KR20170023188A

KR20170023188A - 심장 세포 배양 재료

Info

Publication number: KR20170023188A
Application number: KR1020177003798A
Authority: KR
Inventors: 타카히로 이와미야; 카츠히사 마츠우라
Original assignee: 가부시키가이샤 메토세라
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2015-01-05
Publication date: 2017-03-02
Also published as: CA2954743A1; CA2954743C; US11801267B2; US20170112880A1; EP3168297B1; WO2016006262A1; CN106661552B; JP2016027797A; EP3168297A1; KR102263824B1; US20180369288A1; JP2018029611A; EP3168297A4; AU2015286462A1; JP6241893B2; CN111876371A; CN106661552A; AU2015286462B2

Abstract

본 발명의 목적은 심장 세포들에 특이적으로 작용하는 심장 세포 배양 재료를 제공하는 것이다. 게다가, 본 발명의 또다른 목적은 상기 심장 세포 배양 재료를 이용함으로써 배양하여 수득되는 인공 장기 재료, 및 그것을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 그러므로, 제공되는 것은, 기능적 심장 조직이 VCAM-1를 포함하는 심장 세포 배양 재료를 이용함으로써 순조롭게 만들어지는, 심장 세포 배양이다.

Description

심장 세포 배양 재료{CARDIAC CELL CULTURE MATERIAL}

본 발명은 심장 세포 배양 재료 및 벽 표면 및/또는 바닥 표면을 갖는 배양 기판의 벽 표면 및/또는 바닥 표면이 심장 세포 배양 재료로 코팅된, 세포 배양 기판에 대한 것이다. 게다가, 본 발명은 그 심장 세포 배양 재료을 이용하여 심장 세포를 배양함으로써 수득되는 인공 장기 재료, 및 이를 생산하는 방법에 대한 것이다.

섬유아세포들은 거의 모든 척추동물에 존재하며, 조직이 외상 및 국소빈혈에 의하여 손상될 때, 손상된 영역이 풍부한 세포외 기질 퇴적 및 섬유아세포들 증식에 따른 섬유성 조직으로 대체된다. 마찬가지로, 심근경색 및 심근병증과 같은 여러가지 심장 질환에서, 많은 심장근육세포들이 손실되고, 또한 섬유성 조직이 그 영역을 대체하는데, 이는 과도한 혈류역학적 스트레스 및 신경호르몬 자극을 수반하는 심부전 및 심장 리모델링을 이끈다. 안지오텐신(angiotensin) II 및 엔도텔린(endothelin)-1과 같은 신경호르몬 인자들이 혈압 상승, 심근세포 사멸 및 국지적 염증을 통하여 심장 리모델링을 촉진하는데 기여하는 것으로 잘 알려져 있음에도 불구하고, 심장 섬유아세포들은 그 인자들을 분비하는 것으로 보고되어 왔다. 심장 섬유아세포들은 또한 심장 발달에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 심장 섬유아세포에서 상호연결된 세포 공정들은 콜라겐, 섬유아세포들 및 근세포들의 네트워크를 형성한다. 비록 심근세포(cardiomyocyte) 증식이 두꺼운 심실 벽 형성의 필수적인 공정이기는 하지만, 배아 심장 섬유아세포들 또한 β-1 인테그린 신호전달을 통하여 심근 유사분열 활성을 촉진하는 것으로 보고되어 왔다. 심장 섬유아세포들 지배적인 원인 물질은 불명확하다. 여기에서 심장 섬유아세포들은 여러 형태로 심장 발달 및 병의 발생에 역할을 하기 때문에, 심근세포들 및 심장 섬유아세포들 사이의 메커니즘을 이해하고 서로의 상호작용을 이해하는 것의 중요성이 널리 인식되어 왔다. 그러나 심장 섬유아세포들의 불확실한 특성들이 그 장애물이었고, 심장 섬유아세포들의 기능적 그리고 분자생물학적인 특성들을 밝히는 것이 요구된다.

심장 조직 공학은 재생 의학 뿐 아니라 조직 모델을 위하여도 유망한 방법들이다. 심장 조직 공학 방법들 중 온도 반응성 배양 접시들을 이용한 세포 시트(sheet)-기반의 심장 조직이 발달되어 왔다. 예전에, 여러가지 타입들의 혈관상(vascular bed) 상 신생아인 래트들-유래의 심근세포들, 섬유아세포들 and 내피 세포들을 포함하는 심장 세포 시트들을 겹치는 것이 삼차원 혈관발달된 독자생존가능한(viable) 심장 조직을 제작할하는 것을 가능하게 했다는 것이 보고되었다 (비특허문헌들 1 내지 3). 세포 시트-기반의 조지기 공항이 스캐폴드를 필요로 하지 않기 때문에, 그것은 세포 시트들을 건설하기 위하여 약간의 세포외 기질들을 요구한다. 좌심실이 주로 섬유아세포들 및 심근세포들을 포함한다는 증거들과 일치하게, 정제된 배아 줄기 세포-유래의 심근세포들을 이용할 때, 약간의 섬유아세포가 심장 세포 시트들을 만드는데 필수적이다 (비특허문헌 4). 최근의 보고서들이 심근세포들 및 비-근세포들 사이의 세포-세포 상호작용이 심장 생리학 및 발병에 중요하다는 것을 제안하였기 때문에 (비특허문헌 5), 섬유아세포들 기능은 또한 조작된 심장 조직의 작용에 영향을 미칠 수 있고 그리고 그것은 조직 모델들을 위하여 인 비트로에서 심장 조직을 만드는데 적합한 섬유아세포들을 선택하는데 전제조건일 수 있다. 그러나 다른 타입들의 섬유아세포들 및 관련된 분자 메커니즘들에 비교할 때, 심장 섬유아세포들이 심근세포들에 특이적 기능을 가질지 여부는 불명확하게 남아 있다.

