WO2006078034A1 - 心筋細胞への分化能を有する細胞 - Google Patents

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Shunichiro Miyoshi
Satoshi Ogawa
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Definitions

  • the present invention relates to a cell having the ability to differentiate into cardiomyocytes derived from endometrium or menstrual blood force obtained from the endometrium, or obtained from menstrual blood, umbilical cord blood or fetal appendage force. More particularly, the present invention relates to a method for proliferating cells having the ability to differentiate into cardiomyocytes, to induce differentiation into cardiomyocytes, and to a therapeutic agent for heart diseases using these cells.
  • Cardiomyocytes actively divide before birth with autonomous pulsation. However, at the time of birth, the ability to divide is lost, and it does not acquire the ability to divide again like hepatocytes, and unlike skeletal muscle cells, it does not have undivided progenitor cells such as satellite cells. . Therefore, when myocardial cells become necrotic due to myocardial infarction, myocarditis, aging, or the like, cell enlargement occurs in vivo instead of cell division of the remaining cardiomyocytes.
  • Cardiac hypertrophy is a physiological adaptation in the initial stage, but it also leads to a decrease in the diastolic function of the heart itself and a decrease in the contractile function due to the interstitial fibrosis due to the proliferation of coexisting cardiac fibroblasts.
  • Conventional treatment of heart failure due to myocardial infarction has been centered on symptomatic treatments such as increased cardiac contraction force, reduced pressure load on the heart with vasodilators, reduced blood flow with diuretics, etc. .
  • heart transplantation is a fundamental treatment for severe heart failure, but heart transplantation is a common medical treatment due to problems such as lack of organ donors, difficulty in determining brain death, rejection, and rising medical costs. It is not easy to spread. In fact, heart disease is the third leading cause of death in Japan (Health and Welfare 1998). If lost cardiomyocytes can be regenerated, it is thought to lead to a significant advance in medical welfare.
  • cell strains that preserve the properties of cardiomyocytes include tumor strains generated in the atria of transgenic mice produced by recombination of the SV40 large T antigen with the promoter of the atrial natriuretic hormone.
  • AT-1 cells are mentioned [Science, 239; 102 9-1038 (1988)].
  • the cells form a tumor when transplanted in vivo, There is a problem that it is not suitable for cell transplantation. Given this background, the following methods were considered to reconstruct the myocardium.
  • the first method is a method of converting cells other than cardiomyocytes into cardiomyocytes. This was inferred from the fact that MyoD can be converted into skeletal muscle cells when introduced into fibroblasts. So far, successful cases with mouse fetal cancer cells, P19 cells, have been demonstrated [Cell Struc. & Fun, 21: 101-110 (1996)], but successful cases with non-cancerous cells have been reported. It has not been.
  • the second method is a method of imparting mitotic potential again to cardiomyocytes. This is based on the phenomenon that the myocardium can divide while pulsating during fetal period. However, no successful cases have been reported so far.
  • the third method is a method in which cardiomyocytes are induced by unsatisfactory stem cell force. It has already been shown that embryonic stem cell (ES cell) force cardiomyocytes can be induced. However, when embryonic stem cells themselves are transplanted into adults, they form a carcinoma, and there are problems such as antigenicity [Nature Biotechnology, ⁇ 7, 139-142 (1999)].
  • a method for obtaining myocardial progenitor cells, which are unsatisfactory fetal power, and using them for transplantation is also considered, and in experiments using animals, it is known to function effectively as cardiomyocytes. [Science, 264, 98-101 (1994)]. However, it is difficult to obtain a large amount of myocardial progenitor cells by this method, and the ethical viewpoint is not easy to apply to general medicine.
  • adult bone marrow contains mesenchymal stem cells, which are derived from bone cells, chondrocytes, tendon cells, ligament cells, skeletal muscle cells, adipocytes, and stromal cells. It has been reported that liver oval cells can induce differentiation [Science, 284, 143-147 (1999); Science, 284, 1168-1170 (1999)]. On the other hand, it has recently been reported that cardiomyocytes can be induced from cells that have acquired bone marrow strength of adult mice [J. Clinical Inve stigation, 103, 10-18 (1999)].
  • hematopoietic stem cells have the characteristics of CD34 + / CD38- / HLA-DR- / CD90 (Thy-1) +, and as hematopoietic stem cells are analyzed, CD38 is expressed and CD90 (Thy-l) is known to disappear [Protein Nucleic Acid Enzyme Vol. 45, Nol 3, 2056-2062 (2000)].
  • Vascular endothelial cells express markers such as CD34, CD31, Flk-1, Tie-2, and E-selectin [Molecular cardiovascular disease Vol. L, No. 3,294-302 (2000)].
  • Mesenchymal stem cells express markers such as CD90, CD105, CD140a [Science, 284, 143-147 (1999); Science, 284, 1168-1170 (1999)].
  • Cells that differentiate into mouse bone marrow derived myocardium express markers such as CD117 (c-kit) and CD140a (US2002 / 014 2457), and cells that differentiate into human bone marrow derived myocardium are CD13, CD29 It is reported that markers such as CD44, CD55, CD59, CD90, CD105, and CD166 are expressed [The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)]. Summary of the Invention
  • the present inventor has recently found that cells derived from human endometrial tissue that also obtained endometrium or menstrual blood force, or mesenchymal stem cells obtained from menstrual blood, umbilical cord blood, or fetal appendage organ force It was found that cardiomyocytes differentiate at high frequency by co-culture of. It has been found that this separation into cardiomyocytes occurs at a high frequency even if the cells are not subjected to demethylation treatment (for example, 5-azacitidine treatment). The present invention is based on strong knowledge.
  • an object of the present invention is to provide cells having the ability to differentiate into cardiomyocytes.
  • the present invention also differentiates into cardiomyocytes derived from endometrium obtained from endometrium or menstrual blood, or derived from mesenchymal stem cells isolated from menstrual blood, umbilical cord blood or fetal appendage organs
  • the purpose is to provide a method for preparing cardiomyocytes from cells capable of
  • the present invention aims to provide a medicine, particularly a cardiac regenerative drug or a heart disease therapeutic drug.
  • the cells according to the present invention are derived from endometrial tissue or endometrial tissue from which menstrual blood force is also isolated, or from mesenchymal stem cells isolated from menstrual blood, umbilical cord blood or fetal appendage force, A cell that has the ability to differentiate into cardiomyocytes.
  • the cells according to the present invention can be obtained from menstrual blood, umbilical cord blood, or fetal appendage force that is discarded after childbirth, the collection is repeated without giving new pain and a relatively large amount. This is extremely advantageous compared to cells having the ability to differentiate into conventional cardiomyocytes, for example, in that a large number of HLA types can be supplied.
  • the cell according to the present invention may be immortalized, and its immortalization may be achieved, for example, by intracellular expression of telomerase or Bmi-1 or by intracellular expression of the E6 or E7 gene of human papillomavirus.
  • the method for preparing cardiomyocytes comprises endometrial tissue or menstrual force cells derived from endometrium, or mesenchymal stem cells isolated from menstrual blood, umbilical cord blood or fetal accessory organs. And at least comprising inducing differentiation of the cells into cardiomyocytes.
  • differentiation induction is performed by co-culture with cardiomyocytes, differentiation induction by demethylation treatment of DNA, a factor expressed in a fetal heart development region or a fetus. Selection of differentiation by factors acting on differentiation into cardiomyocytes at the heart developmental stage, and differentiation force induced by the culture supernatant of cardiomyocytes differentiated from cells capable of differentiating into cardiomyocytes This is done by at least one of the following.
  • the immortalization which may be immortalized before inducing differentiation of endometrial cells into cardiomyocytes, is a telomerase or Bmi-1 cell. Forces produced by internal expression or intracellular expression of the human papillomavirus E6 or E7 gene.
  • the medicament according to the present invention comprises the above-described cell according to the present invention as an active ingredient, and is specifically used as a cardiac regenerative drug or a heart disease therapeutic drug.
  • a wild-type gene for a mutated gene for a congenital genetic disease of the heart is introduced into the cell according to the present invention, and this is included as an active ingredient.
  • a congenital heart disease treatment is provided.
  • FIG. 1 shows the proportion of induced differentiation of Troponin I-expressing cells from immortalized cells in Example 1 (3) (myocardial induction rate), the presence or absence of co-culture, and 5-azacitidine (5 -It is a diagram showing the relationship between the presence or absence of azaC) processing.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of surface antigens of E-MSC cells according to the present invention, measured with a flow cytometer using various antibodies.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of analysis of the surface antigens of E-MSC cells according to the present invention using a flow cytometer using various antibodies, as in Fig. 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of analysis of the surface antigen of E-MSC cells according to the present invention using a flow cytometer using various antibodies, as in FIG.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of analysis of the surface antigens of E-MSC cells according to the present invention using a flow cytometer using various antibodies, as in Fig. 2. Detailed description of the invention [0025] Cell deposit
  • E-MSC (hEPClOO) cells and E-MSC (hEPC214) cells which are specific examples of cells having the ability to separate cardiomyocytes according to the present invention, are patents of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited at the Biological Depositary Center (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on January 19, 2005 (original deposit date), FERM BP—10467 and FERM BP—10468 I have an accession number.
  • Cells derived from the endometrium having the ability to separate cardiomyocytes according to the present invention can be isolated from the endometrium or menstrual blood.
  • a method for isolating cells capable of differentiating into cardiomyocytes will be described.
  • the method for obtaining endometrial cells having the ability to separate cardiomyocytes from the human endometrium is not particularly limited as long as it is a safe and efficient method, but Am.J. Path ol., 163, 2259-2269 (2003).
  • human endometrial tissue removed by surgery is cut into small pieces and placed in a medium in which cells can be cultured.
  • the medium is not particularly limited as long as the cells can be cultured, and is preferably limited to force, preferably MEM (minimnum essential medium), DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium), IMDM (Isocove s Modified Dulbecco's medium) is cultured in a medium containing 1-20% animal-derived serum, preferably 5-10% urchin fetal serum (FCS).
  • Antibiotics such as penicillin and streptomycin may be ordered.
  • collagenase such as type 3 and DNA-degrading enzyme such as deoxyribonuclease I are added to the medium, and the conditions are 20 to 40 ° C, preferably 37 ° C, for example, 10 minutes to 5 hours. Shake gently for 1 hour, preferably.
  • Individual endometrial glands should be isolated under a microscope and isolated using appropriate culture vessels, e.g., 24-well culture dishes, 37 ° C, 5% CO.
  • Isolation of mouse eclampsia endometrial cells is not particularly limited, and can be performed based on the method described in McCormack SA and Glasser SR [Endocrinology, 106, 1634-1649 (1980)].
  • proteolytic enzymes for example, PBS (phosphate- buffed saline) soaked ⁇ this containing 5 mg / ml of trypsin and 25 mg / ml pancreatin, 0-37.
  • the reaction is carried out at C for 10 minutes to 3 hours, preferably at 0 ° C. for 30 minutes to 1 hour, and further at room temperature for 10 minutes to 3 hours, preferably 30 minutes to 1 hour.
  • a suitable medium containing 1-20% animal-derived serum, preferably 5-10% FCS, such as DMEM / F-12 (DMEM and Ham's F- 12 medium mixed 1: 1) Trypsin is inactivated by adding medium. Replace the medium with PBS and gently shake the tissue for 10 to 30 minutes, preferably 30 seconds. Carefully remove the eclamptic tissue and pass the cell suspension through a filter, eg, a 70-m mesh filter. Cells are collected in the precipitate fraction, for example by centrifuging the filtrate at 1000 X g for 5 minutes. Cells may be washed by resuspension in PBS and centrifugation.
  • FCS DMEM / F-12
  • Trypsin is inactivated by adding medium. Replace the medium with PBS and gently shake the tissue for 10 to 30 minutes, preferably 30 seconds. Carefully remove the eclamptic tissue and pass the cell suspension through a filter, eg, a 70-m mesh filter. Cells are collected in the precipitate fraction,
  • any medium capable of growing cells precipitated by centrifugation 1-20% animal-derived serum, preferably 5-10% FCS DMEM / F-12 medium Suspend in Antibiotics such as lOOunits / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin may be added to the medium. Further, for example, 1% of a non-essential amino acid solution may be added.
  • isolation from menstrual blood can be performed as follows. First of all, since the number of cells obtained from menstrual blood on the first day of menstruation is larger, preferably menstrual blood on the first day of menstruation (the first day when menstruation starts) is used as a sanitary product or directly. Collect from the vulva. The collected menstrual blood is preferably placed in DMEM (Dulbecco's modified MEM) medium (added with penicillin / streptomycin antibiotics) containing 1% fetal calf serum, and cells contained in menstrual blood are collected by centrifugation.
  • DMEM Dynamic microsomal fetal calf serum
  • a cell culture medium such as a-MEM (a-modified MEM) ⁇ DMEM (Dulbecco's modified MEM) or IMDM (Isocove's modifie d Dulbecco's medium) containing 10% FBS (fetal calf serum).
  • a-MEM a-modified MEM
  • DMEM Dulbecco's modified MEM
  • IMDM Isocove's modifie d Dulbecco's medium
  • FBS fetal calf serum
  • Mesenchymal stem cells isolated from menstrual blood, umbilical cord blood or fetal appendage organs can be isolated as follows. That is, in DMEM, the excised tissue is shredded with an ophthalmic scissors (about 1-5mm3) and left to stand for a few minutes before containing blood cells. Discard the supernatant and wash the tissue again with DMEM. Repeat this operation 3-4 times. Then, centrifuge at 100G for about 30 seconds.
  • a medium used for culturing cells capable of differentiating into cardiomyocytes isolated by the above-mentioned method a known cell culture medium (eg, tissue culture technical basic edition 3rd edition, Asakura Shoten 1996)
  • a culture medium for cell culture such as a-MEM, DMEM, DMEM / F-12 or IMDM to which 5-20% of serum such as ushi is added is preferably used.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as the cells can be cultured, but the culture temperature is preferably 33 to 37 ° C, and further cultured in an incubator filled with 5 to 10% diacid-carbon gas. Is preferred.
  • the cells derived from the lining of the eclampsia having the ability to separate cardiomyocytes adhere to a normal plastic culture dish for tissue culture and proliferate.
  • the medium is removed, and the cells are suspended by adding trypsin EDTA (ethylenediamine- ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ -tet raacetic add) solution.
  • trypsin EDTA ethylenediamine- ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ -tet raacetic add
  • Floating cells can be further subcultured by washing with PBS or the cell culture medium, diluting 5 to 20 times with the cell culture medium, and adding to a new culture dish. it can.
  • the method (1) is used alone, or the method (1) is combined with one or more methods selected from the above (2) to (4) forces.
  • cardiomyocytes can be induced at a high rate from cells having the ability to separate cardiomyocytes.
  • an induction rate of 80% or more can be obtained by the method (1) alone, and 95% or more can be obtained by combining (1) and (2).
  • the myocardial cell is not particularly limited as long as it is a cell that can be co-cultured with cells capable of differentiating into myocardium and promote the induction of differentiation into cardiomyocytes.
  • the myocardial cell is a mammalian cell, for example, mouse, rat, guinea pig, nomstar, usagi, cat, nu, hidge, pig, ushi, Group power consisting of gi, monkey and human is selected.
  • mouse fetal cardiomyocytes can be used as myocardial cells.
  • Mouse fetal cardiomyocytes are not particularly limited, and can be prepared, for example, by the method described in [The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)].
  • the strain and gestation period of pregnant mice are not particularly limited, but specifically BALB / cAJcl mice with 14-16 days of gestation are used.
  • Mother mice are euthanized by superficial anesthesia with ether followed by intraperitoneal administration of a lethal dose of pentobarbital. After confirmation of euthanasia, open the incision. At that time, it is desirable to sterilize the abdomen with isodine and operate aseptically.
  • the mouse can be further disinfected with isodine or 70% ethanol, and the heart can be projected out of the thoracic cavity by incising the chest with scissors for ophthalmic use and excluding the chest wall.
  • the heart is excised with ophthalmic scissors and suspended in a culture medium.
  • the medium is not particularly limited, and preferably a DMEM medium containing 5% to 10% sushi serum, a DMEM / F-12 medium, or the like.
  • the number of fetal mice is not particularly specified, but preferably the heart is removed from 30 to 50 fetal mice and suspended in the same medium.
  • the suspended heart is bluntly cut with ophthalmic scissors. There will be no problem if the subsequent enzyme reaction is sufficiently performed, but it is desirable to cut into pieces with scissors about 50 to 100 times to the extent that the prototype of the heart cannot be visually recognized.
  • Cardiomyocytes are isolated from the same tissue using a proteolytic enzyme, and the enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that does not destroy the myocardium and digests only the tissue stroma.
  • myocardial tissue is put into PBS containing 0.05% trypsin and 0.25 mmol / L EDTA, and the enzyme reaction is performed at 20 to 40 ° C for 5 to 60 minutes, preferably at 37 ° C for 5 minutes.
  • the enzyme reaction is then stopped using 1-20% animal-derived serum, preferably 5-10% FCS in DMEM.
  • Tissue digestion fluid is centrifuged at 500-2000 rpm for 3 to 10 minutes using a centrifuge.
  • the cardiomyocytes contained in the supernatant can be cultured under any conditions, but the cells are usually cultured at a cell density of Ixl0 3 to lxl0 7 / cm 2 , preferably 5xl0 4 to 5xl0 5 / cm 2 It is preferable to culture in an incubator filled with 5 to 10% carbon dioxide gas at a culture temperature of 33 to 37 ° C.
  • the primary cardiomyocytes Immediately after the start of the culture of the primary cardiomyocytes to 10 days later, preferably after 1 to 2 days Preferably, it is added at a density of 5xl0 3 / cm 2 .
  • the label may be any material as long as it is a dye that does not have cytotoxicity and does not elute into the culture medium during culture. Specifically, as described in [The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)], cells having the ability to differentiate green fluorescent protein (GFP) gene into cardiomyocytes by adenovirus The cells can be observed as cells emitting green fluorescence.
  • GFP green fluorescent protein
  • the cardiac muscle marker protein can detect mRNA expression by RT-PCR, Northern blot analysis, DNA microarray analysis, etc., and the expression of the protein can be detected using an antibody specific for the protein. It can be detected by immunohistostaining or Western plot analysis.
  • Suitable marker genes / proteins include, for example, myocardial specific transcription factors Nkx2.5 / Csx, GATA4, TEF-1, MEF-2C, MEF-2D, MEF-2A, atrial natriuretic peptide (ANP), cerebral Natriuretic peptide (BNP), a-myosin heavy chain (oc-MH C), ⁇ -myosin heavy chain (13-MHC), myosin light chain-2a (MLC-2a), myosin light chain-2v (ML C- 2v), ⁇ -myocardial actin, myocardial Troponin T, connexin43 (Cnx43), etc. [J. Clin. Invest., 103, 697-705 (1999)].
  • the DNA demethylating agent is not particularly limited as long as it is a compound that causes demethylation to DNA, but as a demethylating agent, cytosine residues in the CpG sequence in chromosomal DNA are used.
  • Examples include demethylase, an enzyme that specifically inhibits methyl baboon, 5-azacitidine (hereinafter abbreviated as 5-aza-C), DMSO (dimethyl sulfoxide), and the like.
  • Examples of the demethylase include those described in Nature, 397, 579-583 (1999). Specific examples of differentiation induction by treatment with a DNA demethylating agent are shown below.
  • 5-aza-C in a medium containing cells capable of separating cardiomyocytes to a concentration between 3 mol / 1 and 10 mol / 1, and incubate for 24 hours under the above culture conditions.
  • This method can preferably induce, for example, sinus node cells and ventricular cardiomyocytes.
  • factors that are expressed in the fetal heart development region or that act on differentiation into cardiac myocytes in the fetal heart development stage include cytoforce in, vitamins, adhesion molecules, and transcription factors.
  • the site force-in is not particularly limited as long as the cell force-in cell promotes the division into the myocardial cells at the developmental stage of the heart.
  • Specific examples include platelet-derived growth factor (hereinafter abbreviated as PDGF), fibroblast growth factor 8 (FGF8), endothelin 1 (ET1), midkine, and bone morphogenetic factor 4 (BMP4).
  • PDGF includes PDGF A, PDGF B, and PDGFC.
  • the site force in is used at a concentration of 10 to 40 ng / ml, for example.
  • cyto force-in that suppresses the division of cardiomyocytes
  • FGF-2 fibroblast growth factor-2
  • SEQ ID NO: 7 or 8 FGF-2 represented.
  • Inhibitors for cytocans that suppress the distribution to cardiomyocytes include substances that inhibit the transmission of cytoforce-in information, such as antibodies that neutralize cytokines, and low molecular weight compounds.
  • the vitamin is not particularly limited as long as it promotes differentiation into cardiomyocytes at the heart development stage, such as retinoic acid, which has the ability to separate into cardiomyocytes.
  • Retinoic acid for example, used at a concentration of 10- 9 mol / l.
  • the adhesion molecule is not particularly limited as long as it is expressed in the cardiac development region at the developmental stage of the heart, and preferred specific examples include extracellular matrix proteins such as gelatin, laminin, collagen, and fibronectin. Is mentioned.
  • differentiation into cardiomyocytes can be promoted by culturing cells capable of differentiating into cardiomyocytes in a culture dish coated with fibronectin.
  • transcription factors homebox transcription factor Nkx2.5 / Csx, Zinc finger transcription factor GATA4 belonging to GATA family, transcription factor MEF-2A belonging to myocyte enhancer factor-2 (MEF-2) family, MEF-2B, MEF-2C and MEF-2D, basic helix loop, helix transcription factor dHAND, eHAND and MesPl, TEA-DNA binding transcription factor family TEF-l, TEF-3 and TEF-5 Can be mentioned.
  • MEF-2A belonging to myocyte enhancer factor-2 (MEF-2) family
  • MEF-2B transcription factor-2B
  • MEF-2C and MEF-2D basic helix loop
  • helix transcription factor dHAND helix transcription factor dHAND
  • eHAND and MesPl TEA-DNA binding transcription factor family
  • TEF-l TEF-3 and TEF-5
  • the transcription factor described above can induce differentiation into cardiomyocytes by introducing DNA encoding the factor into cells capable of differentiating into cardiomyocytes and expressing the DNA. wear.
  • myocardial differentiation-inducing factor a factor that induces differentiation into cardiomyocytes
  • various protease inhibitors are added to the culture supernatant of autonomously beating cells, and dialysis, salting-out and chromatography are combined. Can be acquired.
  • a cDNA library prepared from a cell that autonomously beats using a DNA probe designed based on the amino acid sequence, wherein a partial amino acid sequence of the above-described myocardial differentiation-inducing factor was determined using a microsequencer
  • the gene for the myocardial differentiation factor can be obtained by screening the above.
  • the myocardial differentiation-inducing factor gene thus obtained is prepared and used as a cardiomyogenic agent as follows.
  • a cardiomyogenic agent comprising a gene encoding a myocardial differentiation inducing factor as an active ingredient
  • a recombinant viral vector plasmid is constructed by inserting a gene DNA fragment of a myocardial differentiation-inducing factor or a full-length cDNA downstream of a promoter in a viral vector plasmid.
  • the recombinant viral vector plasmid is introduced into packaging cells compatible with the viral vector plasmid.
  • the knocking cell is not particularly limited as long as it can replenish the deficient protein of a recombinant viral vector plasmid lacking at least one gene encoding a protein required for virus packaging.
  • HEK293 cells derived from human kidney, mouse fibroblasts NIH3T3, etc. can be used.
  • Proteins replenished by knocking cells include gag , p 0 l, and env proteins derived from mouse retrovirus in the case of retroviral vectors, and gag, pol, and HIV viruses derived from lentiviral vectors. env, vpr, vpu, vif, tat, rev, nel3 ⁇ 4 proteins, adenoviral vectors El A, E1B and other proteins, adeno-associated viruses Rep (p5, pl9, p40), Vp Proteins such as (Cap) can be used.
  • a recombinant virus can be produced in the above-described packaging cells, and a promoter is contained at a position where a wild-type gene for a causative gene of a heart congenital genetic disease can be transcribed in cardiac muscle cells. The thing is used.
