゼラチンコートした培
養器に播種し、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣ
Ｏ₂インキュベーターにて１日間培養したものを実験に
用いた。

【０１３６】ＥＳ細胞の無血清培養は以下のように行っ
た。ＩＭＤＭ培地（GIBCO/BRL社製）に５０μＭ ２−
メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、１％牛血清
アルブミン（Stem Cell Technologies社製）、１０μｇ
／ｍｌ牛膵インスリン（Stem Cell Technologies社
製）、２００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Stem C
ell Technologies社製）および４０μｇ／ｍｌ低比重リ
ポプロテイン（low density lipoprotein; LDL、Sigma
社製）を加えた培地（以下、「無血清基本培地」と呼ぶ）
を基本培地として用い、この無血清基本培地に各種蛋白
性因子を添加した培地を調製し、２,０００細胞／ｍＬ
の細胞濃度でＥＳ細胞を懸濁し、６穴プレートに１ｍｌ
づつ播種後、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ
₂インキュベーターで２０日間培養を行い、ＥＢの形成
の有無、数、形態の変化等を倒立顕微鏡下で観察した。
ＥＢを染色する場合には、メイギムザ染色法を用いて行
った。

【０１３７】ＥＳ細胞は、無血清培養開始の２日前に、
コンフルエント濃度の１０分の１になるように継代した
細胞を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１ｍＭＥＤＴＡお
よび０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ（−）溶液を加
え３７℃で５分間インキュベーションを行うことで単一
細胞状態にし、各種蛋白性因子を添加した無血清基本培
地に２,０００細胞／ｍＬの細胞濃度に懸濁したものを
調製して実験に用いた。

【０１３８】６穴プレートは、市販の細胞培養用プレー
ト（岩城硝子株式会社製）、コラーゲンＴｙｐｅＩコー
トプレート（岩城硝子株式会社製）、コラーゲンＴｙｐ
ｅIVコートプレート（岩城硝子株式会社製）、ゼラチン
コートプレート（岩城硝子株式会社製）、フィブロネク
チンコートプレート（BECTON DICKINSON社製BIOCOAT Ce
llware）、ラミニンコートプレート（BECTON DICKINSON
社製BIOCOAT Cellware）、または、ポリーＤ−リジンコ
ートプレート（BECTON DICKINSON社製BIOCOAT Cellwar
e）を実験に用いた。

【０１３９】蛋白性因子は、マウス造血幹細胞増殖因子
（mouse stem cell growth factor;以下ＳＣＧＦとも略
す）、マウス造血幹細胞因子（mouse stem cell facto
r;以下ＳＣＦとも略す、R&D Systems社製）、マウスｆ
ｌｋ―２／ｆｌｔ３リガンド（mouse flk-2/flt3 ligan
d; 以下ＦＬとも略す、R&D Systems社製）、マウスイン
ターロイキン３（mouse interleukin 3; 以下ＩＬ−３
とも略す、R&D Systems社製）、マウストロンボポイエ
チン（mouse thrombopoietin; 以下ＴＰＯとも略す、R&
D Systems社製）、マウス血管内皮増殖因子（mouse vas
cular endothelial growth factor; 以下ＶＥＧＦとも
略す、Pepro Tech社製）、ヒトエリスロポイエチン（hu
man erythropoietin; 以下ＥＰＯとも略す、キリンビー
ル株式会社製）、マウスインターロイキン６（mouse in
terleukin 6; 以下ＩＬ−６とも略す、Pepro Tech社
製）、または、マウスインターロイキン１１（mouse in
terleukin 11; 以下ＩＬ−１１とも略す、R&D Systems
社製）を単独あるいは複数を無血清基本培地に添加し実
験に用いた。各種蛋白性因子ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬ、
ＩＬ−３、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−６、およ
びＩＬ−１１の無血清基本培地への添加濃度はそれぞ
れ、５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍ
Ｌ、５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍ
Ｌ、１ｕｎｉｔ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍ
Ｌとした。なお、ＳＣＧＦは参考例１で調製したものを
用いた。

【０１４０】２０日間培養を行った結果を図１に示し
た。細胞培養用プレートあるいはポリ−Ｄ−リジンコー
トプレートを用いて培養を行った場合には、上述の各種
蛋白性因子を添加してもＥＢの形成は全く観察されなか
った。また、細胞外マトリックス蛋白質をコートしたプ
レートでも、無血清基本培地に上述の蛋白性因子を添加
しない場合には、ＥＢの形成は全く観察されなかった。
一方、上述の蛋白性因子を添加した無血清基本培地を用
いた場合には、フィブロネクチンを筆頭に、以下ゼラチ
ン、コラーゲンタイプＩＶ、コラーゲンタイプＩ、ラミ
ニンでコートしたプレートの順に良好なＥＢの形成が観
察され、ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３およびＴＰ
Ｏらの蛋白性因子が良好なＥＢの出現に効果的である可
能性が示唆された。図２にフィブロネクチンコートプレ
ートでのＥＢの出現の様子を示した。

【０１４１】実施例２ ＥＢ形成の経時変化 無血清培養下でのＥＢの形成の様子を観察するために、
フィブロネクチンコートしたプレートと、ＳＣＧＦ、Ｓ
ＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＩＬ−
１１を添加した無血清基本培地を用い、実施例１に記載
の方法に従ってＥＳ細胞GSI-1の無血清培養を行った。

【０１４２】ＥＳ細胞は、播種後４日目頃からプレート
の底部で小さなコロニーを形成し始め、１２日目には大
きなＥＢへと成長していった。成長したＥＢはその後２
０日を越えて維持された。図３に１２日目のＥＢの写真
を示した。

【０１４３】実施例３ ＥＢの形成に影響を与える蛋白
性因子の解析―その１；無血清培地に添加する蛋白性因
子について― ＥＢの形成に影響を与える蛋白性因子について解析する
ために、フィブロネクチンコートしたプレートと、ＳＣ
ＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３あるいはＴＰＯの各因子
を単独または複数添加した無血清基本培地を用い、実施
例１に記載の方法に従ってＥＳ細胞GSI-1の無血清培養
を行った。

【０１４４】結果を図４に示した。上記蛋白性因子を単
独で加えた場合にはＥＢの形成は観察されなかった。２
因子を組み合わせた場合には、ＳＣＧＦとＳＣＦを組み
合わせた場合のみでＥＢの形成が観察された。３因子を
添加した培地を用いた場合には、ＳＣＧＦ、ＳＣＦ及び
ＦＬの組み合わせ、ＳＣＧＦ、ＳＣＦ及びＩＬ−３の組
み合わせ、 ＳＣＧＦ、ＳＣＦ及びＴＰＯの組み合わせ
の場合にＥＢの形成が観察された。４因子を添加した培
地を用いた場合には、 ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬ及びＩ
Ｌ−３の組み合わせ、ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬ及びＴＰ
Ｏの組み合わせ、ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＴＰ
Ｏの組み合わせ、ＳＣＧＦ、ＦＬ、ＩＬ−３及びＴＰＯ
の組み合わせの場合にＥＢの形成が観察された。以上の
結果から、無血清培養条件下でＥＢを形成させるには、
ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬの蛋白性因子が特に重要であ
ることが明らかになった。

【０１４５】実施例４ ＥＢの形成に影響を与える蛋白
性因子の解析―その２；プレートをコートする細胞外マ
トリックス蛋白質について― ＥＢの形成に影響を与える蛋白性因子について解析する
ために、ＳＣＧＦとＳＣＦを添加した無血清基本培地
と、フィブロネクチンコートプレートあるいは通常の細
胞培養用プレートを用い、実施例１に記載の方法に従っ
てＥＳ細胞GSI-1の無血清培養を行った。この際、ＥＳ
細胞の播種細胞濃度を変化させることで細胞密度の影響
も合わせて検討した。

【０１４６】まず、フィブロネクチンコートプレートを
用いてＥＢを出現させた場合に、播種細胞濃度がどのよ
うな影響を示すか検討した（図５）。無血清基本培地に
ＳＣＧＦとＳＣＦを添加した培地を用いた場合には、播
種細胞濃度１,５００細胞／ｍＬの培養からＥＢの形成
が観察され、播種細胞濃度４,０００細胞／ｍＬで培養
した場合に３５個のＥＢの形成が観察された。播種細胞
濃度を５,０００細胞／ｍＬ以上にすると、生じてきた
ＥＢがお互いに融合し計測が不可能となった。また、無
血清基本培地のみを用いた場合でも、播種細胞濃度２,
５００細胞／ｍＬ以上からＥＢの形成が観察されたが、
このＥＢの形成効率はＳＣＧＦとＳＣＦを添加した無血
清基本培地を用いた場合に比べて明らかに低かった。

【０１４７】次に、通常の細胞培養用プレートと無血清
基本培地を用い、ＥＳ細胞の播種細胞濃度を変えてＥＢ
が出現するか否か検討した。フィブロネクチンコートプ
レートを用いた場合とは異なり、播種細胞濃度１,５０
０細胞／ｍＬ、２,０００細胞／ｍＬ、２,５００細胞／
ｍＬ、３,５００細胞／ｍＬ、４,０００細胞／ｍＬのい
ずれの場合にもＥＢの形成は観察されなかった。

【０１４８】以上の結果から、無血清培養条件下でＥＢ
を形成させるには、ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、フィブロネクチ
ンの蛋白性因子が重要であることが明らかになった。

【０１４９】実施例５ 血清培地中でのＥＢの形成 上述した無血清培地でのＥＢの形成効率を、血清培地を
用いた場合と比較するために、Dulbecco MEM培地（GIBC
O/BRL社製）に２０％の牛胎児血清（fetal calf serum;
Hyclone社製）、２ｍＭグルタミン、１００μＭ MEM N
on-Essential Amino Acids溶液、１０ｍＭHEPES、１０
０μＭ ２―メルカプトエタノールを加えた血清培地を
用い、ＥＳ細胞GSI-1の培養を以下のように行った。

【０１５０】ＥＳ細胞は、試験開始の２日前に、コンフ
ルエント濃度の１０分の１になるように継代した細胞
を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１ｍＭ ＥＤＴＡおよ
び０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ（−）溶液を加え
３７℃で５分間インキュベーションを行うことで単一細
胞状態にし、上述の血清培地に２,０００細胞／ｍＬの
細胞濃度に懸濁したものを調製して実験に用いた。２,
０００細胞／ｍＬの細胞濃度に調製したＥＳ細胞を、市
販の細胞培養用６穴プレート（岩城硝子株式会社製）に
１ｍＬづつ播種後、３７℃で５％の二酸化炭素を通気し
たＣＯ₂インキュベーターで２０日間培養を行い、形成
されたＥＢの数を倒立顕微鏡下で観察した。

【０１５１】形成されたエンブリオイドボディの数は、
血清のロットによって変動する傾向が観察されたが、低
い場合で４個、平均で１２個程度であった。

【０１５２】実施例６ 血清培地中でのＥＢの形成に及
ぼす蛋白性因子の効果 無血清培養でのＥＢの形成に効果のあった蛋白性因子
が、血清培養でも効果を有するか検討するために、蛋白
性因子を添加した血清培地を用いてＥＳ細胞の培養を行
った。

【０１５３】蛋白性因子としては、ＳＣＧＦ、ＳＣＦ、
ＦＬ、ＩＬ−３、ＴＰＯを用いた。実施例５に記載の方
法に従い、上記蛋白性因子を単独あるいは複数添加した
血清培地を用い、ＥＳ細胞GSI-1の培養を行った。各蛋
白性因子の添加濃度は実施例１に記載した濃度とした。

