CN111876371A - 心脏细胞培养材料 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供专门作用于心脏细胞的心脏细胞培养材料。另外，本发明的另一目的在于提供通过使用该心脏细胞培养材料进行培养而得到的人工器官材料及其制造方法。由此，本发明提供心脏细胞培养物，其中，通过使用含有VCAM‑1的心脏细胞培养材料而良好地构建功能性心脏组织。

Description

心脏细胞培养材料
本申请是申请日为2015年01月05日、发明名称为“心脏细胞培养材料”的申请号为201580037730.1的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及心脏细胞培养材料，以及在具有壁面和/或底面的培养基材的壁面和/或底面上使用该心脏细胞培养材料进行涂覆的细胞培养基材。另外，本发明涉及通过使用该心脏细胞培养材料来培养心脏细胞而得到的人工器官材料及其制造方法。
背景技术
成纤维细胞几乎存在于所有脊椎动物中，并且当组织被创伤和缺血造成伤害的时候，受伤害的区域通过成纤维细胞增殖和丰富的细胞外基质沉积而被纤维组织置换。同样，在诸如心肌梗塞和心肌疾病的各种心脏疾病中，很多心肌细胞丧失，纤维组织也置换该区域，引起心脏重塑以及伴随过剩的血液动力学压力和神经体液性刺激的心力衰竭。尽管公知的是诸如血管紧张素II和内皮素-1的神经体液因子有助于通过升高血压、心肌细胞凋亡和局部炎症促进心脏重塑，已报道心脏成纤维细胞分泌这些因子。众所周知，心脏成纤维细胞在心脏发育中担负重要作用。在心脏成纤维细胞中相互连接的细胞过程形成胶原、成纤维细胞和肌细胞的网络。虽然心肌细胞增殖是厚的心室壁的形成的必不可少的过程，但是也已报道胚性心脏成纤维细胞通过β1整联蛋白信号转导促进心肌的有丝分裂活性。产生心脏成纤维细胞占优势的效果的物质迄今无人知晓。在此，由于心脏成纤维细胞通过各种各样的方法作用于心脏发育和发病中，理解心肌细胞和心脏成纤维细胞之间的相互作用和潜在机制的重要性被广泛认可。但是，心脏成纤维细胞的尚不明确的特性成为其瓶颈，需要明确心脏成纤维细胞的功能和分子生物学性质。
心脏组织工程不仅对于再生医疗，而且对于组织模型也是有前景的方法。在心脏组织工程方法中，开发了使用温度应答性培养皿的基于细胞片层的心脏组织。此前，据报道在各种类型的血管床上，包含新生大鼠来源的心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的心脏细胞片层的分层，使得可以对血管化的能存活的心脏组织进行三维构建(非专利文献1～3)。因为基于细胞片层的组织工程不需要任何支架，所以需要一些量的细胞外基质以构建细胞片层。与左心室主要由成纤维细胞和心肌细胞构成的证据相一致，在使用来自于纯化的胚胎干细胞的心肌细胞时，一定量的成纤维细胞对于构建心脏细胞片层来说是必不可少的(非专利文献4)。由于最近的报告表明心肌细胞和非肌细胞之间的细胞-细胞相互作用对于心脏的生理学和病理而言是重要的(非专利文献5)，心脏成纤维细胞功能也可能对工程化的心脏组织的功能产生影响，并且为了在体外构建用于组织模型的心脏组织，选择合适的成纤维细胞可能是前提。但是，与其它成纤维细胞以及相关的分子机理相比，尚不明确心脏成纤维细胞是否对心肌细胞具有特别的功能。
如上所述，因为心脏成纤维细胞在心脏发育和心脏病的发病或治愈中具有重要作用，所以需要将专门作用于诸如心肌细胞的心脏细胞的心脏成纤维细胞与其它成纤维细胞分离开并对心脏成纤维细胞进行取样。以前认为成纤维细胞是均一的细胞种类，最近的研究表明成纤维细胞具有非常多样的表型，并且表明根据所存在的器官、组织或细胞的负荷状态，该表型不同。
但是，成纤维细胞的功能不太清楚，并且成纤维细胞仅是在形态学上分类的细胞。因此，在成纤维细胞中，难以仅选择具有特定功能的一种类型的成纤维细胞。
另一方面，对于VCAM-1和α4整联蛋白，Kwee等报道了VCAM-1在胎龄11.5天在心外膜、心肌细胞和心室间隔等处表达。还报道了尽管α4整联蛋白的表达与VCAM-1的表达在类似的区域发现，但是α4整联蛋白在心室间隔中不表达(非专利文献6)。此外，报道了在VCAM-1缺失的胚胎中，在胎龄11.5天，存在由胎盘形成受阻引起的胚胎死亡以及归因于心室间隔和心室肌的致密层的减少的畸形。Yang等还报道了胎龄11.5天的α4整联蛋白无效(null)的胚胎中的心外膜缺陷(非专利文献7)。因此，认为VCAM-1和α4整联蛋白主要有助于在胚胎期的心脏细胞和心外膜的形成。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Shimizu T,et al.,Fabrication of pulsatile cardiac tissuegrafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique andtemperature-responsive cell culture surfaces.Circulation research.2002；90:e40
非专利文献2：Sekiya S，et al.,Bioengineered cardiac cell sheet graftshave intrinsic angiogenic potential.Biochemical and biophysical researchcommunications.2006；341:573-582
非专利文献3：Shimizu T，et al.,Cell sheet engineering for myocardialtissue reconstruction.Biomaterials.2003；24:2309-2316
非专利文献4：Matsuura K，et al.,Hagiwara N，Zandstra PW，Okano T.Creationof mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets.Biomaterials 2011；32:7355-7362
