KR102283340B1

KR102283340B1 - 심근 직분화를 위한 심장 모사 세포 배양장치 및 이를 이용한 세포 분화 방법

Info

Publication number: KR102283340B1
Application number: KR1020200037212A
Authority: KR
Inventors: 김병수; 차국헌; 송석영; 류진
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-07-30

Abstract

본 발명은 전기자극 및 세포 공배양을 통하여 심장 미세환경을 모사함으로써, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 직분화 효율을 높일 수 있는 세포 분화 방법 및 세포 분화 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포 분화 방법은 전기적 자극과 공배양 두 가지 요소를 동시에 적용시킴으로서 심근세포의 생체 내 미세환경을 모사하여 분화 효율을 더욱 높일 수 있다. 따라서 본 발명은 심근경색을 포함한 심혈관 질환의 치료 등 다양한 연구에 활용될 수 있다.

Description

심근 직분화를 위한 심장 모사 세포 배양장치 및 이를 이용한 세포 분화 방법 {Cardiac-mimetic cell culture platform and a method for direct cardiac reprogramming}

본 발명은 심근 직분화를 위한 심장 모사 세포 배양장치 및 이를 이용한 세포 분화 방법에 관한 것이다.

생체에서 심근세포(cardiomyocytes)는 세포 분열능을 상실하므로, 허혈이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 일단 괴사 또는 소실되면, 보충되지 않는다. 그 결과, 잔존하는 심근세포가 대상성 비대를 통해 기능을 유지하려고 하지만, 이러한 상태가 지속되어 심근 조직의 허용 범위를 넘어서게 되면, 심근세포는 더욱 더 피폐 또는 사멸되어, 최종적으로는 심근 기능의 저하, 즉 심부전이 발생하게 된다. 이러한 심부전(heart failure)을 비롯한 심장 질환은 전 세계적인 주요 사망원인 중 하나로서, 심근세포의 유실이나 기능장애에 의해 발생한다.

심장 질환 환자는 예후가 매우 나빠, 5년 생존율이 약 50%에 불과하며, 심근세포의 재생 능력이 매우 제한적이기 때문에 완치에는 많은 어려움이 있는 실정이다. 널리 이용되고 있는 대중적 치료법은 상해를 입은 심장 조직 자체를 회복시키는 것은 아니며, 심장 이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 기증자의 부족, 의료 윤리, 환자의 육체적 또는 경제적 부담감 등의 문제로 인해, 일반적인 치료법으로서의 이용에는 한계가 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 많은 연구 그룹들이 심근세포의 이식을 통하여 심장의 기능을 회복시키는 방법에 관한 연구를 진행하고 있다. 심근세포의 이식에 이용될 세포를 획득하기 위한 방법으로는 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 유도 만능줄기세포(Induced pluripotent stem cells: iPSC)를 분화시켜서 심근세포를 획득하는 것이 가장 일반적으로 제시되고 있는 방법이다. 그러나 성체줄기세포는 자가 유래 세포를 얻는 데 한계가 있고, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포는 공통적으로 양성종양(teratoma) 형성 위험이 문제가 되어 임상적용에 어려움을 겪고 있다.

최근 주목받고 있는 직분화(direct reprogramming)의 경우 피부 등에 존재하는 섬유아세포를 중간의 만능줄기세포 상태 없이 바로 심근으로 분화시킬 수 있는 기술이다. 유도만능줄기세포와 같이 섬유아세포를 재료로 하므로, 골수 등에서 추출해야 하는 기존의 성체줄기세포보다 환자 유래의 자가 세포를 사용하기 용이하다. 그러면서도 배아 줄기세포의 윤리적 문제나 유도만능줄기세포의 teratoma 형성 위험성에서 자유롭기 때문에, 2010년 처음으로 발표된 이래 많은 연구가 진행되고 있다. 하지만 분화율이 낮은 것이 큰 문제인데, 이를 해결하고자 소분자전달(small molecule delivery), 사이토카인 전달(cytokine delivery), 전사인자 변화(change of transcription factors), 마이크로RNA 도입(miRNA delivery)등의 방법이 도입되어 왔다. 그러나 아직 낮은 효율 때문에 임상 적용에 어려움을 겪고 있다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하고자 심근분화 방법에 대한 연구를 지속한 결과, 공배양과 전기자극 두 가지 요소를 모두 도입하여 심장 미세환경을 모사함으로써 기존의 방법에 비하여 직분화 효율이 현저히 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 한계를 해결하기 위해, 보다 효율적으로 섬유아세포를 심근세포로 분화 유도시키는 방법 및 세포 분화 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

세포 분화 방법이 소개 된다.