전술한 바와 같이, 심장 섬유아세포들은 심장 발달, 및 심장 질환들의 시작 또는 치료에 중요한 역할을 하기 때문에, 심근세포들과 같은 심장 세포들에 특이적으롱 작용하는 심장 섬유아세포들을 다른 섬유아세포들로부터 분리하고 심장 섬유아세포들을 표본채취하는 것이 요구된다. 최근 연구들에 따라, 전에는 균일한 세포 타입으로 생각되었던, 섬유아세포들이 매우 여러가지의 표현형들을 갖고 있다는 것, 그리고 표현형들이 존재하는 장기들, 조직들 또는 세포들의 부하(load) 상태에 따라 다르다는 것이 밝혀져 왔다.

그러나 섬유아세포들의 기능은 명확히 알려지지 않았으며, 섬유아세포들은 형태상으로 분류된 세포들일 뿐이다. 그러므로, 섬유아세포들 중에서, 그 중 특이적 기능을 갖는 하나의 타입만을 선택하는 것은 어렵다.

한편, VCAM-1 및 α4 인테그린과 관련하여, Kwee, et al.는 VCAM-1이 외심막(epicardium), 심근세포들, 심실사이막, 등에서 11.5 배아 일(embryonic day)에 발현되었다는 것을 보여하였다. 비록 α4 인테그린의 발현이 VCAM-1의 그것들로 유사한 영역들에서 인식되었음에도 불구하고, α4 인테그린은 심실사이막에서 발현되지 않았다는 것이 또한 보고되었다. (비특허문헌 6). 게다가 배아 일 11.5에, VCAM-1에 결함이 있는 배(embryo)에서 심실사이막 및 심실 심근의 빽빽한 층들에서의 감소 때문에 기형(deformity) 및 태반(placenta)의 형성의 억제를 야기하는 배아 사망이 있다는 것이 보고되었다. Yang, et al.은 또한 배아 일 11.5 의 α4 인테그린 무존재(null) 배아에서 외심막 결함을 보고하였다 (비특허문헌 7). 따라서, VCAM-1 및 α4 인테그린이 주로 배아기에 외심막 및 심장 세포들의 형성에 공헌하는 것으로 생각된다.

비특허 문헌 1: Shimizu T, et al., Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique and 온도-반응성 cell culture surfaces. Circulation research. 2002;90:e40 비특허 문헌 2: Sekiya S, et al., Bioengineered 심장 세포 sheet grafts have intrinsic angiogenic potential. Biochemical and biophysical research communications. 2006;341:573-582 비특허 문헌 3: Shimizu T, et al., Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials. 2003;24:2309-2316 비특허 문헌 4: Matsuura K, et al., Hagiwara N, Zandstra PW, Okano T. Creation of 마우스 embryonic stem cell-derived 심장 세포 sheets. Biomaterials. 2011;32:7355-7362 비특허 문헌 5: Deschamps AM, et al., Disruptions and detours in the myocardial matrix highway and heart failure. Current heart failure reports. 2005;2:10-17 비특허 문헌 6: Kwee L, et al., Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (vcam-1) deficient 마우스들. Development (Cambridge, England). 1995;121:489-503 비특허 문헌 7: Yang JT, et al., Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development (Cambridge, England). 1995;121:549-560

본 발명의 목적은 심장 세포들에 특이적으로 작용하는 심장 세포 배양 재료을 제공하는 것, 그리고 벽 표면 및/또는 바닥 표면을 갖는 배양 기판의 벽 표면 및/또는 바닥 표면이 심장 세포 배양 재료로 코팅되는 세포 배양 기판을 제공하는 것이다. 게다가, 본 발명의 또다른 목적은 심장 세포 배양 재료을 이용하여 심장 세포를 배양함으로써 수득되는 인공 장기 재료, 및 그것을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

심장 세포 배양에서, 기능적 심장 조직이 VCAM-1 단백질을 포함하는 심장 세포 배양 재료를 이용함으로써 잘 구축된다는 것이 명확하져 왔다. 그러므로, 심장 세포 배양 재료는 벽 표면 및/또는 바닥 표면을 갖는 배양 기판의 벽 표면 및/또는 바닥 표면에 코팅되고, 세포 배양 기판으로서 이용될 수 있다. 심장 세포 배양 재료를 이용하여 배양된 심장 세포는 인공 장기 재료로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명은 하기를 포함한다.

[1] VCAM-1 단백질을 포함하는 심장 세포 배양 재료.

[2] 이때 VCAM-1 단백질은 동물 재료, VCAM-1 재조합 단백질, 또는 VCAM-1 단백질을 발현시키는 세포로부터 분리되고 정제된 VCAM-1인, [1]에 따른 심장 세포 배양 재료.

[3] 심장 조직을 건설하기 위하여 배양하는데 사용되는 [1] 또는 [2]에 따른 심장 배양 재료.