  • viral vector plasmids examples include MFG [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-673 7 (1995)], pBabePuro [Nucleic Acids Research, 18, 3587-3596 (1990)], LL-CG CL-CG ⁇ CS-CG, CLG [Journal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)], pAdexl [Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821 (1995)] and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in human yarn and weaving.
  • cytomegalovirus (human CMV) IE immediate early gene promoter
  • early SV40 Named promoters early SV40 Named promoters
  • retrowinores promoters meta-mouthone promoters
  • heat shock protein promoters SRa promoters
  • SRa promoters etc.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • a promoter of a cardiomyocyte-specific gene such as Nkx2.5 / Csx gene, the target gene can be expressed specifically in cardiomyocytes.
  • a recombinant virus vector can be produced by introducing the above-described thread-replaceable virus vector plasmid into the above packaging cell.
  • the method for introducing the viral vector plasmid into the packaging cell include the calcium phosphate method [JP-A-2-227075], the lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like. I can list them.
  • It can be induced into cardiomyocytes by infecting the above-described recombinant viral vector with cells capable of differentiating into cardiomyocytes.
  • a DNA fragment having an appropriate length including a portion encoding the protein is prepared.
  • a recombinant expression vector of the protein is constructed by inserting the DNA fragment or full-length cDNA downstream of the promoter in the expression vector.
  • the recombinant expression vector is introduced into a host cell compatible with the expression vector.
  • any cell capable of expressing the target DNA can be used.
  • Escherichia, Serratia, Corvneba ctenum, flevin Guari "Bem, BreviDactenum, Pseudomonas, Bacillus, Microbacterium, etc., Kluweromvces, Saccharomvces, Yeast, animal cells, insect cells, etc. belonging to the genus Shizosaccharomvces, Trichosporon, Schwanniomvces, etc. can be used.
  • the expression vector is capable of autonomous replication in the above host cell or can be integrated into the chromosome, and contains a promoter at a position where the gene DNA of the myocardial differentiation factor inducing factor protein can be transcribed.
  • a promoter at a position where the gene DNA of the myocardial differentiation factor inducing factor protein can be transcribed.
  • recombinant expression vectors for myocardial differentiation factor protein Is preferably a recombinant expression vector that is capable of autonomous replication in the bacterium, and at the same time is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a DNA encoding a myocardial derivation factor protein, and a transcription termination sequence. It may contain a gene that controls the promoter.
  • Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all sold by Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotech), pSE280 (In vitrogen), pGEMEX-1 (Promega PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO [JP 58-110600], pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSA 1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in a host cell. Specific examples include trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), P promoter, P
  • promoters examples include promoters, promoters derived from Escherichia coli and phages such as T7 promoter, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter, and the like. It is also possible to use artificially designed and modified promoters such as promoters in which two Ptrps are connected in series (Ptrpx2), tac promoter, letl promoter [Gene, 44, 29 (1986)], and lacT7 promoter. Monkey.
  • Cardiac myocardium inducer protein gene Production of the target protein by substituting the base sequence of the portion encoding the protein of the DNA so that the codon is optimal for host expression. The rate can be improved.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the gene DNA of the myocardial differentiation-inducing factor protein, but it is preferable to place the transcription termination sequence directly under the structural gene.
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Syudomonas, Bacillus, Microbataterium, and the like, such as Escherichia coli XL-1 Blue, Escherichia coli XL2—Blue, Escherichia coli L H1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escher ichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Bacillus subtilislo uefaciens, Breviba cter
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • examples of expression vectors include YEpl3 (ATC C37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast.
  • PH05 promoter PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MF a 1 promoter, CUP 1 promoter, etc.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electopore position method [Methods in EnzymoL, 194, 18 2 (1990)]
  • Eroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]
  • Lithium acetate method ⁇ .
  • examples of expression vectors include pCDNAI (manufactured by Invitrogen), pCDM8 (manufactured by Invitrogen), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990). )], PAS3-3 (JP-A-2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pCDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem., 101 1307 (1987)], pAGE210 and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • cytomegalovirus (human CMV) IE immediate early gene promoter
  • SV40 early promoter examples include a retrowinores promoter, a meta-mouthone promoter, a heat shock protein promoter, and an SRa promoter.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • Namalwa cells which are human cells, COS cells, monkey cells, CHO cells, Chinese's cells, and Muster cells, HBT5637 [Japanese Patent Laid-Open No. 63-299] Etc.
  • the method for introducing the recombinant vector is not particularly limited as long as it can introduce DNA into animal cells.
  • the electopore method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method JP-A-2-227075
  • the lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987), Virology, 52, 456 (1973)]
  • the transformant can be obtained and cultured according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075 or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • insect cells are used as hosts, for example, baculovirus' expression
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into insect cells to express the protein. it can.
  • Examples of gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVLl
  • Autographa californica nu clear polyhedrosis virus which is a virus that infects night stealing insects, can be used for Autographa californica nu clear polyhedrosis virus. .
  • Insect cells include Spodoptera fruriDerda egg-thin pods S19, S1 1 [Baculovirus
  • Trichoplusiam ovary cells such as High 5 (manufactured by Invitrogen) can be used.
  • Examples of a method for co-introducing the recombinant gene transfer vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075], the lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a transformant having recombinant DNA incorporating a DNA encoding a myocardial differentiation-inducing factor is cultured in a medium, and a myocardial differentiation inducing factor protein is produced and accumulated in the culture. By collecting the protein, a myocardial differentiation inducing factor protein can be produced.
  • the method for culturing the transformant for producing the myocardial differentiation-inducing factor protein in a medium can be performed according to the usual method used for culturing a host.
  • the medium As a medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like that can be assimilated by the host. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
  • each host can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. Alcohols such as organic acids, ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphates of various inorganic acids and organic acids, and others.
  • Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, strong zein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and their denatured products are used.
  • monopotassium phosphate dipotassium phosphate
  • magnesium phosphate magnesium sulfate
  • sodium chloride salt ferrous sulfate
  • manganese sulfate copper sulfate
  • calcium carbonate calcium carbonate
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C, and the culture time is usually 16-7 days.
  • the pH is 3.0-9.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • antibiotics such as ampicillin or tetracycline.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, use isopropyl 13 D-thiogalatatopyranoside (IPTG) or the like, and use the trp promoter.
  • IPTG isopropyl 13 D-thiogalatatopyranoside
  • V When cultivating microorganisms transformed with the expression vector, indoleacrylic acid (IAA) etc. may be added to the medium! / ⁇ .
  • a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host cell a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 1 99, 519 (1967)], Eagle's MEM Medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] or these You can use a culture medium supplemented with urchin fetal serum.
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • TNM-FH medium Pharmingen
  • Sf-900 II SFM medium Sf-900 II SFM medium
  • ExCell400 ExCell405 (all manufactured by JRH Biosciences)
  • Grace's Insect Medium Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 5 days under conditions of pH 6-7, 25-30 ° C, etc.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as necessary during the culture.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as necessary during the culture.
  • gentamicin may be added to the medium as necessary during the culture.
  • a normal protein alone is used. Separation and purification methods may be used.
  • the myocardial differentiation inducing factor protein when expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing and suspended in an aqueous buffer, followed by an ultrasonic crusher, French press Then, disrupt the cells with a Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, etc.
  • Anion exchange chromatography using a resin such as Jetylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), or a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) Cation exchange chromatograph Method, hydrophobic chromatography using resin such as butyl sepharose, ferrule sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing, etc.
  • a purified sample can be obtained by combining a single method such as electrophoresis, etc.
  • the cell When the protein is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the cell is recovered and then crushed and centrifuged to recover the protein insoluble substance as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble matter of the protein is dissolved with a protein denaturant.
  • Isolation Purification method provides a purified sample of the protein.
  • the protein or a derivative such as a sugar chain adduct can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture preparation is collected by a technique such as culture force centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the protein expressed by the above method can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-ptyoxycarbonyl method). can do.
  • peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Amersham Pharmacia Biotech, Protein Technology Instrument, Synthece U-Vega, PerS Stamp, Shimadzu, etc. It is a matter of using and synthesizing.
  • It also has the ability to differentiate into cardiomyocytes by culturing using a culture dish coated with extracellular matrix obtained from autonomously beating cardiomyocytes, and adding culture supernatant of autonomously beating cardiomyocytes Cells can be induced to differentiate into cardiomyocytes.
  • the method for purifying cells according to the present invention is not particularly limited.
  • a vanning method using an antibody that specifically recognizes cells capable of differentiating into cardiac muscle cells described later [J. Im munol, 141 (8), 2797-2800 (1988)], FACS method [Int. Immunol, 10 (3), 275-283 (1998)]
  • it can be carried out by a method for constructing a reporter system using a promoter of a gene specific for cells capable of separating into cardiomyocytes.
  • telomerase Bmi-1 As an immortalization method for increasing the number of cell divisions without causing the cells to become cancerous, a method of expressing telomerase Bmi-1 in cells capable of separating into cardiomyocytes can be mentioned. wear.
  • TERT gene which is a catalytic subunit of telomerase
  • a retroviral vector As a method of expressing telomerase in cells capable of separating cardiomyocytes, TERT gene, which is a catalytic subunit of telomerase, is introduced into a retroviral vector, and the vector is differentiated into cardiomyocytes.
  • a method in which a factor that induces and expresses the TERT gene endogenous to the cell capable of differentiating into cardiomyocytes is administered to a cell having the ability to differentiate into cardiomyocytes. Examples thereof include a method of introducing a vector containing DNA encoding the factor into cells capable of differentiating into cardiomyocytes.
  • the above-mentioned factor that induces and expresses the TERT gene is a cell having the ability to disperse a vector DNA incorporating a TERT gene promoter and a reporter gene such as GFP, luciferase, or 13-galactosidase into cardiomyocytes. By introducing it into the factor, a factor that induces and expresses the TERT gene can be selected.
  • Bmi-1 gene reported to be essential for self-renewal of hematopoietic stem cells and neural stem cells is expressed in cells capable of differentiating into cardiomyocytes according to the present invention.
  • a Bmi-1 gene is introduced into a retroviral vector, and the vector is introduced into a cell capable of differentiating into a cardiomyocyte.
  • a Bmi-1 gene endogenous to a cell capable of differentiating into a cardiomyocyte.
  • a method of administering a factor that induces and expresses to a cell capable of differentiating into cardiomyocytes, and a DNA containing a factor encoding the factor that induces and expresses the Bmi-1 gene For example, a method of introducing a cell into a cell having the ability to separate cardiomyocytes.
  • the above-mentioned factor that induces and expresses the Bmi-1 gene is a vector DNA that incorporates a Bmi-1 gene promoter and a reporter gene such as GFP, luciferase, or 13-galactosidase into cardiomyocytes. By introducing it into a cell having the ability, a factor that induces and expresses the Bmi-1 gene can be selected.
  • the number of cell divisions can also be increased by using an immortalizing gene derived from a virus.
  • an immortalizing gene derived from a virus For example, human papillomavirus (HPV) E6 gene and E7 gene can be used.
  • HPV human papillomavirus
  • the E6 gene it is preferable to use a mutant that has lost its transforming activity on cells, for example, a mutant that lacks leucine, the 151st amino acid.
  • the gene is introduced into a retroviral vector, and the vector is introduced into a cell capable of differentiating into cardiomyocytes.
  • Introducing the vector into a normal plasmid vector and introducing the vector into cells capable of differentiating into cardiomyocytes, or a structure capable of expressing the gene, for example, expression in animal cells upstream of the gene The ability to differentiate into cardiomyocytes by adding a poly-A signal downstream of the gene and, if necessary, an enzyme splicing signal for specific expression in the desired cells. And a method for introducing it into cells having the ability to differentiate HPV virus or a virus having deletion, substitution, addition of other sequences, etc. into cardiomyocytes It can be mentioned, such as how to infection or introduced into the cells.
  • Hearts including wraps that divide into heart wraps.
  • a medicament comprising the cells according to the present invention, specifically a cardiac regenerative drug. Or a therapeutic agent for heart disease is provided.
  • Heart diseases targeted by the cardiac regenerative drug or cardiac disease therapeutic agent according to the present invention include myocardial infarction, ischemic heart disease, congestive heart failure, arrhythmia, hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, Examples include myocarditis and valvular disease.
  • the cells contained in the medicament according to the present invention may be immortalized in some cases. Alternatively, it may be a cell derived from cardiomyocytes or myocardial progenitor cells. According to a preferred embodiment of the present invention, depending on the damaged part of the heart, myocardial endothelial cells (Endocardial endothelial cells), cushion cells (Cushion cells), ventricular cardiomyocytes, atrial cardiomyocytes, sinus node cells, etc. Cells that can be induced to differentiate into various cells that form the heart of the heart or cells that have been induced to differentiate into these cells or their precursor cells are used.
  • Endocardial endothelial cells Endocardial endothelial cells
  • cushion cells Cushion cells
  • ventricular cardiomyocytes ventricular cardiomyocytes
  • atrial cardiomyocytes atrial cardiomyocytes
  • sinus node cells etc.
  • a method for transporting the medicament according to the present invention to a damaged site a method using a catheter or the like is used.
  • a specific method will be described below with an example of ischemic heart disease. Since cardiomyocytes damaged by ischemic heart disease are present downstream of the vascular stenosis site, coronary angiography (Illustrated Pathology Department of Cardiovascular Medicine 1, MEDICAL VIEW, 1993) ) To identify the stenosis site of the blood vessel. Organic stenotic lesions are classified into afferent stenosis, eccentric stenosis, and multiple wall irregularities according to the stenotic condition. In particular, eccentric stenosis is subdivided into two types, type I and type II.
  • Stenotic morphology is known to be related to the course and prognosis of angina.
  • Type II eccentric stenosis and multiple wall irregularities are likely to shift to myocardial infarction, which is common in patients with unstable angina.
  • the injected cell may not reach the damaged site, so the stenotic site should be restarted in advance by percutaneous coronary angioplasty (PTCA) or thrombolytic therapy. is required.
  • PTCA percutaneous coronary angioplasty
  • thrombolytic therapy is required.
  • the cells to be injected can be distinguished as ventricular or atrial.
  • the catheter can be inserted from the right upper brachial artery using the Sones method (Illustrated Pathology, Department of Cardiology 1, MEDICAL VIEW, 1993) or from the femoral artery, Jundkins Method (Illustration Pathology, Department of Cardiology 1, Cardiology 1, MEDICAL VIEW, 1993) can be used for ⁇ IJ.
  • a method and a therapeutic agent for treating a heart-related congenital genetic disease are provided.
  • diseases that cause heart failure there is a group of heart failure due to a lack of a part of the protein that is originally necessary for the separation or maintenance of the heart due to mutation of a single gene.
  • diseases include familial hypertrophic cardiomyopathy, Fabri disease, long QT syndrome, Marfan syndrome, aortic stenosis, mitochondrial cardiomyopathy, Duchenne muscular dystrophy Etc.
  • diseases are known to be caused by genetic abnormalities such as myosin, troponin, tropomyosin, voltage-gated Na channel, K channel, fibrin, elastin, mitochondria and dystrophin [Therapeutics, ⁇ , 1302- 1306 (1996)].
  • a method for treating the above-mentioned diseases which comprises obtaining a cell having a differentiation potential into a myocardial cell from a patient, introducing a normal gene into this cell, and For example, by transplanting the cells into the heart, for example, by the same method as that for the medicament according to the present invention described above.
  • a normal gene can be introduced into a cell capable of differentiating into a cardiomyocyte according to the present invention after being inserted into the gene therapy vector described in 3 (3) (b) above.
  • An antibody that is specifically expressed in cells having the ability to separate cardiomyocytes according to the present invention and recognizes surface antigens performs cell therapy for heart diseases such as myocardial infarction. Therefore, it can be used for the purity test and purification of cells having the ability to separate cardiomyocytes, which is necessary for this.
  • X 10 5 cells Z cells capable of differentiating into cardiomyocytes according to the present invention, or cell membrane fractions 1 to 10 mg Z cells prepared with this cell force are used as antigens.
  • a suitable adjuvant for example, Complete Freund's Adjuvant
  • subcutaneously, intravenously or intraperitoneally in a non-human mammal such as a rabbit, goat, 3-20 week old rat, mouse or hamster, or Administer with aluminum hydroxide gel, pertussis vaccine, etc.
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. On the 3rd to 7th day after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus. Years, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988].
  • a non-human mammal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of serum or antibody-producing cells.
  • a polyclonal antibody can be prepared by separating and purifying the serum.
  • a monoclonal antibody is prepared by fusing the antibody-producing cells and myeloma cells derived from a non-human mammal to produce a hyperidoma, and culturing the hybridoma or administering to an animal to cause the animal to undergo ascites tumor. It can be prepared by separating and purifying the culture medium or ascites.
  • antibody-producing cells spleen cells, lymph nodes, antibody-producing cells in peripheral blood, particularly spleen cells, are preferably used.
  • the myeloma cell line is an 8-azaguanine-resistant mouse (BALB / c-derived) myeloma cell line, ⁇ 3—Xri 3Ag8—U1 (P3—U1) strain [Surrent Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NSl / l-Ag41 (NS-l) strain [European J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2 / 0—Agl4 (SP—2) strain [Nature, 276, 269 (1978)], P3—X63—Ag8653 (653) strain [J. Immunology, 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) strain [Nature, 256, 495 (1975)], etc.
  • Original cell lines are preferably used.
  • Hypridoma cells can be prepared by the following method.
  • Antibody-producing cells and myeloma cells were mixed, and HAT medium [RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mmol / 1), 2-mercaptoethanol (5 X 10 " 5 mol / 1), gentamicin (10 ⁇ m g / ml) and 10% FCS in medium example mosquitoes ⁇ , hypoxanthine (10_ 4 mol / 1), thymidine (1. 5 X 10 "5 mol / 1) and aminopterin (4 X 10" 7 mol / 1 ) Is suspended in a medium containing 2) and cultured for 7 to 14 days.After culturing, a portion of the culture supernatant is removed and reacted with the antigen by enzyme immunoassay, etc. Next, select those that do not react, perform cloning by limiting dilution, and select those that have a stable and high antibody titer by enzyme immunoassay as monoclonal antibody-producing hyperpridoma cells.
  • Methods for separating and purifying polyclonal or monoclonal antibodies include centrifugation, ammonium sulfate precipitation, force prillic acid precipitation, DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A or G-column or gel filtration column, etc. And a method of treating chromatograms and the like using singly or in combination.
  • a cDNA library prepared from cells capable of differentiation into cardiomyocytes was obtained from control cells other than cells capable of differentiating into cardiomyocytes, such as hematopoietic stem cells and neural stem cells. Perform subtraction using. After preparing a differential cDNA library enriched with cell-specific genes capable of differentiating into cardiomyocytes, the cDNA sequence inserted into the differential cDNA library is randomly sequenced from the 5 'end. Select only those that have a differentiation signal sequence (random sequence analysis). By determining the full-length nucleotide sequence of the cDNA thus obtained, it is possible to distinguish whether the protein encoded by the cDNA is a secretory protein or a membrane protein.
  • the signal sequence trap method is a method for selectively screening a gene having a secretory signal sequence.
  • a signal sequence trap library was created using a vector that can be subtracted, and a signal sequence that also produced cell forces capable of differentiating into cardiomyocytes.
  • a method of subtracting a trap library using mRNA obtained from control cells such as hematopoietic stem cells and neural stem cells is desirable.
  • the DNA fragment containing the secretory signal sequence obtained in this way can be used as a probe for cloning full-length cDNA.
  • the protein encoded by the cDNA can be identified. A distinction can be made between secreted and membrane proteins.
  • Some membrane proteins encode receptors. Such a receptor may function in the specific proliferation of cells capable of differentiating into cardiomyocytes, or in the regulation of differentiation into cardiomyocytes, and can be used for searching for ligands of the receptor. it can. In the case of a secreted protein, it can be used to proliferate or differentiate cells having the ability to differentiate directly into cardiomyocytes.
  • Screening for growth factors of cells capable of differentiating into cardiomyocytes and differentiation-inducing factors into cardiomyocytes is performed by cultivating cells capable of differentiation into cardiomyocytes in a serum-free medium. And then examining whether the cells proliferate or are induced to differentiate into cardiomyocytes.
  • Substances used as specimens include, but are not limited to, secreted proteins such as various cyto force-ins and growth factors, membrane-bound proteins such as cell adhesion molecules, tissue extracts, synthetic peptides, synthetic compounds, and microbial culture solutions. Not.
  • Proliferation ability can be examined by colony forming ability and BrdU incorporation.
  • Colony-forming ability can be examined by seeding cells having the ability to separate cardiomyocytes according to the present invention at a low density.
  • BrdU incorporation can be examined by immunostaining using an antibody that specifically recognizes BrdU.
  • Examples of the method for evaluating the distribution to cardiomyocytes include a method using the autonomous pulsation of cells as an index, and a method using the expression of a reporter gene introduced into cells as an index.
  • a method using reporter gene expression as an indicator is based on the method of using a vector DNA incorporating a gene promoter and a reporter gene specifically expressed in cardiomyocytes into cardiomyocytes. This is a method of introducing into a cell having differentiation potential and examining the expression of a reporter gene using the cell.
  • reporter gene examples include GFP, luciferase, and a gene encoding 13-galactosidase.
  • Promoters for genes specifically expressed in cardiomyocytes include promoters such as cardiac Troponin I [J. Biological Chemistry, 273, 25371-25380 (1998)].
  • a method for obtaining a cell expressing a target surface antigen from the endometrium or menstrual blood is provided.
  • this method include a method using a flow cytometer having a sorting function and a method using magnetic beads.
  • Flow cytometer sorting methods include the water droplet charging method and the cell capture method (flow cytometer freely, ⁇ 14-23, Shujunsha, 1999). In both methods, the expression level of the antigen can be quantified by converting the fluorescence intensity emitted from the antibody bound to the molecule expressed on the cell surface into an electric signal. Moreover, it is also possible to separate using a plurality of surface antigens by combining the types of fluorescence used.
  • FIT and FIT fluorescein isothiocyanate containing PE (phycoery thnn) ⁇ APC (Allo-pnycocyanin) ⁇ TR (TexasRed) ⁇ Cy «3, yGhrome, Red (Flow cytometer freely, p3-13, Shujunsha, 1999).
  • a primary antibody recognizing a surface antigen and a target cell sample are mixed and incubated on ice for 30 minutes to 1 hour. If the primary antibody is fluorescently labeled, separate it with a flow cytometer after washing. If the primary antibody is fluorescently labeled and is V ⁇ , mix the fluorescently labeled secondary antibody that has binding activity to the primary antibody and the cells reacted with the primary antibody after washing, and again on ice for 30 minutes. Incubate for 1 hour. After washing, the cells stained with the primary and secondary antibodies are flow cytometer Separation at one.
  • the primary antibody After the primary antibody is reacted with the cells, the primary antibody that did not react with the cells is removed, and the secondary antibody that specifically binds to the primary antibody and bound with the magnetic beads is bound. Cells from which the remaining secondary antibody has been washed away can be separated by a stand provided with a magnet. The materials and equipment needed for these operations are available from DYNAL.
  • the method using magnetic beads can be similarly used to remove unnecessary cells from a cell sample.
  • the StemSep method sold by Stem Cell Technologies Inc. (Vancouver, Canada) can be used.
  • the antibody used in the above-described method is the antibody obtained in the above 8, or Flk-1, CD31, which is known as a surface antigen of vascular endothelial cells, or a surface antigen of hematopoietic cells.
  • CD13, CD14, CD34, CD45, CD90, CD140a (PDGFR a) known as a mesenchymal cell surface antigen, integrin CD29, matrix receptors CD44, CD50, CD54, CD24, a marker for B cells and granulocytes
  • antibodies that recognize CD55, CD59, and adhesion molecule CD166 which is a member of the immunoglobulin superfamily, are widely expressed in blood cells. By combining these antibodies, target cells can be obtained with higher purity.
  • CD34-negative, CD29-positive, CD140a-negative and CD44-positive cells human eclampsia or menstrual blood-derived cell force CD34-positive cells and CD140a-positive cells are used. After removal using the immunomagnetic bead method described above, the target cells can be separated by fractionating the CD29-positive and CD44-positive cell fractions.
  • the green fluorescein green fluorescent protein (green fluores cent protein; GFP) can be used as an indicator of cell separation.