非专利文献5：Deschamps AM，et al.,Disruptions and detours in themyocardial matrix highway and heart failure.Current heart failurereports.2005；2:10-17
非专利文献6：Kwee L，et al.,Defective development of the embryonic andextraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule(vcam-1)deficient mice.Development(Cambridge,England).1995；121:489-503
非专利文献7：Yang JT，et al.,Cell adhesion events mediated byalpha4integrins are essential in placental and cardiacdevelopment.Development(Cambridge,England).1995；121:549-560
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供特异性地作用于心脏细胞的心脏细胞培养材料，以及提供在具有壁面和/或底面的培养基材的壁面和/或底面上使用该心脏细胞培养材料进行涂覆的细胞培养基材。另外，本发明的另一目的是提供通过使用该心脏细胞培养材料来培养心脏细胞而得到的人工器官材料及其制造方法。
技术手段
已弄清楚的是，在心脏细胞培养中通过使用含有VCAM-1蛋白质的心脏细胞培养材料而良好地构建了功能性心脏组织。因此，将该心脏细胞培养材料涂覆于具有壁面和/或底面的培养基材的壁面和/或底面上，并且可以作为细胞培养基材使用。可以将通过使用心脏细胞培养材料培养的心脏细胞用作人工器官材料。
也就是说，本发明包括下述内容：
[1]含有VCAM-1蛋白质的心脏细胞培养材料。
[2]如[1]所述的心脏细胞培养材料，其中，所述VCAM-1蛋白质是从动物材料分离并纯化的VCAM-1、VCAM-1重组蛋白质或表达VCAM-1蛋白质的细胞。
[3]如[1]或[2]所述的心脏细胞培养材料，所述心脏细胞培养材料用于培养以构建心脏组织。
[4]如[2]或[3]所述的心脏细胞培养材料，其中，所述表达VCAM-1蛋白质的细胞是表达VCAM-1蛋白质的成纤维细胞。
[5]如[4]所述的心脏细胞培养材料，其中，所述成纤维细胞是来自于心脏的成纤维细胞。
[6]如[4]或[5]所述的心脏细胞培养材料，其中，所述成纤维细胞是心外膜来源的成纤维细胞。
[7]细胞培养基材，其中，将具有壁面和/或底面的培养基材的壁面和/或底面用[1]-[6]所述的心脏细胞培养材料进行涂覆。
[8]人工器官材料，所述人工器官材料通过将[1]-[6]所述的心脏细胞培养材料与心脏细胞共培养而得到。
[9]制造人工器官材料的方法，所述方法包括将[1]-[6]所述的心脏细胞培养材料与心脏细胞共培养的步骤。
[10]一种试剂，所述试剂用于筛选含有抗VCAM-1抗体的心脏细胞培养材料。
[11]表达VCAM-1蛋白质的来自于心脏的成纤维细胞。
[12]如[9]所述的制造人工器官材料的方法，其中，所述方法进一步包括从培养基材分离和收集经培养的细胞的步骤。
[13]如[12]所述的制造人工器官材料的方法，其中，前述培养基材是温度敏感性培养皿，前述剥离通过温度变化进行。
发明的有益效果
通过使用本发明的心脏细胞培养材料培养心脏细胞，可以构建能够用于再生医疗和组织模型中的功能性心脏细胞。可将该心脏细胞培养材料在具有壁面和/或底面的培养基材的壁面和/或底面上涂覆，可以将其作为细胞培养基材使用。进一步地，可以将通过培养得到的心脏细胞或心脏组织作为人工器官材料使用。
附图说明
图1是NCF、ACF和ADF的显微镜观察(照片)。图1A是各成纤维细胞的明视野显微镜图像。图1B-图1E是DDR2、波形蛋白及αSMA表达的代表性图片(大部分成纤维细胞不表达调宁蛋白、细胞角蛋白11或NG2)。
图2是与成纤维细胞共培养的mESC来源的心脏细胞片层的特性的差异(照片)。图2A是在分离前，在NCF和ACF共培养片层上观察到自律搏动(beating)的许多细胞块。温度下降后，在mESC来源的心肌细胞和成纤维细胞(﹣)中未观察到细胞片层的形成。图2B是在各细胞片层上的细胞外动作电位。在各通道中观察到ACF或NCF共培养片层中的动作电位。但是，在ADF共培养膜片上的动作电位以一次性出现(环绕线表示细胞片层的形状)。图2C是通过共聚焦显微镜观察到的各细胞培养皿中的免疫荧光染色。YFP发射绿色(黄色)荧光(YFP：激发波长514nm，荧光波长527nm)，而波形蛋白发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst 33258(蓝色)(hoechst 33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。共聚焦显微镜观察表明，同与成纤维细胞(﹣)或ADF共培养的细胞相比，与NCF或ACF共培养的细胞具有最大数量的YFP(+)细胞。图2D是通过共聚焦显微镜观察到的各细胞培养皿中的免疫荧光染色。cTnT发射绿色荧光(FITC：激发波长488nm，荧光波长530nm)，波形蛋白发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst 33258(蓝色)(hoechst33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。共聚焦显微镜观察表明，同与成纤维细胞(﹣)或ADF共培养的细胞相比，与NCF或ACF共培养的细胞具有最大数量的cTnT(+)细胞。图2E为显示出各细胞培养皿中的YFP(+)细胞或cTnT(+)细胞的数量增加的柱形图。将成纤维细胞(﹣)中的YFP(+)细胞或cTnT(+)细胞的数量设定为1。同ADF共培养或成纤维细胞(﹣)的培养皿中的相比，在NCF或ACF培养皿中观察到更多数量的YFP(+)和cTnT(+)细胞。此外，在NCF和ACF之间的心肌细胞数量方面没有显著性关系。(N＝3，**P<0.01)