이를 위해 본 발명은 섬유아세포가 공배양될 수 있는 별도의 공배양세포와 인접한 상태에서, 상기 섬유아세포에 전기자극을 주어 공배양과 전기자극이 동시에 가해지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 세포 분화 방법 및 심장 모사 세포 분화 장치는 전기적 자극과 공배양 두 가지 요소를 동시에 적용시킴으로서 심근세포의 생체 내 미세환경을 모사하여 분화 효율을 더욱 높일 수 있다. 따라서 본 발명은 심근경색을 포함한 심혈관 질환의 치료 등 다양한 연구에 활용될 수 있다.

도 1은 본원발명의 다공성 나노막의 공극 크기 및 두께를 주사탐침현미경(AFM)과 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하고, 이미지 분석 프로그램(Image J)을 이용해 나타낸 도면,
도 2는 본원발명의 다공성 나노막이 공배양에 적합한지 여부를 확인하여 나타낸 도면,
도 3은 전사인자를 가한 후 GFP를 발현, 전사인자 발현 및 심근 마커 mRNA의 발현 여부를 확인하여 나타낸 도면,
도 4는 본원발명의 심장 모사 세포 배양장치 사용 시 심근마커 mRNA의 양 및 섬유아세포 마커의 발현양을 확인하여 나타낸 도면,
도 5는 GMTHN(cardiac-specific transcription factor, (Gata4, Mef2c, Tbx5, Hand2, and Nkx2.5; GMTHN))을 전달한 그룹(그룹B, D, F)에서 심근 특이적인 단백질인 Cardiac Troponin T (cTnT)의 발현을 정성적, 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 도면,
도 6은 심근 직분화와 관련된 세포 내 신호전달 경로(signaling pathway)를 나타낸 도면,
도 7은 배양한 세포를 헤마-에오신 염색법(H&E)으로 관찰한 결과를 나타낸 도면,
도 8은 혈관내피세포를 이용하여 혈관형성을 유도한 후 혈관마커인 본윌리브랜드 요소(vWF, Von Willebrand Factor)의 면역염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면,
도 9는 본 발명이 구현되기 위한 일정한 순서도와 장치의 개략도이다.

이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명인 심근 직분화를 위한 심장 모사 세포 배양장치 및 이를 이용한 세포 분화 방법의 바람직한 실시 예를 설명한다.

본 발명은 섬유아세포가 공배양될 수 있는 별도의 공배양세포와 인접한 상태에서 섬유아세포에 별도의 전기자극을 주어 공배양과 전기자극이 동시에 가해지는 것을 특징으로 하는, 세포 분화 방법을 제공한다.

일 구현예에서 섬유아세포는 힘줄, 인대, 근육, 피부, 치주, 각막, 연골, 뼈, 혈관, 소장, 대장 또는 추간판 유래의 섬유아세포일 수 있으며 바람직하게는 피부 유래의 섬유아세포이나 이에 제한되지는 않는다.

일 구현예에서 전기자극은 직류 전류 또는 교류 전류에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 전기자극은 심장 내부에 흐르는 생체전류를 모사하기 위함이다.

또한 본 발명은 아래와 같은 방법에 의해 구현됨이 바람직하다.

(a)섬유아세포를 다공성 나노막에 부착하는 단계, b)섬유아세포와 인접된 공배양세포에 의해 상기 섬유아세포가 공배양되는 단계 및, (c)상기 (b)단계와 동시에 상기 섬유아세포에 전기자극을 주는 단계를 포함한다.