  • a GFP gene is connected to the GFP gene, and a vector is prepared and introduced into a cell having the ability to separate cardiomyocytes. Cells into which such a reporter vector has been introduced are separated using a marker such as drug resistance, and then differentiated into cardiomyocytes. Differentiated cells express GFP and emit fluorescence. Fluorescent cardiomyocytes and myocardial progenitor cells can be easily separated using a flow cytometer (flow cytometer freely, p44-52, Shujunsha, 1999).
  • MLC2v or Tropon in I can be used as a promoter of a gene that is specifically expressed in cardiomyocytes.
  • the aforementioned plasmid vector for animal cells, adenovirus vector and the like can be used.
  • Menstrual blood on the first day of menstruation was transferred to a 10 ml sterile plastic dish from the sanitary ware or directly from the vulva.
  • 50 ml blast tube containing menstrual blood collected in a plastic dish containing 20 ml of culture solution [DMEM (Dulbecco's modified MEM) medium containing 1% fetal calf serum, penicillin added with streptomycin antibiotics] Moved to.
  • the menstrual blood cells After collecting the menstrual blood cells by centrifuging the obtained medium containing menstrual blood by centrifugation at 1,000 X g, the menstrual blood cells contain 10% FBS (fetal calf serum) a -MEM (a -modified MEM ) A cell fluid derived from menstrual blood was obtained by resuspending in the medium.
  • FBS fetal calf serum
  • a -MEM a -modified MEM
  • the isolated cells contained in menstrual blood, supplemented with 10-20% serum from cattle, etc. It was dispersed in the ground, placed in a plastic culture dish for tissue culture, and cultured in an incubator filled with 5 to 10% diacid carbon dioxide gas at a culture temperature of 33 to 37 ° C. On the second day after the start of culture, the medium was changed to remove red blood cells. When the cells grew all over the culture dish, the medium was removed, and the cells were suspended by adding trypsin EDTA solution.
  • a human endometrium-derived immortalized cell line was established by introducing an immortalized gene into the human eclampsia-derived cells obtained in (1) above using a retrowill vector.
  • the medium was replaced with the same medium and further cultured under the same conditions to obtain a cell line incorporating the retroviral vector LXSN-16E7.
  • the cell line obtained above was further infected with a retroviral vector L XSH-hTERT containing human TERT (hTERT). That is, the obtained cell line was grown in the same medium containing 100 / zg / ml G418, and 5 ⁇ 10 6 cells were planted on a 6 cm culture dish the day before infection with the virus at 37 ° C., 5% Cultivation was performed in an incubator with CO concentration.
  • hTERT human TERT
  • the medium was replaced with the same medium containing glomycin B, and further cultured under the same conditions to obtain a cell line incorporating the retroviral vectors LXSN-16E7 and LXSH-hTERT.
  • a retroviral vector MSCVpuro-16E6SD containing the 16E6SDD151 gene, a deletion mutant in which the transforming activity of the HPV16-derived E6 gene was further lost in the obtained cell line D151 was infected. That is, the obtained cell line was grown in the same medium containing 100 ⁇ g / ml G418 and 50 ⁇ g / ml hyaluromycin B, and 5 ⁇ 10 6 cells were cultured 6 cm on the day before the virus was infected. It was planted in a dish and cultured overnight in an incubator at 37 ° C and 5% CO concentration. [J.Gene
  • GFP green fluorescent protein Infected with adenovirus expressing
  • the immortalized cell line derived from human endometrium labeled with GFP has a concentration of 3 / z mol / l as a 5-azacitidine (Sigma, hereinafter abbreviated as 5-aza-C) treatment group.
  • 5-aza-C 5-azacitidine
  • Demethylation treatment was performed by culturing at ° C. By changing the medium, 5-aza-C was removed, and after 1 day, the cells were collected and divided into those that were cultured alone and those that were co-cultured with mouse embryonic cardiomyocytes.
  • a medium without 5-aza-C was used for the 5-aza-C untreated group. The same culture was performed, and the cells were divided into those that were collected and cultured alone and those that were cocultured with mouse embryonic cardiomyocytes.
  • intimal cell-derived immortal cell line into cardiomyocytes was performed.
  • immortal cell lines derived from human eclampsia which are not co-cultured, use PMEM containing 0.05% trypsin and 0.25 mmol / l EDTA, and then use DMEM medium containing 10% FCS. 5% CO concentration
  • the cells were cultured at 37 ° C in a two-time incubator.
  • the anti-human CD59 antibody (BD-555764, Becton Dickinson, which is an antibody against the antigen expressed in the immortal cell line derived from human eclampsia Magnetic microbeads (BD IMagnet Cell Separation Magnet ⁇ BD— 552311, manufactured by Becton Dickinson Bioscience) was used to isolate cells.
  • BD-555764 Becton Dickinson, which is an antibody against the antigen expressed in the immortal cell line derived from human eclampsia Magnetic microbeads (BD IMagnet Cell Separation Magnet ⁇ BD— 552311, manufactured by Becton Dickinson Bioscience) was used to isolate cells.
  • BD-555764 Becton Dickinson
  • the cells were stained with a body (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human and atalogue ff i'21, manufactured by HyTest), which is an intracellular antigen and specific to human cardiac muscle protein. Went.
  • a body Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human and atalogue ff i'21, manufactured by HyTest
  • the surface of the slide glass was coated with Poly-L-Lysine (P8920, manufactured by Sigma).
  • the slide glass was washed with 70% ethanol containing 1% HC1 in advance, and Poly-L-Lysine diluted 10-fold with pure water was added to the same part and left at room temperature for 5 minutes. Poly-L-Lysine was then removed and thoroughly dried at 60 ° C for 1 hour.
  • a suspension of the immortalized cell line derived from human eclampsia was placed on the slide glass coated with ysine for 1 hour and firmly adhered onto the slide glass. Thereafter, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and immersed in a PBS solution containing 0.02% Triton-X for 20 minutes to disrupt the cell membrane. Thereafter, anti-human myocardial Troponin I antibody diluted 400-fold with PBS was added as a primary antibody, and the mixture was allowed to react in the refrigerator for 1 day while moisturizing. Thereafter, the remaining antibody was removed by washing 10 times with PBS, and a secondary antibody (Anti Mouse TRITC, manufactured by Sigma) solution was collected and allowed to react at room temperature for 30 minutes while moisturizing.
  • Anti Mouse TRITC manufactured by Sigma
  • human eclampsia-derived immortalized cell lines can be obtained by co-culture with cardiomyocytes.
  • Myocardium that has a very high rate of self-pulsation and has a physiological function on the culture dish regardless of treatment It became clear to become.
  • E-MSC hEPClOO
  • E-MSC hEPC214
  • mice embryonic cardiomyocytes were cultured on the upper surface of the collagen membrane, and E-MSCs were cultured on the lower surface and observed.
  • Cell density and culture conditions were basically the same as those described above. That is, mouse embryonic cardiomyocytes were seeded on the upper surface of the tissue culture collagen membrane with lxl0 5 / cm 2 cells, and the medium was 37 ° with a 5% CO concentration incubator using DMEM medium containing 10% FCS. C. cultured for 24 hours.
  • a human endometrium-derived immortalized cell line labeled with GFP collected 1 day after infection is turned upside down on the collagen membrane on which mouse embryonic cardiomyocytes are cultured on the top, with the collagen membrane bottom facing up, 5 X 10 Immortalized cell line derived from human endometrium at a density of 4 / cm 2 is seeded on the bottom of the collagen membrane at a density of 5 ⁇ 10 3 / cm 2 and 5% CO concentration using DMEM medium containing 10% FCS. Incubator was incubated at 37 ° C for 24 hours.
  • E-MSCs are physically separated from the primary mouse cultured cardiomyocytes by a collagen membrane, and are in physical contact with each other, so cell fusion does not occur.
  • E-MSC started self-pulsation after 1 week of culture. By observing the same cells with a confocal laser microscope, clear expression of human Troponin I was observed. This method proved that E-MSC myocardial induction was not due to cell fusion.
  • E-MSCs started self-pulsation on the second day after co-culture with mouse embryonic cardiomyocytes, and E-MSCs began to contract in synchrony between 3 and 4 days. Macroscopically, it was observed that 100% of the cells emitting GFP fluorescence contracted, and in this state, culture was possible for about one month. E-MSC was not treated with 5-aza-C, but was induced into the myocardium only by co-culture with mouse embryonic cardiomyocytes. Under these conditions, myocardium-specific protein mRNA expressed in E-MSCs induced in the myocardium was measured by RT-PCR.
  • human myocardial RNA was purchased from Clontech (Clontech) and converted to cDNA using the same method as described above.
  • Cardiomyocyte-specific genes include natriuretic peptides ANP and BNP, troponin T and troponin I proteins that regulate muscle contraction, cardiac actin, mycinic light chain MLC-2a, Nkx2.5 / Csx and GATA4, which are cardiomyocyte-specific transcription factors, were used. Since these sequences are set as human-specific primers, even if mouse cardiomyocyte-derived cDNA is mixed in the sample, the measurement results are not affected.
  • E-MSC co-cultured with mouse embryonic cardiomyocytes, as well as human cardiomyocytes have ANP and BNP, which are natriuretic peptides, as muscle cardiomy specific genes.
  • ANP and BNP proteins that regulate contraction, such as Troponin T and Troponin I, cardiac actin as a protein, MLC-2a as a myosin light chain, Nkx2.5 / Csx and GATA4 mRNA as cardiomyocyte-specific transcription factors are expressed. It was observed that!
  • E-MSC distributed to cardiomyocytes strongly expresses human cardiac myocyte specific troponin I, and has a fibrous structure characteristic of cells that cause strong contraction. was able to be observed. Only myocardial Troponin I reaction was detected in E-MSCs emitting green GFP fluorescence.
  • the myocardium is not the only cell that causes spontaneous excitation and contraction! Since skeletal and smooth muscles can spontaneously excite, it is necessary to measure action potentials to prove that the cells are cardiomyocytes.
  • the action potential of cardiomyocytes has a specific plateau phase generated by myocardium-specific L-type Ca current, and therefore the action potential duration has a width of about 200-300 ms!
  • the cells were subjected to an experiment under observation with an inverted epifluorescence microscope (IX-70-23FL / DIC manufactured by Olympus) Nomarski differential interference microscope.
  • the cells are visually identified with self-pulsating green fluorescent cells using a fluorescence microscope, and the cells are glazed using a piezo-driven patch clamp micro-manipulator (PCS-5400, manufactured by Narishige).
  • PCS-5400 piezo-driven patch clamp micro-manipulator
  • the electrode was approached and inserted. In other words, the electrode tip was adhered to the cell membrane surface so as not to penetrate the cell, then a hole was made in the cell membrane using a buzz system, and the electrode was inserted into the cell. The recording was stable for 5-10 minutes.
  • the electrode tip is small, red dye is hardly observable in the cell during potential recording.However, after the potential recording is completed, the charged Alexa-568 is released into the cell by passing a current of about ⁇ through the electrode. It penetrated into the cell by ionophoresis, and the whole cell was stained quickly. By comparing the morphology of cells that show green fluorescence with the staining pattern that appears in red after recording the potential, the cells that recorded the potential were positive for GFP. E-MSC cells were confirmed. The potential is applied to the patch clamp amplifier (Axopatch via a platinum electrode inserted in the glass electrode.
  • Intracellular potential was amplified using 200B (manufactured by Axon), and the waveform was captured on a computer using a data capture device (pClamp8).
  • the recorded action potential has a pacemaker potential characteristic of cells with automatic function.
  • One E-MSC shows a sinus rhythmic action potential with a relatively short action potential, and another E-MSC.
  • MSC exhibited a working myocardial action potential with a wide action potential range and a deep resting membrane potential.
  • the V-deviation also has a myocardial-specific potential waveform!
  • E-MSCs differentiate into working cardiomyocytes and sinus node cells by co-culture with mouse embryonic cardiomyocytes.
  • Flk-1 Flk-1
  • CD31 which is known as a surface antigen of vascular endothelial cells
  • CD13, CD14, CD34, CD45, CD90 which are known as surface antigens of hematopoietic cells, and mesenchymal cells.
  • CD140a PDGF receptor ⁇ , hereinafter abbreviated as PDGFR a
  • integrin CD29 matrix receptors CD44, CD50, CD54, B cell condylar marker CD24
  • CD55 CD59
  • adhesion molecule CD166 a member of the immunoglobulin superfamily.
  • Each antibody was added at a concentration of 2 ⁇ g / 5xl0 5 cel ls / 0.2 ml to the endometrial cells suspended in FACS buffer (1% FCS-PBS) and allowed to react in ice for 30 minutes. .
  • Cells treated with FITC-labeled or PE-labeled antibody were suspended in 0.5 ml after washing 3 times with buffer.
  • Cells treated with unlabeled primary antibody should be washed with buffer and concentrated at 2ug / 5xl0 5 cells / 0.2ml.
  • the anti-mouse IgTRITC-labeled antibody was reacted for 30 minutes in ice, washed 3 times with buffer, and suspended at 0.5 ml.
  • the fluorescence intensity was measured with a flow cytometer (BD FACSort, manufactured by Becton Dickinson Bioscience), and the presence or absence of expression of the antigen molecule was examined based on whether the fluorescence intensity increased.
  • BD FACSort manufactured by Becton Dickinson Bioscience
  • CD140a antigen For expression of CD140a antigen, antibody reaction was performed using unlabeled anti-human CD140a (PDGFRa) antibody (556001, manufactured by PharMingen), measured with anti-mouse IgTRITC-labeled antibody, and measured with a flow cytometer did.
  • PDGFRa unlabeled anti-human CD140a
  • Flk-1 antigen For the expression of Flk-1 antigen, an antibody reaction was performed using an unlabeled anti-human Flk-1 antibody (sc-6251, manufactured by Santa Cruz), and after treatment with anti-mouse IgTRITC-labeled antibody, a flow cytometer Measured with one.
  • FITC-labeled anti-human CD31 antibody (IM1431, Beckman
  • the antibody reaction was carried out using Coulter) and measured with a flow cytometer.
  • the antibody reaction was carried out using Coulter) and measured with a flow cytometer.
  • CD14 antigen was measured by a flow cytometer using an FITC-labeled anti-human CD14 antibody (PN6604110, manufactured by Beckman Coulter) to carry out an antibody reaction.
  • CD34 antigen For the expression of CD34 antigen, an antibody reaction was performed using a PE-labeled anti-human CD34 antibody (IM1250, manufactured by Beckman Coulter) and measured with a flow cytometer.
  • IM1250 PE-labeled anti-human CD34 antibody
  • CD45 antigen For the expression of CD45 antigen, an antibody reaction was carried out using a FITC-labeled anti-human CD45 antibody (PM31254X, manufactured by PharMigen, Inc.), and measured with a flow cytometer.
  • FITC-labeled anti-human CD45 antibody PM31254X, manufactured by PharMigen, Inc.
  • CD90 antigen For the expression of the CD90 antigen, an antibody reaction was carried out using a PE-labeled anti-human CD90 antibody (HD7403, manufactured by Beckman Coulter) and measured with a flow cytometer.
  • PE-labeled anti-human CD90 antibody HD7403, manufactured by Beckman Coulter
  • the antibody reaction was performed using a flow cytometer.
  • the antibody reaction was performed using a flow cytometer.
  • PE-labeled anti-human CD50 antibody IM1601, Beckman Coupe
  • the antibody reaction was performed using a flow cytometer.
  • an antibody reaction was performed using an unlabeled human CD54 antibody (IM0544, manufactured by Beckman Coulter). After treatment with an anti-mouse IgTRITC-labeled antibody, a flow cytometer was used. It was measured.
  • CD24 antigen For the expression of the CD24 antigen, an antibody reaction was performed using an unlabeled human CD24 antibody (IM0118, manufactured by Beckman Coulter), and after treatment with an anti-mouse IgTRITC-labeled antibody, a flow cytometer was used. It was measured.
  • CD55 antigen For the expression of CD55 antigen, an antibody reaction was performed using a FITC-labeled anti-human CD55 antibody (IM2725, manufactured by Beckman Coulter) and measured with a flow cytometer.
  • FITC-labeled anti-human CD55 antibody IM2725, manufactured by Beckman Coulter
  • CD59 antigen For the expression of the CD59 antigen, an antibody reaction was performed using a FITC-labeled anti-human CD59 antibody (IM3457, manufactured by Beckman Coulter), and measured with a flow cytometer.
  • IM3457 FITC-labeled anti-human CD59 antibody
  • CD166 antigen For the expression of the CD166 antigen, an antibody reaction was performed using an unlabeled anti-human CD166 antibody (RDI-CD166-aA6, manufactured by RDI) and measured with a flow cytometer.
  • RDI-CD166-aA6, manufactured by RDI unlabeled anti-human CD166 antibody
  • Example 2 In the same manner as in Example 2 (4), a sheet-like graft graft stained with E-GFP was obtained.
  • the obtained sheet was layered in 2-3 layers in the culture solution and placed on a collagen film (CM-6, Kohken).
  • a collagen membrane was attached as a zygote, transplanted onto the surface of a nude rat heart without rejection immunity, and closed. The chest resumed after 2 weeks.
  • the heart was fixed and immunostained.
  • the heart was stained with ardiac Troponin-1 antibody, barcomenc alpha actinin rod, and Connexin 43 antibody, and it was confirmed that the graft was induced to the myocardium by using a confocal laser confocal microscope.
  • Example 5 Isolation and culture of cells from human menstrual blood
  • Menstrual blood on the first day of menstruation was transferred to a 10 ml sterile plastic dish from the sanitary ware or directly from the vulva.
  • a 50 ml plastic 'tube containing menstrual blood collected in a plastic dish containing 20 ml of culture solution [DMEM (Dulbecco's modified MEM) medium with 1% fetal calf serum, added with penicillin' streptomycin antibiotics'] Moved to.
  • the menstrual blood cells After collecting the menstrual blood cells by centrifuging the obtained medium containing menstrual blood by centrifugation at 1,000 X g, the menstrual blood cells contain 10% FBS (fetal calf serum) a -MEM (a -modified MEM ) A cell fluid derived from menstrual blood was obtained by resuspending in the medium.
  • FBS fetal calf serum
  • a -MEM a -modified MEM
  • the isolated cells contained in menstrual blood are dispersed in an ⁇ - ⁇ culture medium supplemented with 10-20% of serum from cows, etc., placed in a plastic culture dish for tissue culture, and cultured.
  • the cells were cultured in an incubator filled with 5-10% diacid carbon gas at a temperature of 33-37 ° C.
  • the medium was changed to remove red blood cells.
  • the cells were suspended by adding trypsin EDTA solution.
  • human menstrual mesenchymal stem cells obtained in (1) above were infected with an adenovirus expressing GFP according to a method described in the literature [J. Gene Med., 6, 833-845 (04)]. Specifically, human menstrual mesenchymal stem cells at a density of 5 ⁇ 10 4 / cm 2 were implanted in a 6 cm culture dish in a DMEM medium containing 10% FCS, and infected with adenovirus expressing GFP the next day. The cells were further cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO concentration in the same medium except for the supernatant. The expression of GFP
  • DMEM medium containing 10% FCS Use DMEM medium containing 10% FCS and culture at 37 ° C in an incubator with 5% CO concentration. Induced human placental umbilical cord mesenchymal stem cells into cardiomyocytes. ⁇ Human placental umbilical cord mesenchymal stem cells were similarly removed from the culture dish with PBS containing 0.05% trypsin and 0.25 mmol / l EDTA, and then used with DMEM medium containing 10% FCS. % CO dark
  • the cells were cultured at 37 ° C in a two-time incubator.
  • the cells were stained with an intracellular antigen that is against human heart muscle-specific protein Troponin I (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human and atalogue ff i'21, manufactured by HyTest). Went.
  • the surface of the slide glass was coated with Poly-L-Lysine (P8920, manufactured by Sigma).
  • the slide glass was washed with 70% ethanol containing 1% HC1 in advance, and Poly-L-Lysine diluted 10-fold with pure water was added to the same part and left at room temperature for 5 minutes. Poly-L-Lysine was then removed and thoroughly dried at 60 ° C for 1 hour.
  • human menstrual mesenchymal stem cells cultured alone without co-culture with mouse embryonic cardiomyocytes, with or without 5-aza-C treatment showed Troponin I positive cells The ratio was very low (less than 1% of GFP positive cells).
  • human menstrual mesenchymal stem cells that had not been treated with 5-aza-C were considered to be indispensable for myocardial induction. A positive rate was shown.
  • human menstrual mesenchymal stem cells can be treated with 5-aza-C by co-culture with cardiomyocytes. Regardless of the presence or absence, it became clear that the heart beats at a very high rate and becomes a myocardium with physiological functions already on the culture dish.
  • the activity potential was measured based on the method of the literature [J. Gene Med., 6, 833-845 (04)].
  • the recorded action potential showed a myocardial action potential with a width of nearly 300 msec and had diastolic slow depolarization (pacemaker potential)! / ⁇ .
  • the supernatant containing blood cells is discarded, and the tissue is washed again with DMEM. Purified. This operation was repeated 3-4 times.
  • the tissue was resuspended in a-MEM (a-modified MEM) medium containing 10% FBS (fetal calf serum).
  • the liquid containing placenta and umbilical cord tissue is dispersed in a-MEM medium supplemented with 10-20% of serum from cows, etc., placed in a plastic culture dish for tissue culture, and cultured at a temperature of 33-37. Incubated at 5 ° C. in an incubator filled with 5-10% diacid carbon dioxide gas. On the second day after the start of culture, the medium was changed to remove erythrocytes. When the cells grew on the entire surface of the culture dish, the medium was removed, and the cells were suspended by preparing a trypsin EDTA solution.
  • human placental umbilical cord mesenchymal stem cells thus obtained were infected with an adenovirus expressing GFP according to a method described in the literature [J. Gene Med., 6, 833-845 (04)]. Specifically, human placental umbilical cord mesenchymal stem cells at a density of 5 ⁇ 10 4 / cm 2 were implanted in a 6 cm culture dish with DMEM medium containing 10% FCS, and infected with adenovirus expressing GFP the next day. The supernatant was removed, and the cells were further cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO concentration in the same medium. GFP expression is fluorescent confocal
  • Human placental umbilical cord mesenchymal stem cells into cardiomyocytes. ⁇ Human placental umbilical cord mesenchymal stem cells were similarly removed from the culture dish with PBS containing 0.05% trypsin and 0.25 mmol / l EDTA, and then used with DMEM medium containing 10% FCS. % CO dark
  • the cells were cultured at 37 ° C in a two-time incubator.
  • Human placental umbilical cord mesenchymal stem cell culture dishes co-cultured with mouse embryonic cardiomyocytes for 1 week produced approximately 30% self-pulsation by visual observation, and cells exhibiting GFP fluorescence contracted in synchrony with each other. What was observed was observed. However, since all the cells are synchronized, it has been difficult to accurately evaluate the proportion of cells that have caused cardiac muscle induction. So this human placenta For umbilical cord mesenchymal stem cells, a sample co-cultured with mouse embryonic cardiomyocytes for 1 week and a sample cultured alone without co-culture were prepared.
  • the cells were stained with intracellular antigens against Troponin I, a protein specific to human myocardium (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human and atalogue ff i'21, manufactured by HyTest). Went.
  • the surface of the slide glass was coated with Poly-L-Lysine (P8920, manufactured by Sigma).
  • the slide glass was washed with 70% ethanol containing 1% HC1 in advance, and Poly-L-Lysine diluted 10-fold with pure water was added to the same part and left at room temperature for 5 minutes. Poly-L-Lysine was then removed and thoroughly dried at 60 ° C for 1 hour.
  • a suspension of human placenta umbilical cord mesenchymal stem cells was placed on a slide glass coated with ysine for 1 hour and adhered firmly onto the slide glass. Thereafter, the cells were fixed with 4% baraformaldehyde and immersed in a PBS solution containing 0.02% Triton-X for 20 minutes to break the cell membrane. Thereafter, anti-human myocardial Troponin I antibody diluted 400 times with PBS as a primary antibody was added and allowed to react for one day in a refrigerator while moisturizing. Thereafter, the remaining antibody was removed by washing 10 times with PBS, and a secondary antibody (Anti Mouse TRITC, manufactured by Sigma) solution was collected and allowed to react at room temperature for 30 minutes while being moisturized.