图3是在各细胞培养皿中的细胞培养开始第1天和第5天的心肌细胞的数量(照片)。图3A是使用共聚焦显微镜的在各细胞培养皿中的细胞培养开始第1天的免疫荧光染色。YFP发射绿色(黄色)荧光(YFP：激发波长514nm，荧光波长527nm)，而cTnT发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst 33258(蓝色)(hoechst33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。图3B是通过共聚焦显微镜观察到的在各细胞培养皿中的细胞培养开始第5天的免疫荧光染色。YFP发射绿色(黄色)荧光(YFP：激发波长514nm，荧光波长527nm)，而cTnT发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst33258(蓝色)(hoechst 33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。图3C是在各细胞培养皿中的心肌细胞的数量。柱形图显示出YFP(+)细胞和cTnT(+)细胞的数量的增加(将成纤维细胞(-)的培养开始第1天的值设为1)。在ACF和NCF培养皿中，与培养开始第1天的心肌细胞相比，在培养开始第5天观察到更多数量的心肌细胞。但是，在其它的培养皿中，第1天和第5天之间的心肌细胞的数量没有差异。在ACF和NCF之间，未观察到显著差异。(N＝3，**P<0.01)
图4是通过免疫荧光染色进行的心肌细胞增殖的评价(照片)。图4A是通过使用共聚焦显微镜进行的在各个共培养皿中的Ki67阳性心肌细胞的免疫荧光染色观察。cTnT发射绿色荧光(FITC：激发波长488nm，荧光波长530nm)，而Ki67发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst 33258(蓝色)(hoechst 33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。图4B是在各培养皿中的Ki67(+)或磷酸化组蛋白3(phosphor S10；Phh3)(+)心肌细胞的百分比(N＝4，**P<0.01)。图4C是通过使用共聚焦显微镜进行的在各培养皿中的磷酸化组蛋白3(phosphor S10；Phh3)阳性心肌细胞的免疫荧光染色观察。cTnT发射绿色荧光(FITC：激发波长488nm，荧光波长530nm)，而磷酸化组蛋白3(phosphor S10；Phh3)发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst 33258(蓝色)(hoechst 33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。图4D是在各培养皿中的磷酸化组蛋白3(phosphor S10；Phh3)(+)心肌细胞的百分比(N＝4，**P<0.01)。图4E、图4F是在各培养皿中的心肌细胞的BrdU FACS测定(N＝3，**P<0.01)。图4G是通过使用共聚焦显微镜进行的在插入式培养皿中的在培养开始第1天和第5天的YFP(+)和cTnT(+)的免疫荧光染色观察。YFP发射绿色(黄色)荧光(YFP：激发波长514nm，荧光波长527nm)，而cTnT发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst33258(蓝色)(hoechst 33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。图4H为显示出在第1天和第5天的YFP(+)细胞和cTnT(+)细胞的数量的增加的柱形图。将第1天的YFP(+)细胞和cTnT(+)细胞的数量设为1。在第5天观察到心肌细胞的增殖(N＝4，**P<0.01)。
图5A是ADF和NCF的全面的基因簇分析(照片)。该基因热图显示出ADF和NCF之间的显著的差异。该图被分为两个组。第1组仅由ADF构成，而第2组仅由NCF构成。图5B是通过实时PCR测定的VCAM-1基因的表达水平。在NCF中的VCAM-1的表达水平显著地高。在NCF中的VCAM-1基因的数量比起在ADF中的更高16倍(N＝3，*P<0.05)。图5C-图5D是在蛋白质印迹分析中的NCF和ADF中的VCAM-1蛋白质的表达水平。将如下的瞬时过表达细胞裂解物作为阳性对照使用：Sol8(SantaCruz，CA，USA)。将各细胞的β-肌动蛋白的标记峰设为1(N＝3，**P<0.01)。图5E是mESC来源的心肌细胞上的VCAM-1受体(α4β1)的免疫荧光染色。图5F是mESC来源的心肌细胞上的VCAM-1受体的蛋白质印迹分析。将如下的瞬时过表达细胞裂解物作为阳性对照使用：Jurkat全细胞裂解物。
图6是通过免疫荧光染色分析进行的心脏生长因子的鉴定(照片)。图6A-图6B是第5天中和抗体针对的心肌细胞的效果的免疫荧光染色观察。YFP发射绿色(黄色)荧光(YFP：激发波长514nm，荧光波长527nm)，而cTnT发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst 33258(蓝色)(hoechst 33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。当通过使用VCAM-1中和抗体将NCF与心肌细胞进行共培养时，在第5天心肌细胞的数量减少。同时，当使用同种型对照时，对第5天的心肌细胞的数量无影响(N＝3，**P<0.01)。图6C-图6D是第5天的VCAM-1可溶性蛋白质对心肌细胞的效果的免疫荧光染色观察。YFP发射绿色(黄色)荧光(YFP：激发波长514nm，荧光波长527nm)，而cTnT发射红色荧光(cy3：激发波长512nm，荧光波长552nm)，且核以hoechst 33258(蓝色)(hoechst 33258：激发波长352nm，荧光波长461nm)染色。通过与VCAM-1可溶性蛋白质(10μg/mL)一起培养，获得心肌细胞生长效果。在与NCF共培养和与NCF(-)中的VCAM-1可溶性蛋白质共培养的条件之间，心肌细胞的数量无显著差别(N＝3，*P<0.05，**P<0.01)。