【０１５４】図６に出現したＥＢの数を経時的に観察し
た結果を示した。ＳＣＧＦを添加した培地を用いたとこ
ろ、顕著なエンブリオイドボディの形成促進の効果が観
察された。一方、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３およびＴＰＯ
を添加した培地を用いた場合には若干のＥＢの形成促進
の効果が観察されたが、ＳＣＧＦ単独の効果には及ばな
かった。さらに、ＳＣＧＦを添加した培地にＳＣＦ、Ｆ
Ｌ、ＩＬ−３およびＴＰＯを加えても、ＳＣＧＦ単独の
場合と比べて有為な効果は観察されなかった。以上の結
果から、ＳＣＧＦは強いエンブリオイドボディの形成促
進効果を有しているものと示唆された。

【０１５５】実施例７ ＳＣＧＦ添加無血清培養により
形成されたＥＢからの分化細胞の増殖 実施例１に記載の方法に従い、フィブロネクチンコート
した６穴プレートを用いて、ヒトＳＣＧＦ（参考例２に
従って調製したものを用いた）、マウスＳＣＧＦ、マウ
スＳＣＦの各因子を単独または複数添加した無血清基本
培地（因子無添加、マウスＳＣＧＦ、ヒトＳＣＧＦ、マ
ウスＳＣＦ、マウスＳＣＧＦおよびＳＣＦ、ヒトＳＣＧ
ＦおよびマウスＳＣＦ）を用いて、マウスＥＳ細胞GSI-
1の無血清培養を行った。各因子の添加濃度は全て５０
ｎｇ／ｍＬずつで行った。ただし、播種するＥＳ細胞の
濃度は３５００細胞／ｍＬで行い、３７℃で５％の二酸
化炭素を通気したＣＯ₂インキュベーターで１２日間培
養を行った。形成されたＥＢの数は、マウスＳＣＧＦお
よびマウスＳＣＦを添加した培養あるいはヒトＳＣＧＦ
およびマウスＳＣＦを添加した培養で他の培養よりもや
や数が多かったが、どの培養においても１０個前後であ
った。

【０１５６】各培養ごとに、形成された全てのＥＢをＰ
ＢＳ（−）で２回洗浄後、０．０５％トリプシンを含む
０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（GIBCO/BRL 社製）で
３７℃、８〜１０分消化した。剥離した単一細胞全量を
１０％牛胎児血清（fetal calf serum；以下ＦＣＳと略
す、Stem Cell Technologies 社製）添加ＩＭＤＭ培地
（GIBCO/BRL 社製）に容量１．５ｍＬになるように浮遊
させた。この回収細胞浮遊液の０．４ｍＬに、５０ｎｇ
／ｍＬマウスＩＬ−３、１ｕｎｉｔ／ｍＬヒトＥＰＯ、
２０ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ−ＣＳＦ（Pepro Tech社
製）、２０ｎｇ／ｍＬマウスＴＰＯ（各因子の濃度は回
収細胞浮遊液に加えて２ｍＬになったときの濃度を示し
た）をそれぞれ含む２０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭ培地（以
下、この培地を造血因子添加培地と称する）１．６ｍＬ
を加えて細胞培養用６穴プレート（Costar 社製）にそ
れぞれ播種し、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣ
Ｏ₂インキュベーターで７〜１０日間培養を行い、生じ
たコロニー（以下、ＥＢに由来する細胞の培養から生じ
たコロニーを２次分化コロニーとよぶこともある。）の
細胞をメイ−グリュンワルト−ギムザ（May-Grunwald-G
iemsa）染色し、コロニー数を数えた。その結果を図９
および図１０に示したが、マウスＳＣＧＦまたはヒトＳ
ＣＧＦをＥＳ細胞に添加した培養により形成されたＥＢ
からは、細胞が増殖し１００〜１６０個程度の多数のコ
ロニーが生じたのに対し、マウスＳＣＦのみを添加した
培養により形成されたＥＢからは、２０個以下の少数の
コロニーしか生じず、無血清基本培地のみ（因子無添
加）の培養により形成されたＥＢからはコロニーが生じ
なかった。また、ヒトまたはマウスＳＣＧＦとマウスＳ
ＣＦを共に添加した培養とヒトまたはマウスＳＣＧＦを
単独で添加した培養からそれぞれ形成されたＥＢから生
じたコロニー数に大きな差は見られなかった。このこと
から、ＥＳ細胞の無血清培養により形成されたＥＢに分
化因子を加えて培養し、細胞の分化を誘導し増殖させる
ためには、ＥＳ細胞の培養時にＳＣＧＦを存在させるこ
とが重要であり、ＳＣＦは必ずしも必要でないこと、Ｅ
Ｂの形成時に、ＳＣＧＦは単独でＥＳ細胞から分化した
細胞への方向づけ（プライミング）をできることがわか
った。また、マウスＥＳ細胞に対してはＳＣＧＦであれ
ば種差はなく、マウスＳＣＧＦであってもヒトＳＣＧＦ
であっても同様の効果を示すことが見出された。

【０１５７】なお、ＥＢから回収した細胞の培養をＦＣ
Ｓ非添加（造血因子は添加）の条件あるいは、造血因子
非添加（ＦＣＳは添加）の条件で行った場合は、どちら
の条件でも、ヒトまたはマウスＳＣＧＦを添加した無血
清培養により形成されたＥＢからの２次分化コロニーの
形成は殆ど見られなかった。造血因子非添加の条件で培
養を行った結果を図１１に示す。ヒトまたはマウスＳＣ
ＧＦを添加した無血清培養により形成されたＥＢから生
じたコロニーは１個あたり１．５〜３．０×１０⁴個の
細胞からなっており、そのメイ−グリュンワルト−ギム
ザ染色したサイトスピン標本の顕微鏡観察から、核／細
胞質比の大きな好塩基性細胞質の小円型未熟細胞や核／
細胞質比の小さな顆粒や空胞を有する細胞質の大型細胞
など多彩な細胞から構成されていることがわかった。図
１２にヒトＳＣＧＦ単独添加培養により形成されたＥＢ
から生じたコロニーにおいて観察された種々の細胞を示
す。

【０１５８】実施例８ ＳＣＧＦまたはＢＭＰ−４添加
無血清培養により形成されたＥＢからの造血幹細胞の取
得 （１）ＳＣＧＦまたはＢＭＰ−４添加無血清培養により
形成されたＥＢからの造血幹細胞への分化 個体発生の過程で胎生期の造血分化誘導に影響すること
が知られているＢＭＰ−４をＥＳ細胞の培養時に添加し
た場合の、ＥＢからの造血分化へのプライミングの効果
を以下のようにして検証した。実施例７と同様にしてＥ
Ｓ細胞GSI-1の無血清培養を行い、ＥＢを形成させた。
ただし、培地は、ヒトＳＣＧＦ、ヒトＢＭＰ−４（R&D
Systems社製）の各因子をそれぞれ単独または両者とも
添加した無血清基本培地を用い、各因子の添加濃度は全
て５０ｎｇ／ｍＬずつで行った。形成したＥＢの数は、
どの培養でも１０個前後で差はなかった。実施例７と同
様にして、それぞれのＥＢから細胞浮遊液１．５ｍＬを
回収し、その０．４ｍＬに、（ａ）造血因子添加培地ま
たは（ｂ）５０ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＧＦを含む造血因子
添加培地１．６ｍＬを加えて、実施例７と同様に培養
し、生じた２次分化コロニーの細胞の染色を行い、コロ
ニー数を数えた。その結果、図１３に示すように、いず
れのＥＢからも造血因子の添加培養により、多数のコロ
ニーが生じ、ＳＣＧＦだけでなくＢＭＰ−４によっても
分化へのプライミングができることがわかった。なお、
各ＥＢとも（ａ）と（ｂ）の培地でコロニー数に差はな
く、２次分化コロニーの形成時におけるＳＣＧＦの添加
によるコロニー数の増加はみられなかった。

【０１５９】それぞれのＥＢの細胞を、上記の（ａ）造
血因子添加培地または（ｂ）造血因子＋ヒトＳＣＧＦの
添加培地で培養した場合に生じた、２次分化コロニーの
細胞の細胞膜表面形質を、EPICS XL フローサイトメー
ター（Coulter 社製）を用いたシングルカラーフローサ
イトメトリーにより解析した。解析は、２次分化コロニ
ーの細胞について、まず前方および側方散乱蛍光を測定
し、それぞれ規定の数値内の細胞群を回収し行った。標
識抗体は、ＦＩＴＣ標識抗Ｂ２２０抗体（Caltag社
製）、ＦＩＴＣ標識抗Ｓｃａ−１抗体（Caltag社製）、
Ｒ−ＰＥ標識抗ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗体（Caltag
社製）、Ｒ−ＰＥ標識抗ＣＤ３４抗体（Caltag社製）の
各ラットモノクローナル抗体を用いた。同時に各抗体の
ＦＩＴＣあるいはＲ−ＰＥ標識ラットアイソタイプＩｇ
Ｇ２ａあるいはＩｇＧ２ｂ（いずれもCaltag社製）を陰
性対照として解析し、陰性対照で得られる最大蛍光強度
以上に染色される細胞を陽性とし、解析全細胞に占める
陽性細胞率を測定した。各抗体との反応は各メーカー指
定の方法に従った。

【０１６０】その結果、造血幹細胞に特異的な細胞膜表
面形質であるＳｃａ−１は８〜１４％の細胞に、ＣＤ３
４は２〜６％の細胞に、ＣＤ１１７は１０〜１４％の細
胞に陽性で、少数のＢ細胞系Ｂ２２０陽性細胞も認めら
れた。図１４にヒトＳＣＧＦおよびヒトＢＭＰ−４添加
無血清培養により形成されたＥＢに由来する細胞を造血
因子添加培地で培養した場合の、２次分化コロニーの細
胞膜表面形質の解析を示した。これら陽性細胞の実数を
計算すると、図１５に示すように、ＥＳ細胞３５００個
から、ＳＣＧＦ単独、ＢＭＰ−４単独または両者の併用
により、それぞれ４〜８×１０⁵個のＳｃａ−１陽性細
胞、１〜４×１０⁵個のＣＤ３４陽性細胞、４〜７×１
０⁵個のＣＤ１１７陽性細胞が得られたことになる。以
上のように、ＳＣＧＦまたはＢＭＰ−４を添加した培養
によりＥＳ細胞から形成したＥＢを適当な造血因子（Ｉ
Ｌ−３、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＰＯ）と血清を
添加した培地で培養することにより、ＥＳ細胞は造血幹
細胞に分化し、大量の造血幹細胞を取得できることが見
出された。

【０１６１】（２）２次分化コロニーの細胞の培養 さらに、上記の各培養条件で得られた２次分化コロニー
から、実施例７のＥＢと同様にして細胞浮遊液を回収
し、２次分化コロニーの形成時と同様の条件で培養を行
ったところ、生じるコロニー（以下、このような２次分
化コロニーの細胞の培養により生じたコロニーを３次分
化コロニーとも称する。）の数はさらに増加した（図１
６）。３次分化コロニーの数は、ＥＳ細胞の無血清培養
時に添加する因子が、ＳＣＧＦ＜ＢＭＰ−４＜ＳＣＧＦ
＋ＢＭＰ−４の順に増加した。この傾向は、図１７に示
したコロニーを構成する細胞のメイ−グリュンワルト−
ギムザ染色したサイトスピン標本の顕微鏡観察でも明瞭
であった。３次分化コロニーを構成する細胞は２次分化
コロニーの構成細胞と同様、各種細胞からなる不均一な
細胞集団であった。