일 구현예에서 다공성 나노막은 생분해성 고분자이며 상기 생분해성 고분자는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리 락틱 코 글리콜산(Poly(D,L-latic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리아미노산, 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 및 이들의 유도체 또는 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 폴리 락틱 코 글리콜산(Poly(D,L-latic-co-glycolic acid), PLGA)이나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 다공성 나노막은 공동 배양 세포의 혼합을 막는 장벽으로서의 역할을 할뿐만 아니라, 이종 세포 간의 접촉을 통하여 능동적인 상호작용을 유도시킴으로써 줄기세포를 효과적으로 분화시킬 수 있으며, 분화된 세포를 회수하는 단계에서 가벼운 전단 응력을 가하여 세포를 분리시키는 역할을 할 수 있다.

상기와 같은 방법이 구현되기 위해 본 발명은 아래와 같은 기술적 사상을 포함하는데 도 9를 참조(이하 후술할 제조예2)로 설명하면 다음과 같다.

내부에 소정공간이 형성된 하우징이 마련된다.

하우징의 형상에는 제한이 없으며, 내부에 공배양세포가 위치할 수 있고, 외부에서 별도의 전기자극을 줄 수 있는 장치이면 본 발명에 적용될 수 있음이 자명하다.

하우징 내부의 소정 위치에 구체적으로는 이하 설명할 공배양 세포 상측에

섬유아세포가 부착된 다공성나노막이 형성된다.

물론, 다공성나노막과 이하 설명할 공배양세포의 위치는 서로 변경될 수 있으나, 공배양세포가 안정적으로 위치되기 위해서는 하우징의 내부 하면에 위치함이 바람직하다.

섬유아세포와 인접되도록 위치하는 공배양세포층이 마련되고, 섬유아세포에 전기자극을 줄 수 있는 별도의 전기자극부가 형성된다.

전기자극부는 여러 방법에 의해 섬유아세포 측으로 전기자극을 줄 수 있으며, 반드시 어느 한 장치에 한정되지 않는다.

구체적으로 섬유아세포가 부착된 다공성나노막으로 사용자가 설정한 시간과 전압으로 전기자극이 가해진다.

이때, 섬유아세포가 공배양됨과 전기자극이 동시에 가해지게 된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 섬유아세포에 전기적 자극과 공배양 두 가지 요소를 모두 도입하였을 때 심근세포로의 분화효율이 증가함을 알 수 있다.

전술한 방법에 의해 섬유아세포로부터 분화된 심근세포는 심근세포-지지체 복합체로서 다양한 용도에 활용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의하여 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

<제조예 1> 다공성 나노막 제조

다공성 나노막은 미국 식약처(FDA) 인증된 생분해성 고분자인 poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)로 제조하였다. 구체적으로는 4%의 PLGA 용액(tetrahydrofuran, THF)을 스핀코팅하고, 물에 띄우는 방식으로 얇은 막을 분리해내 PET 프레임에 고정하여 제조하였다.

<제조예 2> 세포 배양장치 제조

염다리(salt bridge)와 유리 슬라이드를 고정할 수 있는 테플론 블록과 덮개로 전기자극을 줄 수 있는 배양장치를 제작하였다. 구체적으로는 염다리는 실리콘 튜빙 안에 2% (w/v) 아가로즈 용액을 주입하여 제작하였고, 고무 재질의 완충재를 이용하여 유리 슬라이드가 깨지지 않고 테플론 사이에 단단히 고정될 수 있도록 하였다. 모든 구성품은 미리 고압증기멸균(autoclave) 하여 세포가 오염되는 것을 방지하였다.

<실시예 1> 다공성 나노막의 성질 확인

상기 제조예 1에서와 같이 제작된 다공성 나노막의 성질을 확인하고, 상기 다공성 나노막이 심근모사 배양 과정 내내 세포를 제대로 지지하면서도, 공배양 상대 세포와 소통할 수 있는데 적합한 공극을 유지하는지 확인하기 위해 상기 제조예 2에서와 같이 제작된 전기 자극 배양장치에서 3주간 관찰하였다.

관찰결과는 주사탐침현미경(AFM)과 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하고, 이미지 분석 프로그램(Image J)을 이용해 공극을 분석하였다.