图7是来自于新生小鼠的心脏成纤维细胞的FACS分析结果。图7A-图7C显示出使用抗VCAM-1抗体染色的结果。图7D显示出将皮肤成纤维细胞仅使用二抗染色的阴性对照的结果。
具体实施方式
本发明涉及含有VCAM-1的心脏细胞培养材料。在本发明中，“心脏细胞培养材料”可以是在培养心脏细胞时使用的任何材料。例如，该材料包括但不限于：待添加至培养基的试剂；用于涂覆诸如培养皿和烧瓶等的培养容器的培养基材的底面或壁面的材料等。
血管细胞粘附分子(VCAM-1)是在血管内皮细胞等中表达的作为细胞粘附分子的已知的蛋白质。例如，在人类的情况下，VCAM-1包括但不限于：通过以美国国家生物技术信息中心(NCBI)的登录号NM_001078等描述的基因编码的蛋白质，并且还包括通过选择性剪接获得的同种型。在本发明中的VCAM-1蛋白质包括：在细胞表面上表达的VCAM-1；可溶性VCAM-1；VCAM-1蛋白质的氨基酸缺失、置换或添加1个或多个(例如，1-20个、1-15个、1-10个或1-5个)氨基酸，且具有与VCAM-1蛋白质相同活性的各种突变体。可以使用动物材料中的VCAM-1蛋白质(通过公知的方法进行分离和纯化)、也可以使用重组蛋白质作为本发明中的VCAM-1。还可以使用可商购的重组蛋白质。
此外，可以将表达VCAM-1的细胞用作本发明的VCAM-1。为了筛选表达VCAM-1的细胞，可以使用公众已知的细胞分选法。例如，细胞分选法包括但不限于：使用抗VCAM-1抗体的流式细胞术、磁珠法、亲和柱法和选淘法。
抗VCAM-1抗体并不受到特别限制。可以使用可商购的抗VCAM-1抗体，也可以使用通过采用VCAM-1作为抗原通过已知方法制作的产品。另外，只要可以筛选表达VCAM-1的细胞，可以使用单克隆抗体或多克隆抗体；然而，从特异性的观点来看，优选使用单克隆抗体。
也就是说，本发明的筛选心脏细胞培养材料的方法包括下述步骤：制备细胞的步骤；通过使用抗VCAM-1抗体对该细胞进行细胞分选的步骤；作为细胞分选的结果，仅收集被判定为表达VCAM-1的细胞的步骤。
作为表达VCAM-1的细胞，只要表达VCAM-1即可，其种类不受到限制。然而，优选使用成纤维细胞。成纤维细胞包括将最终成为成纤维细胞或成肌纤维细胞的所有细胞。也就是说，本发明的成纤维细胞的范围包括：在分化或成熟阶段的过程中的细胞；以及在当时无法被鉴别为成纤维细胞或成肌纤维细胞，只要将最终成为成纤维细胞或成肌纤维细胞的细胞。
成纤维细胞的来源不受限制。可以将诸如ES细胞、iPS细胞和muse细胞的多能干细胞，以及诸如间充质干细胞的成体干细胞进行分化并使用；且可以使用从动物采集的原代细胞；以及可以使用已建立细胞系的细胞。然而，优选使用心脏来源的成纤维细胞，其中，特别优选使用心外膜来源的成纤维细胞。在使用已建立细胞系的细胞的情况下，通过选择已知表达VCAM-1的细胞，可以省略细胞分选的处理。根据待共培养的细胞的来源的动物，可以适当选择成纤维细胞的来源的动物。动物例如包括：人；诸如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、猴和兔的实验动物；诸如狗、猫和鸟的宠物；以及诸如牛、马、绵羊和山羊的家畜。在从动物采集成纤维细胞的情况下，可以使用胎儿、新生儿、幼儿、成体的任何时期的成纤维细胞，但并不加以限制。
为了维持或保存VCAM-1蛋白质或表达VCAM-1蛋白质的细胞，本发明的心脏细胞培养材料可以是包含生理盐水、细胞培养液或细胞保存液等的组合物等。只要内容物不会损害VCAM-1的功能，该组合物中包含的内容物不受限制。此外，本发明的心脏细胞培养材料的状态可以是液体、凝胶状、冷冻或冷冻干燥的，并且其状态不受限制。
进一步地，心脏细胞培养材料可以含有成纤维细胞，而无关于VCAM-1蛋白质的存在或不存在。成纤维细胞包括将最终成为成纤维细胞或成肌纤维细胞的所有细胞。也就是说，即使细胞处于分化或成熟阶段的过程中且在此时无法被识别为成纤维细胞或成肌纤维细胞，如果细胞是最终将成为成纤维细胞或成肌纤维细胞的细胞，则可以使用该细胞，而不受限制。其中，优选表达CD31(血管内皮细胞标志物)的成纤维细胞。在将表达VCAM-1蛋白质的成纤维细胞作为VCAM-1蛋白质使用时，表达VCAM-1蛋白质的细胞(细胞数量)：表达CD31的细胞(细胞数量)的比例优选为5∶5-9∶1、更优选5∶5-8∶2，并且甚至更优选6∶4-8∶2。
本发明的一个方面涉及通过将心脏细胞与上述心脏细胞培养材料一起培养而得到的人工器官材料或其制造方法。也就是说，本发明的心脏细胞培养材料可以通过与心脏细胞一起培养来构建可在再生医疗和组织模型中使用的功能性心脏组织。可将该心脏组织用作人工器官材料。人工器官材料可以具有任何形式。例如，人工器官材料可以被附着至诸如处于片状形式的心脏的器官的损伤部位。在通过使用支架使其聚集或层叠后，人工器官材料也可以被移植入具有某种程度的厚度的器官的缺陷部位。该支架的材料包括但不限于：羟基磷灰石、缺端肽胶原和凝胶。进一步地，由于人工器官材料处于培养细胞的状态而无需将其制成特定形式，可将人工器官材料用于细胞移植、学术研究等。进一步地，可以通过使用3D打印机从该人工器官材料生产人工器官。所生产的人工器官不仅可以用于移植，而且还可以被广泛应用于安全性药理测试和临床前研究等。
在本发明中，“构建心脏组织”是指构建具有诸如促进心脏细胞的分裂以及提供在整个组织中的均一搏动的至少一种心脏功能的组织，该组织可以用于再生医疗和组织模型。心脏功能包括诸如自律脉动能力、收缩和松弛能力、脉冲传导能力和激素分泌能力等的所有已知的心脏功能。该心脏功能并不限于仅心脏具有的功能。例如，肌细胞也具有收缩和松弛能力。然而，即使其它细胞具有同等功能，并不会影响本发明的心脏功能的定义。此外，关于心脏功能，只要适合心脏组织的使用目的即可，而并不对功能的高低加以限制。例如，出于制做人工心脏的目的，需要具有达到可以从全身泵出血液的程度的收缩和松弛能力；然而，出于体外的收缩和松弛能力的学术研究等目的，只要收缩和松弛能力可通过一些手段检测即可。