【０１６２】以上のようにして得られた３次分化コロニ
ーの構成細胞の細胞膜表面形質を、（１）と同様にし
て、シングルカラーフローサイトメトリーにより解析し
た。その結果、Ｓｃａ−１は９〜１９％の細胞に、ＣＤ
３４は１０〜２６％の細胞に、ＣＤ１１７は１４〜１８
％の細胞に陽性で、少数のＢ２２０陽性細胞も認められ
た。図１８にヒトＳＣＧＦ添加無血清培養から形成され
たＥＢに由来する細胞の造血因子添加培地による培養で
得られた２次分化コロニーの細胞を、さらに造血因子添
加培地で培養した場合の３次分化コロニーの構成細胞の
細胞膜表面形質の解析を示した。全体に造血幹細胞特異
的な細胞膜表面形質の陽性率は２次分化コロニーの構成
細胞を上回っていたが、特にＣＤ３４陽性細胞の増加が
顕著であった。これら陽性細胞を実数を計算すると、図
１９に示すように、ＥＳ細胞３５００個から、ＳＣＧＦ
単独、ＢＭＰ−４単独または両者の併用により、それぞ
れ５〜２０×１０⁵個のＳｃａ−１陽性細胞、５〜２５
×１０⁵個のＣＤ３４陽性細胞、５〜１５×１０⁵個のＣ
Ｄ１１７陽性細胞が得られたことになる。特に、ＢＭＰ
−４とＳＣＧＦの両者を添加したＥＳ細胞の培養から得
られた陽性細胞数は、それぞれの因子単独の添加の場合
の３〜５倍に上昇した。

【０１６３】実施例９ ＳＣＧＦまたはＢＭＰ−４添加
無血清培養により形成されたＥＢからのＢ細胞の分化 実施例８（１）と同様にして、ヒトＳＣＧＦ、ヒトＢＭ
Ｐ−４の各因子をそれぞれ単独または両者とも添加した
無血清基本培地を用いてＥＳ細胞GSI-1からＥＢを形成
させた。実施例７と同様にして、それぞれのＥＢから細
胞浮遊液１．５ｍＬを回収し、その０．４ｍＬに、５０
ｎｇ／ｍＬ（回収細胞浮遊液に加えて２ｍＬになったと
きの濃度）マウスＩＬ−７を含む２０％ＦＣＳ添加ＩＭ
ＤＭ培地１．６ｍＬを加えて、実施例７と同様に培養し
た。その結果、いずれのＥＢからも多数の２次分化コロ
ニーが生じることがわかった。さらに、上記の各培養条
件で得られた２次分化コロニーから、実施例８（２）と
同様にして３次分化コロニーを形成させたところ、図２
０に示すように、コロニーの数はさらに増加した。この
３次分化コロニーの構成細胞の細胞膜表面形質を、実施
例８（１）と同様にして、ＦＩＴＣ標識抗Ｂ２２０ラッ
トモノクローナル抗体（Caltag社製）抗体を用いたシン
グルカラーフローサイトメトリーにより解析した。その
結果、図２１に示すように、Ｂ細胞系の細胞に特異的な
細胞表面形質Ｂ２２０の陽性細胞が認められ、Ｂ細胞系
の細胞を得ることができることがわかった。

【０１６４】実施例１０ ＳＣＧＦまたはＢＭＰ−４添
加無血清培養により形成されたＥＢからの血管内皮細胞
の分化 実施例８（１）と同様にして、ヒトＳＣＧＦ、ヒトＢＭ
Ｐ−４の各因子をそれぞれ単独または両者とも添加した
無血清基本培地を用いてＥＳ細胞GSI-1からＥＢを形成
させた。実施例７と同様にして、それぞれのＥＢから細
胞浮遊液１．５ｍＬを回収し、その０．４ｍＬに、
（ｃ）５０ｎｇ／ｍＬマウスＶＥＧＦまたは（ｄ）５０
ｎｇ／ｍＬマウスＶＥＧＦと５０ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＧ
Ｆ（示した各因子の濃度は回収細胞浮遊液に加えて２ｍ
Ｌになったときの濃度）を含む２０％ＦＣＳ添加ＩＭＤ
Ｍ培地１．６ｍＬを加えて、実施例７と同様に培養し
た。ただし、培養には細胞培養用６穴プレートの代わり
に、フィブロネクチンでコートした６穴プレート（Bect
on Dickinson社製、BIOCOAT Cellware）を用いた。生じ
たコロニーの細胞の染色を行い、コロニー数を数えた。
その結果、図１３に示すように、いずれのＥＢからも多
数の２次分化コロニーが生じることがわかった。なお、
各ＥＢとも造血因子添加培地の場合と同様に、（ｃ）と
（ｄ）の培地でコロニー数に差はなく、２次分化コロニ
ーの形成時におけるＳＣＧＦの添加によるコロニー数の
増加はみられなかった。さらに、上記の各培養条件で得
られた２次分化コロニーから、実施例８（２）と同様に
して３次分化コロニーを形成させたところ、図２２に示
すように、コロニーの数はさらに増加した。

【０１６５】得られた３次分化コロニーを構成する細胞
の細胞膜表面形質を、ＬＳＡＢユニバーサルキット（Da
ko社製）を用いた免疫組織化学により同定した。細胞を
４％パラホルムアルデヒド固定し、１次モノクローナル
抗体としてラット抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）抗体
（Caltag社製）あるいはマウス抗ＣＤ１４４（ＶＥ−カ
ドヘリン）抗体（Santa Cruz社製）と反応させ、ビオチ
ン標識２次抗体、アルカリホスファターゼ標識ストレプ
トアビジンと順次反応後、ニューフクシンで発色しマイ
ヤーヘマトキシリンでカウンター染色した。陰性対照１
次抗体としてそれぞれラットＩｇＧ２ａ（Zymed社製）
およびマウスＩｇＧ１（Dako社製）を使用した。アルカ
リホスファターゼ発色基質にレバミゾールを加えること
により内因性アルカリホスファターゼをブロックした。
なお詳細な反応条件はメーカー指定の方法に従った。そ
の結果、血管内皮細胞に特異的な膜表面形質であるＣＤ
１４４（ＶＥ−カドヘリン）陽性細胞およびＣＤ３１
（ＰＥＣＡＭ−１）陽性細胞を認めた。図２３に、ヒト
ＳＣＧＦとヒトＢＭＰ−４添加無血清培養により形成さ
れたＥＢから、マウスＶＥＧＦおよびヒトＳＣＧＦを添
加した培養により得られた３次分化コロニーの構成細胞
の免疫組織化学の結果を示す。

【０１６６】また、ヒトＳＣＧＦ、ヒトＢＭＰ−４の各
因子をそれぞれ単独または両者とも添加した無血清培養
により形成させたＥＢから、マウスＶＥＧＦおよびヒト
ＳＣＧＦを添加した培養により得られた３次分化コロニ
ーの構成細胞について、以下のようにして発現遺伝子の
解析を行った。３次分化コロニーの構成細胞から、RNea
sy（Qiagen社製）を使用して全ＲＮＡを調製した。続い
てSUPERSCRIPT II（Invitrogen社製）によりcDNAを逆転
写し、ポリメラーゼチェーン反応（polymerasechain re
action; PCR）により、血管内皮細胞に特異的な遺伝子
の発現を検出した。ＰＣＲに用いたプライマーおよびそ
のＰＣＲ産物のサイズを表１に示す。

【０１６７】

【表１】

【０１６８】ＰＣＲはTaKaRa Taq(宝酒造社製)、GeneAm
p PCR System 9600（Perkin-Elmer社製）を用いて行っ
た。まず９４℃で５分加熱後、各遺伝子について表２に
示す条件を繰り返し、最後に７２℃５分加熱し４℃で冷
却した。ＰＣＲ産物を４．５％ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動の後、SYBR Green I（宝酒造社製）で染色
し、Molecular Imager FX（Bio-Rad社製）で検出した。

【０１６９】

【表２】

【０１７０】その結果、図２４に示すように、どの３次
分化コロニーの構成細胞についても、血管内皮細胞に特
異的な遺伝子であるｃ−ｆｌｋ−１、ｃ−ｆｌｔ−１、
ｃ−ｔｉｅ−１、ｃ−ｔｉｅ−２、ＣＤ３１（ＰＥＣＡ
Ｍ−１）、ＣＤ３４、フォンウイルブランド因子および
ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）の発現を認めた。

【０１７１】比較例１ 従来法における無血清培養での
ＥＢの形成 ジョハンソン（Johansson）らの報告（B. M. Johansson
& M. V. Wiles; Mol.Cell. Biol., 15, 141, 1995）に
従って、インスリン、トランスフェリン、アルブミンを
含有する無血清培地を用いてＥＳ細胞GSI-1の培養を行
った。

【０１７２】無血清培地は、ＩＭＤＭ培地（GIBCO/BRL
社製）とＦ１２培地（GIBCO/BRL社製）を等量混合した
培地を基礎培地として用い、２ｍＭグルタミン、５ｍｇ
／ｍＬ牛血清アルブミン（Boehringer Mannheim社
製）、１５μｇ／ｍＬトランスフェリン（Boehringer M
annheim社製）、４５０μＭモノチオグリセロール、７
μｇ／ｍＬインスリン（GIBCO/BRL社製）および１倍濃
度の脂質（100x mixture chemically defined lipid co
ncentration; Life Technologies社製 カタログ番号066
-01905H）を添加した培地と、さらに１Ｕ／ｍＬ ＬＩ
Ｆ（ESGRO Murine LIF;ライフテックオリエンタル株式
会社製）を添加した培地を調製し実験に用いた。

【０１７３】ＥＳ細胞は、無血清培養開始の２日前に、
コンフルエント濃度の１０分の１になるように継代した
細胞を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１ｍＭ ＥＤＴＡ
および０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ（−）溶液を
加え３７℃で５分間インキュベーションを行うことで単
一細胞状態にし、上述のいずれかの無血清培地に５,０
００細胞／ｍｌの細胞濃度に懸濁したものを調製して実
験に用いた。

【０１７４】ＥＳ細胞の無血清培養は以下のように行っ
た。５,０００細胞／ｍｌの細胞濃度に調製したＥＳ細
胞を、市販の細菌培養用３５ｍｍデッシュ（岩城硝子株
式会社製）に１ｍＬづつ播種後、３７℃５％の二酸化炭
素を通気したＣＯ₂インキュベーターで培養を行い、形
成されたＥＢの形態を倒立顕微鏡下で観察した。

【０１７５】ＬＩＦを添加していない培地を用いて培養
した場合には、３日後には細胞が死滅し、ジョハンソン
（Johansson）らの報告の結果を再現した。また、ＬＩ
Ｆを添加した場合でも細胞の長期間に渡る維持は難し
く、１週間以上の培養ではＥＢの形成がほとんど観察さ
れなかった。

【０１７６】参考例１ ＳＣＧＦの調製 １）発現ベクターの作製 動物細胞用発現ベクターpAGE210（WO96/34016）のHindI
II/KpnI処理断片をマウスSCGFポリペプチドをコードす
るDNA（WO98/08869）と連結したマウスＳＣＧＦ発現ベ
クターpAGE-mSCGFの構築を以下のように行った(図７参
照)。