구체적으로 도 1A에 주사탐침현미경(AFM) 관찰 결과를 나타내었으며 이미지 분석 프로그램(Image J)으로 공극을 분석한 결과 전기 자극 환경에 노출되기 전의 공극의 크기는 337.9 ± 17.4 nm로 측정되었다(도 1B). 이후 전기 자극 배양장치에서 3주간 세포를 배양한 뒤 공극 크기를 측정한 결과 466.3 ± 7.1 nm(도 1D)로 나타나 전기 자극 환경에 노출되기 전보다 공극의 크기는 커졌으며, 두께도 538 nm에서 385 nm로 변화가 있음을 확인하였다(도 1E).

상기와 같이 전기 자극 환경에 노출되기 전후의 공극의 크기 및 두께에 변화가 있었으나, 이와 같은 변화는 다공성 나노막이 안정적으로 세포를 지탱하는 데는 문제가 없으며 세포 간 소통을 하는데도 적합한 수준의 공극 크기와 두께를 유지함을 확인하였다.

<실시예 2> 다공성 나노막이 공배양에 적합한지 여부의 확인

제조예 1에서와 같이 제작된 다공성 나노막이 공배양에 적합한지 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

먼저 섬유아세포를 상기 제조예 1에서와 같이 제작한 다공성 나노막에 1 x 10⁵ cells/cm² 농도로 접종하였다. 이후 다공성 나노막이 세포 친화적인지 여부를 확인한 결과, 도 2A에 나타낸 것과 같이 일반 세포 배양 접시에 배양한 것과 유사한 형태(morphology)를 보이는 것을 확인하였으며, 도 2B에 나타낸 바와 같이 배양 중에도 정상적으로 성장하고 분열하는 것을 확인하였다.

또한 공배양 시 공배양 세포 간 소통이 가능한지 확인하기 위해 상기 섬유아세포를 심근세포가 존재하는 플레이트에 접종한 후 형광 Z-스택 분석을 진행하였다. 그 결과 도 2C에 나타낸 바와 같이 두 세포가 매우 가깝게 유지되어 두 세포가 띠는 형광이 겹쳐 나타나는 것을 확인하였다.

이후 공배양 후 교차 오염 없이 분리가 가능한지 확인하기 위해 인간 특이적 세포 마커를 사용하여 마우스 세포와 분리가 가능한지 확인하였으며, 그 결과 도 2D에 나타낸 바와 같이 3주 동안의 공배양 후에 인간 특이적 세포마커가 거의 모든 세포에서 나타남으로써, 마우스 세포와 섞이지 않고 분리되는 것을 확인하였다.

<실시예 3> 심장 모사 세포 배양장치에서의 세포 배양

제조예 2에서와 같이 제작된 전기자극장치에서 1 V/cm의 전압을 biphasic square로 5 ms 동안 가하는 펄스를 5 Hz로 가하여 심장 환경을 모사하였다. 전체 배양은 이산화탄소 5%의 습윤한 세포배양 챔버에 넣은 상태로 진행되었다.

<실시예 4> 전사인자 영향 확인

상기 실시예 2의 공배양 세포에 전사인자를 처리하는 경우의 분화 효율을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

구체적으로 세포 1×10⁶개에 30 μg의 전사인자를 가하여 2일 경과 후 유세포 분석(flow cytometry)을 실시한 결과 도 3A에 나타낸 바와 같이 41.65%의 세포가 GFP를 발현하는 것으로 확인되었고, 약 80%의 생존도를 보였다. 또한 도 3B에 나타낸 바와 같이 모든 전사인자들이 발현된 것을 확인하였으며, 도 3C에 나타낸 바와 같이 Tnnt2, Nppa, Ryr2 등의 심근 마커 mRNA도 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다 .

<실시예 5> 심장모사 세포배양시스템에서의 심근세포로의 분화 확인

상기 제조예 2와 같이 제조한 심장모사 세포배양시스템 및 전사인자를 처리한 경우 심근세포로의 분화 효율을 관찰하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 심근마커 mRNA의 양이 크게 증가하고 섬유아세포 마커가 감소함을 확인하였다.