  • a secondary antibody Anti Mouse TRITC, manufactured by Sigma
  • Example 2 the activity potential was measured based on the method of the literature [J. Gene Med., 6, 833-845 (04)]. As a result, the recorded action potentials exhibited myocardial action potentials with a width of nearly 300 msec, and some had diastolic slow depolarization (pacemaker potential)!
  • human amnion mesenchymal stem cells to separate into cardiomyocytes was examined as follows.
  • human amnion mesenchymal stem cells obtained according to the method described in Example 6 (1) above, according to the method described in the literature [J. Gene Med., 6, 833-845 (04)] Infected with an adenovirus expressing GFP. That is, human amnion mesenchymal stem cells at a density of 5 ⁇ 10 4 / cm 2 were implanted in a 6 cm culture dish in DMEM medium containing 10% FCS, and infected with adenovirus expressing GFP the next day. Remove supernatant and use the same medium at 37 ° C, 5% CO
  • Human amniotic mesenchymal stem cells without co-culture were similarly peeled off from the culture dish with PBS containing 0.05% trypsin and 0.25 mmol / l EDTA, and then 5% using DMEM medium containing 10% FCS. Incubator with CO concentration And cultured at 37 ° C.
  • the activity potential was measured based on the method of the literature [J. Gene Med., 6, 833-845 (04)].
  • the recorded action potential showed a myocardial action potential with a width of nearly 300 msec and had diastolic slow depolarization (pacemaker potential)! / ⁇ .
  • a body (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human and atalogue ff i'21, manufactured by HyTest), which is an intracellular antigen and specific to human cardiac muscle protein, is detected.
  • HyTest a body
  • Poly-L-Lysine P8920, manufactured by Sigma.
  • the slide glass was washed with 70% ethanol containing 1% HC1 in advance, and Poly-L-Lysine diluted 10-fold with pure water was added to the same part and left at room temperature for 5 minutes. Poly-L-Lysine was then removed and thoroughly dried at 60 ° C for 1 hour.
  • a suspension of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was placed on the slide glass coated with ysine for 1 hour and adhered firmly onto the slide glass. Thereafter, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and immersed in a PBS solution containing 0.02% Triton-X for 20 minutes to disrupt the cell membrane. Thereafter, anti-human myocardial Troponin I antibody diluted 400-fold with PBS as a primary antibody was added and allowed to react in the refrigerator for 1 day while keeping the moisture. Thereafter, the remaining antibody was removed by washing 10 times with PBS, a secondary antibody (Anti Mouse TRITC, Sigma) solution was added, and the mixture was allowed to react at room temperature for 30 minutes while moisturizing.
  • a secondary antibody Anti Mouse TRITC, Sigma
  • the activity potential was measured based on the method of the literature [J. Gene Med., 6, 833-845 (04)].
  • the action potential that could be recorded exhibited an action potential peculiar to the myocardium with a width of nearly 200 msec, and this cell force could not be recorded for diastolic slow depolarization (pacemaker potential).

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Abstract

　子宮内膜または月経血から得られた子宮膜由来の、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞由来の心筋細胞に分化する能力を有する細胞が開示されている。本発明による細胞は、その入手が比較的容易であり、かつ例えば多数のＨＬＡタイプを供給可能な月経血、臍帯血、または出産後に廃棄される胎児付属臓器から得ることが出来る。この細胞は、心筋細胞との共培養により、高頻度で心筋細胞に分化する。さらに心筋細胞への分化は、不死化細胞を脱メチル化処理（例えば、５－アザシチジン処理）しなくとも高頻度で生じる。本発明による細胞によれば、心臓再生薬または心臓疾患治療薬を提供できる。

Description

明 細 書
心筋細胞への分化能を有する細胞
発明の背景
[0001] 発明の分野
本発明は、子宮内膜または月経血力 得た子宮膜由来の、または月経血、臍帯血 若しくは胎児付属臓器力 得た間葉系幹細胞由来の、心筋細胞への分化能を有す る細胞に関し、更に詳しくは、心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞の増殖方法および 心筋細胞への分ィ匕誘導、ならびにこれら細胞を用いた心臓疾患の治療薬に関する。
[0002] 普晋 術
心筋細胞は、出生前は自律拍動しながら活発に細胞分裂を行っている。しかし、出 生と同時にその分裂能は喪失し、肝細胞のように再び細胞分裂能を獲得することは なぐまた骨格筋細胞とも異なり衛星細胞といった未分ィ匕な前駆細胞を持つこともな い。従って、心筋梗塞、心筋炎または老化等に伴い心筋細胞が壊死すると、生体内 では残存心筋細胞の細胞分裂ではなく細胞の肥大がおきる。心肥大は初期におい ては生理的適応であるが、また共存する心線維芽細胞の増殖による間質の線維化と 相まって心臓自体の拡張機能の低下、さらには収縮機能の低下へと結びつき心不 全を呈するようになる。心筋梗塞等による心不全のこれまでの治療は心収縮力の増 強、血管拡張薬による心臓の圧負荷'容量負荷の軽減、利尿薬による血流量の減少 等の対症療法を中心に行われてきた。これに対し、心臓移植は重症心不全に対する 根本的な治療法であるが、臓器提供者の不足、脳死判定の難しさ、拒絶反応、医療 費の高騰等の問題から心臓移植が一般的な医療に普及するのは簡単ではない。実 際、心臓病は我が国の死亡原因の第 3位となっており (厚生白書平成 10年)、失われ た心筋細胞を再生することができれば医療福祉の大きな前進につながると考えられ る。
[0003] 現在までに、心筋細胞の性質を保存した細胞株としては、心房性ナトリウム利尿ホ ルモンのプロモーターに SV40の large T抗原を組み換えて作製したトランスジエニック マウスの心房に生じた腫瘍力 株化された AT-1細胞が挙げられる [Science, 239; 102 9-1038 (1988)]。しカゝしながら、該細胞は in vivoに移植すると腫瘍を形成するため、 細胞移植には適さないという問題がある。そこで、このような背景のもと、心筋を再構 築するため以下の方法が考えられた。
[0004] 1つ目の方法は、心筋細胞以外の細胞を心筋細胞に変換する方法である。これは 、線維芽細胞に MyoDを導入すると骨格筋細胞に変換できることから類推された。こ れまでに、マウスの胎児性癌細胞である P19細胞での成功例は示されているものの [ Cell Struc. &Fun ， 21: 101-110 (1996)]、非ガン細胞での成功例は報告されていな い。
[0005] 2つ目の方法は、心筋細胞に再び分裂能を付与する方法である。これは、胎児期 に心筋が拍動しながら分裂できる現象に基づいている。し力しながら、これまでに成 功例は報告されていない。
[0006] 3つ目の方法は、未分ィ匕な幹細胞力も心筋細胞を誘導する方法である。すでに、胚 性幹細胞 (ES細胞)力 心筋細胞を誘導できることが示されて 、るが、胚性幹細胞自 身を成体に移植するとカルシノーマを形成すること、抗原性などの問題が存在する [N ature Biotechnology, Γ7, 139-142 (1999)]。
[0007] 従って、胚性幹細胞を現実の医療へと応用するためには、少なくとも心筋前駆細胞 あるいは、心筋細胞を純粋に精製する技術が不可欠である。抗原性の問題はクロー ン化の技術により解決できる可能性は示唆されているが、煩雑な操作を必要とするこ と力 一般的な医療への応用は容易ではな 、。
[0008] 中絶胎児力 未分ィ匕な細胞である心筋前駆細胞を取得して移植に用いる方法も考 えられており、動物を用いた実験では心筋細胞として有効に機能することが知られて いる [Science, 264, 98-101 (1994)]。しかしながら、この方法で大量の心筋前駆細胞 を取得することは困難であり、倫理の観点力 も一般的な医療への応用は容易では ない。
[0009] 成体骨髄には造血系幹細胞および血管幹細胞以外に間葉系幹細胞が存在し、間 葉系幹細胞からは骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、靱帯細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、 ストローマ細胞、肝臓 oval細胞が分ィ匕誘導できることが報告されている [Science, 284, 143-147 (1999); Science, 284, 1168-1170 (1999)]。一方、最近、マウス成体の骨髄 力も取得した細胞から、心筋細胞が分ィ匕誘導できることが報告された [J. Clinical Inve stigation, 103, 10-18 (1999)]。マウスの骨髄細胞力 榭立された不死化細胞は、最 大で 50%程度筋管様細胞に分化することが報告されて 、る（US2002/0142457)。最 近、ヒトの骨髄細胞についても、マウスの骨髄細胞と同様に、心筋細胞への分化誘導 が可能であることが報告された [The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004); Exp. Biol. Med., 229, 623-631 (2004)]が、分化誘導効率はマウス細胞と比較して低 頻度である。また、骨髄力 骨髄細胞を採取するためには全身麻酔が必要であり、採 取できる幹細胞数が少な 、。
[0010] 一方、子宮内膜は、周期的に組織の剥離と再構築が行われており、組織幹細胞の 存在が示唆されている。実際、ヒト子宫内膜にある種の幹細胞のマーカー [CD117(c- kit)、 CD34]が発現していることが見出され [Fertility and Sterility, 81, 403-407 (2004 )]、子宫内膜から組織幹細胞を分離同定する試みも報告されている [Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology, 44, 380-386 (2004)] 0しかし、 子宮内膜に存在することが示唆されている組織幹細胞の分ィ匕能等の性質について は十分解明されておらず、子宮内膜由来組織幹細胞が心筋細胞に分化する能力を 有するかどうかについての報告はない。また、子宮内膜から心筋細胞への分ィ匕能力 を有する幹細胞を分離同定するための有用なマーカーも報告されていない。
[0011] 生体内の組織から目的の細胞を取得する方法として、各種表面抗原を認識する抗 体が用いられている。例えば、未熟な造血幹細胞では CD34+/CD38-/HLA-DR-/C D90 (Thy-1)+の特性を有していること、また、造血幹細胞が分ィ匕するに従い、 CD38 が発現し CD90(Thy-l)が消失することが知られている [蛋白質核酸酵素 Vol. 45, Nol 3, 2056-2062(2000)]。血管内皮細胞では、 CD34、 CD31、 Flk-1、 Tie-2、 E—セレク チン等のマーカーを発現しており [分子心血管病 Vol. l,No.3,294-302(2000)]、骨髄の 間葉系幹細胞では CD90、 CD105、 CD140a等のマーカーを発現している [Science, 28 4, 143-147 (1999); Science, 284, 1168-1170 (1999)]。マウス骨髄細胞由来の心筋に 分化する細胞は、 CD117(c- kit)、 CD140a等のマーカーを発現しており（US2002/014 2457)、ヒト骨髄細胞由来の心筋に分化する細胞は、 CD13、 CD29、 CD44、 CD55、 C D59、 CD90、 CD105、 CD166等のマーカーが発現していることが報告されている [The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)]。 発明の概要
[0012] 本発明者は、今般、子宮内膜または月経血力も得たヒト子宮内膜組織由来の細胞 、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器力 得た間葉系幹細胞が、心筋細胞 との共培養により、高頻度で心筋細胞に分化する、との知見を得た。この心筋細胞へ の分ィ匕は、細胞を脱メチルイ匕処理 (例えば、 5—ァザシチジン処理)しなくとも高頻度 で生じるとの知見を得た。本発明は力かる知見に基づくものである。
[0013] よって、本発明は、心筋細胞に分化する能力を有する細胞の提供をその目的として いる。
[0014] また、本発明は、子宮内膜または月経血から得られた子宮膜由来の、または月経 血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞由来の、心筋細胞 に分化する能力を有する細胞からの心筋細胞の調製法の提供をその目的としている
[0015] また、本発明は、医薬、とりわけ心臓再生薬または心臓疾患治療薬の提供をその目 的としている。
[0016] そして、本発明による細胞は、子宮内膜組織または月経血力も単離された子宮膜 由来の、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器力 単離された間葉系幹細胞 由来の、心筋細胞に分化する能力を有する細胞である。
[0017] 本発明による細胞は、月経血、臍帯血、または出産後に廃棄される胎児付属臓器 力ら得ることが出来ることから、その採取にあたり、新たな苦痛を与えることなぐ繰り 返し、比較的多量の試料を採取することができ、また、例えば多数の HLAタイプを供 給できる点で、従来の心筋細胞に分化する能力を有する細胞に比較して極めて有利 である。
[0018] 本発明による細胞は不死化されてもよぐその不死化は例えば、テロメラーゼまたは Bmi-1の細胞内発現またはヒトパピローマウィルスの E6または E7遺伝子の細胞内発 現によりなされてよい。
[0019] また、本発明による心筋細胞の調製法は、子宮内膜組織または月経血力 子宮内 膜由来の細胞、または月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器から単離された間葉系 幹細胞を得て、前記細胞を心筋細胞へ分化誘導することを少なくとも含んでなる。 [0020] 本発明の好ましい態様によれば、この方法において、分化誘導は、心筋細胞との 共培養、 DNAの脱メチル化処理による分化誘導、胎児の心臓発生領域で発現して いる因子または胎児の心臓発生段階において心筋細胞への分化に働く因子による 分化誘導、および心筋細胞への分化能を有する細胞または該細胞から分化した心 筋細胞の培養上清による分ィ匕誘導力 なる群力 選択される少なくとも一つにより行 われる。
[0021] 本発明による心筋細胞の調製法において、子宮内膜由来の細胞を、心筋細胞へ 分化誘導する前に、不死化されていてもよぐこの不死化は、テロメラーゼまたは Bmi- 1の細胞内発現によりなされる力 またはヒトパピローマウィルスの E6または E7遺伝子 の細胞内発現によりなされる。
[0022] また、本発明による医薬は、上記の本発明による細胞を有効成分として含んでなる ものであり、具体的には、心臓再生薬または心臓疾患治療薬として用いられる。
[0023] また、本発明の別の態様によれば、上記の本発明による細胞に、心臓の先天性遺 伝子疾患についての変異遺伝子に対する野生型遺伝子を導入し、これを有効成分 として含んでなる先天性心臓疾患治療薬が提供される。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]は、実施例 1 (3)における、不死化細胞から、 Troponin I発現細胞が分化誘導さ れた割合 (心筋誘導率)と、共培養の有無、 5—ァザシチジン (5- azaC)処理の有無と の関係を表す図である。
[図 2]は、本発明による E-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体を用い、フロー サイトメーターで測定した結果のグラフである。
[図 3]は、図 2と同様に、本発明による E-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体 を用い、フローサイトメーターで測定した結果のグラフである。
[図 4]は、図 2と同様に、本発明による E-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体 を用い、フローサイトメーターで測定した結果のグラフである。
[図 5]は、図 2と同様に、本発明による E-MSC細胞の表面抗原の解析を、種々の抗体 を用い、フローサイトメーターで測定した結果のグラフである。 発明の具体的説明 [0025] 細胞の寄託
本発明による心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞の具体例である、後記する E— M SC (hEPClOO)細胞および E— MSC (hEPC214)細胞は、独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中 央第 6)に、平成 17年 1月 19日（原寄託日）に寄託され、 FERM BP— 10467およ び FERM BP— 10468の受託番号を得ている。
[0026] 1.心筋細胞への分化能を有する細胞の単離
本発明による心筋細胞への分ィ匕能を有する子宮内膜由来の細胞は、子宮内膜ま たは月経血から単離することができる。以下に、心筋細胞への分化能を有する細胞 を単離する方法を説明する。
ヒトの子宮内膜より心筋細胞への分ィ匕能を有する子宮内膜細胞を取得する方法と しては、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、 Am.J.Path ol.， 163, 2259-2269 (2003)に記載された方法に基づき行うことができる。
[0027] すなわち、外科手術により摘出されたヒト子宮内膜組織を、細かく切り、細胞を培養 可能な培地に入れる。該培地としては、細胞が培養可能なものであれば特に限定さ れな 、力、、好適に【ま -MEM、 — minimnum essential medium)、 DMEM (Dulbecco s modified Eagle s medium)、 IMDM(Isocove s modified Dulbecco ' s medium)等に 1〜 20%の動物由来の血清、好ましくは 5〜10%のゥシ胎児血清 (FCS)をカ卩えた培地で培 養する。ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質をカ卩えても良い。さらに、細胞 の分離を良くするために、 type3などのコラゲナーゼおよび deoxyribonuclease Iなどの DNA分解酵素を培地に添加し、 20〜40°C、好ましくは 37°Cの条件で、例えば 10分間 〜5時間、好ましくは 1時間、緩やかに振盪する。個々の子宮内膜腺を顕微鏡で観察 しながら分離し、適当な培養容器、例えば、 24-ゥエル培養皿を用いて 37°C、 5%CO
2 の条件下で孵卵器にて培養することにより、心筋細胞への分ィ匕能を有する子宮内膜 細胞を取得することができる。
[0028] マウスの子宫内膜細胞の単離は、特に限定されないが、 McCormack SA and Glass er SR [Endocrinology, 106, 1634-1649 (1980) ]に記載されている方法に基づき行う ことができる。 [0029] すなわち、子宫を切片に切断し、タンパク質分解酵素、例えば、 5mg/mlのトリプシン と25 mg/mlのパンクレアチンを含む PBS (phosphate- buffed saline)〖こ浸し、 0〜37。Cで 、 10分間〜 3時間、好ましくは 0°Cで 30分間〜 1時間、さらに、室温にて 10分〜 3時間 、好ましくは 30分間〜 1時間反応させる。酵素を含む PBS溶液を注意深く除去した後 、 1〜20%の動物由来の血清、好ましくは 5〜10%の FCSを含む適当な培地、例えば 、 DMEM/F- 12 (DMEMと Ham' s F- 12 mediumを 1： 1に混合したもの）培地を加えるこ とにより、トリプシンを失活させる。培地を PBSに置換し、組織を 10秒間〜 30分間、好 ましくは 30秒間ゆっくり振盪する。子宫組織を注意深く除き、細胞懸濁液をフィルター 、例えば、 70- mのメッシュフィルターに通す。濾過液を例えば、 1000 X gで 5分間遠 心することにより、細胞を沈殿画分に回収する。細胞は、 PBSに再懸濁して遠心する ことにより、洗浄しても良い。遠心操作により沈殿した細胞を、増殖可能な培地ならい ずれの培地を使用することもできる力 1〜20%の動物由来の血清、好適には 5〜10 %の FCSを含む DMEM/F-12培地に懸濁する。培地に抗生物質、例えば、 lOOunits/ mlのペニシリン、 100mg/mlのストレプトマイシンをカ卩えても良い。また、非必須アミノ酸 溶液を例えば、 1 %添加しても良い。このような方法を用いることにより、心筋細胞へ の分ィ匕能を有する子宮内膜細胞を取得することができる。
[0030] さらに、月経血からの単離は以下のとおり行うことができる。まず、月経 1日目の月 経血からの方が獲得される細胞数が多いことから、好ましくは月経 1日目（生理が始 まった 1日目）の月経血を、生理用品ないしは直接、外陰部より採取する。採取した 月経血を、好ましくは 1%牛胎仔血清入りの DMEM (Dulbecco's modified MEM)培地（ ペニシリン 'ストレプトマイシンの抗生物質を添加])に入れ、遠心分離により月経血に 含まれる細胞を回収する。この細胞を、 10%の FBS (牛胎仔血清）を含む a -MEM ( a -modified MEM)ゝ DMEM (Dulbecco's modified MEM)まには IMDM (Isocove's modifie d Dulbecco's medium)等の細胞培養用培地に再浮遊させることにより、月経血に由 来する細胞液を得ることができる。
[0031] 月経血、臍帯血若しくは胎児付属臓器 (例えば、胎盤、臍帯、または羊膜)力もの 間葉系幹細胞の単離は以下のとおり行うことができる。すなわち、 DMEM内で、摘出 した組織を眼科用鋏で細断し (約 l-5mm3大)、数分間静置した後、血液細胞が含ま れる上清を廃棄し、再び、 DMEMにて組織を洗浄する。この操作を 3— 4回繰り返す。 その後、 100Gで 30秒程度の遠心分離を行ってもょ 、。
[0032] 2.心筋細胞への分化能を有する細胞の培着
上記 1の方法により単離した、心筋細胞への分化能を有する細胞を培養するため に用いる培地としては、公知の細胞培養用培地 (例えば、組織培養の技術基礎編 第三版、朝倉書店 1996)を用いることができるが、好ましくはゥシ等の血清を 5〜20% 添加した、 a - MEM、 DMEM, DMEM/F- 12または IMDM等の細胞培養用培地などが 用いられる。培養条件は、細胞が培養可能であれば特に限定されないが、培養温度 は 33〜37°Cが好ましぐさらに 5〜10%の二酸ィ匕炭素ガスで満たした孵卵器で培養す ることが好ましい。心筋細胞への分ィ匕能を有する子宫内膜由来細胞は、通常の組織 培養用のプラスチック製培養皿に接着して増殖することが好ましい。細胞が培養皿一 面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシン EDTA(ethylenediamine- Ν,Ν,Ν',Ν'- tet raacetic add)溶液をカ卩えることで細胞を浮遊させる。浮遊した細胞は、 PBSあるいは 該細胞培養用の培地で洗浄後、該細胞培養用の培地で 5倍から 20倍希釈して新し い培養皿に添加することで、さらに継代培養することができる。
[0033] 3.心筋糸田 への分化亩 する糸田 力 の d糸田 の^ 1 法
心筋細胞への分化能を有する細胞を心筋細胞に分化誘導する方法としては、
(1)心筋由来細胞との共培養、
(2) DNAの脱メチル化剤処理による分化誘導、
(3)胎児の心臓発生領域で発現して!/、る因子または胎児の心臓発生段階にお!ヽ て心筋細胞への分化に働く因子による分ィ匕誘導、
(4)心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞または該細胞力 分ィ匕した心筋細胞の培養 上清による分ィ匕誘導などの方法を挙げることができる。
[0034] 本発明の好ま 、態様によれば、上記（1)の方法を単独で、または上記（1)の方法 に上記（2)〜 (4)力 選ばれる 1つ以上の方法を組み合わせることにより、心筋細胞 への分ィ匕能を有する細胞から心筋細胞を高率に誘導することができる。例えば、（1) の方法単独の場合では 80%以上、（1)と（2)とを組み合わせた場合には 95%以上 の誘導率を得ることができる。 [0035] (1)心筋由来細胞との共培養
心筋由来細胞としては、心筋への分化能を有する細胞と共培養して、心筋細胞へ の分ィ匕誘導を促進することができる細胞であれば特に限定されない。本発明の好ま しい態様によれば、心筋由来の細胞は哺乳類由来の細胞であり、例えば、マウス、ラ ット、モルモット、ノヽムスター、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ャギ、サルおよび ヒトからなる群力 選択される。
[0036] 本発明の好ましい態様によれば、心筋由来細胞として、マウスの胎児心筋細胞を用 いることができる。マウス胎児心筋細胞としては、特に限定されないが、例えば、 [The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)]に記載されている方法で調製すること ができる。この方法において、妊娠したマウスの系統及び妊娠期間は特に限定され ないが、具体的には妊娠 14〜16日の BALB/cAJclマウスを用いる。母マウスをエーテ ルで浅麻酔後、致死量のペントバルビタール腹腔内投与を行うことにより安楽死させ る。安楽死確認後、切開開腹する。その際腹部をイソジン等で消毒し無菌的に操作 することが望ましい。子宫を切開し胎児マウスを取り出す。同マウスをさらにイソジン消 毒あるいは 70%エタノール消毒を行い、胸部を眼科用ハサミで切開、胸壁を圧排す ることによって心臓を胸腔外へ突出させることができる。