[4] 이 때, VCAM-1 단백질을 발현시키는 세포는 VCAM-1 단백질을 발현시키는 섬유아세포인, [2] 또는 [3]에 따른 심장 세포 배양 재료.

[5] 이 때, 섬유아세포는 심장-유래 섬유아세포인 [4]에 따른 심장 세포 배양 재료.

[6] 이 때 섬유아세포는 심외막-유래 섬유아세포인, [4] 또는 [5]에 따른 심장 세포 배양 재료.

[7] 이 때, 벽 표면 및/또는 바닥 표면을 갖는 배양 기판의 벽 표면 및/또는 a 바닥 표면이 [1]-[6]에 따른 심장 세포 배양 재료로 코팅되는, 세포 배양 기판.

[8] [1]-[6]에 따른 심장 세포 배양 재료로 심장 세포를 공(co)-배양함으로써 수득되는 인공 장기 재료.

[9] [1]-[6]에 따른 심장 세포 배양 재료로 심장 세포을 공-배양하는 단계를 포함하는 인공 장기 재료를 생산하는 방법.

[10] 항-VCAM-1 항체를 포함하는 심장 세포 배양 재료를 스크리닝하기 위한 시약.

[11] VCAM-1 단백질을 발현시키는 심장-유래 섬유아세포.

[12] 배양 기판으로부터 배양된 세포를 분리(separating) 및 수집하는 단계를 더 포함하는, [9]에 따른 인공 장기 재료를 생산하는 방법.

[13] 이 때, 배양 기판은 반응성(responsive) 배양 접시이고, 그리고 이때 분리는 온도 변화에 의하여ㅏ 수행되는, [12]에 따른 인공 장기 재료를 생산하는 방법.

재생 의학 및 조직 모델에서 사용될 수 있는 기능적 심장 세포는 본 발명의 심장 세포 배양 재료를 이용하여 심장 세포를 배양함으로써 구축(construct)될 수 있다. 심장 세포 배양 재료는, 세포 배양 기판으로 이용될 수 있는, 벽 표면 및/또는 바닥 표면을 갖는 배양 기판의 벽 표면 및/또는 바닥 표면 상에 코팅될 수 있다. 나아가, 배양에 의하여 수득되는 심장 조직 또는 심장 세포는 인공 장기 재료로 이용될 수 있다.