【０１７７】３μｇのpBluescript II SK+(STRATAGENE
社製)を制限酵素HindIIIとKpnIで消化し、ＢＡＰ（宝酒
造株式会社製）処理した後、フェノールクロロホルム処
理、クロロホルム処理、エタノール沈殿し、最終的に水
に溶解した。配列番号１記載のマウスＳＣＧＦ ｃＤＮ
Ａのうち、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコード
する部分をＰＣＲ法を利用して調製した。正方向プライ
マーとしては配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド
を、逆方向プライマーとして配列番号４に記載のオリゴ
ヌクレオチドを使用した。合成オリゴヌクレオチドは固
相法を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作製し
た。各オリゴヌクレオチドの精製は、ＯＰＣカートリッ
ジを使用して行った。クローン21-1C4-5H6（PCT国際公
開WO98/08869）約１００ｎｇを鋳型として、５０μＬ反
応液中でNative Pfu Polymerase(1.25単位；STRATAGENE
社製)によるＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、１０％ Ｄ
ＭＳＯ存在下、それぞれ正方向プライマー、逆方向プラ
イマー５０μＭを使用し、ＰＣＲ工程(１サイクルは変
性９４℃；１分間、アニーリング５０℃；１分間、ポリ
メラーゼ反応７２℃；４分間からなる)を２０サイクル
行い、最後に７２℃で７分間反応させた。得られたＰＣ
Ｒ産物をフェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿
を行い制限酵素HindIIIとKpnIで消化した。該反応液を
アガロースゲル電気泳動により分画し、ゲルから１，０
００ｂｐ付近のＤＮＡ断片を切り出し、精製し、ＴＥ緩
衝液に溶出した。該ＰＣＲ増幅物のHindIII/KpnI処理断
片とpBluescript II SK+のHindIII/KpnI処理断片とを連
結し、大腸菌DH5α株(CLONTECH社製)を形質転換し、図
７に示すpB-mSCGFを得た。得られたクローンが正確なマ
ウスＳＣＧＦ ｃＤＮＡの配列を有することは自動ＤＮ
Ａシークエンサー(ABI社製373)によって確認した。

【０１７８】３μｇのpAGE210を制限酵素HindIIIとKpnI
で消化し、ＢＡＰ（宝酒造株式会社製）処理した後、フ
ェノールクロロホルム処理、クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿し、最終的に水に溶解した。pB-mSCGFを制限酵
素HindIIIとKpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動に
より分画し、ゲルから１，０００ｂｐ付近のＤＮＡ断片
を切り出し、精製し、ＴＥ緩衝液に溶出した。該断片と
pAGE210のHindIII/KpnI処理断片とを連結し、大腸菌DH5
α株(CLONTECH社製)を形質転換し、図７に示すpAGE-mSC
GFを得た。

【０１７９】なお、図７中のpSEはシミアン・ウィルス
(simian virus) 40 (SV40)初期遺伝子プロモータを示し
Hygはハイグロマイシン耐性遺伝子を示し、dhfrはジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を示し、P1はpBR322由来P1プロ
モータを示し、Ptkはヘルペス・シンプレクス・ウィル
ス(Herpes simplex virus; HSV)チミジンキナーゼ(tk)
遺伝子のプロモータを示し、ABGはラビットβグロブリ
ン遺伝子ポリA付加シグナルを示し、ASEはシミアン・ウ
ィルス(simian virus) 40 (SV40)初期遺伝子ポリA付加
シグナルを示す。

【０１８０】２）動物細胞におけるマウスＳＣＧＦポリ
ペプチドの発現 動物細胞へのプラスミドの導入は、宮地らの方法に従
い、エレクトロポレーション法（Miyaji et.al., Cytot
echnology, 3, 133-140, 1990）を用いて行った。上記
で得られたpAGE-mSCGFを、dhfr遺伝子を欠損したＣＨＯ
細胞（Urlaub andChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 77, 4216-4220, 1980）４×１０⁶個あたり４μｇ導
入後、１０ｍＬのMEMα（核酸含有: Life Technologies
社製）−５％血清（Life Technologies社製）培地に懸
濁し、９６-well plate (岩城硝子社製)にまいた。３７
℃の５％ ＣＯ₂インキュベータ中で２４時間培養した
後、ハイグロマイシン（Life Technologies社製）を
０．３ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、１−２週間培養
し耐性株を得た。これら耐性株を２４-well plateに継
代培養し、メトトレキセート（ＭＴＸ）を５０ｎＭ含む
MEMα(核酸非含有: Life Technologies社製）−５％透
析血清（Life Technologies社製）培地で培養した。Ｍ
ＴＸ耐性を獲得した細胞株のうち、抗ＳＣＧＦ抗体を用
いたウェスタンブロッティング（PCT国際公開WO98/0886
9）によりマウスＳＣＧＦを多く生産していることが確
認された細胞を拡大培養し、EXCELL301 (JRH社製)に培
地を交換して４日から１０日間培養した。細胞を遠心操
作によって除去し、マウスＳＣＧＦポリペプチドを含む
培養上清サンプルを得た。

【０１８１】３）ＣＨＯ細胞培養上清からのマウスＳＣ
ＧＦの精製 得られたＣＨＯ細胞培養上清４００ｍＬは、セルロース
アセテートろ過膜（ミニザルトプラス、ザルトリウス社
製）でろ過した後、亜鉛イオン固定化キレーティングセ
ファロースＦａｓｔＦｌｏｗ担体（ファルマシア社製）
を充填したカラム（１５ｍｍ ｘ １００ｍｍ）に負荷
した。０．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを十分洗浄後、０
〜１００ｍＭヒスチジン直線濃度勾配で溶出した。各溶
出分画についてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、銀染色（２Ｄ-銀染色試
薬-II「第一」、第一化学薬品社製）で検出される約４７
ｋＤａのバンドを多く含む約４５ｍＭ〜７０ｍＭヒスチ
ジン溶出分画を回収した。

【０１８２】このヒスチジン溶出分画３０ｍLに終濃度
が６５％となるように１２．９ｇの硫酸アンモニウムを
添加し、攪拌溶解した。４℃下で2時間放置した後、１
８８００Ｇで３０分間遠心して得た沈殿物に９ｍＬの１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、攪拌
溶解した。

【０１８３】溶解液は１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマト
グラフィーカラム（５ｍｍ×５０ｍｍ、ファルマシア社
製）に負荷した。平衡化液で十分洗浄後、０〜１．０Ｍ
塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出した。各溶出分画に
ついてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色で検出される約
４７ｋＤａのバンドを多く含む約３５０ｍＭ〜５００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム溶出分画を回収した。

【０１８４】ここで得た溶出分画３ｍＬは限外ろ過膜
（マイクロコン１０、ミリポア社製）で濃縮した後、Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲ
ルろ過クロマトグラフィーカラム（１０ｍｍ×３００ｍ
ｍ、ファルマシア社製）に負荷した。各溶出分画につい
てＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色で検出される約４７
ｋＤａのバンドを多く含む溶出体積Ｖｅが１１．５ｍＬ
〜１３．５ｍＬの分画を回収した。この最終分画は２−
メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ-ＰＡＧＥを行っ
たところ、クマジーブルー染色で約４７ｋＤａの単一バ
ンドを示した（図８）。

【０１８５】精製マウスＳＣＧＦのＮ末端アミノ酸配列
はタンパク質化学の常法に従って決定した。精製分画を
２-メルカプトエタノール還元下でＳＤＳ-ＰＡＧＥを行
った後、Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａの方法（Ｊ．Ｂ．
Ｃ．２６２、１００３５―１００３８、１９８７）に従
いＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、アプライドバイオシ
ステムズ社）へ電気的に転写した。転写した膜をクマジ
ーブルー染色して得られた約４７ｋＤａ付近のバンドを
切り出し、気相プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−１
０、島津製作所社製）を用いてメーカー推奨の方法によ
りＮ末端アミノ酸配列を解析した。得られたアミノ酸配
列を配列番号５に記載したが、マウスＳＣＧＦ遺伝子配
列から推定される開始メチオニン残基から２２残基目の
アラニン残基からの配列に一致した。

【０１８６】参考例２ ヒトＳＣＧＦの調製 （１）ヒトＳＣＧＦ発現用プラスミドpAGE-SCGFαの構
築および動物細胞での発現 動物細胞用発現ベクターpAGE210（WO96/34016）のHindI
II／KpnI処理断片とヒトＳＣＧＦをコードするＤＮＡ
（Mioら; Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 124,
1998）とを連結することにより、ヒトＳＣＧＦ発現ベク
ターpAGE-SCGFαを構築した。

【０１８７】動物細胞へのプラスミドの導入は宮地等の
方法（Cytotechnology, 3, 133, 1990）に従いエレクト
ロポレーション法により行った。４μｇのpAGE-SCGFα
を４×１０⁶個のｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株（Url
aub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 42
16-4220, 1980）へ導入した。この細胞を１０ｍＬのMEM
α2000-dFCS(5)培地〔透析ＦＣＳを５％、７．５％ Na
HCO₃を１／４０量、２００ｍＬグルタミン溶液（GIBCO/
BRL社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶
液（GIBCO/BRL社製、５０００単位／ｍＬペニシリンお
よび５０００ ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）を
０．５％含むMEMα2000培地（GIBCO/BRL社製）〕に懸濁
し、１０ｃｍプレート（IWAKI社製）に入れ、３７℃の
ＣＯ₂インキュベーター中で２４時間培養した。ハイグ
ロマイシン（GIBCO/BRL社製）を終濃度０．３ｍｇ／ｍ
Ｌになるよう添加し、さらに１〜２週間培養した。形質
転換細胞がコンフルエントになった時点で回収し、ハイ
グロマイシンを０．３ｍｇ／ｍＬ、メトトレキセート
（methotrexate；ＭＴＸ）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むMEM
α2000-dFCS(5)培地に１〜２×１０⁶細胞／ｍＬになる
ように懸濁し、Ｆ７５フラスコ（Greiner社製）に２ｍ
Ｌ分注した。１〜２週間の培養後、５０ｎｍｏｌ／ＬＭ
ＴＸ耐性の細胞を０．３ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン、
２００ｎｍｏｌ／ＬＭＴＸ含有MEMα2000-dFCS(5)培地
に１〜２×１０⁵細胞／ｍＬになるように懸濁し、Ｆ７
５フラスコ（Greiner社製）に２ｍＬ分注した。１〜２
週間の培養後、２００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性の細胞
を得た。この２００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性細胞を１
０ｍｇ／Ｌのアプロチニン（aprotinin；Sigma社製）を
含む無血清EX-CELL 301培地（JRH Biosciences社製）を
用い、２Ｌのローラーボトル（Greiner社製）で３７
℃、８０回転／分で培養を行った。約５日間の培養後、
細胞を遠心操作により分離し、培養上清サンプルを得
た。