[0037] その心臓を眼科用ハサミにて切除し、培地に浮遊させる。培地は特に限定されない 1S 5〜10%のゥシ等の血清を含む DMEM培地、 DMEM/F-12培地などが好ましい。 胎児マウスの匹数にっ 、ては特に指定は無 、が、好ましくは 30〜50匹の胎児マウス から心臓を取り出し、同培地に浮遊させる。浮遊させた心臓は、眼科用ハサミにて鈍 的に切断する。後の酵素反応が十分行われれば問題は無いが、心臓の原型を肉眼 的に判別できない程度に、 50〜100回程度ハサミにて細切することが望ましい。同組 織から蛋白分解酵素を用いて心筋細胞を単離するが、該酵素としては、心筋を破壊 せず、組織間質のみを消化する酵素であれば特に限定されない。具体的には、 0.05 %トリプシン及び 0.25mmol/Lの EDTAを含む PBSに心筋組織を投入し、 20〜40°Cに て 5〜60分間、好ましくは 37°Cで 5分間酵素反応させる。その後、 1〜20%の動物由 来の血清、好ましくは 5〜10%の FCS入りの DMEMを用いて酵素反応を停止する。組 織消化液は遠心器によって 500〜2000回転/分、 3分から 10分かけて遠心分離を行 い、その沈殿物を 5〜10%の血清を含む DMEM培地中に入れ、細胞を浮遊させる。 細胞浮遊液を 30分から 3時間程度の間、通常の組織培養用皿上で培養し、接着性の 低い細胞が含まれる上清のみを採取することにより、心筋細胞以外の細胞を除外す る。上清に含まれる心筋細胞はどのような条件で培養しても力まわないが、同細胞を Ixl03〜lxl07/cm2、好ましくは 5xl04〜5xl05/cm2の細胞密度にて通常の組織培養用 皿上で、 33〜37°Cの培養温度で、 5〜10%の二酸化炭素ガスで満たした孵卵器にて 培養することが好ましい。
[0038] 上記初代心筋細胞の培養開始直後〜 10日後、好ましくは 1〜2日後に、その培養
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好ましくは 5xl03/ cm2の密度で添加する。心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞の心筋への分ィ匕を確認 するために、心筋細胞への分化能を有する細胞を共培養前に標識しておくことが望 ましい。該標識としては、細胞障害性の無い色素で培養中に培養液中に溶出しない 材質で有ればどのようなものでもかなわない。具体的には、 [The Journal of Gene Me dicine, 6, 833-845 (2004)]に記載されているように、 green fluorescent protein (GFP) 遺伝子をアデノウイルスによって心筋細胞への分化能を有する細胞に導入し、該細 胞を緑色の蛍光を発する細胞として観察することができる。
[0039] 数日後には、同期して収縮する初代マウス培養心筋細胞とは異なった動きをする 緑色蛍光を示す細胞が観察でき、心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞が心筋へ分ィ匕 したことが確認できる。心筋の活動電位は、例えば、倒立顕微鏡と蛍光フィルターを 用いて測定することにより、心筋特異的な電位波形を観察することができる。また、心 筋のマーカータンパク質は、 mRNAの発現を、 RT- PCR、 Northernブロット解析、 DNA マイクロアレイ解析等にて検出することができるし、該タンパク質の発現を、該タンパク 質に特異的な抗体を用いた免疫組織染色や Westernプロット解析等により検出する ことができる。好適なマーカー遺伝子/タンパク質としては、例えば、心筋特異的転写 因子 Nkx2.5/Csx、 GATA4、 TEF- 1、 MEF- 2C、 MEF- 2D、 MEF- 2A、心房性ナトリウム 利尿ペプチド (ANP)、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP)、 a -ミオシン重鎖（ oc - MH C)、 β -ミオシン重鎖（ 13 -MHC)、ミオシン軽鎖- 2a (MLC- 2a)、ミオシン軽鎖- 2v (ML C-2v)、 α -心筋ァクチン、心筋 Troponin T、 connexin43 (Cnx43)等を挙げることがで きる [J. Clin. Invest., 103, 697-705 (1999)]。
[0040] (2) DNAの脱メチル化剤処理による分化誘導
DNAの脱メチル化剤としては、 DNAに対して脱メチルイ匕を引き起こすィ匕合物であれ ば特に限定されないが、脱メチル化剤としては、染色体 DNA中の CpG配列中のシト シン残基のメチルイヒを特異的に阻害する酵素であるデメチラーゼ、 5-ァザシチジン（ 以下、 5-aza-Cと略す）、 DMSO (dimethyl sulfoxide)などが挙げられる。デメチラーゼ としては、 Nature, 397, 579-583 (1999)記載のデメチラーゼが挙げられる。 DNAの脱 メチル化剤処理による分化誘導の具体例を以下に示す。
3 mol/1から 10 mol/1の間の濃度になるように 5-aza-Cを心筋細胞への分ィ匕能を 有する細胞を含む培地中に添加し、 24時間上記培養条件下でインキュベーションす る。培地を交換することで 5-aza-Cを除去し、さらに 2〜3週間培養することで心筋細 胞を取得することができる。この方法により、好ましくは、例えば、洞結節細胞および 心室型心筋細胞を分ィ匕誘導することができる。
[0041] (3)胎児の心臓発生領域で発現して!/、る因子または胎児の心臓発生段階にお!、て 心筋細胞への分化に働く因子による分ィ匕誘導
胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心 筋細胞への分化に働く因子としては、サイト力イン、ビタミン、接着分子、転写因子な どを挙げることができる。
[0042] サイト力インとしては、心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞に、心臓の発生段階で心 筋細胞への分ィ匕を促進するものであれば特に限定されない。具体的には、血小板由 来増殖因子（以下、 PDGFと略記する）、線維芽細胞増殖因子 8(FGF8)、エンドセリン 1(ET1)、ミドカイン (midkine)、骨形成因子 4(BMP4)などを挙げることができる。 PDGFと しては PDGF A、 PDGF B、 PDGFCなどがあげられる。サイト力インは、例えば 10〜40n g/mlの濃度で用いられる。
また、心筋細胞への分ィ匕を抑制するサイト力インに対する阻害剤を用いることにより 、心筋細胞への分ィヒ能を有する細胞に、心臓の発生段階で心筋細胞への分ィヒを促 進することも可能である。心筋細胞への分ィ匕を抑制するサイト力インとしては、線維芽 細胞増殖因子— 2 (以下、 FGF-2と略記する。）、具体的には、配列番号 7または 8で 表される FGF-2などを挙げることができる。心筋細胞への分ィ匕を抑制するサイトカン に対する阻害剤としては、サイト力インの情報伝達を阻害する物質、例えばサイトカイ ンを中和する抗体、低分子化合物などを挙げることができる。
[0043] ビタミンとしては、レチノイン酸など心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞に、心臓の発 生段階で心筋細胞への分化を促進するものであれば特に限定されな 、。レチノイン 酸は、例えば、 10— 9 mol/lの濃度で用いられる。
[0044] 接着分子としては、心臓の発生段階で心臓発生領域で発現して 、れば特に限定さ れないが、好ましい具体的としては、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フイブロネクチン などの細胞外マトリックス蛋白質等が挙げられる。例えば、フイブロネクチンをコートし た培養皿で該心筋細胞への分化能を有する細胞を培養することにより心筋細胞への 分化を促進することができる。
[0045] 転写因子としては、ホメォボックス型転写因子 Nkx2.5/Csx、 GATAファミリーに属す る Zinc finger型転写因子 GATA4、 myocyte enhancer factor- 2(MEF- 2)ファミリーに属 する転写因子 MEF- 2A、 MEF- 2B、 MEF- 2Cおよび MEF- 2D、 basic helix loop helix型 転写因子に属する dHAND、 eHANDおよび MesPl、 TEA-DNA結合型転写因子フアミ リーに属する TEF-l、TEF-3および TEF-5どを挙げることができる。
[0046] 上述した転写因子は、該因子をコードする DNAを心筋細胞への分化能を有する細 胞中に導入し、 DNAを発現させることにより心筋細胞への分ィ匕を誘導させることがで きる。
また、心筋細胞への分化を誘導する因子 (以下、心筋分ィ匕誘導因子という）を用い て、心筋細胞への分化能を有する細胞を心筋細胞に分化誘導することができる。こ のような心筋分ィ匕誘導因子の取得方法としては、自律拍動する細胞の培養上清に各 種プロテアーゼ阻害剤を添加して、透析、塩析ならびにクロマトグラフィーなどを組み 合わせること〖こより取得することができる。
[0047] さらにマイクロシーケンサーを用いて、上記の心筋分化誘導因子の部分アミノ酸配 列を決定し、該アミノ酸配列に基づき設計した DNAプローブを用いて該自律拍動す る細胞より作製した cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、心筋分ィ匕誘導 因子の遺伝子を取得することができる。 こうして得られた心筋分化誘導因子の遺伝子を、以下のように心筋形成剤として調 製して用いる。
[0048] (a)心筋分化誘導因子をコードする遺伝子を有効成分とする心筋形成剤
まず、心筋分化誘導因子の遺伝子 DNA断片、あるいは全長 cDNAをウィルスベクタ 一プラスミド内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウィルスベクター プラスミドを造成する。
この組換えウィルスベクタープラスミドを、このウィルスベクタープラスミドに適合した パッケージング細胞に導入する。
[0049] ノ ッケージング細胞としては、ウィルスのパッケージングに必要なタンパク質をコー ドする遺伝子の少なくとも 1つを欠損している組換えウィルスベクタープラスミドの該欠 損する蛋白質を補給できる細胞であれば特に限定されない。例えばヒト腎臓由来の HEK293細胞、マウス線維芽細胞 NIH3T3などを用いることができる。
[0050] ノ ッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマ ウスレトロウイルス由来の gag、 p0l、 envなどの蛋白質、レンチウィルスベクターの場合 は HIVウィルス由来の gag、 pol、 env、 vpr、 vpu、 vif、 tat、 rev、 nel¾どの蛋白質、アデノ ウィルスベクターの場合はアデノウイルス由来の El A、 E1Bなどの蛋白質、アデノ随伴 ウィルスの場合は Rep(p5,pl9,p40)、 Vp(Cap)などの蛋白質を用いることができる。
[0051] ウィルスベクタープラスミドとしては上記パッケージング細胞にぉ 、て組換えウィル スが生産でき、心臓先天性遺伝子疾患の原因遺伝子に対する野生型の遺伝子を心 筋細胞で転写できる位置にプロモーターを含有して 、るものが用いられる。
[0052] ウィルスベクタープラスミドとしては MFG [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-673 7 (1995)]、 pBabePuro [Nucleic Acids Research, 18, 3587—3596 (1990)], LL— CG、 CL - CGゝ CS- CG、 CLG [Journal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)]、 pAdexl [Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821 (1995)]等が用いられる。
[0053] プロモーターとしては、ヒト糸且織中で発現できるものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（ヒト CMV)の IE(immediate early)遺伝子のプロモ 一ター、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネイン プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、 SR aプロモーター等を挙げること ができる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ い。また、 Nkx2.5/Csx遺伝子のような心筋細胞特異的な遺伝子のプロモーターを用 いることで、心筋細胞で特異的に目的の遺伝子を発現させることができる。
[0054] 上記糸且換えウィルスベクタープラスミドを上記パッケージング細胞に導入することで 組換えウィルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記 ウィルスベクタープラスミドの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法 [特開平 2- 227075] ,リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等を挙げ ることがでさる。
上述した組換えウィルスベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に感染させ ることにより、心筋細胞へ誘導することができる。
[0055] (b)蛋白質を有効成分とする心筋形成剤
心筋分ィ匕誘導因子蛋白質の完全長 cDNAをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコ ードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片、あるいは完全長 cDNAを発現ベクター内のプロモーターの下流に揷 入することにより、該蛋白質の組換発現ベクターを造成する。
該組換発現ベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞内に導入する。
[0056] 宿主細胞としては、 目的とする DNAを発現できるものは全て用いることができ、例え ば、ェシエリヒア (Escherichia)属、セラチア（Serratia)属、コリネパクテリゥム（Corvneba ctenum) 、フ'レビン グァリ「ノム（BreviDactenum)属、ンュ' ~~トモナス (Pseudomonas) 属、バチルス（Bacillus)属、ミクロパクテリゥム（Microbacterium)属等に属する細菌、ク ノレィベロミセス（Kluweromvces)属、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、シゾサッカ ロマイセス（Shizosaccharomvces)属、トリコスポロン（Trichosporon)属、シヮニォミセス (Schwanniomvces)属等に属する酵母や動物細朐、昆虫細胞等を用いることができる
[0057] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込みが可能で、心筋分ィ匕誘導因子蛋白質の遺伝子 DNAを転写できる位置にプ 口モーターを含有して 、るものが用いられる。 細菌を宿主細胞として用いる場合は、心筋分化誘導因子蛋白質の組換え発現べク ターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列 、心筋分ィヒ誘導因子蛋白質をコードする DNAおよび転写終結配列より構成された組 換え発現ベクターであることが好ま 、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて いてもよい。
[0058] 発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガー マンハイム社より巿販）、 pKK233- 2 (Amersham Pharmacia Biotech社製）、 pSE280 (In vitrogen社製）、 pGEMEX- 1 (Promega社製）、 pQE- 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO [特開 昭 58- 110600]、 pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、 pLSA 1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 430 6 (1985)]、 pBluescript II SK (-) (Stratagene社製)、 pGEX (Amersham Pharmacia Biot ech社製）、 pET- 3 (Novagen社製）、 pTerm2(USP4686191、 USP4939094, USP516073 5)、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 [j. BacterioL, Γ72, 2392 (1990)]等を ί列示することができる。
[0059] 発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ（Shine-Dalgar no)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したものを用い ることが好ましい。
[0060] プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、具 体例としては、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモーター（Plac)、 Pプロモーター、 P
L R
プロモーター、 T7プロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、 S P01プロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等を挙げることができる。ま た Ptrpを 2つ直列させたプロモーター（Ptrpx2)、 tacプロモーター、 letlプロモーター [ Gene, 44, 29 (1986) ]、 lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモー ター等ち用いることがでさる。
[0061] 心筋分ィヒ誘導因子蛋白質の遺伝子 DNAの蛋白質をコードする部分の塩基配列を 、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、 目的とする蛋白 質の生産率を向上させることができる。
心筋分化誘導因子蛋白質の遺伝子 DNAの発現には転写終結配列は必ずしも必 要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい [0062] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテ リウム属、シユードモナス属、バチルス属、ミクロバタテリゥム属等に属する微生物、例 ば、 Escherichia coli XL丄一 Blue、 Escherichia coli XL2— Blue、 Escherichia coli L H1、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escher ichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia coli NY49、 Bacillus subtilis、 Bacillus amvlolig uefaciens, Breviba cterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、 Brevibacterium saccharolvticum ATCC14066、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13032、 Coryneb acterium glutamicum ATCC14067、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13869、 Cory nebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354、 Pseudomonas sp. D-0110等を挙げることができる。
[0063] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、または Gene, H, 107 (1982)や Molecular & General Genetics,崖， 111 (1979)に記載の方法等を 挙げることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を例示す ることがでさる。
[0064] プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば 、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gal 1プロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、 MF a 1プロ モーター、 CUP 1プロモーター等を挙げることができる。
[0065] 宿主細胞としては、サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)、シゾサ ッカロミセス ·ボンべ (Schizosaccharomvces pombe)、クリュイベロミセス ·ラクチス (Kluv veromvces lactis)、トリコスポロン ·プルフンス (Trichosporon pullulans)、シュヮ-ォ セス ·ァノレビウス（Schwanniomvces alluvius)等を挙げることができる。 [0066] 組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods in EnzymoL, 194, 18 2 (1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]、酢酸リ チウム法 ϋ. BacterioL, 153, 163 (1983)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978 )]等を挙げることができる。
[0067] 動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pCDNAI (Invitrogen社製)、 pCDM8 (Invitrogen社製）、 pAGE107 [特開平 3- 22979 ; Cytotechno logy, 3, 133 (1990)]、 pAS3— 3 (特開平 2— 227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)] 、 pCDNAI/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103 [J. Biochem., 101. 1307 (1987)]、 pAGE210等を例示することができる。
[0068] プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（ヒト CMV)の IE(immediate early)遺伝子のプロモ 一ター、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネイン プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、 SR aプロモーター等を挙げること ができる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ い。
[0069] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 [特開昭 63- 29 9]等を挙げることができる。
[0070] 組換えベクターの導入法としては、動物細胞に DNAを導入できるものであれば、特 に限定されず、例えば、エレクト口ポーレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)、 Virology, 52, 456 (1973)]等を用いることができる。形質転換 体の取得および培養は、特開平 2-227075号公報あるいは特開平 2-257891号公報に 記載されて 、る方法に準じて行なうことができる。
[0071] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウィルス'エクスプレッション
'へクタ ~~ス, /' ·フホフトリ ~~ 'マニュ/ レ [Baculovirus Expression Vectors, A Laborat ory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992)]、カレント 'プロトコ一ノレ ズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーサプルメント 1-38(1987- 1997)、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
[0072] 該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、例えば、 pVL1392、 pVLl
393、 pBlueBacIII (ともに Invitrogen社製）等を挙げることができる。
[0073] バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virusノ等 用 ヽ oこと力できる。
[0074] 昆虫細胞としては、 Spodoptera fruriDerdaの卵巢細朐である S19、 S1 1 [Baculovirus
Expression Vectors, A Laboratory Manual、 W.H. Freeman and Company, New York
, (1992)]、 Trichoplusia mの卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製）等を用いること ができる。
[0075] 組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 [特開平 2 -227075] ,リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等を挙 げることができる。
[0076] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー 'クローユング 第 2版
[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second Edition,し old bpnng Harbor Lab oratory Press (1989)]に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発 現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付 カロされた蛋白質を得ることができる。
[0077] 心筋分ィ匕誘導因子をコードする DNAを組み込んだ組換え体 DNAを保有する形質 転換体を培地に培養し、培養物中に心筋分化誘導因子蛋白質を生成蓄積させ、該 培養物より該蛋白質を採取することにより、心筋分化誘導因子蛋白質を製造すること ができる。 心筋分化誘導因子蛋白質を製造する形質転換体を培地に培養する方法は、宿主 の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
[0078] 大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換 体を培養する培地としては、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等を含有 し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいず れでもよい。
[0079] 炭素源としては、それぞれの宿主が資化し得るものであればよぐグルコース、フラ クトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物 等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのァ ルコール類を用いることができる。
[0080] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の各種無機酸若しくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他 含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、力 ゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消 化物等が用いられる。
[0081] 無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
[0082] 培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度 は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間である。培養中 pHは、 3.0-9.