在本发明的人工器官材料或其制造方法中，待使用的心脏细胞包括诸如心肌细胞、平滑肌细胞、起搏细胞和血管内皮细胞等的所有构成心脏的细胞。该心脏细胞的来源可以根据人工器官材料的使用目的而适当设定。例如，为了向人移植为目的，可以使用人类来源的心脏细胞；而为了在小鼠实验中的构建组织模型为目的，可以使用小鼠来源的心脏细胞。进一步地，可以使用来自胎儿、新生儿、幼儿和成体的任何时期的心脏细胞，而不对时期加以限制。本发明的心脏细胞优选从如下制造：诸如ES细胞、iPS细胞和muse细胞的多能性干细胞；以及诸如间充质干细胞的成体干细胞。
本发明的“培养”可以通过公众已知的细胞培养方法进行，并且只要心脏细胞培养材料和心脏细胞存在于培养容器中或浸入同一培养基中，也就不对培养条件进行限制。在心脏细胞培养材料是表达VCAM-1蛋白质的细胞的情况下，表达VCAM-1的细胞(细胞数量)相对于心脏细胞的混合百分比优选为3-20％、更优选6-18％、并且最优选9-16％。
在本发明中，用于培养的培养液可以根据待培养细胞的种类适当设定，例如，可以使用DMEM、α-MEM、RPMI-1640等。可以向培养液中添加诸如FCS和FBS的营养物质和抗生素。
对于培养时期，可以适当设定获得期望的细胞数量和/或功能的天数。例如，该时期包括：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月。培养温度可以根据待培养细胞的种类适当设定。例如，温度可以是10-60℃、优选20-50℃、并且更优选30-40℃。
本发明的制造方法可以进一步包括收集经培养的细胞的步骤。“经培养的细胞”可以包括成纤维细胞和心脏细胞两种细胞，并且可以仅包括心脏细胞。关于收集细胞的步骤，可以通过使用诸如胰蛋白酶的蛋白酶来分离并收集细胞。然而，优选通过使用可以在保留细胞外基质等的同时分离细胞的温度应答性培养皿，通过温度变化将细胞分离并收集。
实施例
以下，参照下述实施例进一步对本发明进行更详细地描述；但是，应该澄清的是，这些实施例不以任何方式对本发明进行限制。
实施例1
材料和方法
动物和试剂
野生型C57BL/6小鼠购自日本SLC(日本，静冈)。B6 Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J小鼠购自Jackson实验室(Bar harbor，ME)。所有的实验规程均通过东京女子医科大学动物实验委员会批准。将下述抗体用于免疫细胞化学、蛋白质印迹和流式细胞术分析(FACS)：兔多克隆抗盘状结构域受体蛋白酪氨酸激酶2(DDR2)(GeneTex，Irvine，CA)；豚鼠单克隆抗波形蛋白(Progen，Heidelberg，德国)；小鼠单克隆抗NG2(Millipore，Temecula，CA)；兔多克隆抗α平滑肌肌动蛋白(Abcam，Cambridge，UK)；小鼠单克隆抗心脏肌钙蛋白T(cTnT)(Thermo Scientific，Rockford，IL)；小鼠单克隆抗细胞角蛋白11(EXBIO，Nad Safinou，CZ)；兔多克隆抗Ki67(Abcam，Cambridge，UK)；兔多克隆抗组织蛋白H3(phosphor S10)(Abcam，Cambridge，UK)；大鼠单克隆抗整联蛋白α4/β1(Abcam，Cambridge，UK)；重组小鼠VCAM-1/CD106Fc嵌合体(R&D systems，Minneapolis，MN)。除非另有指定，所有的试剂均购自Sigma-Aldrich。二抗购自Jackson免疫研究实验室(West Grove，PA)。
小鼠ES细胞培养
在α-肌球蛋白重链启动子的调控下的表达新霉素磷酸转移酶基因的mESC的维持、以及心肌细胞分化和纯化在先前的报道中已描述(Matsuura K等，Biomaterials.2011；32:7355-7362)。简言之，为了心肌细胞诱导和心肌细胞纯化，将胰蛋白酶化的ES细胞以5×104细胞/mL接种于旋转瓶中(Integra Biosciences，Zizers，瑞士)(总计125mL/瓶)，并使用添加有10％FBS的DMEM培养10天，之后将这些经分化的细胞使用新霉素再处理8天。
成纤维细胞分离
从野生型C57BL/6小鼠(新生小鼠，1日龄；成体小鼠，10-12周龄)得到成纤维细胞。
新生心脏成纤维细胞(NCF)按照此前报道中的描述(Matsuura K等，Biomaterials.2011；32:7355-7362)从新生小鼠(1日龄)的心脏得到。将3次继代的NCF用于实验。
成体心脏成纤维细胞(ACF)使用下述的外植体培养方法从成体小鼠(10-12周龄)的心脏得到。首先，将心脏用PBS(-)清洗并切成约5mm2的片。将这些切片用灭菌的盖玻片覆盖，并使用添加有10％FBS的DMEM在10cm培养皿中培养。培养开始2周后，将细胞使用0.25％胰蛋白酶/EDTA进行解离，并在另外的10cm培养皿中进行继代培养。将3次继代的ACF用于实验。
成体的皮肤成纤维细胞(ADF)从成体小鼠(10-12周龄)的背部皮肤组织得到。首先，将采集的皮肤组织用中性蛋白酶I[1000U/mL](エーデイア株式会社)在4℃下处理过夜。然后，将组织切成约1mm2的片。将这些切片用灭菌的盖玻片覆盖，并使用添加有10％FBS的DMEM在10cm培养皿中进行培养。培养开始2周后，将细胞使用0.25％胰蛋白酶/EDTA进行解离，并在另外的10cm培养皿中进行继代培养。将3次继代的ADF用于实验。
在一些实验中，NCF和ADF使用与上述相同的方法从B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J小鼠(新生小鼠，1日龄；成体小鼠，10周龄)得到。
细胞片层制备
在接种细胞前，将温度应答性培养皿(UpCell；セルシード)的表面使用FBS包被2小时。mESC来源的心肌细胞与各类型的成纤维细胞以8:2的比例用添加有10％FBS的DMEM共培养(3.2×105细胞/cm2)。培养5天后，将细胞在20℃下孵育，以分离细胞片层。样本的明视野图像通过Nikon ECLIPSE Ti(尼康，Tokyo，日本)得到。
电生理学分析
如同此前报道中所描述的(Matsuura K等，Biomaterials.2011；32:7355-7362)，通过多极阵列(MED)系统(Alpha MED Sciences，Osaka，日本)测定细胞外电位得到心脏细胞片层的电活动。
免疫细胞化学