[도 1] NCF, ACF 및 ADF의 미세 관찰 (사진들). (A) 각 섬유아세포의 명시야(bright field) 현미경(microscope) 이미지들. (B-E) DDR2, 비멘틴(vimentin) 및 αSMA 발현의 대표 도들(대부분의 섬유아세포들은 칼포닌(calponin), 사이토케라틴(cytokeratin) 11 또는 NG 2을 발현시키지 않고 있었다).
[도 2] 섬유아세포들과 공-배양된 mESC 유래 심장 세포 시트들의 특성들에서의 차이들 (사진들). (A) 분리되기 전, 독자적으로 박동하고 있는 많은 세포 덩어리들이 NCF 및 ACF 공-배양 시트 상에서 관찰되었다. 온도의 감소 후, 세포 시트 형성은 mESC 유래 심근세포들 및 섬유아세포들 (-)에서 관찰되지 않았다. (B) 세포 시트들의 각각 상 세포외 활동 전위들. ACF 또는 NCF 공-배양 시트에서 활동 전위들은 각 채널에서 관찰되었다. 활동 전위들은 ADF 공-배양 시트 상 단 한 번의 근거(basis) 상에 발생한다(둘러싸는 선들은 세포 시트들의 형태를 가리킨다). (C) 공초점 현미경에 의하여 관찰되는 세포 배양 접시들의 각각에 면역형광 염색. YFP는 녹색(노랑) 형광을 방출하였다 (YFP: 여기 파장 514 nm, 형광 파장 527 nm), 그리고 비멘틴(vimentin)은 붉은 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트(hoechst) 33258 (파랑)으로 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). 공초점 현미경 관찰은, NCF 또는 ACF과 공-배양된 세포들이, 섬유아세포들 (-) 또는 ADF와 공-배양된 세포들에 비하여, 많은 수의 YFP (+) 세포들을 갖는다는 것을 제안하였다. (D) 공초점 현미경에 의하여 관찰된 세포 배양 접시들 각각에서의 면역형광 염색. cTnT는 녹색 형광을 방출하였고 (FITC: 여기 파장 488 nm, 형광 파장 530 nm), 비멘틴은 빨간 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). 공초점 현미경 관찰은 NCF 또는 ACF과 공-배양된 세포들은, 섬유아세포들 (-) 또는 ADF와 공-배양된 세포들과 비교하여, 많은 수의 cTnT (+) 세포들을 갖는다. (E) 막대는 세포 배양 접시들 각각에서 YFP (+) 세포들 또는 cTnT (+) 세포들의 수의 증가를 보여준다. 섬유아세포들 (-)에서 YFP (+) 세포들 또는 of cTnT (+) 세포들의 수들은 1로 셋팅되었다. 더 많은 수의 YFP (+) 세포들 및 cTnT (+) 세포들이, ADF 공-배양 또는 섬유아세포들 (-)의 배양 접시에서의 그것과 비교하여, NCF 또는 ACF 배양 접시에서 관찰되었다. 게다가, NCF 및 ACF 사이의 심근세포들의 수에 유의한 관계가 없다. (N = 3, ** P < 0.01)
[도 3] 각각의 세포 배양 접시들에서 세포 배양 시작으로부터 1일 및 5일에 심근세포들의 수 (사진들). (A) 공초점 현미경에 사용된 각 세포 배양 접시들의 배양 시작으로부터 1일의 면역형광 염색. YFP은 녹색(노랑) 형광을 방출하였고 (YFP: 여기 파장 514 nm, 형광 파장 527 nm), 그리고 cTnT는 빨강 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). (B) 공초점 현미경에 의하여 관찰된 각 세포 배양 접시들의 배양 시작으로부터 5일에서의 면역형광 염색. YFP는 녹색(노랑) 형광을 방출하였고 (YFP: 여기 파장 514 nm, 형광 파장 527 nm), 그리고 cTnT는 빨강 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). (c) 각 세포 배양 접시들에서 심근세포들의 수. 막대 그래프들은 YFP (+) 세포들 and of cTnT (+) 세포들의 수의 증가를 보여준다 (섬유아세포들 (-)에서 1일의 값들은 1로 셋팅되었다). ACF 및 NCF 배양 접시들에서, 더 많은 수의 심근세포들이 1일의 것들에 비하여 배양 시작으로부터 5일에 관찰되었다. 그러나, 다른 배양 접시들에서, 1일 및 5일 사이에 심근세포들의 수에는 차이가 없었다. ACF 및 NCF 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. (N =3, ** P < 0.01)
[도 4] 면역형광 염색에 의한 심근세포들에서 증식의 평가 (사진들). (A) 공초점 현미경을 이용하여 각 공-배양 접시들에서 Ki67 양성 심근세포들의 면역형광 염색 관찰. cTnT는 녹색 형광을 방출하였고 (FITC: 여기 파장 488 nm, 형광 파장 530 nm), 그리고 Ki67는 빨강 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). (B) 각 배양 접시들에서 Ki67 (+) 또는 인산화된 히스톤(histone) 3 (인광물질(phosphor) S10; Phh3) (+) 심근세포들의 퍼센트 (N = 4, ** P < 0.01). (C) 공초점 현미경을 이용하여 각 배양 접시들에서 인산화된 히스톤 3 (인광물질 S10; Phh3) 양성 심근세포들의 면역형광 염색 관찰. cTnT는 녹색 형광을 방출하였고 (FITC: 여기 파장 488 nm, 형광 파장 530 nm), 그리고 인산화된 히스톤 3 (인광물질 S10; Phh3)는 빨강 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). (D) 각 배양 접시들에서 인산화된 히스톤 3 (인광물질 S10; Phh3) (+) 심근세포들의 퍼센트 (N = 4, ** P < 0.01). (E) (F) 각 배양 접시들에서 심근세포들의 BrdU FACS 분석 (N = 3, ** P < 0.01). (G) 공초점 현미경을 이용하여 삽입 배양 접시들에서 배양 시작으로부터 1일 및 5일에 YFP (+) 및 cTnT (+)의 면역형광 염색 관찰. YFP는 녹색 (노랑) 형광을 방출하였고 (YFP: 여기 파장 514 nm, 형광 파장 527 nm), 그리고 cTnT는 빨강 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). (H) 막대 그래프들은 1일 및 5일에 YFP (+) 세포들 및 cTnT (+) 세포들의 수의 증가를 보여준다. 1일에 YFP (+) 세포들 및 cTnT (+) 세포들의 수들은 1로 셋팅되었다. 심근세포들의 증식은 5일에 관찰되었다 (N = 4, ** P < 0.01).

[도 5] (A) ADF 및 NCF의 포괄적 유전자 클러스터 분석 (사진). 유전자 히트(heat) 지도는 ADF 및 NCF 사이의 놀라운 차이를 보여준다. 이 지도는 두 개의 그룹으로 나누어졌다. 첫 번째 그룹은 ADF만으로 구성되어 있고, 두 번째 그룹은 NCF만으로 구성되어 있다. (B) VCAM-1 유전자 발현 레벨은 실시간 PCR에 의하여 시험되었다. VCAM-1 발현 레벨은 NCF에서 유의하게 높았다. NCF에서 VCAM-1 유전자들의 수는 ADF에서의 것보다 16 배 더 높았다 (N = 3, * P < 0.05). (C-D) 웨스턴 블롯 분석에서 NCF and ADF에서 VCAM-1 단백질의 발현 레벨. 하기 일시적 과발현 세포 용해물은 양성 대조군으로 사용되었다: Sol8 (SantaCruz, CA, USA). 각 세포의 β-액틴의 표지 피크는 1로 셋팅되었다 (N = 3, ** P < 0.01). (E) mESC 유래된 심근세포들 상 VCAM-1 수용체 (α4β1)의 면역형광 염색. (F) mESC 유래된 심근세포들 상 VCAM-1 수용체의 웨스턴 블롯 분석. 하기의 일시적 과발현 세포 용해물이 양성 대조군으로서 사용되었다: Jurkat 전체(whole) 세포 용해물.
[도 6] 면역형광 염색 분석에 의한 심장 성장 인자의 확인 (사진들). (A-B) 5일에 심근세포들 상 항체들을 중성화시키는 효과의 면역형광 염색 관찰. YFP은 녹색 (노랑) 형광을 방출하였고 (YFP: 여기 파장 514 nm, 형광 파장 527 nm), 그리고 cTnT는 빨강 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). NCF 및 심근세포들이 항체를 중화시키는 VCAM-1을 이용하여 공-배양될 때, 심근세포들의 수는 5일에 감소되었다. 한편, 동기준 표본(isotype) 대조군이 사용되었을 대, 5일에 심근세포들의 수에는 영향이 없었다 (N = 3, ** P < 0.01). (C-D) 5일에 심근세포들에 대한 VCAM-1 가용성(soluble) 단백질의 면역형광 염색 관찰. YFP는 녹색 (노랑) 형광을 방출하였고 (YFP: 여기 파장 514 nm, 형광 파장 527 nm), 그리고 cTnT는 빨강 형광을 방출하였고 (cy3: 여기 파장 512 nm, 형광 파장 552 nm), 그리고 핵은 회흐스트 33258 (파랑)에서 염색되었다 (회흐스트 33258: 여기 파장 352 nm, 형광 파장 461 nm). 심장근육세포 성장 효과는 VCAM-1 가용성 단백질 (10 μg/mL)과 배양함으로써 얻어졌다. NCF와 공-배양하는 조건들 및 NCF (-)에서 VCAM-1 가용성 단백질과 공-배양하는 조건들 사이의 심근세포들의 수에는 유의한 차이가 없었다 (N = 3, * P < 0.05, ** P < 0.01).
[도 7] 신생아 마우스들로부터 유래된 심장 섬유아세포들의 FACS 분석 결과들. (A-C) 항-VCAM-1 항체와의 염색 결과들이 보여진다. (D) 이차 항체만으로 피부 섬유아세포들을 염색함으로써 음성 대조군의 결과가 보여진다.