【０１８８】（２）ＫＭ２１４２を用いたウェスタンブ
ロッティングによるヒトＳＣＧＦの存在確認 抗ヒトＳＣＧＦモノクローナル抗体ＫＭ２１４２（WO98
/08869に記載の方法により作製した）を用いたウェスタ
ンブロッティングにより、ヒトＳＣＧＦの存在の有無に
ついて、以下の方法により実施した。以下の（３）で記
述するヒトＳＣＧＦのクロマトグラフィー精製における
各精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、P. Matsudair
aの方法（J. Biol. Chem., 262, 10035, 1987）に従っ
てＰＶＤＦ膜（Immobilon Transfer Membrane、ミリポ
ア社製）へ電気的に転写した。転写膜はブロッキング溶
液〔１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（１３７ｍｍ
ｏｌ／Ｌ NaCl、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ KCl、９．６ｍ
ｍｏｌ／ｌ Na₂HPO₄/KH₂PO₄ ｐＨ７．２）〕中で３０
分間振盪した後、ブロッキング溶液で１ｍｇ／ｍＬに希
釈したＫＭ２１４２を含む溶液中で室温６０分間振盪し
た。該転写膜はさらに０．０５％ Tween 20を含むＰＢ
Ｓで５分間洗浄を２回、ＰＢＳでの５分間洗浄を１回実
施した後、パーオキシダーゼで標識された抗ラットＩｇ
Ｇ抗体（DAKO社製）をＰＢＳで１／１０００に希釈した
溶液中で室温６０分間振盪した。０．０５％ Tween 20
を含むＰＢＳで５分間洗浄を２回、ＰＢＳでの５分間洗
浄を１回実施した後、発光法（ECL Western blottingde
tection reagents、アマシャム ファルマシア バイオテ
ク社製）により検出した。

【０１８９】（３）ＣＨＯ細胞培養上清からのヒトＳＣ
ＧＦの精製 （１）で得られたＣＨＯ細胞培養上清から、ヒトＳＣＧ
Ｆを以下の３段階のクロマトグラフィーにより精製取得
した。 第１段階：亜鉛キレートクロマトグラフィー Zn²⁺イオンで飽和させたChelating Sepharose Fast Flo
w担体（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）
を径５．０ｃｍ×２０ｃｍのカラム（BioRad社）に１
４．５ｃｍの高さまで充填し、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナ
トリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．１）で平衡化した。これに上記（１）で得
たＣＨＯ細胞培養上清１２Ｌを添加し、同平衡化液で十
分に洗浄後、０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン直線濃
度勾配で溶出した。溶出画分の一部を用いてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行い、上記（２）で示したＫＭ２１４２による
ウェスタンブロッティングで交差する約４５ｋＤａのバ
ンドを含む画分を回収した。

【０１９０】第２段階：MonoQ陰イオン交換クロマトグ
ラフィー 上記亜鉛キレートクロマトグラフィー粗精製画分に終濃
度５０％となるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌
後、４℃で２時間放置した。１８８００×ｇで３０分間
遠心して得られた沈澱を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同トリス−塩酸緩衝液
で平衡化したMonoQ HR 10/10 カラム（アマシャム ファ
ルマシア バイオテク社）に添加した。平衡化液で十分
洗浄後、０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム直線濃度勾配
で溶出した。溶出画分の一部を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行い、上記（２）で示したＫＭ２１４２によるウェス
タンブロッティングで交差する約４５ｋＤａのバンドを
含む画分を回収した。

【０１９１】第3段階：S-400ゲルろ過クロマトグラフィ
ー Sephacryl S-400 HR担体（アマシャム ファルマシア バ
イオテク社）をXK50/60カラム（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク社）に５１．５ｃｍの高さまで充填した
カラムとXK50/100カラム（アマシャム ファルマシア バ
イオテク社）に９３ｃｍの高さまで充填したカラムを直
列に連結し、ＰＢＳで十分平衡化した。これに上記Mono
Q陰イオン交換クロマトグラフィー精製画分２８ｍＬを
添加し、６ｍＬ／分の流速でＰＢＳにより溶出した。溶
出画分の一部を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、上記
（２）で示したＫＭ２１４２によるウェスタンブロッテ
ィングで交差する約４５ｋＤａのバンドを含む画分を回
収した。この最終精製品のSDS-PAGEにおけるパターン
（クマジーブルー染色）を図２５に示す。

【０１９２】

【発明の効果】本発明により、血清培養、無血清培養い
ずれの培養条件においても、胚性幹細胞からＥＢを効率
的に形成させることができる。

【０１９３】

【配列表のフリーテキスト】配列番号３−人工配列の説
明：マウスＳＣＧＦ ｃＤＮＡコード領域の増幅とその
５’末端へのHindIII認識部位作成のための正方向プラ
イマー配列番号４−人工配列の説明：マウスＳＣＧＦ
ｃＤＮＡコード領域の増幅とその３’末端へのKpnI認識
部位作成のための逆方向プライマー

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> PROCESS OF FORMING AN EMBRYOID BODY AND USE THEREOF <130> P-36214-1 <150> JP 2001-110100 <151> 2001-04-09 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1399 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (132)..(1118) <400> 1 gaagctggca gaagaaggtc aaggggcttg tgagctgccc accagactgg gacacttgct 60 aggtctatac agcagtccta cccctggcat tctgacctct ctactatttg ggtgctggga 120 agcccagctg g atg cag gca gcc tgg ctc ttg ggg gcc cta gtg gtc cct 170 Met Gln Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Leu Val Val Pro 1 5 10 cag ctt ttg agt ttt ggt cat gga gcc cga ggt cct ggg agg gag tgg 218 Gln Leu Leu Ser Phe Gly His Gly Ala Arg Gly Pro Gly Arg Glu Trp 15 20 25 gag gga ggc tgg gga ggt gcc ctg gag gag gag aga gag cgg gag tca 266 Glu Gly Gly Trp Gly Gly Ala Leu Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ser 30 35 40 45 cag atg ttg aag aat ctc cag gag gcc cta ggg ctg ccc act ggg gtg 314 Gln Met Leu Lys Asn Leu Gln Glu Ala Leu Gly Leu Pro Thr Gly Val 50 55 60 gga aat gag gat aat ctt gct gaa aac cct gaa gac aaa gag gtc tgg 362 Gly Asn Glu Asp Asn Leu Ala Glu Asn Pro Glu Asp Lys Glu Val Trp 65 70 75 gag acc aca gag act caa ggg gaa gaa gag gaa gag gaa atc acc aca 410 Glu Thr Thr Glu Thr Gln Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Thr Thr 80 85 90 gca cct tct tct agt ccc aac cct ttc ccc agc cct tct ccc aca cca 458 Ala Pro Ser Ser Ser Pro Asn Pro Phe Pro Ser Pro Ser Pro Thr Pro 95 100 105 gag gac act gtc act tac atc ttg ggc cgc ttg gcc agc ctc gat gca 506 Glu Asp Thr Val Thr Tyr Ile Leu Gly Arg Leu Ala Ser Leu Asp Ala 110 115 120 125 ggc cta cac caa ttg cac gtc cgt ctg cac gtt ttg gac acc cgt gtg 554 Gly Leu His Gln Leu His Val Arg Leu His Val Leu Asp Thr Arg Val 130 135 140 gtt gag ctg acc cag ggg ctg cgg cag ctg cgg gat gct gcg agt gac 602 Val Glu Leu Thr Gln Gly Leu Arg Gln Leu Arg Asp Ala Ala Ser Asp 145 150 155 acc cgc gac tca gtg caa gcc ctg aag gag gtc cag gac cgt gct gag 650 Thr Arg Asp Ser Val Gln Ala Leu Lys Glu Val Gln Asp Arg Ala Glu 160 165 170 cag gag cac ggc cgc ttg gag ggc tgc ctg aag ggc ctg cgc ctt ggc 698 Gln Glu His Gly Arg Leu Glu Gly Cys Leu Lys Gly Leu Arg Leu Gly 175 180 185 cac aag tgc ttc ctg ctc tcg cga gac ttc gag acc cag gcg gcg gcg 746 His Lys Cys Phe Leu Leu Ser Arg Asp Phe Glu Thr Gln Ala Ala Ala 190 195 200 205 cag gcg cgg tgc aag gcg cga ggt ggg agc tta gca cag cct gcg gac 794 Gln Ala Arg Cys Lys Ala Arg Gly Gly Ser Leu Ala Gln Pro Ala Asp 210 215 220 cgc cag caa atg gat gcg cta agc cgg tac tta cgc gcc gct ctc gcc 842 Arg Gln Gln Met Asp Ala Leu Ser Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Leu Ala 225 230 235 ccc tac aac tgg ccg gtg tgg ctg gga gtg cac gat cgg cgc tcc gag 890 Pro Tyr Asn Trp Pro Val Trp Leu Gly Val His Asp Arg Arg Ser Glu 240 245 250 ggg ctc tac ctt ttc gag aac ggc cag cgc gtg tct ttc ttc gcc tgg 938 Gly Leu Tyr Leu Phe Glu Asn Gly Gln Arg Val Ser Phe Phe Ala Trp 255 260 265 cac cgc gca ttc agc ctg gag tcc ggc gcc cag cct agt gcg gca aca 986 His Arg Ala Phe Ser Leu Glu Ser Gly Ala Gln Pro Ser Ala Ala Thr 270 275 280 285 cat cca ctc agc ccg gat cag ccc aat ggc ggc gtc ctg gag aac tgc 1034 His Pro Leu Ser Pro Asp Gln Pro Asn Gly Gly Val Leu Glu Asn Cys 290 295 300 gtg gcc cag gcc tca gac gac ggt tct tgg tgg gac cat gac tgt gag 1082 Val Ala Gln Ala Ser Asp Asp Gly Ser Trp Trp Asp His Asp Cys Glu 305 310 315 cgg cgc ctc tac ttc gtc tgc gag ttc ccc ttc tag agaaccggtc 1128 Arg Arg Leu Tyr Phe Val Cys Glu Phe Pro Phe 320 325 tctgcccagg agctctagtg cacattttgc accgtacacc gcgcacccta ttgttagggg 1188 cctgggagtc gctcagagat taagcgtgac catgaataca ttttaatcag aagaggtttt 1248 ttattttaga tactggcacc cagactgatt ggggccaggt gtgctcctga gattgcttcc 1308 aagatgcatt atcagcccag ggattttaaa ggcaaacccc acaagattgc atgtagcctg 1368 cttacatgta ggccggagca taaaaattta a 1399 <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Gln Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Leu Val Val Pro Gln Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Gly His Gly Ala Arg Gly Pro Gly Arg Glu Trp Glu Gly Gly 20 25 30 Trp Gly Gly Ala Leu Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ser Gln Met Leu 35 40 45 Lys Asn Leu Gln Glu Ala Leu Gly Leu Pro Thr Gly Val Gly Asn Glu 50 55 60 Asp Asn Leu Ala Glu Asn Pro Glu Asp Lys Glu Val Trp Glu Thr Thr 65 70 75 80 Glu Thr Gln Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Thr Thr Ala Pro Ser 85 90 95 Ser Ser Pro Asn Pro Phe Pro Ser Pro Ser Pro Thr Pro Glu Asp Thr 100 105 110 Val Thr Tyr Ile Leu Gly Arg Leu Ala Ser Leu Asp Ala Gly Leu His 115 120 125 Gln Leu His Val Arg Leu His Val Leu Asp Thr Arg Val Val Glu Leu 130 135 140 Thr Gln Gly Leu Arg Gln Leu Arg Asp Ala Ala Ser Asp Thr Arg Asp 145 150 155 160 Ser Val Gln Ala Leu Lys Glu Val Gln Asp Arg Ala Glu Gln Glu His 165 170 175 Gly Arg Leu Glu Gly Cys Leu Lys Gly Leu Arg Leu Gly His Lys Cys 180 185 190 Phe Leu Leu Ser Arg Asp Phe Glu Thr Gln Ala Ala Ala Gln Ala Arg 195 200 205 Cys Lys Ala Arg Gly Gly Ser Leu Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gln Gln 210 215 220 Met Asp Ala Leu Ser Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Leu Ala Pro Tyr Asn 225 230 235 240 Trp Pro Val Trp Leu Gly Val His Asp Arg Arg Ser Glu Gly Leu Tyr 245 250 255 Leu Phe Glu Asn Gly Gln Arg Val Ser Phe Phe Ala Trp His Arg Ala 260 265 270 Phe Ser Leu Glu Ser Gly Ala Gln Pro Ser Ala Ala Thr His Pro Leu 275 280 285 Ser Pro Asp Gln Pro Asn Gly Gly Val Leu Glu Asn Cys Val Ala Gln 290 295 300 Ala Ser Asp Asp Gly Ser Trp Trp Asp His Asp Cys Glu Arg Arg Leu 305 310 315 320 Tyr Phe Val Cys Glu Phe Pro Phe 325 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of a coding region of mouse SCGF cDNA and creation of a HindIII site at its 5' end <400> 3 cgccaagctt ccaccatgca ggcagcctgg cttttgg 37 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of a coding region of mouse SCGF cDNA and creation of a KpnI site at its 3' end <400> 4 ggggtacctt actagaaggg gaactcgcag acg 33 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> UNSURE <222> (8) <400> 5 Ala Arg Gly Pro Gly Arg Glu Xaa Glu Gly Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 tctgtggttc tgcgtggaga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 gtatcatttc caaccaccct 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 ctctgatggt gatcgtgg 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 catgcgtctg gccacttg 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 ctcactgccc tcctgactgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 cgatgtactt ggatataggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 gtcatggcca tggtcgagta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 ctcctcggca tcttgctgaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 ttacctctgg gatcccttca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 ccagaggtga ccaatgcaat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 ggatgcagag gctcacagag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 ctggcggttc acgttggact 20 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 atgatggaga ggttacacat ctctcag 27 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 19 ccagctcatc caccccactg agcag 25