将细胞用4％多聚甲醛固定，并进行如此前报道中(Matsuura K等，Biomaterials2011；32:7355-7362)描述的免疫染色。染色样本的图像通过ImageXpress Ultra共聚焦高含量筛选系统(Molecular Devices，CA，美国)得到。图像分析数据通过MetaExpresssoftware(Molecular Devices，CA，美国)得到。
FACS分析
在细胞培养基中用终浓度为10μM的BrdU对孵育细胞(5×105个细胞)进行染色。按照BrdU Flow试剂盒的说明书(BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)中的描述进行用于FACS分析的BrdU染色。简单而言，将细胞用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液进行固定和透性化处理，然后将掺入的BrdU暴露于DNase。BrdU染色用APC抗BrdU抗体(BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)进行。样本使用Gallios(Beckman Coulter，Brea，CA)分析。将下述试剂用于分析：BD Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)；BDPerm/Wash缓冲液(10×)(BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)；BD Cytoperm Plus缓冲液(Buffer)(10×)(BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)；BrdU(10mg/mL)(BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)；DNase(BD Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)。
延时摄影
将样本在5％CO2中于37℃下用BZ-9000荧光显微镜(Keyence，Osaka，日本)观察5天。
RNA提取和全面的基因分析
根据制造商的说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取总RNA。根据制造商的说明书使用Qiagen RNeasy Mini Kit(QIAGEN，Valencia，CA)进一步纯化总RNA。
按照所推荐的方法使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo FisherScientific Inc.，Waltham，MA)和安捷伦生物分析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)测定RNA的数量和质量。
为了cRNA扩增和标记，将总RNA扩增并根据制造商的说明书使用Agilent LowInput Quick Amp Labeling Kit，one-color(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)用花青素3(Cy3)进行标记。简单而言，使用多聚dT-T7启动子引物，将100ng总RNA逆转录成为双链cDNA。将引物、模板RNA以及已知浓度和品质的质量控制转录本首先在65℃变性10分钟，并在40℃下使用5×第一链缓冲液、0.1M DTT、10mM dNTP混合物和AffinityScript RNaseBlock混合物孵育2小时。在70℃下使AffinityScript酶失活15分钟。
此后，将cDNA产物用作在体外转录的模板，以产生荧光cRNA。在T7 RNA聚合酶和Cy3标记的CTP的存在下，将cDNA产物与transcription master mix混合并在40℃下孵育2小时。使用QIAGEN的RNeasy mini旋转离心柱对经标记的cRNA进行纯化，并以30μl无核酸酶的水进行洗脱。扩增和标记后，使用Nanodrop ND-1000分光光度计和安捷伦生物分析仪测定cRNA的量和花青素的掺入。为了样本的杂交，将1.65μg Cy3标记的cRNA进行片段化，并在65℃下杂交至安捷伦小鼠GE 4×44Kv2微阵列(Design ID：026655)17小时。清洗后，使用安捷伦DNA微阵列扫描仪对微阵列进行扫描。对于微阵列的数据分析，各经扫描的特征的强度值使用安捷伦feature extraction软件version 10.7.3.1(进行了背景扣除)进行定量。
仅使用标示为没有错误(存在标示)的特征，并排除如下特征：非阳性、不显著、不均一、不高于背景、饱和的以及离群值(边缘和不存在标示)。使用安捷伦GeneSpring GXversion 11.0.2.(每个芯片：归一化至75％位移进行，每个基因：归一化至所有样本的中位值)进行归一化。无对照探针，在安捷伦小鼠GE 4×44Kv2微阵列(Design ID：026655)上存在共计39,429个探针。
变化的转录本使用比较法进行定量。在这一研究中，我们在信号强度方面施加≥2倍的变化以识别基因表达的显著差异。
定量实时PCR分析
使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied biosystems)从总RNA生成互补的DNA。作为PCR相关引物，使用VCAM-1Gene Expression Assays(life Technology)。各RT-PCR使用iCycler(BIO-RAD)，包括：在25℃下10分钟、在37℃下120分钟和在85℃下5秒。使用来自于各样本的cDNA模板(1μg)。TaqMan探针实时PCR研究使用TaqMan Gene Expression Assays(Applied biosystems)进行。所有实验以三重复进行。样本用7300实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行40次如下循环：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，此后在95℃下15秒钟和在60℃下1分钟循环40次。使用Gap DH基因作为内对照根据用于定量实时PCR的ΔΔCT方法计算相对定量。