예들의 기재

본 발명은 VCAM-1를 포함하는 심장 세포 배양 재료에 대한 것이다. 본 발명에서, "심장 세포 배양 재료"는 심장 세포를 배양할 때 사용되는 임의의 재료일 수 있다. 예를 들어, 그 재료는 페트리 디쉬 및 플라스크 등과 같은, 배양 용기의 배양 기판의 바닥 표면 또는 벽 표면을 코팅하기 위한 재료 등과 배양 배지에 첨가되는 시약을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

VCAM-1 (혈관(vascular) 세포(cell) 부착(adhesion) 분자(molecule)-1)은 혈관 내피 세포 등에서 발현되는 세포 부착 분자로서 알려진 단백질이다. 예를 들어, 인간들의 경우, VCAM-1는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 기탁(accession) 번호 NM_001078 로 기재된 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않고, 또한 선택적(alternative) 스플라이싱(splicing)에 의하여 수득되는 아이소폼(isoform)을 포함한다. 본 발명에서 VCAM-1 단백질은 VCAM-1를 포함하는데, 이는 예를 들어, 세포 표면 상에 VCAM-1 단백질의 아미노산가 결실, 치환 또는 삽입된 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 아미노산들의 하나 또는 수많은 여러가지 돌연변이들, 가용성 VCAM-1를 발현시키는 VCAM-1을 포함한다. 잘 알려진 방법에 의하여 분리 및 정제된 동물 재료에서 VCAM-1 단백질이 본 발명의 VCAM-1으로서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 재조합 단백질이 또한 이용될 수 있다.

게다가, VCAM-1을 발현시키는 세포는 본 발명의 VCAM-1으로서 사용될 수 있다. VCAM-1을 발현시키는 세포를 스크리닝하기 위하여, 공개적으로 알려진 세포 분류(sorting) 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 분류 방법은 항-VCAM-1 항체, 자성 비드 방법, 친화성(affinity) 칼럼 방법 및 패닝(panning) 방법 을 이용하여 유동 세포 분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

항-VCAM-1 항체들는 특별히 제한되지 않는다. 상업적으로 이용가능한 항-VCAM-1 항체들이 이용될 수 있고, 항원으로서 VCAM-1을 이용하여 알려진 방법에 의하여 생산되는 제품이 또한 사용될 수 있다. 게다가, VCAM-1를 발현시키는 세포들이 스크리닝되는 한, 단일클론 항체 또는 다클론성 항체이 사용될 수 있다; 그러나, 특이성의 관점에서 보면 단일클론 항체를 이용하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 심장 세포 배양 재료들을 스크리닝하는 방법들은 세포들을 준비하는 단계, VCAM-1 항체를 이용하여 세포들로 세포 분류를 수행하는 단계, 및 세포 분류 결과로서 VCAM-1을 발현시키는 것으로 판단된 세포들만을 수집하는 단계를 포함한다.

VCAM-1를 발현시키는 세포로서, 그 타입들은 VCAM-1가 발현되는 한 제한되지 않는다. 그러나, 섬유아세포들을 이용하는 것이 선호된다. 섬유아세포들은 결국 섬유아세포들 또는 근섬유아세포들(myofibroblasts)이 될 모든 세포들을 포함한다. 즉 본 발명의 섬유아세포들의 범위는 분화 또는 성숙 단계 중간에 있고, 그 세포들이 결국 섬유아세포들 또는 근섬유아세포들이 될 때까지 그 때 섬유아세포들 또는 근섬유아세포들로 확인될 수 없는 세포들을 포함한다.