【図面の簡単な説明】

【図１】は、細胞外マトリックス蛋白質をコートしたプ
レート上で胚性幹細胞を無血清培養した場合に形成され
るＥＢのコロニー数を示したグラフである。各カラム番
号は、図下部に示した各種蛋白性因子を含む無血清基本
培地を用いたことを示している。尚、ＣＭ^*はＳＣＦ、
ＦＬ、ＩＬ−３、ＴＰＯの４因子が含まれることを意味
している。

【図２】は、フィブロネクチンをコートしたプレート上
でＥＳ細胞を無血清培養した場合に形成されるＥＢの出
現の様子を示した写真である。各ウエルの左肩の番号
は、図下部に示した各種蛋白性因子を含む無血清基本培
地を用いたことを示している。尚、ＣＭ^*はＳＣＦ、Ｆ
Ｌ、ＩＬ−３、ＴＰＯの４因子が含まれることを意味し
ている。

【図３】は、フィブロネクチンをコートしたプレート上
でＥＳ細胞を無血清培養した場合に形成されるＥＢの顕
微鏡像の写真である。写真の左側に記した蛋白性因子を
含む無血清基本培地を用いた。尚、ＣＭ^*はＳＣＦ、Ｆ
Ｌ、ＩＬ−３、ＴＰＯの４因子を意味している。

【図４】は、フィブロネクチンをコートしたプレート上
でＥＳ細胞を無血清培養した場合に形成されるＥＢの出
現の様子を示した写真である。各ウエルの左肩の番号
は、図下部に示した各種蛋白性因子を含む無血清基本培
地を用いたことを示している。７番、１７番、１８番、
２７番のプレートで１個、１９番、２８番、３０番のプ
レートで２個、２９番のプレートで３個のＥＢの出現が
観察された。その他のプレートではＥＢの形成は観察さ
れなかった。

【図５】は、フィブロネクチンをコートしたプレート上
でＥＳ細胞を無血清培養した場合に形成されるＥＢのコ
ロニーの数が、播種するＥＳ細胞の細胞密度を変えた場
合にどのように変化したか示したグラフである。●はＳ
ＣＧＦとＳＣＦを含む無血清基本培地を用いた場合の結
果を、○は無血清基本培地のみを用いた場合の結果を示
している。

【図６】は、ＥＳ細胞を血清培養した場合に形成される
ＥＢのコロニーの数の変化を経時的に示したグラフであ
る。○は血清培地を用いた場合、●はＳＣＧＦを含む血
清培地を用いた場合、▲はＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３およ
びＴＰＯを含む血清培地を用いた場合、■はＳＣＧＦ、
ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ−３およびＴＰＯを含む血清培地を
用いた場合に形成されたＥＢの数を示している。

【図７】は、動物細胞でのマウスＳＣＧＦ発現用ベクタ
ーの構築過程を示した図である。

【図８】は、ＣＨＯ細胞で発現したマウスＳＣＧＦを精
製しＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った図で
ある（レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製マウ
スＳＣＧＦ）。

【図９】は、ＥＢから回収した細胞を造血因子添加培地
で培養し、生じた２次分化コロニーをメイ−グリュンバ
ルト−ギムザ染色した写真である。各ウェルの培養に用
いたＥＢは、ＥＳ細胞を、各ウェルの外に記載した因子
をそれぞれ添加した無血清培地で培養することにより形
成されたものである。

【図１０】は、横軸に示す因子をそれぞれ添加した無血
清培地で、３．５×１０³個のＥＳ細胞を培養すること
により形成されたＥＢ、およびそのＥＢから回収した細
胞を造血因子添加培地で培養することにより生じた２次
分化コロニーの数を示すグラフである。白い棒グラフは
ＥＢの数、黒い棒グラフは２次分化コロニーの数を示
す。

【図１１】は、ＥＢから回収した細胞を造血因子非添加
のＦＣＳ添加ＩＭＤＭ培地で培養し、生じた２次分化コ
ロニーをメイ−グリュンバルト−ギムザ染色した写真で
ある。各ウェルの培養に用いたＥＢは、ＥＳ細胞を、各
ウェルの下に記載した因子をそれぞれ添加した無血清培
地で培養することにより形成されたものである。

【図１２】の１〜６は全て、ＥＳ細胞のヒトＳＣＧＦ添
加無血清培養により形成されたＥＢから回収した細胞
を、造血因子添加培地で培養し、生じた２次分化コロニ
ーを構成する細胞について、メイ−グリュンバルト−ギ
ムザ染色したサイトスピン標本の顕微鏡写真の例であ
る。

【図１３】は、ＥＳ細胞の無血清培養で形成されたＥ
Ｂ、およびそのＥＢから回収した細胞の培養により生じ
た２次分化コロニーの数を示すグラフである。横軸にＥ
Ｓ細胞の無血清培養（１次培養）、ＥＢの細胞の培養
（２次培養）において、それぞれ添加した因子の組み合
わせ（＋は添加、−は非添加）を示す。白いバーはＥＢ
の数、黒いバーは２次分化コロニーの数を示す。

【図１４】は、ヒトＳＣＧＦおよびヒトＢＭＰ−４添加
無血清培養により形成されたＥＢから回収した細胞を造
血因子添加培地で培養することにより得られた２次分化
コロニーの構成細胞について、シングルカラーフローサ
イトメトリーによる膜表面形質の解析結果を示す図であ
る。左の図は、２次分化コロニーの各構成細胞の前方お
よび側方散乱蛍光の分布を示し、楕円で囲まれた細胞群
について、シングルカラーフローサイトメトリーによる
解析を行った。右の図は、上からＦＩＴＣ標識抗Ｓｃａ
−１抗体、Ｒ−ＰＥ標識抗ＣＤ３４抗体、Ｒ−ＰＥ標識
抗ＣＤ１１７抗体をそれぞれ用いたシングルカラーフロ
ーサイトメトリーの解析結果であり、それぞれの図の右
側のグラフが、各抗体を用いた解析、左側のグラフが陰
性対照を示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。
Ｍ２は陰性対照の蛍光強度の範囲を示し、Ｍ１は陽性細
胞とした蛍光強度の範囲を示す。

【図１５】は、３．５×１０³個のＥＳ細胞の無血清培
養により形成されたＥＢから回収した細胞の培養により
得られた２次分化コロニーにおける、横軸に示した各細
胞膜表面形質の陽性細胞実数を示すグラフである。グラ
フの下に、各バーにおける、ＥＳ細胞の無血清培養（１
次培養）、ＥＢの細胞の培養（２次培養）において、そ
れぞれ添加した因子の組み合わせを示す。

【図１６】は、横軸に示す因子をそれぞれ添加した無血
清培地で、３．５×１０³個のＥＳ細胞を培養すること
により形成されたＥＢ、そのＥＢから回収した細胞を造
血因子添加培地で培養することにより生じた２次分化コ
ロニー、および２次分化コロニーから回収した細胞を造
血因子添加培地で培養することにより生じた３次分化コ
ロニーの数を示すグラフである。白いバーはＥＢの数、
灰色のバーは２次分化コロニーの数、黒いバーは３次分
化コロニーの数を示す。

【図１７】は、各パネルの左上に示した因子を添加した
無血清培地でＥＳ細胞を培養することにより形成された
ＥＢから、造血因子添加培地を用いた培養により得られ
た３次分化コロニーについて、構成細胞のメイ−グリュ
ンバルト−ギムザ染色したサイトスピン標本の顕微鏡写
真である。

【図１８】は、ヒトＳＣＧＦ添加無血清培養から形成さ
れたＥＢから回収した細胞の造血因子添加培地による培
養で得られた３次分化コロニー構成細胞についてのシン
グルカラーフローサイトメトリーである。左上がＦＩＴ
Ｃ標識抗Ｓｃａ−１抗体、右上がＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ３
４抗体、左下がＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ１１７抗体をそれぞ
れ用いたシングルカラーフローサイトメトリーであり、
それぞれの図の薄い灰色のグラフが、各抗体を用いた解
析、濃い灰色のグラフが陰性対照の抗体を用いた解析を
示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。Ｍ２は陰
性対照の蛍光強度の範囲を示し、Ｍ１は陽性細胞とした
蛍光強度の範囲を示す。

【図１９】は３．５×１０³個のＥＳ細胞の無血清培養
により形成されたＥＢから回収した細胞の培養により得
られた３次分化コロニーにおける、横軸に示した各細胞
膜表面形質の陽性細胞実数を示すグラフである。グラフ
の下に、各バーにおける、ＥＳ細胞の無血清培養（１次
培養）、ＥＢの細胞の培養（２次培養）において、それ
ぞれ添加した因子の組み合わせを示す。

【図２０】は、横軸に示す因子をそれぞれ添加した無血
清培地で、３．５×１０³個のＥＳ細胞を培養すること
により形成されたＥＢ、そのＥＢから回収した細胞をＩ
Ｌ−７培地で培養することにより生じた２次分化コロニ
ー、および２次分化コロニーから回収した細胞をＩＬ−
７添加培地で培養することにより生じた３次分化コロニ
ーの数を示すグラフである。白いバーはＥＢの数、灰色
のバーは２次分化コロニーの数、黒いバーは３次分化コ
ロニーの数を示す。

【図２１】は、ヒトＳＣＧＦ添加無血清培養により形成
されたＥＢから回収した細胞のＩＬ−７添加培地による
培養で得られた３次分化コロニー構成細胞について、Ｆ
ＩＴＣ標識抗Ｂ２２０抗体を用いたシングルカラーフロ
ーサイトメトリーである。図の薄い灰色のグラフが抗Ｂ
２２０抗体を用いた解析、濃い灰色のグラフが陰性対照
の抗体を用いた解析を示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細
胞数を示す。Ｍ２は陰性対照の蛍光強度の範囲を示し、
Ｍ１は陽性細胞とした蛍光強度の範囲を示す。