蛋白质印迹
将NCF或ADF溶解于Laemmli样本缓冲液(BIO-RAD，CA，USA)、蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和2-巯基乙醇(Wako Pure ChemicalIndustries，日本)中。将样本在4％-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies，MD，美国)上分离，使用iBlot 7-Minute印迹系统(Life technologies，MD，美国)电转移至iBlot转膜堆层(硝酸纤维素，标准尺寸)(Life technologies，MD，美国)上进行，然后使用Amersham ECLPrime蛋白质印迹检测试剂(GE Healthcare，PA，美国)进行处理处理以用于化学发光分析。条带的强度使用LAS4000(Fujifilm，Tokyo，日本)和NIH图像软件(version 1.46r)进行分析。将下面的细胞瞬时过表达裂解物用于阳性对照：用于Col11a1的K562(人红白血病细胞系；Human erythromyeloblastoid leukemia cell line)(Abcam，CB，UK)；用于Vcam-1的Sol8(SantaCruz，CA，USA)；用于β1/CD29的ITGB1 293T(Abnova，台北，中国台湾)；用于整联蛋白α4β1的Jurkat全细胞裂解物(SantaCruz，CA，USA)。
中和抗体分析
将下述抗体和培养皿用于中和抗体分析：抗VCAM-1(LifeSpan Biosciences，Seattle，WA)，山羊IgG同种型对照(LifeSpan Biosciences，Seattle，WA)；用于24孔培养板的细胞培养插件；孔径0.4μm、半透明、高密度PET膜(BD Pharmingen，Franklin Lakes,NJ)。
用10μg/mL抗体进行30分钟预处理后，将成纤维细胞接种在插入式培养皿的上层(2.4×105个细胞)。将mESC来源的心肌细胞接种在下层(4.8×105个细胞)。每天更换具有10μg/mL抗体的培养液至5天。
统计分析
所有数据以平均值±SD表示。不同组之间的变化的显著性通过单因素方差分析确定。之后，两个组之间的差异使用Statcel软件通过Tukey-Kramer多重比较法确定。将p值＜0.05视为显著性差异。
2.实验结果
使用mESC来源的心肌细胞和成纤维细胞制作细胞片层
首先我们对用于共培养实验的细胞的特性进行评价。相衬图像表明，从新生小鼠的心脏、成体小鼠的心脏以及成体小鼠的皮肤组织分离的细胞显示出成纤维细胞样的形态(参见图1A)。由于没有对成纤维细胞具有特异性的抗体，所以尝试调查了已知在成纤维细胞中表达的诸如DDR2(CD167b)、波形蛋白和αSMA的蛋白质的表达。如图1B-图1E所示，几乎所有的各类型的细胞表达DDR2、波形蛋白和αSMA，然而不表达调宁蛋白(平滑肌细胞标记物)、细胞角蛋白(上皮细胞标记物)和NG2(周皮细胞标记物)。基于这些发现，我们在接下来的实验中将这些细胞作为成纤维细胞使用。
基于我们此前的发现，需要特定范围量的成纤维细胞用于构建使用mESC来源的心肌细胞的细胞片层，并且心肌细胞和成纤维细胞的最佳比例为8:2(Biomaterials.2011；32:7355-7362)，我们尝试使用mESC来源的心肌细胞和3种类型的成纤维细胞(ACF、ADF和NCF)在UpCell温度应答性培养皿上制作心脏细胞片层。当将心肌细胞与ACF或NCF共培养时，搏动的心肌细胞均等地分布在所有的区域。相反，当将心肌细胞与ADF共培养时，附近的搏动细胞聚集。5天培养后，当将培养条件由37℃变更为20℃时，在使用成纤维细胞的各种条件下产生单层细胞片层，然而，在没有成纤维细胞的条件下不产生单层细胞片层(图2A)。
接下来，使用MED系统对细胞片层进行电生理学评价(Biomaterials.2011；32:7355-7362；Biomaterials.2006；27:4765-4774)。与显微镜观察相一致(图2A)，在具有ACF和NCF的细胞片层中，在各通道观察到细胞外动作电位(图2B)。在这些细胞片层中，由于认识到整个片层均匀地搏动，暗示了在片层中构建了电网络，并且这些细胞片层可以进行电传输。同时，在与ADF共培养的细胞片层中，仅在局部区域观察到细胞外动作电位。
为了确认细胞片层之间的心肌细胞分布的差异，进行了共聚焦显微镜分析。如图2C-图2E中所示，在具有ACF和NCF的细胞片层中的YFP(+)细胞的数量和心脏肌钙蛋白T(cTnT)(+)细胞的数量(显示mESC来源的细胞的指示物)比起具有ADF的细胞片层中的细胞的数量更多。在具有ADF的细胞片层中的心肌细胞的数量比得上在没有成纤维细胞的条件下的数量。此外，在与ACF和与NCF共培养的细胞片层之间，心肌细胞数量没有显著的相关关系。这些发现表明，各种类的成纤维细胞均用于构建细胞片层，然而，来自于心脏的成纤维细胞可能更适合于构建更具功能性的心脏细胞片层。
细胞片层中的心肌细胞增殖
为了调查与心脏来源的成纤维细胞和皮肤组织来源的成纤维细胞共培养的细胞片层之间的心肌细胞数量不同的原因，检测了共培养第1天和第5天的心肌细胞数量(图3A-图3C)。在第1天，在各条件之间的心肌细胞数量相同，表明各类型的成纤维细胞不会影响接种后的心肌细胞的初期附着。在与ACF和NCF的共培养中，第5天的YFP(+)和cTnT(+)的心肌细胞数量显著比第1天更高。另一方面，在与ADF共培养或在心肌细胞单独培养的条件下，第5天的心肌细胞数量与第1天类似。使用分离自DsRed小鼠的成纤维细胞和YFP(+)心肌细胞的时移图像分析显示，在与NCF共培养中，心肌细胞迁移并增殖且构建互联网络结构。相反，在与ADF共培养中，心肌细胞显示出较少的增殖，且未构建网络结构。这些发现表明，来自心脏的成纤维细胞(而不是来自皮肤组织的成纤维细胞)在共培养条件下可能诱导mESC来源的心肌细胞的增殖。