섬유아세포들의 유래는 제한되지 않는다. ES 세포들, iPS 세포들 및 뮤즈(muse) 세포들과 같은 다능성(Pluripotent) 줄기 세포들, 및 중간엽(mesenchymal) 줄기 세포들과 같은 줄기 세포들이 분화되고 이용될 수 있고, 동물들로부터 취해진 일차(primary) 세포들이 사용될 수 이TRh, 확립된 세포들이 사용될 수 있다. 그러나, 심장-유래 섬유아세포들이 바람직하게 이용되며, 그 중에서도, 외심막-유래 섬유아세포들이 사용하기에 특히 선호된다. 확립된 세포들이 사용되는 경우, 세포 분류의 공정은 VCAM-1을 발현시키는 것으로 알려진 세포들을 선택함으로써 생략될 수 있다. 섬유아세포들이 유래되는 동물들은 공-배양될 세포들이 유래되는 동물들에 따라 적당하게 선택될 수 있다. 동물들은, 예를 들어 인간들; 마우스들, 래트들, 기니피그들, 햄스터들, 돼지들, 원숭이들 및 토끼들과 같은 실험 동물들; 개들, 고양이들 및 새들과 같은 애완 동물들; 및 소, 말, 양 및 염소들과 같은 가축들을 포함한다. 섬유아세포들이 동물들로부터 취해지는 경우, 섬유아세포들은 태아, 신생아, 아기, 성체와 같은 임의의 시기의 동물의 것일 수 있고, 제한은 없다.

본 발명의 심장 세포 배양 재료는 생리식염수, 세포 배양 용액 또는 VCAM-1 단백질을 발현시키는 VCAM-1 단백질 또는 세포들의 유지 또는 보존을 위한 세포 보존 용액 등을 포함하는 조성물일 수 있다. 그 내용물들이 VCAM-1의 기능을 손상시키지 않는 한 조성물내 포함되는 내용물들에는 제한이 없다. 게다가 본 발명의 심장 세포 배양 재료의 상태는 액체, 겔-유사, 동결 또는 동결-건조일 수 있고, 그것의 상태는 제한되지 않는다.

나아가, 심장 세포 배양 재료는 VCAM-1 단백질의 존재 또는 부존재에 상관없이 섬유아세포들을 포함할 수 있다. 섬유아세포들은 결국 섬유아세포들 또는 근섬유아세포들이 될 모든 세포들을 포함한다. 즉, 그 당시에 섬유아세포들 또는 근섬유아세포들 로 확인될 수 없고, 분화 또는 성숙 중인 세포들이라도, 만약 그 세포들이 결국 섬유아세포들 또는 근섬유아세포들이 되는 것들이라면, 세포들은 제한없이 사용될 수 있다. 그 중 CD31 (혈관 내피 세포 마커)를 발현시키는 섬유아세포들이 선호된다. VCAM-1 단백질을 발현시키는 섬유아세포들이 VCAM-1 단백질로서 사용될 때, 세포들(세포 수)을 발현시키는 VCAM-1 단백질 : CD31을 발현시키는 세포들(세포 수)의 비율은 바람직하게는 바람직하게는 5:5-9:1, 더욱 바람직하게는 5:5-8.2, 그리고 더욱 더 바람직하게는 6:4-8.2이다.

본 발명의 한 측면은 상기-기재된 심장 세포 배양 재료로 심장 세포를 배양함으로써 수득되는 인공 장기 재료, 또는 그것을 생산하는 방법에 대한 것이다. 즉, 본 발명의 심장 세포 배양 재료는 심장 세포를 배양함으로써 재생 의학 및 조직 모델에서 사용될 수 있는 기능적 심장 조직을 구축할 수 있다. 심장 조직은 인공 장기 재료로서 사용될 수 있다. 인공 장기 재료는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 그것은 시트의 형태로 심장과 같은 장기들의 손상된 부분에 부착될 수 있다. 인공 장기 재료는 또한, 그것이 어느 정도까지 두께를 갖는, 스캐폴드를 이용함으로써 집괴되거나 적층된 후 장기의 결함 부위에 이식될 수 있다. 스캐폴드의 재료는 수산화인회석, 아텔로콜라겐(atelocollagen) 및 겔을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가 인공 장기 재료는 특정 형태로 그것을 만들지 않고, 배양 세포의 형태이기 때문에, 세포 이식, 학술 연구 등에 사용될 수 있다. 게다가 인공 장기는 3D 프린터를 이용하여 인공 장기 재료로부터 생산될 수 있다. 생산된 인공 장기는 이식을 위해서 사용될 뿐 아니라, 안전성 약리 시험 및 전임상 연구 등에도 널리 사용될 수 있다.

본 발명에서, "심장 조직을 구축"하는 것은 심장 세포들의 분할을 촉진하는 것과 같은 심장 기능들 중 적어도 하나를 갖는 조직을 구축하는 것, 및 재생 의학 및 조직 모델에 사용될 수 있는 전체 조직 전체에 균일한 박동(beating)을 제공하는 것을 의미한다. 심장 기능들은 자율적으로 박동하는 능력, 수축 및 이완 능력, 흥분파 전도 능력 및 호르몬 분비 능력 등과 같은 모든 심장 기능들을 포함한다. 심장 기능들은 심장만이 갖는 기능들에 제한되지 않는다. 예를 들어, 근육 세포 또한 수축 및 이완 능력을 갖는다. 그러나 다른 세포들이 동등한 기능을 갖는다 하더라도, 그것은 본 발명의 심장 기능들의 정의에 영향을 미치지 않는다. 나아가, 심장 기능들의 측면에서, 그것들이 심장 조직의 사용 목적에 적합한 한, 기능들의 높음 및 낮음에는 제한이 없다. 예를 들어, 인공 심장의 생산 목적을 위하여, 그것은 그것이 혈액을 신체 밖으로 쏟아낼 수 있는 정도로 정도까지 수축 및 이완 능력을 가질 것이 요구되나; 그러나 인 비트로에서 수축 및 이완 능력의 학술 연구 등의 목적을 위하여는, 수축 및 이완 능력이 몇몇 수단에 의하여 검출된다면 그것은 만족된다.