【図２２】は、横軸に示す因子をそれぞれ添加した無血
清培地で、３．５×１０³個のＥＳ細胞を培養すること
により形成されたＥＢ、そのＥＢから回収した細胞をＶ
ＥＧＦ添加培地で培養することにより生じた２次分化コ
ロニー、および２次分化コロニーから回収した細胞をＶ
ＥＧＦ添加培地で培養することにより生じた３次分化コ
ロニーの数を示すグラフである。白いバーはＥＢの数、
灰色のバーは２次分化コロニーの数、黒いバーは３次分
化コロニーの数を示す。

【図２３】は、ヒトＳＣＧＦおよびＢＭ−４添加無血清
培養により形成されたＥＢから回収した細胞を、ＶＥＧ
ＦおよびＳＣＧＦ添加培地で培養することにより得られ
た３次分化コロニーの構成細胞についての、血管内皮細
胞特異的な膜表面形質の免疫組織化学解析を示す図であ
る。１次抗体として上から、陰性ラット対照ＩｇＧアイ
ソタイプ（上パネル）、抗ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリ
ン）抗体（中パネル）および抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−
１）抗体（下パネル）と反応させた結果を示す。

【図２４】は、ＥＳ細胞の無血清培養により形成された
ＥＢから回収した細胞を、ＶＥＧＦおよびＳＣＧＦ添加
培地で培養することにより得られた３次分化コロニーの
構成細胞についての、ＰＣＲによる血管内皮細胞特異的
遺伝子の発現解析を示す図である。上にそれぞれ解析し
た血管内皮細胞特異的遺伝子を、かっこ内にＰＣＲ産物
のヌクレオチドサイズを示す。各レーンはＥＳ細胞の無
血清培養を因子無添加（レーン１）、ＳＣＧＦ添加（レ
ーン２）、ＢＭＰ−４添加（レーン３）、ＳＣＧＦおよ
びＢＭＰ−４添加（レーン４）で行った場合を示す。

【図２５】は、ＣＨＯ細胞の培養上清から精製したヒト
ＳＣＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１
は分子量マーカー、レーン２はヒトＳＣＧＦの最終精製
品のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/32 Ａ６１Ｋ 35/34 35/34 35/36 35/36 35/37 35/37 35/39 35/39 35/407 35/407 35/42 35/42 35/48 35/48 35/55 35/55 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 1/04 1/04 1/16 1/16 1/18 1/18 3/10 3/10 5/14 5/14 5/18 5/18 7/00 7/00 7/02 7/02 9/00 9/00 9/04 9/04 9/10 9/10 １０１ １０１ 9/12 9/12 11/00 11/00 11/06 11/06 13/00 13/00 13/12 13/12 15/00 15/00 15/08 15/08 17/00 17/00 17/02 17/02 17/06 17/06 19/00 19/00 19/02 19/02 19/08 19/08 19/10 19/10 21/00 21/00 21/04 21/04 25/08 25/08 25/14 25/14 25/16 25/16 25/28 25/28 27/02 27/02 27/16 27/16 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/04 31/04 31/18 31/18 31/20 31/20 37/02 37/02 37/08 37/08 Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＥ (72)発明者 佐藤 光男 東京都町田市旭町３丁目６番６号 協和醗 酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者 杉本 整治 東京都町田市旭町３丁目６番６号 協和醗 酵工業株式会社東京研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA13 DA36 FB02 4B065 AA90X AC20 BA23 BB22 BB23 BB32 BB34 BB40 CA44 CA60 4C084 AA17 NA14 ZA022 ZA062 ZA152 ZA162 ZA332 ZA342 ZA362 ZA402 ZA422 ZA512 ZA592 ZA662 ZA682 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZA972 ZB072 ZB132 ZB152 ZB332 ZB352 ZC062 ZC332 ZC352 ZC552 4C087 AA01 AA02 AA03 BB40 BB42 BB46 BB49 BB51 BB52 BB55 BB62 BB63 BB64 CA04 NA14 ZA02 ZA06 ZA15 ZA16 ZA33 ZA34 ZA36 ZA40 ZA42 ZA51 ZA59 ZA66 ZA68 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB07 ZB13 ZB15 ZB33 ZB35 ZC06 ZC33 ZC35 ZC55