보다 구체적으로 그룹A 내지 F, 총 6개 그룹으로 나누어 비교하였으며, 그룹A는 HNDF(human neonatal dermal fibroblasts), 그룹B는 GMTHN-HNDF(cardiac-specific transcription factor, (Gata4, Mef2c, Tbx5, Hand2, and Nkx2.5; GMTHN)), 그룹C는 심근세포주와 공배양한 HNDF, 그룹D는 심근세포주와 공배양한 GMTHN-HNDF, 그룹E는 심장모사 세포배양시스템 내에서 공배양과 전기자극을 모두 준 HDNF, 그룹F는 심장모사 세포배양시스템 내에서 배양한 GMTHN-HNDF로 나타내었다. 심근의 수축성 단백질(Tnnt2, Myl2), 심장 채널 단백질(Ryr2), 심근 펩타이드(Nppa), 심장 전사인자(SIK1, NFAT C2), 심장의 대사활동에 관여하는 단백질 (PHKA1)을 코딩하는 mRNA들이 각각 그룹 F에서 통계적으로 유의미하게 증가함을 확인하였다. 공배양만 진행한 그룹D에서도 심근 마커의 증가 경향이 보였지만, Tnnt2와 Ryr2만 통계적으로 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 반면, 섬유아세포 마커인 ColA1a는 유미하게 감소하여 섬유아세포가 본래의 성질을 잃고 심근세포의 성질을 띠게 되었음을 확인하였다.

<실시예 6> 각 배양 조건에서 심근 전사인자 GMTHN가 분화에 미치는 영향 확인

상기 실시예 4에 나타낸 바와 같이 전기자극의 유무와 상관없이 심근세포와 공배양 시 심근 전사인자 GMTHN을 전달하지 않은 경우에는 (그룹C, 그룹E) 심근 mRNA 마커가 유의미하게 증가하지 않는 것을 확인하였다. 따라서 각 배양 조건에 서 심근 전사인자 GMTHN이 미치는 영향을 관찰하기 위하여 심근 특이적 단백질 마커의 발현 여부를 심근 전사인자 GMTHN을 전달하지 않은 그룹A를 대조군으로 하여, GMTHN을 전달한 그룹인 그룹B, D, F에서만 조사하여 도 5에 나타내었다.

심근 직분화 효율은 기존에 알려진 바와 같이 심근 특이적인 단백질인 Cardiac Troponin T (cTnT)의 발현을 정성적, 정량적으로 확인하여 평가하였다. 세포면역염색법(Immunocytochemistry)으로 cTnT의 발현을 확인한 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이 심장모사 세포배양시스템에서 배양된 세포에서 cTnT가 더 많이 발현되어 있었고, 이를 유세포분석법(flow cytometry)으로 측정한 결과 도 5B 에 나타낸 바와 같이 대조군(그룹A, 0.2±0.0%)에 비해 유의미하게 증가(그룹F, 6.4±0.2%)한 것을 확인하였다. 또한 공배양만을 진행했을 때(그룹D, 2.9±0.4%) GMTHN 심근 전사인자만 전달한 것(그룹B, 2.6±0.7%)에 비해 유의미하게 cTnT 발현량이 증가하지 않은 것으로 보아, 심근세포와의 공배양만으로는 심근 직분화가 촉진되지 않음을 확인하였다.

<실시예 7> 심장모사 세포배양시스템에서의 심근 직분화 촉진 메커니즘 확인

심장모사 세포배양시스템이 심근 직분화를 촉진하는 메커니즘을 확인하고자, 세포 내 신호전달 경로(signaling pathway)를 조사하여 도 6에 도시하였다. 아직 심근 직분화에 관여하는 모든 세포 내 경로가 밝혀진 것은 아니나, 도 6A에 나타낸 바와 같이 phosphoinositol 3-kinase/Akt (PI3K/Akt) 패스웨이와 p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) 패스웨이는 각각 심근 직분화에 기여하는 것으로 보고된 바 있다. 이에 심장모사 배양시스템에서 7일간 배양한 섬유아세포 내부의 신호전달 물질의 인산화 여부를 조사하였다. 심장모사 배양시스템 중 공배양은 3일간 실시되었다.