인공 장기 재료, 또는 본 발명의 그것을 생산하기 위한 방법에서, 사용되는 심장 세포들은 심근세포들, 평활근 세포들, 심박조율(pacemaker) 세포들 및 혈관 내피 세포들과 같은 심장을 구축하는 모든 세포들을 포함한다. 심장 세포들의 유래는 인공 장기 재료로서 이용 목적에 따라 적당하게 정할 수 있다. 예를 들어, 인간들로의 이식 목적을 위하여, 인간-유래 심장 세포들이 이용될 수 있고, 마우스 실험에서 조직 모델을 구축하는 목적을 위하여, 마우스-유래 심장 세포들이 이용될 수 있다. 게다가, 태아, 신생아, 소아 및 성체의 임의의 기간의 심장 세포가 사용될 수 있고, 기간에 제한은 없다. 본 발명의 심장 세포는 ES 세포들, iPS 세포들, 및 뮤즈 세포들과 같은 다능성 줄기 세포들, 및 중간엽 줄기 세포들과 같은 성체 줄기 세포들로붜ㅌ 생산되는 것이 바람직하다.

본 발명의 "배양"은 공개적으로 알려진 세포 배양 방법에 의하여 수행될 수 있고, 심장 세포 배양 재료 및 심장 세포가 배양 용기에 존재하거나, 또는 동일한 배양 배지에 담그어 지는 한, 배양 조건에는 제한이 없다. 심장 세포 배양 재료가 VCAM-1 단백질을 발현시키는 세포들인 경우에, VCAM-1을 발현시키는 세포들 (세포 수)의 심장 세포들에 대한 혼합 퍼센트는 바람직하게는 3-20%, 더욱 바람직하게는 6-18% 그리고 가장 바람직하게는 9-16%이다.

본 발명에서, 배양을 위하여 사용되는 배양액은 배양되는 세포의 종류에 따라 적당히 정할 수 있다. 예를 들어, DMEM, α-MEM, RPMI-1640 등이 사용될 수 있다. FCS 및 FBS와 같은 영양 물질들 및 항생제들이 배양액에 첨가될 수 있다. 배양 기간과 관련하여, 희망했던 세포 수 및/또는 기능이 수득될 때까지의 일(days) 수는 적당하게 정할 수 있다. 예를 들어, 기간은 1 일(day), 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 1 달, 2 달, 3 달, 4 달, 5 달, 및 6 달을 포함한다. 배양 온도는 배양되는 세포들의 종류에 따라 적당히 정해질 수 있다. 예를 들어, 온도는 10-60 ℃, 바람직하게는 20-50 ℃, 그리고 더욱 바람직하게는 30-40 ℃일 수 있다.

본 발명의 생산 방법은 배양된 세포들을 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. "배양된 세포들"은 섬유아세포들 및 심장 세포들 둘다를 포함할 수 있고, 그리고 심장 세포들만을 포함할 수도 있다. 세포를 수집하는 단계에 대하여, 세포는 트립신과 같은 프로테아제들을 이용하여 분리 및 수집될 수 있다. 그러나 세포외 기질 등을 보유하는 동안 세포를 분리시킬 수 있는 온도 반응성 배양 접시을 이용하여 온도 변화에 의하여 분리 및 수집되는 것이 선호된다.

예들

본 발명은 하기 예들을 참조하여 상세하게 하기에서 더 기술된다; 그러나 본 발명은 그 예들에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.

[실시예 1]

재료들 및 방법들

<동물들 및 시약들>

야생형 C57BL/6 마우스들이 일본 SLC (Shizuoka, Japan)으로부터 구입되었다. B6 Cg-Tg (CAG-DsRed*MST) 1Nagy/J 마우스들은 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 구입되었다. 모든 실험 프로토콜들은 동경여자대학교의 Institutional Animal Care and Use Committee에 의하여 승인되었다. 하기 항체들이 면역 세포화학, 웨스턴 블롯 및 유동세포분석 (FACS): 토끼 다클론 항-디스코이딘도마인(discoidindomein) 수용체 티로신 키나아제 2 (DDR2) (GeneTex, Irvine, CA); 기니피그 단일클론 항-비멘틴(vimentin) (Progen, Heidelberg, 독일); 마우스 단일클론 항-NG2 (Millipore, Temecula, CA); 토끼 다클론 항-알파 평활근 액틴(actin) (Abcam, Cambridge, UK); 마우스 단일클론 항-심장(cardiac) 트로포닌(troponin) T (cTnT) (Thermo Scientific, Rockford, IL); 마우스 단일클론 항-사이토케라틴(cytokeratin)11 (EXBIO, NadSafinou, CZ); 토끼 다클론 항-Ki67 (Abcam, Cambridge, UK); 토끼 다클론 항-히스톤(Histon) H3 (phosphor S10) (Abcam, Cambridge, UK); 래트 단일클론 항-인테그린(integrin) α4/β1 (Abcam, Cambridge, UK); 재조합 마우스 VCAM-1/CD106 Fc 키메라(chimera) (R&D systems, Minneapolis, MN)에 사용되었다. 다르게 특정되지 않는 한, 모든 시약들은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 이차 항체들은 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA)에서 구입하였다.