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 胚性幹細胞を造血幹細胞増殖因子（stem
   cell growth factor）を含む培地を用いて培養する工
   程を含むことを特徴とする、胚性幹細胞からエンブリオ
   イドボディを形成する方法。
2. 【請求項２】 該培地が血清を含む培地である請求項１
   に記載の方法。
3. 【請求項３】 該培地がさらに細胞外マトリックス蛋白
   質を含む無血清培地である請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 該培地がさらに骨形成因子４（bone mor
   phogenetic protein4）を含む培地である請求項３に記
   載の方法。
5. 【請求項５】 胚性幹細胞を骨形成因子４（bone morph
   ogenetic protein 4）および細胞外マトリックス蛋白質
   を含む無血清培地で培養する工程を含むことを特徴とす
   る、胚性幹細胞からエンブリオイドボディを形成する方
   法。
6. 【請求項６】 該培地が白血病阻害因子（leukaemia in
   hibitory factor）を含まない培地である請求項１〜５
   のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 細胞外マトリックス蛋白質が以下の
   （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）からなる
   群から選ばれる少なくとも一つの蛋白質である請求項３
   〜６のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。
8. 【請求項８】 細胞外マトリックス蛋白質がフィブロネ
   クチン（fibronectin）である請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 該培地がさらに以下の（ａ）、（ｂ）、
   （ｃ）、（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも一つ
   の蛋白質を含む培地である請求項１、２および６のいず
   れか１項に記載の方法。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
   and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。
10. 【請求項１０】 該培地がさらに以下の（ａ）、
    （ｂ）、（ｃ）、（ｄ）からなる群から選ばれる少なく
    とも一つの蛋白質を含む培地である請求項３、４、６〜
    ８のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
    and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。
11. 【請求項１１】 該培地が、細胞外マトリックス蛋白
    質、造血幹細胞増殖因子（stem cell growth factor）
    および造血幹細胞因子（stem cell factor）を含む培地
    である請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 該培地が、細胞外マトリックス蛋白
    質、造血幹細胞増殖因子（stem cell growth facto
    r）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3ligan
    d）、インターロイキン３（interleukin 3）およびトロ
    ンボポイエチン（thrombopoietin）を含む培地である請
    求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】 細胞外マトリックス蛋白質が以下の
    （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）からなる
    群から選ばれる少なくとも一つの蛋白質である請求項１
    ０〜１２のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。
14. 【請求項１４】 細胞外マトリックス蛋白質がフィブロ
    ネクチンである請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 該培地が無血清培地であり、胚性幹細
    胞を播種する工程で、播種する細胞の濃度が２５００細
    胞／ｍＬ以上の細胞濃度であることを特徴とする請求項
    ７または８に記載の方法。
16. 【請求項１６】 該培地が無血清培地であり、胚性幹細
    胞を播種する工程で、播種する細胞の濃度が２０００細
    胞／ｍＬ以上の細胞濃度であることを特徴とする請求項
    １０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 該培地が無血清培地であり、胚性幹細
    胞を播種する工程で、播種する細胞の濃度が１５００細
    胞／ｍＬ以上の細胞濃度であることを特徴とする請求項
    １０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 該培地が無血清培地であり、胚性幹細
    胞を４日間以上培養する工程を含むことを特徴とする、
    請求項３〜８、１０〜１７のいずれか１項に記載の方
    法。
19. 【請求項１９】 請求項１〜１８のいずれか１項に記載
    の方法を工程として含む胚性幹細胞より分化細胞を誘導
    する方法。
20. 【請求項２０】 分化細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）及
    び（ｃ）からなる群から選ばれる細胞である、請求項１
    ９に記載の方法。 （ａ）外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞； （ｂ）中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞； （ｃ）内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞。
21. 【請求項２１】 外胚葉由来の細胞が神経組織、松果
    体、副腎髄質、色素体および表皮組織からなる群から選
    ばれる部位を構成する細胞である、請求項２０に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 中胚葉由来の細胞が筋組織、結合組
    織、骨組織、軟骨組織、循環器、血液組織、真皮、泌尿
    器および生殖器からなる群から選ばれる部位を構成する
    細胞である、請求項２０に記載の方法。
23. 【請求項２３】 内胚葉由来の細胞が、消化管、呼吸
    器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、肝臓および
    膵臓からなる群から選ばれる部位を構成する細胞であ
    る、請求項２０に記載の方法。
24. 【請求項２４】 さらに以下の（ａ）、（ｂ）、
    （ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
    （ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、
    （ｏ）、（ｐ）、（ｑ）及び（ｒ）からなる群から選ば
    れる因子を単独あるいは複数含む培地を用いて培養する
    ことを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれか１項に
    記載の方法。 （ａ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｂ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。 （ｃ）血管内皮増殖因子（vascular endothelial growt
    h factor）； （ｄ）エリスロポイエチン（erythropoietin）； （ｅ）インターロイキン６（interleukin 6）； （ｆ）インターロイキン１１（interleukin 11）； （ｇ）アクチビンＡ（activin A）； （ｈ）骨形成因子４（bone morphogenetic protein
    4）； （ｉ）塩基性繊維芽細胞増殖因子（basic fibroblast g
    rowth factor）； （ｊ）インターロイキン１（interleukin 1）； （ｋ）マクロファージコロニー刺激因子（macrophage c
    olony-stimulating factor）； （ｌ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granul
    ocyte-macrophage colony- stimulating factor）； （ｍ）インターロイキン７（interleukin 7）； （ｎ）インターロイキン２（interleukin 2）； （ｏ）トランスフォーミング増殖因子β（transforming
    growth factor-β）； （ｐ）神経成長因子（nerve growth factor）； （ｑ）レチノイン酸（retinoic acid）； （ｒ）ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）。
25. 【請求項２５】 請求項１〜１８に記載の方法で形成し
    たエンブリオイドボディに由来する細胞を、血清、イン
    ターロイキン３（interleukin 3）、エリスロポイエチ
    ン（erythropoietin）、顆粒球マクロファージコロニー
    刺激因子（granulocyte-macrophage colony- stimulati
    ng factor）およびトロンボポイエチン（thrombopoieti
    n）を含む培地を用いて培養することを特徴とする、請
    求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 請求項１〜１８に記載の方法で形成し
    たエンブリオイドボディに由来する細胞を、血清および
    インターロイキン７（interleukin 7）を含む培地を用
    いて培養することを特徴とする、請求項２２に記載の方
    法。
27. 【請求項２７】 請求項１〜１８に記載の方法で形成し
    たエンブリオイドボディに由来する細胞を、血清および
    血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth fact
    or）を含む培地を用いて培養することを特徴とする、請
    求項２２に記載の方法。
28. 【請求項２８】 請求項１〜１８に記載の方法で形成し
    たエンブリオイドボディに由来する細胞を、血清、イン
    ターロイキン３（interleukin 3）、エリスロポイエチ
    ン（erythropoietin）、顆粒球マクロファージコロニー
    刺激因子（granulocyte-macrophage colony- stimulati
    ng factor）およびトロンボポイエチン（thrombopoieti
    n）を含む培地を用いて培養することを特徴とする、胚
    性幹細胞より造血幹細胞を誘導する方法。
29. 【請求項２９】 請求項１〜１８に記載の方法で形成し
    たエンブリオイドボディに由来する細胞を、血清および
    インターロイキン７（interleukin 7）を含む培地を用
    いて培養することを特徴とする、胚性幹細胞よりＢ細胞
    を誘導する方法。
30. 【請求項３０】 請求項１〜１８に記載の方法で形成し
    たエンブリオイドボディに由来する細胞を、血清および
    血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth fact
    or）を含む培地を用いて培養することを特徴とする、胚
    性幹細胞より血管内皮細胞を誘導する方法。
31. 【請求項３１】 胚性幹細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）
    及び（ｃ）からなる群から選ばれる細胞である、請求項
    １〜３０のいずれか１項に記載の方法。 （ａ）初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細
    胞； （ｂ）体細胞の核を移植することによって作製された初
    期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞； （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の胚性幹細胞の染色体上の遺伝
    子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞。
32. 【請求項３２】 請求項１〜４、６〜１８のいずれか１
    項に記載の方法で用いる、造血幹細胞増殖因子（stem c
    ell growth factor）を含む胚性幹細胞を培養するため
    の培地。
33. 【請求項３３】 該培地がさらに血清を含む請求項３２
    に記載の培地。
34. 【請求項３４】 該培地がさらに細胞外マトリックス蛋
    白質を含む無血清培地である請求項３２に記載の培地。
35. 【請求項３５】 該培地がさらに骨形成因子４（bone m
    orphogenetic protein 4）を含む請求項３４に記載の培
    地。
36. 【請求項３６】 請求項５記載の方法で用いる、骨形成
    因子４（bone morphogenetic protein 4）および細胞外
    マトリックス蛋白質を含む無血清培地である胚性幹細胞
    を培養するための培地。
37. 【請求項３７】 該培地が白血病阻害因子（leukaemia
    inhibitory factor）を含まない培地である請求項３２
    〜３６のいずれか１項に記載の培地。
38. 【請求項３８】 細胞外マトリックス蛋白質が以下の
    （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも一つの蛋白質である請求項３４〜
    ３７のいずれか１項に記載の培地。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。
39. 【請求項３９】 細胞外マトリックス蛋白質がフィブロ
    ネクチン（fibronectin）である請求項３８に記載の培
    地。
40. 【請求項４０】 該培地がさらに以下の（ａ）、
    （ｂ）、（ｃ）、（ｄ）からなる群から選ばれる少なく
    とも一つの蛋白質を含む培地である請求項３２、３３ま
    たは３７に記載の培地。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
    and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。
41. 【請求項４１】 該培地が、細胞外マトリックス蛋白
    質、造血幹細胞増殖因子（stem cell growth factor）
    および以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）からなる
    群から選ばれる少なくとも一つの蛋白質を含む培地であ
    る請求項３４、３５および３７〜３９のいずれか１項に
    記載の培地。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）； （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
    and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）。
42. 【請求項４２】 該培地が、細胞外マトリックス蛋白
    質、造血幹細胞増殖因子（stem cell growth factor）
    および造血幹細胞因子（stem cell factor）を含む培地
    である請求項４１に記載の培地。
43. 【請求項４３】 該培地が、細胞外マトリックス蛋白
    質、造血幹細胞増殖因子（stem cell growth facto
    r）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3ligan
    d）、インターロイキン３（interleukin 3）およびトロ
    ンボポイエチン（thrombopoietin）を含む培地である請
    求項４１に記載の培地。
44. 【請求項４４】 細胞外マトリックス蛋白質が以下の
    （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも一つの蛋白質である請求項４１〜
    ４３に記載の培地。 （ａ）ゼラチン（gelatin）; （ｂ）ラミニン（laminin）; （ｃ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｄ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｅ）フィブロネクチン（fibronectin）。
45. 【請求項４５】 細胞外マトリックス蛋白質がフィブロ
    ネクチンである請求項４４に記載の培地。
46. 【請求項４６】 造血幹細胞増殖因子（stem cell grow
    th factor）を有効成分として含む胚性幹細胞から分化
    細胞を誘導するための分化誘導剤。
47. 【請求項４７】 さらに以下の（ａ）〜（ｙ）からなる
    群から選ばれる少なくとも一つの因子を有効成分として
    含む請求項４６に記載の分化誘導剤。 （ａ）造血幹細胞因子（stem cell factor）; （ｂ）ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド（flk-2/flt3 lig
    and）； （ｃ）インターロイキン３（interleukin 3）； （ｄ）トロンボポイエチン（thrombopoietin）； （ｅ）血管内皮増殖因子（vascular endothelial growt
    h factor）； （ｆ）エリスロポイエチン（erythropoietin）； （ｇ）インターロイキン６（interleukin 6）； （ｈ）インターロイキン１１（interleukin 11）； （ｉ）アクチビンＡ（activin A）； （ｊ）骨形成因子４（bone morphogenetic protein
    4）； （ｋ）塩基性繊維芽細胞増殖因子（basic fibroblast g
    rowth factor）； （ｌ）インターロイキン１（interleukin 1）； （ｍ）マクロファージコロニー刺激因子（macrophage c
    olony-stimulating factor）； （ｎ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granul
    ocyte-macrophage colony- stimulating factor）； （ｏ）インターロイキン７（interleukin 7）； （ｐ）インターロイキン２（interleukin 2）； （ｑ）トランスフォーミング増殖因子β（transforming
    growth factor-β）； （ｒ）神経成長因子（nerve growth factor）； （ｓ）レチノイン酸（retinoic acid）； （ｔ）ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）； （ｕ）ゼラチン（gelatin）; （ｖ）ラミニン（laminin）; （ｗ）コラーゲンタイプＩ（collagen type I）； （ｘ）コラーゲンタイプＩＶ（collagen type IV）； （ｙ）フィブロネクチン（fibronectin）。
48. 【請求項４８】 請求項１〜１８のいずれか１項に記載
    の方法により得られるエンブリオイドボディ。
49. 【請求項４９】 請求項１９〜３１のいずれか１項に記
    載の方法を用いることにより誘導される分化細胞。
50. 【請求項５０】 被験物質存在下および該被験物質非存
    在下で、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法を
    用い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での胚性
    幹細胞から分化細胞までの分化過程を比較することを特
    徴とする、胚性幹細胞から分化細胞までの分化過程にお
    ける調節に関する物質の評価方法。
51. 【請求項５１】 被験物質存在下および該被験物質非存
    在下で、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法を
    用い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での胚性
    幹細胞から分化細胞までの分化過程を比較することを特
    徴とする、胚性幹細胞から分化細胞までの分化過程にお
    ける調節に関する物質のスクリーニング方法。
52. 【請求項５２】 被験物質存在下および該被験物質非存
    在下で、請求項４９に記載の細胞を培養し、該被験物質
    存在下と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から分化し
    た細胞の機能を比較することを特徴とする、該分化細胞
    の機能の調節に関連する物質の評価方法。
53. 【請求項５３】 被験物質存在下および該被験物質非存
    在下で、請求項４９に記載の細胞を培養し、該被験物質
    存在下と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から分化し
    た細胞の機能を比較することを特徴とする、該分化細胞
    の機能の調節に関連する物質のスクリーニング方法。
54. 【請求項５４】 請求項４６または４７に記載の分化誘
    導剤を含む医薬。
55. 【請求項５５】 請求項４９に記載の分化細胞を含む医
    薬。
56. 【請求項５６】 以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から
    なる群から選ばれる細胞の障害に基づく疾患の診断、予
    防および／または治療のための医薬である、請求項５４
    または５５に記載の医薬。 （ａ）外胚葉由来の細胞； （ｂ）中胚葉由来の細胞； （ｃ）内胚葉由来の細胞 。
57. 【請求項５７】 外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患
    が、神経組織、松果体、副腎髄質、色素細胞および表皮
    組織からなる群から選ばれる部位を構成する細胞の障害
    に基づく疾患である、請求項５６に記載の医薬。
58. 【請求項５８】 中胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患
    が、筋組織、結合組織、骨組織、軟骨組織、循環器、血
    液組織、真皮、泌尿器および生殖器からなる群から選ば
    れる部位を構成する細胞の障害に基づく疾患である、請
    求項５６に記載の医薬。
59. 【請求項５９】 内胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患
    が、消化管、呼吸器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、
    中耳、肝臓および膵臓からなる群から選ばれる部位を構
    成する細胞の障害に基づく疾患である、請求項５６に記
    載の医薬。
60. 【請求項６０】 神経組織を構成する細胞の障害に基づ
    く疾患がアルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パー
    キンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、ダウン症候群、
    多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経外傷または神
    経毒物の障害に起因する疾患であり、松果体を構成する
    細胞の障害に基づく疾患が松果体症または松果体機能不
    全であり、副腎髄質を構成する細胞の障害に基づく疾患
    が副腎機能欠如症または副腎炎であり、色素細胞の障害
    に基づく疾患が色素異常症または色素過剰症であり、表
    皮組織を構成する細胞の障害に基づく疾患が火傷、外
    傷、創傷治癒、床擦れ、皮膚炎、表皮症または乾せんで
    ある、請求項５７に記載の医薬。
61. 【請求項６１】 筋組織を構成する細胞の障害に基づく
    疾患が筋肉不全症、筋無緊張症または重症筋無力症であ
    り、結合組織を構成する細胞の障害に基づく疾患が結合
    組織病、結合組織炎または糖尿病であり、骨組織を構成
    する細胞の障害に基づく疾患が骨粗鬆症、骨関節炎、骨
    形成異常症、骨硬化症、骨髄炎または骨形成不全症であ
    り、軟骨組織を構成する細胞の障害に基づく疾患が変形
    関節炎、慢性関節リウマチ、軟骨形成不全症、軟骨発育
    不全症または軟骨形成異常症であり、循環器を構成する
    細胞の障害に基づく疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管
    閉鎖症、ＳＬＥ、狭心症、高血圧症、高脂血症、糖尿
    病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、再狭窄、
    血栓、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血ま
    たは脈絡膜循環障害であり、血液組織を構成する細胞の
    障害に基づく疾患がＨＩＶ感染、敗血症、移植片―対―
    宿主疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道
    過敏または自己免疫疾患であり、真皮を構成する細胞の
    障害に基づく疾患が火傷、外傷、皮膚炎または乾せんで
    あり、泌尿器を構成する細胞の障害に基づく疾患が溶血
    性尿毒症症候群または腎炎であり、生殖器を構成する細
    胞の障害に基づく疾患が性器発育不全症または性器発育
    異常である、請求項５８に記載の医薬。
62. 【請求項６２】 消化管を構成する細胞の障害に基づく
    疾患が胃潰瘍、胃炎または十二指腸潰瘍であり、呼吸器
    を構成する細胞の障害に基づく疾患が肺気腫、肺水腫、
    肺炎、気管支炎または気管支喘息であり、胸腺を構成す
    る細胞の障害に基づく疾患が胸腺炎、胸腺リンパ形成不
    全症または胸腺機能減退症であり、甲状腺を構成する細
    胞の障害に基づく疾患が甲状腺無形成症または甲状腺機
    能不全症であり、副甲状腺を構成する細胞の障害に基づ
    く疾患が副甲状腺機能低下症であり、膀胱を構成する細
    胞の障害に基づく疾患が膀胱炎または膀胱破裂であり、
    中耳を構成する細胞の障害に基づく疾患が中耳炎であ
    り、肝臓を構成する細胞の障害に基づく疾患が肝臓紫斑
    病、慢性Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎であり、膵臓を構成す
    る細胞の障害に基づく疾患が糖尿病である、請求項５９
    に記載の医薬。