0に保持する。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カル シゥム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添 カロしてちょい。
[0083] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル 13 D—チォガラタトピラノシド（IPTG)等を、 trpプロモーターを用 V、た発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸 (I AA)等を培地に添加してもよ!/ヽ。
[0084] 動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている RPMI1640培地 [The Journal of the American Medical Association, 1 99, 519 (1967)]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、ダルベッコ改変 ME M培地 [Virology, 8, 396 (1959)]、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biolog ical Medicine, 73, 1 (1950)]またはこれら培地にゥシ胎児血清等を添カ卩した培地等を 用!/、ることができる。
培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カロ してちよい。
[0085] 昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている TNM-FH培地（Pharmingen社製）、 Sf- 900 II SFM培地（Life Technolo gies社製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製）、 Grace's Insect Medium [Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 上述の形質転換体の培養物から、心筋分化誘導因子蛋白質を単離精製するには 、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
[0086] 例えば、心筋分化誘導因子蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、 フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有 機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA- 75 (三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラ フィ一法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロ マトグラフィ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独ある ヽ は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
[0087] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、細胞を回収後破砕 し、遠心分離することにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。
回収した該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。
[0088] 該可溶化液を、希釈あるいは透析により、該可溶ィ匕液中の蛋白質変性剤の濃度を 下げることにより、該蛋白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離 精製法により該蛋白質の精製標品を得る。
[0089] 心筋分化誘導因子蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された 場合には、培養上清から、該蛋白質またはその糖鎖付加体等の誘導体を回収するこ とができる。即ち、培養物力 遠心分離等の手法により培養上清を回収し、該培養上 清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
[0090] また、上記方法により発現させた蛋白質を、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカル ボニル法)、 tBoc法 (t-プチルォキシカルボ-ル法)等の化学合成法によっても製造す ることができる。また、米国 Advanced ChemTech社製、 Perkin- Elmer社製、 Amersham Pharmacia Biotech社製、米国 Protein Technology Instrument社氣 国 SyntheceU- Vega社製、米国 PerS印 tive社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して合 成することちでさる。
[0091] (4)心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞または該細胞力 分ィ匕した心筋細胞の培養 上清による分化誘導
また、自律拍動する心筋細胞から取得した細胞外基質をコートした培養皿を用いて 培養すること、自律拍動する心筋細胞の培養上清を添加することで、心筋細胞への 分化能を有する細胞を心筋細胞へ分化誘導させることができる。
[0092] なお、本発明による細胞の精製方法は特に限定されないが、例えば、後述する心 筋細胞への分化能を有する細胞を特異的に認識する抗体を用いたバニング法 [J. Im munol, 141(8), 2797-2800 (1988)]、 FACS法 [Int. Immunol, 10(3), 275-283 (1998)] 、または心筋細胞への分ィヒ能を有する細胞に特異的な遺伝子のプロモーターを用 いたレポーター系を構築する方法により行うことができる。
[0093] 4.心筋細胞への分化能を有する細胞の不死ィ
後記する心臓再生薬または心臓疾患治療薬の場合はその要否ついて別途考慮が 必要となるが、本発明による細胞の研究のための実験にあっては、子宫内膜由来の 細胞の分裂回数は通常有限であることから、本発明による心筋細胞への分ィ匕能を有 する細胞を心筋細胞に分化誘導する前に不死化し、細胞分裂の回数を増やすこと が好ましい。
[0094] 細胞をガン化させずに細胞分裂の回数を増やす、不死化方法としては、テロメラー ゼゃ Bmi-1を心筋細胞への分ィヒ能を有する細胞に発現させる方法を挙げることがで きる。
[0095] テロメラーゼを心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞に発現させる方法としては、テロ メラーゼの触媒サブユニットである TERT遺伝子を、レトロウイルスベクターに導入し、 該ベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、心筋細胞への分 化能を有する細胞に内在する TERT遺伝子を誘導発現させる因子を心筋細胞への 分化能を有する細胞に投与する方法、 TERT遺伝子を誘導発現させる因子をコード する DNAを含むベクターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法など を挙げることができる。
[0096] 上述の TERT遺伝子を誘導発現させる因子は、 TERT遺伝子プロモーターと GFP、 ルシフェラーゼ、あるいは 13一ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子とを組み込 んだベクター DNAを心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞に導入することにより、 TERT 遺伝子を誘導発現させる因子を選別することができる。
[0097] 造血系幹細胞や神経幹細胞の自己複製 (self-renewal)に必須であることが報告さ れて ヽる Bmi-1遺伝子を本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞に発現させ る方法としては、 Bmi-1遺伝子を、レトロウイルスベクターに導入し、該ベクターを心筋 細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、心筋細胞への分化能を有する細胞 に内在する Bmi-1遺伝子を誘導発現させる因子を心筋細胞への分化能を有する細 胞に投与する方法、 Bmi-1遺伝子を誘導発現させる因子をコードする DNAを含むベ クタ一を心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞に導入する方法などを挙げることができ る。
[0098] 上述の Bmi-1遺伝子を誘導発現させる因子は、 Bmi-1遺伝子プロモーターと GFP、 ルシフェラーゼ、あるいは 13一ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子とを組み込 んだベクター DNAを心筋細胞への分ィヒ能を有する細胞に導入することにより、 Bmi-1 遺伝子を誘導発現させる因子を選別することができる。
[0099] また、ウィルス由来の不死化遺伝子を用いることにより、細胞分裂の回数を増加さ せることもできる。例えば、ヒトパピローマウィルス（HPV)の E6遺伝子および E7遺伝子 を用いることができる。 E6遺伝子としては、細胞に対する形質転換活性を消失した変 異体、例えば、 151番目のアミノ酸であるロイシンを欠失した変異体を用いることが好 ま ヽ。該遺伝子を本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞に発現させる方 法としては、該遺伝子を、レトロウイルスベクターに導入し、該ベクターを心筋細胞へ の分化能を有する細胞に導入する方法、通常のプラスミドベクターに導入し、該べク ターを心筋細胞への分化能を有する細胞に導入する方法、あるいは、該遺伝子を発 現可能な構造、例えば該遺伝子の上流に動物細胞で発現可能なプロモーター、該 遺伝子の下流にポリ Aシグナルを付加し、さらに必要に応じて、所望の細胞で特異的 に発現するためのェンノヽンサーゃスプライシングシグナルを付加したものを心筋細胞 への分化能を有する細胞に導入する方法および、 HPVウィルスあるいは、欠失、置 換、他の配列の付加などを有する該ウィルスを心筋細胞への分化能を有する細胞に 感染または導入する方法などを挙げることができる。
[0100] 5.心 纏 への分化 を する纏 を含む心 11蔵 牛 または心 I» 唐、'冶
本発明による細胞は、心筋細胞への分ィ匕能を有するものであるから、本発明の別 の態様によれば、本発明による細胞を含んでなる、医薬、具体的には心臓再生薬ま たは心臓疾患治療薬が提供される。
[0101] 本発明による心臓再生薬または心臓疾患治療薬が治療の対象とする心臓疾患とし ては、心筋梗塞、虚血性心疾患、うつ血性心不全、不整脈、肥大型心筋症、拡張型 心筋症、心筋炎、弁膜症などを挙げることができる。
[0102] 本発明による医薬が含む細胞は、場合により不死化されたものであってもよぐまた 、心筋細胞または心筋前駆細胞へ分ィ匕誘導された細胞であってもよい。本発明の好 ましい態様によれば、心臓の障害部位に応じて、心筋内皮細胞 (Endocardial endothe lial cell),クッション細胞 (Cushion cell),心室型心筋細胞、心房型心筋細胞、洞結節 細胞等の心臓を形成する様々な細胞へ分化誘導できる細胞またはそれら細胞若しく はその前駆細胞に分化誘導された細胞が用いられる。
[0103] 本発明による医薬を障害部位に輸送する方法としては、カテーテルを利用する方 法等が用いられる。以下虚血性心疾患を例に具体的な方法を示す。虚血性心疾患 で障害を受けた心筋細胞は、血管狭窄部位の下流に存在することから、上記の細胞 を注入する前に、冠動脈造影法（図説病態内科講座 循環器一 1、 MEDICAL VIEW , 1993)により血管の狭窄部位を同定しておく必要がある。器質的狭窄病変は狭窄病 態に応じて求心性狭窄、偏心性狭窄、多発性壁不整に分類され、特に偏心性狭窄 はタイプ Iおよびタイプ IIの 2つのタイプに細分類される。狭窄形態は狭心症の経過、 予後に関連することが知られており、タイプ IIの偏心性狭窄や多発性壁不整は不安 定狭心症例に多ぐ心筋梗塞に移行する可能性が高い。血管が完全に狭窄している 場合には、注入する細胞が障害部位に到達しない可能性があるので、事前に経皮 的冠動脈形成術 (PTCA)あるいは血栓溶解療法などにより狭窄部位を再開することが 必要である。障害を受けた心筋細胞の部位に応じて、注入する細胞を心室型や心房 型のように区別することができる。カテーテルの挿入法は右上腕動脈より挿入する So nes法（図説病態内科講座 循環器一 1、 MEDICAL VIEW,1993)あるいは大腿動脈 より挿入する Jundkins法（図説病態内科講座 循環器一 1、 MEDICAL VIEW, 1993)を 禾 IJ用することがでさる。
[0104] 6.先天件遺伝子疾唐、の '治療への禾 II用
本発明の別の態様によれば、心臓関連の先天性遺伝子疾患の治療方法および治 療薬が提供される。
心不全をおこす疾患の中には、一部であるが単一遺伝子の変異により、本来心臓 の分ィヒまたは維持に必要な蛋白質の一部が欠損するために心不全となる一群があ る。このような疾患としては、家族性肥大型心筋症、 Fabri病、 QT延長症候群、マルフ アン症候群、大動脈弁狭窄症、ミトコンドリア心筋症、 Duchenne型筋ジストロフィー症 等が挙げられる。これらの疾患は、ミオシン、トロポニン、トロポミォシン、電位依存性 N aチャンネル、 Kチャンネル、フイブリン、エラスティン、ミトコンドリア、ジストロフィンなど の遺伝子異常が原因であることが知られている [治療学， ^,1302-1306(1996)]。
[0105] 本発明によれば、上記疾患の治療方法が提供され、その方法は、患者より心筋細 胞への分化能を有する細胞を取得し、この細胞に正常な遺伝子を導入したのち、こ の細胞を、例えば前記した本発明による医薬と同様の手法により、心臓に移植するこ とを含んでなる。ここで、正常な遺伝子は、上記 3 (3) (b)において記載した遺伝子治 療用のベクターに挿入したのちに、本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞 に導入することができる。
[0106] 7. 心 への分化 有する な rM^J に認識する杭 体の取得
本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞で発現して！/ヽる表面抗原を特異 的に認識する抗体の調製法について以下説明する。
[0107] 本発明による心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞にぉ 、て特異的に発現して!/、る 表面抗原を認識する抗体は、心筋梗塞などの心臓病の細胞治療を実施する上で必 要な心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞の純度検定や精製に用いることができる。
[0108] この抗体を取得する方法として、本発明による心筋細胞への分化能を有する細胞 3 〜5 X 105cellsZ匹、またはこの細胞力 調製した細胞膜画分 l〜10mgZ匹を抗原と して、ゥサギ、ャギまたは 3〜20週令のラット、マウスもしくはハムスター等の非ヒトほ乳 動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント [例えば、フロインドの完全 アジュバント (Complete Freund's Adjuvant)または、水酸化アルミニウムゲル、百日咳 菌ワクチンなど]とともに投与する。
[0109] 抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜10回行う。各投与後、 3〜7 日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素 免疫測定法 [酵素免疫測定法 (ELISA法）：医学書院刊 1976年、 Antibodies-A Labo ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]などで べる。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物を、血 清または抗体産生細胞の供給源とする。 ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製すること〖こより調製することができる。 モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒトほ乳動物由来の骨髄腫細胞とを融 合させてハイプリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該 動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製すること ができる。
[0110] 抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞、特に脾細 胞が好適に用いられる。
[0111] 骨髄腫細胞としては、 8—ァザグァニン耐性マウス (BALB/c由来)骨髄腫細胞株で め θΡ3— Xり 3Ag8— U1(P3— U1)株 [し urrent Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]、 P3-NSl/l-Ag41(NS-l)株 [European J. Immunology, 6, 511 (1976)]、 SP2 /0— Agl4(SP— 2)株 [Nature, 276, 269 (1978)]、 P3— X63— Ag8653(653)株 [J. Immunolo gy, 123, 1548 (1979)]、 P3-X63-Ag8(X63)株 [Nature, 256, 495 (1975)]等、マウス由 来の株化細胞が好適に用いられる。
ハイプリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。
[0112] 抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、 HAT培地 [RPMI-1640培地にグルタミン（1.5 mmol/1)、 2—メルカプトエタノール（5 X 10"5 mol/1)、ジェンタマイシン（10 μ g/ml) および 10% FCSをカ卩えた培地に、ヒポキサンチン（10_4 mol/1)、チミジン（1. 5 X 10 "5 mol/1)およびアミノプテリン (4 X 10"7 mol/1)をカ卩えた培地]に懸濁した後、 7〜14 日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に 反応し、抗原を含まない蛋白質には反応しないものを選択する。ついで、限界希釈 法によりクローユングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められ たものをモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ細胞として選択する。
[0113] ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心 分離、硫安沈殿、力プリル酸沈殿、または DEAE—セファロースカラム、陰イオン交換 カラム、プロテイン Aまたは G—カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトダラ フィ一等を、単独または組み合わせて処理する方法が挙げられる。
[0114] 上記方法で取得した、心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞で発現している表面抗原 を特異的に認識する抗体を用いて、検体細胞に対する反応性と造血系幹細胞、神 経系幹細胞などの対照となる細胞に対する反応性とを比較することで、検体細胞が 上記特異的表面抗原を発現して 、るかどうかを容易に検定することができる。
[0115] 8.心 纏 への分化 を する纏 で発現,して 、る riffiiJ feよび該 riffiiJ をコードする遣伝早の耐晷
本発明による心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞にぉ 、て特異的に発現して 、る 表面抗原遺伝子の取得方法としては、二つの由来の異なるサンプル間で異なる発現 形態を取る遺伝子を取得する方法であるサブトラクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 85, 5738-5742 (1988)]や Representational difference analysis [Nucleic Acids Res earch, 22, 5640-5648 (1994)]〖こよる方法を挙げることができる。
[0116] まず、心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞より作製した cDNAライブラリーを、造血系 幹細胞や神経系幹細胞などの心筋細胞への分化能を有する細胞以外の対照細胞 より取得した mRNAを用いてサブトラクシヨンを行う。心筋細胞への分化能を有する細 胞特異的な遺伝子を濃縮した差分化 cDNAライブラリーを調製した後、該差分化 cDN Aライブラリーの挿入 cDNA配列を 5 '末端側よりランダムに塩基配列解析を行い、分 泌シグナル配列を持つものだけを選択する（ランダム配列解析)。このようにして得ら れた cDNAの全長塩基配列を決定することにより、該 cDNAがコードする蛋白質が分 泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
[0117] 上記の方法にぉ 、て、ランダム配列解析の代わりに、シグナルシーケンストラップ法 も用いることもできる [Science, 261, 600-603 (1993); Nature Biotechnology, Γ7, 487- 490 (1999)]。シグナルシーケンストラップ法とは、分泌シグナル配列をもつ遺伝子を 選択的にスクリ一二ングする方法である。
[0118] 効率よく特異的な表面抗原を取得するためには、シグナルシーケンストラップライブ ラリーをサブトラクシヨンが行えるベクターを用いて作製し、心筋細胞への分化能を有 する細胞力も作製したシグナルシーケンストラップライブラリーを造血系幹細胞や神 経系幹細胞などの対照となる細胞より取得した mRNAを用いてサブトラクシヨンを行う 方法が望ま ヽ。このようにして取得された分泌シグナル配列を含む DNA断片は全 長 cDNAをクローン化するためのプローブとして用いることができる。
全長 cDNAはその全長塩基配列を解析することで、該 cDNAがコードする蛋白質が 分泌蛋白質か膜蛋白質かを区別することができる。
[0119] ランダム配列解析ある!/、はシグナルシーケンストラップ法を用いた場合でも、得られ たクローンが膜蛋白質をコードする場合は、塩基配列から類推されるアミノ酸配列に 基づき合成ペプチドを作製し、該合成ペプチドを抗原として上記方法により特異的な 抗体を取得することができる。
[0120] また、膜蛋白質の場合は、受容体をコードしているものがある。このような受容体は 心筋細胞への分化能を有する細胞の特異的な増殖、または心筋細胞への分化の調 節に働いている可能性があり、当該受容体のリガンドの探索に用いることができる。 分泌蛋白質の場合は、直接心筋細胞への分化能を有する細胞を増殖あるいは分ィ匕 させるために用いることができる。
[0121] 9.心筋糸田 への分化亩 する糸田 の よび心筋糸田 への分化 導 闵早のスクリーニング
心筋細胞への分化能を有する細胞の増殖因子および心筋細胞への分化誘導因子 のスクリーニングは、心筋細胞への分ィヒ能を有する細胞を無血清培地中で培養する 際に、検体となる種々の物質を添加し、該細胞が増殖するか、または心筋細胞へ分 化誘導されるかを調べることにより行うことができる。
[0122] 検体となる物質としては、各種サイト力インや増殖因子などの分泌蛋白質、細胞接 着分子などの膜結合蛋白質、組織抽出液、合成ペプチド、合成化合物、微生物培 養液等、特に限定されない。
増殖能力はコロニー形成能や BrdUの取り込みなどで調べることができる。 コロニー形成能は、本発明による心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞を低密度で播 種すること〖こより調べることができる。
BrdUの取り込みは、 BrdUを特異的に認識する抗体を用いた免疫染色により調べる ことができる。
[0123] 心筋細胞への分ィ匕を評価する方法としては、細胞の自律拍動を指標とする方法、 細胞内に導入したレポーター遺伝子の発現を指標とする方法などが挙げられる。
[0124] レポーター遺伝子の発現を指標とする方法は、心筋細胞で特異的に発現する遺伝 子のプロモーターとレポーター遺伝子とを組み込んだベクター DNAを心筋細胞への 分化能を有する細胞に導入し、該細胞を用いてレポーター遺伝子の発現を調べる方 法である。
[0125] レポーター遺伝子としては、 GFP、ルシフェラーゼ、 13一ガラクトシダーゼをコードす る遺伝子などが挙げられる。
[0126] 心筋細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーターとしては、 cardiac Troponin I 等のプロモーターが挙げられる [J. Biological Chemistry, 273, 25371-25380 (1998)]。
[0127] 10.心 纏 への分化 を する纏 を杭 ί本を用いて ¾1する 法
本発明の別の態様によれば、子宮内膜または月経血から目的の表面抗原を発現し ている細胞を取得する方法が提供される。この方法としては、ソーティング機能を有 したフローサイトメーターを用いる方法、磁気ビーズを用いる方法が挙げられる。
[0128] フローサイトメーターのソーティングの方式としては、水滴荷電方式、セルキヤプチ ヤー方式などが挙げられる（フローサイトメーター自由自在、 ρ14— 23、秀潤社、 199 9年)。どちらの方法も、細胞の表面に発現している分子に結合した抗体から発せら れる蛍光強度を電気信号に変換することにより抗原の発現量を定量することができる 。また、使用する蛍光の種類を組み合わせることで、複数の表面抗原を利用して分離 することも である。 光とし飞は、 FITし (fluorescein isothiocyanate入 PE(phycoery thnn)ゝ APC(Allo-pnycocyanin)^ TR(TexasRed)^ Cy«3、 し yGhrome、 Redり丄 3、 Red670、 PerCP、 TRI- Color、 QuantumRedなどが挙げられる（フローサイトメーター自由自在、 p3— 13、秀潤社、 1999年）。
[0129] 染色方法としては、子宮内膜または月経血から、上記方法で細胞を分離したのち、 直接抗体で染色する方法、一度適当な培地中で培養 ·増殖を行った後に抗体で染 色する方法が挙げられる。
[0130] 細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的の細胞サンプルを混合し 、氷上で 30分間〜 1時間、インキュベーションする。一次抗体が蛍光で標識されてい る場合には、洗浄後フローサイトメーターで分離を行う。一次抗体が蛍光標識されて Vヽな ヽ場合には、洗浄後一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次 抗体と一次抗体が反応した細胞とを混合し、再び氷上で 30分間〜 1時間、インキュべ ーシヨンする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメータ 一で分離を行う。
[0131] 磁気ビーズを用いる方法では、目的の表面抗原を発現している細胞を大量に分離す ることができる。分離の純度は上述のフローサイトメーターを用いる方法には及ばな いが、精製を繰り返すことにより、十分高い細胞純度を確保することができる。
[0132] 細胞に一次抗体を反応させた後、細胞と反応しな力つた一次抗体を除去し、一次抗 体と特異的に結合する、磁気ビーズを結合させた二次抗体を結合させる。残存する 二次抗体を洗浄除去した細胞は磁石を設置したスタンドで分離することができる。こ れらの操作に必要な材料および装置は DYNAL社から入手することができる。
[0133] 磁気ビーズを用いる方法は、細胞サンプル中より不要な細胞を除去するのにも同様 に利用することができる。不要な細胞をより効率的に除去するには Stem Cell Technol ogies Inc(Vancouver,Canada)より販売されて 、る StemSep法を用いることができる。
[0134] 上述の方法で用いられる抗体としては、前記 8で取得された抗体、または血管内皮 細胞の表面抗原として知られている Flk-1、 CD31、造血系細胞の表面抗原として知ら れている CD13、 CD14、 CD34、 CD45、 CD90、間葉系細胞の表面抗原として知られて いる CD140a (PDGFR a )、インテグリン CD29、マトリックス受容体 CD44、 CD50、 CD54 、 B細胞や顆粒球のマーカーである CD24、血液細胞に広く発現している CD55、 CD5 9、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である接着分子 CD166を認識する抗体が 挙げられる。これらの抗体を組み合わせることで、より高い純度で目的の細胞を取得 することができる。
[0135] 具体的には、 CD34陰性、 CD29陽性、 CD140a陰性細胞および CD44陽性の性質を 有する細胞を取得するには、ヒト子宫内膜または月経血由来細胞力 CD34陽性細 胞と CD140a陽性細胞を上述した免疫磁気ビーズの方法などを利用して除去した後、 CD29陽性および CD44陽性の細胞画分を分取することで目的の細胞を分離すること ができる。
[0136] 11.心筋特異的な遣伝子のプロモーターレポーターベクターを用いた心筋前駆細 朐の分離
心筋細胞への分化能を有する細胞力 誘導した心筋細胞または心筋細胞の前駆 細胞を効率的に分離するために、発光ォワンクラゲの緑色蛍光蛋白質 (green fluores cent protein; GFP)を細胞分離の指標として用いることができる。
[0137] 具体的には、心筋細胞で特異的に発現して 、る遺伝子または前記 9項で取得した 心筋細胞への分化能を有する細胞で特異的に発現して 、る遺伝子のプロモーター の下流に GFP遺伝子をつな 、だベクターを作製し、心筋細胞への分ィ匕能を有する細 胞に導入する。このようなレポーターベクターを導入された細胞を薬剤耐性などの指 標で分離後、心筋細胞へと分化誘導する。分化誘導した細胞は GFPを発現し、蛍光 を発生する。蛍光を発生した心筋細胞ならびに心筋前駆細胞はフローサイトメーター を用いて容易に分離することができる（フローサイトメーター自由自在、 p44— 52、秀 潤社、 1999年)。
[0138] 心筋細胞で特異的に発現して 、る遺伝子のプロモーターとしては MLC2vや Tropon in Iを用いることができる。
[0139] ベクターとしては、上述した動物細胞用のプラスミドベクター、アデノウイルスベクタ 一などを用いることができる。
実施例
[0140] 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に 限定されるものではない。
[0141] 実施例 1
ヒト月経血らの心筋細胞への分化能を有する子宫内膜由来細胞の取得と培養 ( 1)ヒト月経血からの細胞の分離と培養
月経 1日目（生理が始まった 1日目）の月経血を生理用品ないしは直接、外陰部より 、 10mlの無菌的なプラスティック 'ディッシュに移行させた。プラスティック 'ディッシュ に採取された月経血を、 20mlの培養液 [1%牛胎仔血清入りの DMEM (Dulbecco's mo dified MEM)培地、ペニシリン 'ストレプトマイシンの抗生物質を添加]を入れた 50 ml ブラスティック 'チューブに移動させた。取得した月経血が含まれる培養液を 1,000 X g の遠心分離により月経血に含まれる細胞を回収した後、月経血細胞を 10%の FBS (牛 胎仔血清）を含む a -MEM ( a -modified MEM)培地に再浮遊させることにより月経血 に由来する細胞液を得た。
[0142] 単離した、月経血に含まれる細胞を、牛等の血清を 10〜20%添カ卩した、 α -ΜΕΜ培 地に分散し、組織培養用のプラスチック製培養皿に入れ、培養温度 33〜37°Cで、 5 〜10%の二酸ィ匕炭素ガスで満たした孵卵器で培養した。培養開始後 2日目に、赤血 球を除去するために、培地交換を行った。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を 除去して、トリプシン EDTA溶液をカ卩えることで細胞を浮遊させた。