将各条件之间的心肌细胞的增殖通过免疫细胞化学分析进行确认。如图4A-图4D所示，与NCF共培养的Ki67(+)细胞和磷酸化组蛋白H3(PHH3)(+)的心肌细胞的百分比显著高于与ADF共培养和心肌细胞单独培养的条件下的百分比。进一步的，BrdU掺入分析也显示出，比起与ADF共培养和在心肌细胞单独培养条件下的增殖的心肌细胞的百分比，与NCF共培养的增殖的心肌细胞的百分比显著增加(图4E和图4F)。这些发现强烈表明，心脏来源的成纤维细胞诱导心肌细胞的增殖。
为了调查关于与NCF共培养的心肌细胞增殖的潜在机制，将mESC来源的心肌细胞和NCF使用细胞培养插件进行培养。在该实验中，NCF在上层培养，而心肌细胞在下层培养。在NCF的存在下，第5天的心肌细胞的数量比起第1天显著更高(图4G)。然而，在细胞培养插件实验中，第1天和第5天之间的心肌细胞数量的增加程度(～1.8倍)(图4H)比起在共培养条件下(～2.5倍)更低。这些发现示出了，从NCF分泌的可溶性因子以及心脏成纤维细胞与心肌细胞之间的细胞-细胞相互作用可能促进心肌细胞增殖。
NCF和ADF的全面的基因分析
为了识别对参与上述效果负责的因子，使用微阵列分析在NCF和ADF之间进行全面的基因分析。如图5A所示，在NCF和ADF之间观察到基因表达方面的许多差异。与ADF相比，NCF中的超过500个基因显示出更高10倍的增强的表达。在从列表中选择与心血管相关的基因之后，仍然留下了20个基因。进一步地，当选择被报道导致敲除小鼠模型中的心脏的发育异常的胚胎致死表型、并且还充当了可溶性因子和粘着因子的基因时，留下了Vcam-1。通过定量RT-PCR和蛋白质印迹分析确认了，比起ADF在NCF中的Vcam-1的增强的表达(图5B-图5D)。
在与心脏成纤维细胞共培养中的VCAM-1依存性心肌细胞增殖
由于已知整联蛋白α4β1是VCAM-1的主要的辅助受体，所以检查了mESC来源的心肌细胞中的整联蛋白α4β1的表达。如图5E和图5F所示，几乎所有mESC来源的心肌细胞显示出整联蛋白α4β1的生成。
接下来，对于VCAM-1使用中和抗体是否有助于心脏成纤维细胞介导的心肌细胞增殖进行了阐释。在将NCF使用抗VCAM-1抗体进行前处理后，将NCF和mESC来源的心肌细胞使用细胞培养插件进行培养。抗VCAM-1抗体处理显著抑制了心脏成纤维细胞介导的心肌细胞数量的增加(图6A和图6B)。
最后，评价了VCAM-1对心肌细胞增殖的直接效果。培养开始后第1天，将心肌细胞以VCAM-1重组蛋白质处理至第5天。如图6C和图6D所示，与对照相比，VCAM-1处理增加了心肌细胞的数量。这些发现表明，心脏来源的成纤维细胞可能通过心肌细胞中的成纤维细胞介导的VCAM-1和整联蛋白α4β1诱导心肌细胞增殖。
为了确认在构建功能性心脏细胞片层中的VCAM-1阳性细胞的重要性，测定了生物体来源的心脏成纤维细胞中的VCAM-1阳性细胞的百分比。
从C57/BL6小鼠的新生小鼠(1日龄)解剖并收集心脏成纤维细胞，并从成体小鼠(10-12周龄)解剖并收集皮肤成纤维细胞。将各成纤维细胞进行附着培养直至3次继代，在每个条件下得到1×107个细胞的细胞量。3次继代与通过细胞片层制作的上述心肌细胞的培养条件相同。
使两种成纤维细胞经受使用山羊多克隆抗VCAM-1抗体(R&D systems，Minneapolis，MN)的一级免疫荧光染色，并经受使用Alexa Fluor488驴抗山羊IgG(LifeTechnologies，MD，美国)的二级免疫荧光染色。随后，在Gallios(Beckman Coulter，Brea，CA)下进行FACS分析，并测定VCAM-1阳性细胞率(N＝3)。显著性差异的计算使用Student'st检验进行。
心脏成纤维细胞(NCF)的结果在图7A-图7C中示出。发现了NCF中的VCAM-1阳性细胞的百分比为约60％(图7A：66.57％；图7B：58.95％；图7C：54.73％)。相反，皮肤成纤维细胞(ADF)中的VCAM-1阳性细胞的比例为约5％，这证明比起ADF，NCF中的VCAM-1阳性细胞的百分比显著更高(P<0.001)。
表明了含有许多VCAM-1阳性细胞的心脏成纤维细胞通过表达VCAM-1使来自于小鼠ES的心肌细胞增殖，从而有助于构建功能性心肌组织。进一步地，认为从胚胎学的观点来看，VCAM-1阳性的心脏成纤维细胞来自心外膜来源的细胞；并且我们得到启示，从胚胎学的观点进行成纤维细胞分类是有效的，作为用于构建功能性组织的细胞源，不是进行形态学分类而是进行功能分类。
认为NCF中的不表达VCAM-1的细胞的大部分表达CD31(血管内皮细胞标记物)。原因如下：已知组织常驻性心脏成纤维细胞从心外膜来源的细胞通过上皮间充质转化(EMT)产生，并且还通过内皮间充质转化(EndMT)从血管内皮细胞分化。进一步地，与心脏成纤维细胞一样，通过EndMT从血管内皮细胞分化的肾脏成纤维细胞表达CD31(J Am Soc Nephrol19:2282-2287，2008)。这也可以成为支持NCF表达CD31的根据之一。
从上文得到澄清的是，不是皮肤成纤维细胞而是心脏成纤维细胞增强了小鼠胚胎干细胞(mESC)来源的心肌细胞的增殖，并对构建更具功能性的心脏细胞片层做出贡献。此外，示出了心脏成纤维细胞比皮肤成纤维细胞更丰富地表达VCAM-1，而且心脏成纤维细胞的VCAM-1在心脏细胞的增殖和功能性上生物学设计的心脏组织的构建中起重要作用。
工业实用性
通过使用本发明的心脏细胞培养材料进行培养，有利地构建了功能性心脏组织。通过培养得到的心脏细胞可以用作诸如移植的再生医疗或者用作诸如心脏组织模型的人工器官材料。

Claims (3)

1.一种成纤维细胞的细胞群，所述细胞群包含表达VCAM-1的成纤维细胞，其中，所述表达VCAM-1的成纤维细胞包括通过使用已知的细胞分选法作为表达VCAM-1蛋白质的心脏成纤维细胞而分选的心脏成纤维细胞，并且所述成纤维细胞排除了在分化或成熟阶段的过程中以及无法被鉴别为成纤维细胞的成纤维细胞。
2.如权利要求1所述的成纤维细胞的细胞群，其中，所述已知的细胞分选法为使用抗VCAM-1抗体的流式细胞术。
3.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的成纤维细胞的细胞群以及生理盐水、细胞培养液或细胞保存液。
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