그 결과 도 6B에 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 인산화된 Akt와 p38이 유의미하게 많아진 것을 확인하였다. 반면 전기자극 없이 공배양만 실시한 경우나 전기자극만 가한 경우에는 대조군에 비해 인산화된 Akt와 p38가 유의미하게 증가하지 않음을 확인하여 본 발명의 심장모사 세포배양시스템이 섬유아세포를 효율적으로 심근세포로 분화함을 확인하였다.

<실시예 8> 직분화된 세포 분리

그룹 A 내지 D의 세포가 올라가 있는 나노막을 옮겨 두 층으로 적층하고, 일주일 동안 심근 분화 배지에서 배양하였다. 이를 동결박편법으로 시편화하고, 헤마-에오신 염색법(H&E)으로 관찰할 수 있도록 하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이 단층 군은 평균 17.69±2.70 μm, 2중층 군은 평균 43.57±6.50 μm로 유의미한 차이가 나타났다. 각 그룹 내에서는 실험군에 따른 유의미한 차이는 확인되지 않았다.

본원발명의 심장 모사 배양 시스템에서 생산한 2중층 세포 construct를 면역염색법으로 염색한 결과, 사코메트릭 알파 엑티닌(sarcomeric alpha actinin, SAA)과 cTnT가 관찰되었다.

<실시예 9> 직분화된 세포를 이용한 혈관형성 유도

혈관형성을 유도하기 위하여 도 8A에 나타낸 바와 같이 상기 실시예 7의 두 세포층 사이에 혈관내피세포를 넣어서 혈관형성(prevascularization)을 유도하였다.

이후 혈관내피세포가 두 세포층 사이에 잘 자리 잡았는지 여부를 확인하기 위하여 혈관마커인 본윌리브랜드 요소(vWF, Von Willebrand Factor)를 면역염색을 통해 확인하였다.

그 결과 도 8B에 나타낸 바와 같이 혈관내피세포가 두 세포층 사이에 잘 자리 잡았음을 확인하였다.

Claims

in vitro상에서, 섬유아세포에 심근 전사인자 GMTHN을 도입하는 단계; 및
상기 섬유아세포와 공배양될 수 있는 별도의 심근 세포와 인접한 상태의 심근전사인자 GMTHN이 도입된 섬유아세포에 전기자극을 주어 공배양과 전기자극이 동시에 가해지는 단계;를 포함하는, 심근 세포 분화 방법.
(a)섬유아세포에 심근 전사인자 GMTHN을 전달하는 단계;
(b)상기 섬유아세포를 다공성 나노막에 부착하는 단계;
(c)섬유아세포와 인접된 심근 세포에 의해 상기 섬유아세포가 공배양되는 단계; 및
(d)상기 (c)단계와 동시에 상기 섬유아세포에 전기자극을 주는 단계;를 포함하는, 심근 세포 분화 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 섬유아세포는 피부 섬유아세포인 것인 특징으로 하는, 심근 세포 분화 방법.
삭제
제2항에 있어서,
상기 다공성 나노막은 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)인 것을 특징으로 하는, 심근 세포 분화 방법.
내부에 소정공간이 형성된 하우징;
상기 하우징 내부의 소정 위치에 설치된 심근전사인자 GMTHN이 도입된 섬유아세포가 부착된 다공성나노막;
상기 하우징 내부에 위치하여 섬유아세포와 인접되어 상기 섬유아세포를 공배양시키는 심근세포층; 및
상기 섬유아세포에 전기자극을 줄 수 있는 별도의 전기자극부를 포함하되,
상기 섬유아세포가 공배양됨과 동시에 전기자극이 가해지는 것을 특징으로 하는, 심근 직분화를 위한 심장 모사 세포 배양장치.
제6항에 있어서,
상기 섬유아세포는 피부 섬유아세포인 것인 특징으로 하고,
상기 다공성 나노막은 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)인 것을 특징으로 하며,
상기 공배양세포는 심근 세포인 것인 특징으로 하는, 심근 직분화를 위한 심장 모사 세포 배양장치.