[0143] (2)ヒト子宮内膜由来細胞への遺伝子導入と不死化細胞の榭立
上記（1)で得られた、ヒト子宫内膜由来細胞にレトロウィルベクターを用いて不死化 遺伝子を導入し、ヒト子宮内膜由来不死化細胞株を榭立した。
即ち、ウィルスを感染させる前日に 5 X 106の細胞を 10%ゥシ胎児血清 (FCS)を含む D MEM (Dulbecco' s modified MEM)培地を用いて 6cm培養皿に植え、 37°C、 5% CO濃
2 度の孵卵器でー晚培養した。文献 [J.Gene Med., 6,833-845 (2004)]に記載されてい る方法で調製したヒトパピローマウィルス (HPV)16由来の E7を発現するレトロウイルス ベクター LXSN- 16E7を含む溶液に、終濃度 g/mlとなるように hexadimethrine brom ide(polybrene)(Sigma社製)を添加し、ヒト子宫内膜由来細胞の培養上清 2mlをウィル ス液 2mlと置換し、 37°C、 5% CO濃度の孵卵器でー晚培養した。 100 /z g/mlの G418を
2
含む同培地に交換して更に同様の条件で培養し、レトロウイルスベクター LXSN-16E 7の組み込まれた細胞株を得た。
[0144] 上記で得られた細胞株に、さらにヒト TERT (hTERT)を含むレトロウイルスベクター L XSH-hTERTを感染させた。即ち、得られた細胞株を 100 /z g/mlの G418を含む同培 地で増殖させ、 5 X 106の細胞をウィルスを感染させる前日に、 6cm培養皿に植え、 37 °C、 5% CO濃度の孵卵器でー晚培養した。文献 [J.Gene Med., 6,833-845 (2004)]に
2 一 記載されている方法で調製した hTERTを発現するレトロウイルスベクター LXSH-hTE RTを含む溶液に、終濃度 8 g/mlとなるように polybreneを添カ卩し、 HPV16由来の E7 遺伝子を導入したヒト子宫内膜由来細胞株の培養上清 2mlをウィルス液 2mlと置換し 、 37°C、 5% CO濃度の孵卵器でー晚培養した。 100 μ g/mlの G418と 50 μ g/mlのハイ
2
グロマイシン Bを含む同培地に交換して更に同様の条件で培養し、レトロウイルスべ クタ一 LXSN- 16E7および LXSH-hTERTの組み込まれた細胞株を得た。
[0145] 得られた細胞株にさらに HPV16由来の E6遺伝子の形質転換活性を消失した欠失 変異体である 16E6SDD151遺伝子を含むレトロウイルスベクター MSCVpuro-16E6SD D151を感染させた。即ち、得られた細胞株を 100 μ g/mlの G418および 50 μ g/mlのハ イダロマイシン Bを含む同培地で増殖させ、 5 X 106の細胞をウィルスを感染させる前 日に、 6cm培養皿に植え、 37°C、 5% CO濃度の孵卵器で一晩培養した。文献 [J.Gene
2
Med., 6,833-845 (2004)]に記載されている方法で調製した 16E6SDD151遺伝子を発 現するレトロウイルスベクター MSCVpuro- 16E6SDD151を含む溶液に、終濃度 8 g/ mlとなるように polybreneを添カ卩し、 HPV16由来の E7遺伝子および hTERTを導入したヒ ト子宫内膜由来細胞株の培養上清 2mlをウィルス液 2mlと置換し、 37°C、 5% CO濃度
2 の孵卵器でー晚培養した。 100 μ g/mlの G418、 50 μ g/mlのハイグロマイシン Βおよび 1 μ g/mlのピューロマイシンを含む同培地に交換して更に同様の条件で培養し、レト ロウィルスベクター LXSN— 16E7、 LXSH— hTERTおよび MSCVpuro— 16E6SDD151の組 み込まれた細胞株を得た。
約 4ヶ月上記条件で培養し、不死化した細胞を選択した後、希釈により独立した単 一細胞（single cell)由来の細胞株を 2種、榭立した。
[0146] (3)ヒト子宫内膜由来不死化細胞株からの心筋細胞の誘導
ヒト子宫内膜由来不死化細胞株の心筋細胞への分ィ匕能について、以下の通り検討 した。
上記（2)で得られた 2種のヒト子宫内膜由来不死化細胞株について、文献に記載さ れた方法 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、緑色蛍光タンパク質（以下、 GFPと 略記する）を発現するアデノウイルスを感染させた。即ち、 5 X 104/cm2の密度でヒト子 宫内膜由来不死化細胞株を 10% FCSを含む DMEM培地で 6cm培養皿に植え込み、 GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で 37°C、 5%CO
2 濃度の孵卵機にて更に培養した。 GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。
[0147] GFPで標識したヒト子宮内膜由来不死化細胞株は、 5-ァザシチジン (Sigma社製、 以下、 5-aza-Cと略記する）処理群としては、 3 /z mol/lの濃度になるように 5-aza-Cを 添カ卩した 10% FCSを含む DMEM培地を用いて、 5%CO濃度の孵卵機にて 24時間、 37
2
°Cで培養することにより脱メチル処理を行った。培地を交換することで 5-aza-Cを除去 し、 1日後に細胞を回収して、単独で培養するものとマウス胎児由来心筋細胞と共培 養するものに分けた。一方、 5-aza-C未処理群としては、 5-aza-Cを含まない培地を 用いて全く同様の培養を行 ヽ、細胞を回収して単独で培養するものとマウス胎児由 来心筋細胞と共培養するものに分けた。
[0148] マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記 載された条件で行った。即ち、 5-aza-C処理したヒト子宮内膜由来不死化細胞株およ び、 5-aza-C処理しな力つたヒト子宫内膜由来不死化細胞株を、 0.05%トリプシン (GIB CO社製)および 0.25mmol/l EDTA (ethylenediamine— Ν,Ν,Ν',Νし tetraacetic acid)を 含む PBS (phosphate- buffered saline)により、培養皿からはがし、予め 5 X 103/cm2の 密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は、 10% FCSを 含む DMEM培地を用い、 5%CO濃度の孵卵機にて、 37°Cで培養することによりヒト子
2
宫内膜由来不死化細胞株の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト子 宫内膜由来不死化細胞株は、同様に 0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含 む PBS により培養皿からはがした後、 10% FCSを含む DMEM培地を用いて 5%CO濃
2 度の孵卵機にて、 37°Cで培養した。
[0149] 1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行った 2種のヒト子宮内膜由来不死化 細胞株の培養皿は、目視でほぼ 100%自己拍動を生じ、 GFP蛍光を示す細胞同士が 同期して収縮しているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため 、正確に心筋誘導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、 この 2種のヒト子宫内膜由来不死化細胞株について 1週間マウス胎児由来心筋細胞 と共培養したサンプル及び、共培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養 液中の血清を除去するため PBSで一回洗浄し、その後 0.05%トリプシン及び、 0.25mm ol/lの EDTAを含有する PBSをカ卩えて 37°Cの加湿した孵卵器の中で 5分間酵素反応 を行った。細胞はペトリ培養皿より一塊となって剥離した。剥離した組織を 0.5%コラゲ ナーゼ（TypeII、 Worthington社製)と 2,3- butanedione monoxime (以下、 BDMと略記 する） 10mmol/lを含有する PBS内に投入し、 37°Cの恒温槽内でさらに 20分間反応さ せ、細胞を単離した。これらの細胞には、マウス由来細胞が混入しているため、ヒト子 宫内膜由来不死化細胞株に発現して 、る抗原に対する抗体である、抗ヒト CD59抗 体（BD- 555764、 Becton Dickinson Bioscience社製）を用いて磁気マイクロビーズ（B D IMagnet Cell Separation Magnet^ BD— 552311、 Becton Dickinson Bioscience社製) を用いて細胞単離を行った。抗ヒト CD59抗体を用いて細胞を分離すると、 GFP陰性 の細胞は混入せず、ほぼヒト由来の細胞のみが回収された。
[0150] この細胞について、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質である Troponin Iに 对する 体 (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for humanし atalogue ff i'21 、 HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスを Poly- L- Lysine (P8920、 Si gma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって 1%の HC1を含有した 70%エタ ノールにて洗浄し、同部に純水で 10倍希釈した Poly-L-Lysineを加えて室温で 5分間 放置した。 Poly-L-Lysineをその後除去し、 60°Cで 1時間かけ十分乾燥させた。このし ysineでコートされたスライドグラス上にヒト子宫内膜由来不死化細胞株の浮遊液を 1 時間乗せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は 4%バラフオルムアル デヒドにて固定し、 0.02% Triton-Xを含有した PBS液に 20分間浸して、細胞膜を破壊 した。その後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体を PBSで 400倍に希釈したも のを加え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、 PBSで 10回洗浄して 残留抗体を除去し、 2次抗体 (Anti Mouse TRITC、 Sigma社製)溶液をカ卩えて、保湿し ながら室温で 30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡 (FV1000、 Olympus社製） を用いて同サンプルを観察すると、ヒト心筋 Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ 上に染色される像が観察された。これを陽性と判断し、 GFP陽性細胞中の Troponin I 発現細胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、図 1に示されるとおりで めつに。
[0151] その結果、 5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を 行わず、単独で培養した 2種のヒト子宫内膜由来不死化細胞株では、 Troponin I陽性 細胞の比率は極めて低力つた (GFP陽性細胞の 5%以下)。一方、マウス胎児由来心 筋細胞と共培養した条件では、 5-aza-C処理した 2種のヒト子宫内膜由来不死化細 胞株は、ほぼ 100%、従来心筋誘導に不可欠と考えられていた 5-aza-Cの処理をしな 力つた 2種のヒト子宫内膜由来不死化細胞株においても約 80%の Troponin I陽性率を 示した。従来のヒト心筋細胞への誘導率 (一般的には 1%以下)と比較して、ヒト子宫内 膜由来不死化細胞株は、心筋細胞との共培養を行うことにより、 5-aza-C処理の有無 に関らず、極めて高率に自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋 になることが明らかになった。
[0152] 以上のようにして得られた 2種の細胞を、 E— MSC (hEPClOO)細胞および E— M SC (hEPC214)細胞と呼ぶこととし、また両者を以下において一括して呼ぶときには 、これをヒト子宫内膜由来不死化細胞株または E— MSCと呼ぶこととする。
[0153] (4)コラーゲンゲルフィルムによる分離条件での共培養
(3)で示した高い心筋誘導率が、マウス胎児由来心筋細胞とヒト子宮内膜由来不 死化細胞株との細胞融合の結果である可能性を否定するため以下の実験を行った。 即ち、組織培養用コラーゲン膜 (CM- 6、 Koken社製)を用いて、そのコラーゲン膜の上 面にマウス胎児由来心筋細胞を培養し、下面に E-MSCを培養して観察した。細胞密 度、培養条件などは基本的に前述の方法と同様に行った。すなわち、マウス胎児由 来心筋細胞を組織培養コラーゲン膜上面に lxl05/cm2細胞播種し、培地は、 10% FC Sを含む DMEM培地を用い、 5%CO濃度の孵卵機にて、 37°Cで 24時間培養した。
2 一 方、 5 X 104/cm2の密度でヒト子宫内膜由来不死化細胞株を 10% FCSを含む DMEM 培地で 6cm培養皿に植え込み、 GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上 清を除き同培地で 37°C、 5%CO濃度の孵卵機にて更に培養した。 GFPの発現は、蛍
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光共焦点顕微鏡にて確認した。感染 1日後に回収した GFPで標識したヒト子宮内膜 由来不死化細胞株を、上面にマウス胎児由来心筋細胞が培養されているコラーゲン 膜を上下逆転し、コラーゲン膜底面を上向きにし、 5 X 104/cm2の密度でヒト子宮内膜 由来不死化細胞株を 5 X 103/cm2の密度でコラーゲン膜底面に播種し、さらに 10% F CSを含む DMEM培地を用い、 5%CO濃度の孵卵機にて、 37°Cで 24時間培養した。
2
細胞が十分付着した頃に、同コラーゲン膜を別の培養皿に移し、再度、マウス胎児 由来心筋細胞を上面にして培養を続けた。本培養条件では、 E-MSCはコラーゲン膜 で物理的に初代マウス培養心筋細胞と隔絶しており、物理的に接触して!/、な 、ため 細胞融合が生じることは無い。本培養条件では E-MSCが、培養 1週間後より自己拍 動を開始した。同細胞を共焦点レーザー顕微鏡にて観察することにより、明瞭なヒト T roponin Iの発現を認めた。本方法により、 E-MSCの心筋誘導が細胞融合によるもの ではないことが証明された。
[0154] 実施例 2 E-MSCから誘導される心筋細胞の特性
E-MSCはマウス胎児由来心筋細胞との共培養後 2日目より自己拍動を開始し、 3〜 4日で E-MSC同士が同期して収縮し始めた。肉眼的には GFPの蛍光を発している細 胞の 100%が収縮していることを観察でき、この状態で約一ヶ月間培養が可能であつ た。 E-MSCを 5-aza-C処理せず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養のみで心筋に 誘導した。このような条件で心筋に誘導した E-MSCに発現している、心筋特異的なタ ンパク質の mRNAを RT-PCR法により測定した。共培養開始 7日後に培養液中の血清 を除去するため PBSで一回洗浄し、その後 0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/lの EDTA を含有する PBSを加えて 37°Cの加湿した孵卵器の中で 5分間酵素反応を行った。細 胞はペトリ培養皿より一塊となって剥離した。剥離した糸且織を 0.5%コラゲナーゼと BD M 10mmol/lを含有する PBS内に投入し、 37°Cの恒温槽内でさらに 20分間反応させ、 細胞を単離した。単離した細胞は、抗ヒト CD59抗体を用いた磁気ビーズ細胞分離法 を用いてヒト由来細胞を濃縮した。濃縮した細胞から文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 ( 04)]に基づき全 RNAを抽出し、 First-strand cDNAを合成した。即ち、 Isogen (日本ジ ーン社製）を用いて、細胞から全 RNAを抽出し、 First- strand cDNA synthesis kit (A mersham Pharmacia Biotec社製)を用いて、 cDNAを合成した。また、ヒト心筋由来 RN Aは巿販 (Clontech社製)のものを購入し、上記と同様の方法を用いて cDNAに変換し た。
[0155] 次に、心筋細胞特異的な遺伝子の発現を検討するために、 First strand cDNAを基 質として、配列番号 1〜36に示した塩基配列を有する合成 DNAを用いて定量的 PCR を行った。心筋細胞特異的な遺伝子としては、ナトリウム利尿ペプチドである ANPおよ び BNP、筋肉収縮を調節するタンパク質である Troponin Tおよび Troponin I、ァクチ ンである cardiac actin、ミオシン軽鎖である MLC- 2a、心筋細胞特異的転写因子であ る Nkx2.5/Csx、 GATA4を用いた。これらの配列は、ヒト特異的なプライマーとして設 定したので、マウス心筋細胞由来 cDNAがサンプルに混入していても、測定結果には 影響を与えない。
[0156] ANPの増幅には配列番号 1、 2の塩基配列を有する合成 DNAを、 BNPの増幅には 配列番号 3、 4の塩基配列を有する合成 DNAを、 Troponin Tの増幅には配列番号 5、 6の塩基配列を有する合成 DNAを、 Troponin Iの増幅には配列番号 7、 8の塩基配列 を有する合成 DNAを、 cardiac actinの増幅には配列番号 9、 10の塩基配列を有する 合成 DNAを、 MLC- 2aの増幅には配列番号 11、 12の塩基配列を有する合成 DNAを 、心筋細胞特異的転写因子である Nkx2.5/Csxの増幅には配列番号 13、 14の塩基配 列を有する合成 DNAを、 GATA4の増幅には配列番号 15、 16の塩基配列を有する合 成 DNA用いた。
[0157] RT-PCR解析の結果、マウス胎児由来心筋細胞と共培養した E-MSCには、ヒト心筋 細胞と同様、心筋細胞特異的な遺伝子として、ナトリウム利尿ペプチドである ANPお よび BNP、筋肉収縮を調節するタンパク質である Troponin Tおよび Troponin I、ァク チンである cardiac actin,ミオシン軽鎖である MLC- 2a、心筋細胞特異的転写因子で ある Nkx2.5/Csx、 GATA4の mRNAが発現して!/、ることが観察された。
[0158] E-MSCには、これらの心筋細胞特異的遺伝子 mRNAが、共培養する前から発現し ていることが観察された。不死化による遺伝子導入によって、間葉系細胞の性質自 体が変化しないことから考えて [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]、このような心筋先祖 細胞と呼べるような間葉系幹細胞が子宫内膜には多量に存在している可能性が示 唆された。
[0159] 共焦点レーザー顕微鏡による観察では、心筋細胞に分ィ匕した E-MSCはヒト心筋細 胞特異的な Troponin Iを強発現しており、強い収縮を生じる細胞に特徴的な繊維状 構造を観察することができた。緑色の GFP蛍光を発する E-MSCにのみ、心筋 Troponi n Iの反応が検出された。
[0160] 共焦点レーザー顕微鏡を用いて、心筋細胞に分ィ匕した E-MSCの aァクチニン染色 と、心筋同士が電気的に結合し心筋が共同して収縮するのに必須な connexin 43 (以 下、 Cx43と略記する）タンパク質の免疫染色について検討した。 αァクチニン染色に よって明瞭で、ある一定の配向構造を持つ発達した横紋構造を観察することができ た。このことは本細胞が非常に強く収縮していたことを意味し、顕微鏡で肉眼的に観 察して 、た状況と合致する結果である。
[0161] また、核を中心に細胞質の辺縁を取り囲むように、非常に強い Cx43の染色像が観 察された。本細胞が周辺の細胞と強固に電気的に結合していたことを示し、本細胞 の自動能による収縮時に観察された同期現象を極めて良く説明できる。
[0162] 自発的な興奮収縮を起こす細胞は心筋だけとは限らな!/、。骨格筋も平滑筋も自発 的興奮を生じることがあるため、本細胞が心筋細胞であることを証明するためには、 活動電位の測定が必要である。心筋細胞の活動電位は心筋特異的な、 L型 Ca電流 によって生じる特異的なプラトー相を有しており、そのため活動電位持続時間は 200- 300m秒程度の幅を有して!/ヽる。
[0163] 2種の E-MSCを 5-aza-C処理を行わな!/、でマウス胎児由来心筋細胞との共培養の みで心筋に誘導し、心筋に誘導した E-MSC力も活動電位を記録した。 E-MSCはマウ ス胎児由来心筋細胞の上に存在して 、るため、 E-MSC細胞に記録電極を刺入した 場合、その直下のマウス心筋細胞に電極が挿入されて 、る可能性が否定できな 、。 そこで、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電位を測定した。 即ち、 0.5mmol/lの Alexa-568を 2mol/lの KC1電極内液に溶解し、記録ガラス電極内 に封入して記録した。すなわち、ガラス管 (WPI社 CG-150-100TF)から Sutter社電極 プラー P-97を用いて、 2mol/lの KC1を封入した状態で 10-20 Μ Ω程度の抵抗値を有 する細胞内電位記録用微小電極を作製した。細胞を除震台（明立 AZI-0806HS)上 に設置した着磁仕様ジブラルタルプラットフォーム (Gibraltar XX-lss)上のノイズレスヒ ートプレート (Olympus社製 U-PHP)上で 37°Cに保温し保持した。同細胞を、倒立落 射蛍光顕微鏡（Olympus社製 IX- 70-23FL/DIC)ノマルスキー微分干渉顕微鏡にて 観察下に実験を行った。細胞は蛍光顕微鏡によって、自己拍動する緑色の蛍光を発 する細胞を目視で同定し、同細胞に対してピエゾ駆動式パッチクランプマイクロマ- ピュレーター (PCS-5400、 Narishige社製)を用いてガラス電極を接近させ刺入した。す なわち、細胞を貫かないように、電極先端を細胞膜表面に接着させた後、 Buzz syste mを用いて細胞膜に穴をあけ、電極を細胞内に刺入した。記録は安定して 5— 10分 間記録できた。電極先端が小さいため電位記録中はほとんど細胞内に赤色の色素 は観察できないが、電位記録終了後、 ΙΟηΑ程度の電流を電極を介して細胞内に流 すことによって、荷電した Alexa-568は細胞内にィオノフォレーシスによって浸透し、 細胞全体が速やかに染色された。緑色の蛍光を示す細胞の形態と電位記録後に赤 色に見られる染色パターンを比較することによって、電位を記録した細胞が GFP陽性 の E-MSC細胞であることが確認できた。電位は、ガラス電極内に挿入したプラチナ電 極を介してパッチクランプ用アンプ (Axopatch
200B、 Axon社製)を用いて細胞内電位を増幅し、コンピューター上にデータ取り込 み装置 (pClamp8)を用いて波形を取り込んだ。
[0164] 記録した活動電位は自動能を有する細胞に特徴的なペースメーカー電位を有して おり、 1つの E-MSCは比較的活動電位の短い、洞調律型の活動電位を示し、別の E-
MSCは、活動電位幅が広ぐ静止膜電位の深い、作業心筋型の活動電位を呈した。
Vヽずれも心筋特異的な電位波形を有して!ヽた。
[0165] 以上の結果より、 E-MSCは、マウス胎児由来心筋細胞と共培養することにより、作 業心筋型の心筋細胞および、洞結節細胞型の心筋細胞に分化することが示された。
[0166] 施例 3
E-MSCの表面抗原の解析
ヒト子宮内膜から効率的に心筋形成能を有する細胞を単離 ·精製するために、フロ 一サイトメーター（BD FACSort、 Becton Dickinson Bioscience社製）を用いて E- MSC 細胞の表面抗原の解析を行った。
解析に用いたのは、血管内皮細胞の表面抗原として知られている Flk-1、 CD31、造 血系細胞の表面抗原として知られている CD13、 CD14、 CD34、 CD45、 CD90、間葉 系細胞の表面抗原として知られている CD140a (PDGF受容体 α、以下、 PDGFR aと 略記する）、インテグリン CD29、マトリックス受容体 CD44、 CD50、 CD54、 B細胞ゃ顆 粒球のマーカーである CD24、血液細胞に広く発現している CD55、 CD59、免疫グロ ブリンスーパーファミリーの一員である接着分子 CD166の 16種類である。
[0167] FACS用緩衝液（1% FCS-PBS)に懸濁した子宫内膜細胞に各抗体を 2 μ g/5xl05cel ls/0.2mlの濃度で加えて氷中で 30分間反応させた。
[0168] ネガティブコントロールとしては、抗マウス IgTRITC標識抗体 (AP160R、 Chemicon 社製)とのみ反応させた細胞を用いた。
FITC標識あるいは PE標識抗体で処理した細胞は、緩衝液で 3回洗浄後 0.5mlに懸 濁した。
未標識の 1次抗体で処理した細胞は、緩衝液で洗浄後、 2ug/5xl05cells/0.2mlの濃 度の抗マウス IgTRITC標識抗体と氷中で 30分間反応させ、緩衝液で 3回洗浄後 0.5m 1に懸濁した。
フローサイトメーター（BD FACSort、 Becton Dickinson Bioscience社製）で蛍光強度 を測定し、蛍光強度が増加するか否かで抗原分子の発現の有無を調べた。
CD140a抗原の発現につ!、ては未標識の抗ヒト CD140a (PDGFR a )抗体（556001、 PharMingen社製)を用いて抗体反応を行い、抗マウス IgTRITC標識抗体処理後、フ ローサイトメーターで測定した。
[0169] Flk-1抗原の発現については、未標識の抗ヒト Flk-1抗体（sc-6251、 Santa Cruz社 製)を用いて抗体反応を行い、抗マウス IgTRITC標識抗体処理後、フローサイトメータ 一で測定した。
[0170] CD31抗原の発現については、 FITC標識された抗ヒト CD31抗体（IM1431、 Beckman
Coulter社製)を用いて抗体反応を行!、、フローサイトメーターで測定した。
[0171] CD13抗原の発現につ!、ては、 FITC標識された抗ヒト CD13抗体（IM0778、 Beckman
Coulter社製)を用いて抗体反応を行!、、フローサイトメーターで測定した。
[0172] CD14抗原の発現については、 FITC標識された抗ヒト CD14抗体（PN6604110、 Beck man Coulter社製）を用いて抗体反応を行い、フローサイトメーターで測定した。
[0173] CD34抗原の発現につ!、ては、 PE標識された抗ヒト CD34抗体（IM1250、 Beckman C oulter社製)を用いて抗体反応を行!ヽ、フローサイトメーターで測定した。
[0174] CD45抗原の発現につ!、ては、 FITC標識した抗ヒト CD45抗体（PM31254X、 PharMi ngen,社製)を用いて抗体反応を行 、、フローサイトメーターで測定した。
[0175] CD90抗原の発現につ!、ては、 PE標識した抗ヒト CD90抗体（HD7403、 Beckman Co ulter社製)を用いて抗体反応を行!ヽ、フローサイトメーターで測定した。
[0176] CD29抗原の発現については、 FITC標識したヒト CD29抗体（PN6604105、 Beckman
Coulter社製)を用いて抗体反応を行!ヽ、フローサイトメーターで測定した。
[0177] CD44抗原の発現につ!、ては、 FITC標識したヒト CD44抗体（IM1219、 Beckman Cou
Iter社製)を用いて抗体反応を行!ヽ、フローサイトメーターで測定した。
[0178] CD50抗原の発現については、 PE標識した抗ヒト CD50抗体（IM1601、 Beckman Cou
Iter社製)を用いて抗体反応を行!ヽ、フローサイトメーターで測定した。 [0179] CD54抗原の発現につ!、ては、未標識のヒト CD54抗体（IM0544、 Beckman Coulter 社製)を用いて抗体反応を行い、抗マウス IgTRITC標識抗体処理後、フローサイトメ 一ターで測定した。
[0180] CD24抗原の発現につ!、ては、未標識のヒト CD24抗体（IM0118、 Beckman Coulter 社製)を用いて抗体反応を行い、抗マウス IgTRITC標識抗体処理後、フローサイトメ 一ターで測定した。
[0181] CD55抗原の発現につ!、ては、 FITC標識した抗ヒト CD55抗体（IM2725、 Beckman C oulter社製)を用いて抗体反応を行!ヽ、フローサイトメーターで測定した。
[0182] CD59抗原の発現につ!、ては、 FITC標識した抗ヒト CD59抗体（IM3457、 Beckman C oulter社製)を用いて抗体反応を行!ヽ、フローサイトメーターで測定した。
[0183] CD166抗原の発現につ!、ては、未標識の抗ヒト CD166抗体（RDI-CD166-aA6、 RDI 社製)を用いて抗体反応を行 、、フローサイトメーターで測定した。
[0184] フローサイトメーター測定結果は図 2〜図 5に示されるとおりであり、その解析結果を まとめると、以下の表のとおりであった。
[表 1]
表 1
Figure imgf000045_0001
[0185] 実飾 14
in vivo移柩実験
上記実施例 2 (4)と同様にして、 E-GFP染色されたシート状の移植グラフトを得た。 得られたシートを培養液中で 2— 3層に重ね、コラーゲンフィルム膜 (CM- 6, Kohken 社製)に乗せた。コラーゲン膜を接子で持ち、拒絶免疫の無い Nude Rat心臓表面に 移植し閉胸した。 2週間後に再開胸し。、心臓を固定し、免疫染色を行った。心臓を、 饥し ardiac Troponin- 1抗体、 barcomenc alpha actinin饥体、 Connexin 43抗体で染色 し、共焦点レーザーコンフォーカル顕微鏡を用いる事によって移植グラフトが心筋へ 誘導されているかを確認したところ、心筋特異的な明瞭な横紋と、 Cardiac troponin-I の明瞭な染色、 Connexin43蛋白の発現が認められた。移植されたグラフトが移植先 で心筋に高率に誘導され全層性に心筋となっているのが確認された。
[0186] 実施例 5 (1)ヒト月経血からの細胞の分離と培養
月経 1日目（生理が始まった 1日目）の月経血を生理用品ないしは直接、外陰部より 、 10mlの無菌的なプラスティック 'ディッシュに移行させた。プラスティック 'ディッシュ に採取された月経血を、 20mlの培養液 [1%牛胎仔血清入りの DMEM (Dulbecco's mo dified MEM)培地、ペニシリン 'ストレプトマイシンの抗生物質を添加]を入れた 50 ml ブラスティック 'チューブに移動させた。取得した月経血が含まれる培養液を 1,000 X g の遠心分離により月経血に含まれる細胞を回収した後、月経血細胞を 10%の FBS (牛 胎仔血清）を含む a -MEM ( a -modified MEM)培地に再浮遊させることにより月経血 に由来する細胞液を得た。
[0187] 単離した、月経血に含まれる細胞を、牛等の血清を 10〜20%添カ卩した、 α -ΜΕΜ培 地に分散し、組織培養用のプラスチック製培養皿に入れ、培養温度 33〜37°Cで、 5 〜10%の二酸ィ匕炭素ガスで満たした孵卵器で培養した。培養開始後 2日目に、赤血 球を除去するために、培地交換を行った。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を 除去して、トリプシン EDTA溶液をカ卩えることで細胞を浮遊させた。
[0188] (2)ヒト月経血間葉系幹細胞からの心筋誘導
上記（1)で得られたヒト月経血間葉系幹細胞の心筋細胞への分ィ匕能について、以 下の通り検討した。すなわち、ヒト月経血間葉系幹細胞について、文献に記載された 方法 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、 GFPを発現するアデノウイルスを感染さ せた。即ち、 5 X 104/cm2の密度でヒト月経血間葉系幹細胞を 10% FCSを含む DMEM 培地で 6cm培養皿に植え込み、 GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上 清を除き同培地で 37°C、 5%CO濃度の孵卵機にて更に培養した。 GFPの発現は、蛍
2
光共焦点顕微鏡にて確認した。
[0189] マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記 載された条件で行った。 5-aza-C処理しな力つたヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞を、 0.05 %トリプシン (GIBCO社製)および 0.25mmol/l EDTA (ethylenediamine- Ν,Ν,Ν',Νし tetra acetic acid)を含む PBS(phosphate- buffered saline)により、培養皿からはがし、予め 5 X 103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は 、 10% FCSを含む DMEM培地を用い、 5%CO濃度の孵卵機にて、 37°Cで培養すること によりヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わな ヽ ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞は、同様に 0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含 む PBS により培養皿からはがした後、 10% FCSを含む DMEM培地を用いて 5%CO濃
2 度の孵卵機にて、 37°Cで培養した。
[0190] (3)ヒト月経血間葉系幹細胞の心筋誘導率
1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト月経血間葉系幹細胞の培養 皿は、 目視でほぼ 50%自己拍動を生じ、 GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮し ているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため、正確に心筋誘 導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、このヒト月経血間 葉系幹細胞について 1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養したサンプル及び、共 培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養液中の血清を除去するため PBS で一回洗浄し、その後 0.05%トリプシン及び、 0.25mmol/lの EDTAを含有する PBSをカロ えて 37°Cの加湿した孵卵器の中で 5分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培養皿より 一塊となって剥離した。剥離した組織を 0.5%コラゲナーゼ（TypeII、 Worthington社製 )と 2,3- butanedione monoxime (以下、 BDMと略記する） 10mmol/lを含有する PBS内に 投入し、 37°Cの恒温槽内でさらに 20分間反応させ、細胞を単離した。
[0191] この細胞について、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質である Troponin Iに 对する 体 (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for humanし atalogue ff i'21 、 HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスを Poly- L- Lysine (P8920、 Si gma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって 1%の HC1を含有した 70%エタ ノールにて洗浄し、同部に純水で 10倍希釈した Poly-L-Lysineを加えて室温で 5分間 放置した。 Poly-L-Lysineをその後除去し、 60°Cで 1時間かけ十分乾燥させた。このし ysineでコートされたスライドグラス上にヒト月経血間葉系幹細胞の浮遊液を 1時間乗 せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は 4%パラフオルムアルデヒドに て固定し、 0.02% Triton-Xを含有した PBS液に 20分間浸して、細胞膜を破壊した。そ の後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体を PBSで 400倍に希釈したものを加 え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、 PBSで 10回洗浄して残留抗 体を除去し、 2次抗体 (Anti Mouse TRITC、 Sigma社製)溶液をカ卩えて、保湿しながら 室温で 30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡 (FV1000、 Olympus社製)を用い て同サンプルを観察すると、ヒト心筋 Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ上に染 色される像が観察された。これを陽性と判断し、 GFP陽性細胞中の Troponin I発現細 胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、約 30%のヒト月経血間葉系幹細 胞に Troponin- 1が発現して!/ヽた。
[0192] その結果、 5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を 行わず、単独で培養したヒト月経血間葉系幹細胞では、 Troponin I陽性細胞の比率 は極めて低力つた (GFP陽性細胞の 1%以下)。一方、マウス胎児由来心筋細胞と共 培養した条件では、心筋誘導に不可欠と考えられて 、た 5-aza-Cの処理をしなかつ たヒト月経血間葉系幹細胞においても約 30%の Troponin I陽性率を示した。従来のヒト 心筋細胞への誘導率 (一般的には 1%以下)と比較して、ヒト月経血間葉系幹細胞は、 心筋細胞との共培養を行うことにより、 5-aza-C処理の有無に関らず、極めて高率に 自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋になることが明らかにな つた o
[0193] (4)ヒト月経血間葉系細胞力 得られた心筋特異的活動電位
実施例 2と同様に、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電 位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅 300 msec近くある心筋特有の 活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極 (ペースメーカー電位)を有して!/ヽた。
[0194] 実施例 6
( 1)ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞力 の心筋誘導
ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋細胞への分ィ匕能について、以下の通り検討した 出産時に子宮カゝら脱落した胎盤、臍帯を採取し、 20mlの培養液 [1%牛胎仔血清入 りの DMEM (Dulbecco's modified MEM)培地、ペニシリン 'ストレプトマイシンの抗生物 質、および heparin 100Uを添加]を入れた 50 mlプラスティック 'チューブに移動させた 。チューブ内で軽く洗浄した後、組織を 10mlの無菌的なブラスティック 'ディッシュ〖こ 移行させた。組織はブラスティック ·ディッシュ内で眼科用鋏で細断し (約 l-5mm3大)、 数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を廃棄し、再び、 DMEMにて組織を洗 浄した。この操作を 3— 4回繰り返した。組織を 10%の FBS (牛胎仔血清）を含む a -ME M ( a -modified MEM)培地に再浮遊させた。
[0195] 胎盤、臍帯組織の含まれる液体を、牛等の血清を 10〜20%添加した a -MEM培地 に分散し、これを組織培養用のプラスチック製培養皿に入れ、培養温度 33〜37°Cで 、 5〜10%の二酸ィ匕炭素ガスで満たした孵卵器で培養した。培養開始後 2日目に、赤 血球を除去するために、培地交換を行った。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地 を除去して、トリプシン EDTA溶液をカ卩えることで細胞を浮遊させた。
こうして得られたヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞について、文献に記載された方法 [J.Ge ne Med., 6, 833-845 (04)]に従い、 GFPを発現するアデノウイルスを感染させた。即ち 、 5 X 104/cm2の密度でヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞を 10% FCSを含む DMEM培地で 6c m培養皿に植え込み、 GFPを発現するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き 同培地で 37°C、 5%CO濃度の孵卵機にて更に培養した。 GFPの発現は、蛍光共焦点
2
顕微鏡にて確認した。
[0196] マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記 載された条件で行った。 5-aza-C処理しな力つたヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞を、 0.05 %トリプシン (GIBCO社製)および 0.25mmol/l EDTA (ethylenediamine- Ν,Ν,Ν',Νし tetra acetic acid)を含む PBS(phosphate- buffered saline)により、培養皿からはがし、予め 5 X 103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は 、 10% FCSを含む DMEM培地を用い、 5%CO濃度の孵卵機にて、 37°Cで培養すること
2
によりヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わな ヽ ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞は、同様に 0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含 む PBS により培養皿からはがした後、 10% FCSを含む DMEM培地を用いて 5%CO濃
2 度の孵卵機にて、 37°Cで培養した。
[0197] (2)ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の心筋誘導率
1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の培 養皿は、目視でほぼ 30%自己拍動を生じ、 GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収 縮しているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため、正確に心 筋誘導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、このヒト胎盤 臍帯間葉系幹細胞について 1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養したサンプル 及び、共培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養液中の血清を除去する ため PBSで一回洗浄し、その後 0.05%トリプシン及び、 0.25mmol/lの EDTAを含有する PBSを加えて 37°Cの加湿した孵卵器の中で 5分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培 養皿より一塊となって剥離した。剥離した組織を 0.5%コラゲナーゼ（TypeII、 Worthing ton社製)と 2, 3- butanedione monoxime (以下、 BDMと略記する） 10mmol/lを含有する P BS内に投入し、 37°Cの恒温槽内でさらに 20分間反応させ、細胞を単離した。
[0198] この細胞について、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質である Troponin Iに 对する 体 (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for humanし atalogue ff i'21 、 HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスを Poly- L- Lysine (P8920、 Si gma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって 1%の HC1を含有した 70%エタ ノールにて洗浄し、同部に純水で 10倍希釈した Poly-L-Lysineを加えて室温で 5分間 放置した。 Poly-L-Lysineをその後除去し、 60°Cで 1時間かけ十分乾燥させた。このし ysineでコートされたスライドグラス上にヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞の浮遊液を 1時間 乗せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は 4%バラフオルムアルデヒド にて固定し、 0.02% Triton-Xを含有した PBS液に 20分間浸して、細胞膜を破壊した。 その後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体を PBSで 400倍に希釈したものを 加え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、 PBSで 10回洗浄して残留 抗体を除去し、 2次抗体 (Anti Mouse TRITC、 Sigma社製)溶液をカ卩えて、保湿しなが ら室温で 30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡 (FV1000、 Olympus社製)を用 いて同サンプルを観察すると、ヒト心筋 Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ上に 染色される像が観察された。これを陽性と判断し、 GFP陽性細胞中の Troponin I発現 細胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、約 20%のヒト胎盤臍帯間葉 系幹細胞に Troponin-Iが発現して!/ヽた。
[0199] その結果、 5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を 行わず、単独で培養したヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞では、 Troponin I陽性細胞の比 率は極めて低力つた (GFP陽性細胞の 1%以下)。一方、マウス胎児由来心筋細胞と 共培養した条件では、心筋誘導に不可欠と考えられて 、た 5-aza-Cの処理をしなか つたヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞においても約 20%の Troponin I陽性率を示した。従来 のヒト心筋細胞への誘導率 (一般的には 1%以下)と比較して、ヒト胎盤臍帯間葉系幹細 胞は、心筋細胞との共培養を行うことにより、 5-aza-C処理の有無に関らず、極めて 高率に自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋になることが明ら カゝになった。
[0200] (2)ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞力 得られた心筋特異的活動電位
実施例 2と同様に、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電 位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅 300 msec近くある心筋特有の 活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極 (ペースメーカー電位)を有して!/ヽるものもあつ た。
[0201] ¾細17
ヒト羊膜間葉系幹細胞力 の心筋誘導
ヒト羊膜間葉系幹細胞の心筋細胞への分ィ匕能について、以下の通り検討した。 上記実施例 6 (1)に記載の方法に準じて得られた、ヒト羊膜間葉系幹細胞について 、文献に記載された方法 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、 GFPを発現するァ デノウィルスを感染させた。即ち、 5 X 104/cm2の密度でヒト羊膜間葉系幹細胞を 10% FCSを含む DMEM培地で 6cm培養皿に植え込み、 GFPを発現するアデノウイルスを 翌日感染させた。上清を除き同培地で 37°C、 5%CO
2濃度の孵卵機にて更に培養した
。 GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。
[0202] マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記 載された条件で行った。 5-aza-C処理しな力つたヒト羊膜間葉系幹細胞を、 0.05%トリ プシン (GIBCO社製)および 0.25mmol/l EDTA(ethylenediamine— Ν,Ν,Ν',Νし tetraacet ic acid)を含む PBS (phosphate-buffered saline)により、培養皿からはがし、予め 5 X 1 03/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は、 10 % FCSを含む DMEM培地を用い、 5%CO濃度の孵卵機にて、 37°Cで培養することに
2
よりヒト羊膜間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト羊膜 間葉系幹細胞は、同様に 0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含む PBS によ り培養皿からはがした後、 10% FCSを含む DMEM培地を用いて 5%CO濃度の孵卵機 にて、 37°Cで培養した。
(2)ヒト羊膜間葉系幹細胞の心筋誘導率
[0203] 1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト羊膜間葉系幹細胞の培養皿 は、目視でほぼ 20%自己拍動を生じ、 GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮して いるものが観察された。
[0204] (3)ヒト羊膜間葉系幹細胞力 得られた心筋特異的活動電位
実施例 2と同様に、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電 位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅 300 msec近くある心筋特有の 活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極 (ペースメーカー電位)を有して!/ヽた。
[0205] 実施例 8
(1)ヒト臍帯血間葉系幹細胞力 の心筋誘導
ヒト臍帯血間葉系幹細胞の心筋細胞への分ィ匕能について、以下の通り検討した。 文献 [Molecular Biology of the Cell, 16, 1491-1499 (05)]に記載のヒト臍帯血間葉 系幹細胞を用いて、文献に記載された方法 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に従い、 GFPを発現するアデノウイルスを感染させた。即ち、 5 X 104/cm2の密度でヒト臍帯血 間葉系幹細胞を 10% FCSを含む DMEM培地で 6cm培養皿に植え込み、 GFPを発現 するアデノウイルスを翌日感染させた。上清を除き同培地で 37°C、 5%CO
2濃度の孵卵 機にて更に培養した。 GFPの発現は、蛍光共焦点顕微鏡にて確認した。
[0206] マウス胎児由来心筋細胞との共培養は、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]に記 載された条件で行った。 5-aza-C処理しな力つたヒト臍帯血間葉系幹細胞を、 0.05%ト リプシン (GIBCO社製)および 0.25mmol/l EDTA(ethylenediamine— Ν,Ν,Ν',Νし tetraac etic acid)を含む PBS (phosphate- buffered saline)により、培養皿からはがし、予め 5 X 103/cm2の密度で植え込んだ、マウス胎児由来心筋細胞の上に重層した。培地は 、 10% FCSを含む DMEM培地を用い、 5%CO濃度の孵卵機にて、 37°Cで培養すること
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によりヒト臍帯血間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導を行った。共培養を行わないヒト 臍帯血間葉系幹細胞は、同様に 0.05%トリプシンおよび 0.25mmol/l EDTAを含む PB S により培養皿からはがした後、 10% FCSを含む DMEM培地を用いて 5%CO濃度の
2 孵卵機にて、 37°Cで培養した。 [0207] (2)ヒト臍帯血間葉系幹細胞の心筋誘導率
1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養を行ったヒト臍帯血間葉系幹細胞の培養 皿は、 目視でほぼ 80%自己拍動を生じ、 GFP蛍光を示す細胞同士が同期して収縮し ているものが観察された。しかし、すべての細胞が同期してしまうため、正確に心筋誘 導を生じている細胞の割合を評価することは困難であった。そこで、このヒト臍帯血間 葉系幹細胞について 1週間マウス胎児由来心筋細胞と共培養したサンプル及び、共 培養せず単独で培養したサンプルを準備した。培養液中の血清を除去するため PBS で一回洗浄し、その後 0.05%トリプシン及び、 0.25mmol/lの EDTAを含有する PBSをカロ えて 37°Cの加湿した孵卵器の中で 5分間酵素反応を行った。細胞はペトリ培養皿より 一塊となって剥離した。剥離した組織を 0.5%コラゲナーゼ（TypeII、 Worthington社製 )と 2,3- butanedione monoxime (以下、 BDMと略記する） 10mmol/lを含有する PBS内に 投入し、 37°Cの恒温槽内でさらに 20分間反応させ、細胞を単離した。
[0208] この細胞にっ 、て、細胞内抗原でヒト心筋特異的なタンパク質である Troponin Iに 对する 体 (Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for humanし atalogue ff i'21 、 HyTest社製)を用いて染色を行った。まずスライドガラスを Poly- L- Lysine (P8920、 Si gma社製)にて表面をコートした。スライドガラスは前もって 1%の HC1を含有した 70%エタ ノールにて洗浄し、同部に純水で 10倍希釈した Poly-L-Lysineを加えて室温で 5分間 放置した。 Poly-L-Lysineをその後除去し、 60°Cで 1時間かけ十分乾燥させた。このし ysineでコートされたスライドグラス上にヒト臍帯血間葉系幹細胞の浮遊液を 1時間乗 せ、スライドガラス上に強固に接着させた。その後細胞は 4%パラフオルムアルデヒドに て固定し、 0.02% Triton-Xを含有した PBS液に 20分間浸して、細胞膜を破壊した。そ の後、一次抗体として抗ヒト心筋 Troponin I抗体を PBSで 400倍に希釈したものを加 え、一日、保湿しながら冷蔵庫内で反応させた。その後、 PBSで 10回洗浄して残留抗 体を除去し、 2次抗体 (Anti Mouse TRITC、 Sigma社製)溶液をカ卩えて、保湿しながら 室温で 30分間反応させた。共焦点レーザー顕微鏡 (FV1000、 Olympus社製)を用い て同サンプルを観察すると、ヒト心筋 Troponin Iが中心の核を避けてドーナツ上に染 色される像が観察された。これを陽性と判断し、 GFP陽性細胞中の Troponin I発現細 胞の割合を心筋誘導率として算出した。その結果は、約 45%のヒト臍帯血間葉系幹 細胞に Troponin- 1が発現して!/、た。
[0209] その結果、 5-aza-C処理の有無に関らず、マウス胎児由来心筋細胞との共培養を 行わず、単独で培養したヒト臍帯血間葉系幹細胞では、 Troponin I陽性細胞の比率 は極めて低力つた (GFP陽性細胞の 1%以下)。一方、マウス胎児由来心筋細胞と共 培養した条件では、心筋誘導に不可欠と考えられて 、た 5-aza-Cの処理をしなかつ たヒト臍帯血間葉系幹細胞においても約 45%の Troponin I陽性率を示した。従来のヒ ト心筋細胞への誘導率 (一般的には 1%以下)と比較して、ヒト胎盤臍帯間葉系幹細胞 は、心筋細胞との共培養を行うことにより、 5-aza-C処理の有無に関らず、極めて高 率に自己拍動し、培養皿上ですでに生理的な機能を有した心筋になることが明らか になった。
[0210] (2)ヒト臍帯血間葉系幹細胞から得られた心筋特異的活動電位
実施例 2と同様に、文献 [J.Gene Med., 6, 833-845 (04)]の方法に基づき、活動電 位を測定した。その結果、記録できた活動電位は、幅 200 msec近くある心筋特有の 活動電位を呈し、拡張期緩徐脱分極 (ペースメーカー電位）はこの細胞力ゝらは記録で きなかった。

Claims

請求の範囲
[I] 子宮内膜組織または月経血から単離された子宮膜由来の、または月経血、臍帯血 若しくは胎児付属臓器力 単離された間葉系幹細胞由来の、心筋細胞に分化する 能力を有する細胞。
[2] 自己または他人の心筋細胞再生のために単離された、請求項 1に記載の細胞。
[3] 不死化された、請求項 1または 2に記載の細胞。
[4] 前記不死化が、テロメラーゼまたは Bmi-1の細胞内発現によりなされた、請求項 3に 記載の細胞。
[5] 前記不死化が、ヒトパピローマウィルスの E6または E7遺伝子の細胞内発現によりな された、請求項 3に記載の細胞。
[6] 心室筋細胞または洞結節細胞に分ィ匕する能力を有する、請求項 1〜5のいずれか 一項に記載の細胞。
[7] 心筋由来の細胞と共培養することにより心筋細胞に分ィ匕する能力を有する、請求 項 1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
[8] 前記心筋由来の細胞力 哺乳類由来の細胞である、請求項 7に記載の細胞。
[9] 前記哺乳類由来の細胞力 マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ゥサギ、ネコ、ィ ヌ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ャギ、サルおよびヒトからなる群力も選択されるものである、請 求項 8に記載の細胞。
[10] CD140a陰性である、請求項 5に記載の細胞。
[II] CD13、 CD29、 CD44、 CD54、 CD55、 CD59、 CD90、および CD166の少なくとも一つ に陽性である、請求項 5に記載の細胞。
[12] CD14、 CD24、 CD31、 CD34、 CD45、 CD50、および Flk-1の少なくとも一つに陰性で ある、請求項 5に記載の細胞。
[13] hEPClOO細胞（FERM AP— 20368)または hEPC214細胞（FERM AP— 2
0369)である、請求項 1〜12のいずれか一項に記載の細胞。
[14] 前記胎児付属臓器が、胎盤、臍帯、または羊膜である、請求項 1に記載の細胞。
[15] 請求項 1〜14のいずれか一項に記載の細胞力も分ィ匕誘導された、心筋細胞また はその前駆細胞。
[16] 心筋細胞の調製法であって、
子宮内膜組織または月経血力 子宮内膜由来の細胞、または月経血、臍帯血若し くは胎児付属臓器力 単離された間葉系幹細胞を得て、
前記細胞を心筋細胞へ分化誘導すること
を少なくとも含んでなる、方法。
[17] 前記分化誘導が、心筋細胞との共培養、 DNAの脱メチル化処理による分化誘導、 胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心筋 細胞への分化に働く因子による分化誘導、および心筋細胞への分化能を有する細 胞または該細胞から分化した心筋細胞の培養上清による分化誘導からなる群から選 択される少なくとも一つのにより行われる、請求項 16に記載の方法。
[18] 前記分化誘導が、心筋細胞との共培養により行われる、請求項 17に記載の方法。
[19] 前記分化誘導が、心筋細胞との共培養と、 DNAの脱メチル化処理による分化誘導 、胎児の心臓発生領域で発現している因子または胎児の心臓発生段階において心 筋細胞への分化に働く因子による分化誘導、および心筋細胞への分化能を有する 細胞または該細胞力 分ィ匕した心筋細胞の培養上清による分ィ匕誘導力 なる群から 選択される少なくとも一つとの組み合わせにより行われる、請求項 18に記載の方法。
[20] 前記 DNAの脱メチル化処理力 デメチラーゼ、 5 ァザシチジンおよびジメチルス ルフォキシド (DMSO)力もなる群力 選択される少なくとも一種によるものである、請 求項 17または 19に記載の方法。
[21] 子宮内膜由来の細胞を、心筋細胞へ分化誘導する前に、不死化することを含んで なる、請求項 16〜20のいずれか一項に記載の方法。
[22] 前記不死化が、テロメラーゼまたは Bmi-1の細胞内発現によりなされる、請求項 21 に記載の方法。
[23] 前記不死化が、ヒトパピローマウィルスの E6または E7遺伝子の細胞内発現によりな される、請求項 21に記載の方法。
[24] 前記共培養される心筋由来の細胞が、哺乳動物由来のものである、請求項 17〜2
3の 、ずれか一項に記載の方法。
[25] 前記哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ヒッジ 、ブタ、ゥシ、ャギ、サルおよびヒトからなる群力も選択されるものである、請求項 24に 記載の方法。
[26] 請求項 1〜14のいずれか一項に記載の細胞を有効成分として含んでなる、医薬。
[27] 心臓再生薬として用いられる、請求項 26に記載の医薬。
[28] 心臓疾患治療薬として用いられる、請求項 26に記載の医薬。
[29] 心筋梗塞、虚血性心疾患、うつ血性心不全、不整脈、肥大型心筋症、拡張型心筋 症、心筋炎、または弁膜症の治療のための、請求項 26に記載の医薬。
[30] 心臓の先天性遺伝子疾患についての変異遺伝子に対する野生型遺伝子を導入し た、請求項 1〜15のいずれか一項に記載の細胞を有効成分として含んでなる、先天 性心臓疾患治療薬。
[31] 心臓の先天性遺伝子疾患の患者より単離された心筋細胞への分化能を有する細 胞に、正常な遺伝子を導入したのち、この細胞を前記患者に移植するために培養す ることを含んでなる、心筋細胞への分ィ匕能を有する細胞の調製方法。
[32] 請求項 1〜15のいずれか一項に記載の細胞に発現する抗原を特異的に認識する 、抗体。
[33] 請求項 32に記載の抗体を用いて、請求項 1〜15のいずれか一項に記載の細胞を 単離する方法。
[34] 請求項 1〜15のいずれか 1項に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項 1〜
15のいずれか一項に記載の細胞に特異的な表面抗原を取得する方法。
[35] 請求項 1〜15のいずれか一項に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項 1〜
15のいずれか一項に記載の細胞を増殖する因子をスクリーニングする方法。
[36] 請求項 1〜15のいずれか一項に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項 1〜
15のいずれか一項に記載の細胞の心筋細胞への分ィヒを誘導する因子をスクリー- ングする方法。
[37] 請求項 1〜13のいずれか一項に記載の細胞を含んだ、培養上清。
[38] 請求項 37記載の培養上清を用いることを特徴とする、請求項 1〜13のいずれか一 項に記載の細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
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