<마우스 ES 세포 배양들>

α-마이오신(myosin) 중쇄 프로모터의 통제 하 네오마이신(neomycin) 포스포트랜스페라제(phosphotransferase)를 발현시키는 mESC의 유지 및 심근세포 분화 및 정제는 이전 보고서에 기재되어 있다 (Matsuura K, et al.. Biomaterials. 2011;32:7355-7362).

간략하게, 심장 유도 및 심근세포 정제, 트립신화된(trypsinized) ES 세포들이 스피너(spinner) 플라스크들 (Integra Biosciences, Zizers, Switzerland) 내로 5 × 104 세포들/mL (총, 125 mL/플라스크)로 시딩(seed)되었고 10 일 동안 10% FBS로 보충된 DMEM에서 배양되었고, 그 다음 이들 분화된 세포들이 추가로 8일 동안 네오마이신으로 처리되었다.

<섬유아세포 분리들>

섬유아세포들은 야생형 C57BL/6 마우스들 (Neonatal, 1 일; 성체, 10-12 주령)에서 수득되었다.

신생아(neonatal) 심장 섬유아세포들 (NCFs)이 예전 보고서에 기재된 대로 신생아 마우스들 (생후 1일)의 심장들로부터 수득되었다 (Matsuura K, et al,. Biomaterials. 2011; 32: 7355-7362). 3회 계대된(passage) NCF들이 실험들을 위하여 사용되었다.

성체 심장 섬유아세포들 (ACFs)이 하기와 같이 외식편(explant) 배양 방법을 이용하여 성체 마우스들 (10-12 주)의 심장들로부터 수득되었다. 첫 번째 심장들은 PBS(-)로 세척되었고 약 5 mm2 종들로 절단되었다. 이들 종들은 살균된 커버 글래스들로 덮였고, 10 cm 배양 접시들 상에서 10% FBS로 보충된 DMEM로 배양되었다. 배양 시작 2 주 후, 세포들은 0.25% 트립신/EDTA로 분리되었고 다른 10cm 접시들로 계대배양되었다(subculture). 3회 계대(passage) 후 ACF들은 실험에서 사용되었다.

성체 피부(dermal) 섬유아세포들 (ADFs)은 성체 마우스들 (10-12 주령)의 등 피부 조직으로부터 수득되었다. 첫 번째 수확된 피부 조직들은 4 ℃에서 하룻밤 Dispase I [1000 U/mL]　(Eidea inc.)로 처리되었다. 그 다음에, 조직들은 약 1mm2 종들로 절단되었다. 이들 종들은 살균된 커버 글래스들로 덮여졌고 10 cm 배양 접시들 상에서 10% FBS로 보충된 DMEM과 배양되었다. 배양 시작 2 주 후, 세포들은 0.25% Trypsin/EDTA로 분리되었고 또다른 10cm 접시들로 계대배양되었다. 3회 계대로부터의 ADF들이 실험들을 위하여 사용되었다.

몇몇 실험들에서, NCF들 및 ADF들이 전술한 것과 동일한 방법으로 B6.Cg-Tg (CAG-DsRed*MST) 1Nagy/J 마우스들 (신생아: 1 일, 성체: 10 주)로부터 분리되었다.

세포들을 시딩(seed)하기 전, 온도-반응성 배양 접시들 (UpCell; CellSeed inc.)이 2 시간(h) 동안 FBS으로 코팅되었다. 10% FBS로 보충된 DMEM (3.2 x105 세포들/cm²)로 mESC-유래 심근세포들이 각각의 타입의 섬유아세포들과 8:2의 비율로 공-배양되었다. 배양 5 일 후, 세포들은 세포 시트들을 떼기 위하여 20℃에서 배양되었다. 샘플들의 명시 야상들이 Nikon ECLIPSE Ti (Nikon, Tokyo, Japan)에 의하여 얻어졌다.

<전기생리학적 분석>

심근세포 시트들의 전기적 활성들은 예전 보고서에 기재된 대로 (Matsuura K, et al,. Biomaterials. 2011; 32:7355-7362) 다 전극(multi-electrode) 어레이(MED) 시스템 (Alpha MED Sciences,Osaka, Japan)에 의하여 측정된 세포외 포텐셜들로부터 얻어졌다.

세포들은 예전 보고서에 기재된 대로 (Matsuura K, et al,. Biomaterials. 2011;32:7355-7362) 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정되었고 면역염색되었다. 염색된 샘플들의 이미지들은 ImageXpress Ultra Confocal High Content Screening System (Molecular Devices, CA, USA)에 의하여 얻어졌다. 이미지 분석 데이터는 MetaExpress software (Molecular Devices, CA, USA).에 의하여 얻어졌다.

배양된 세포들 (5×10⁵ 세포들)은 세포 배양 배지에서 최종 농도 10 μM에서 BrdU으로 염색되었다. FACS 분석을 위한 BrdU 염색은 BrdU Flow Kits Instruction Manual (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ)에 기재된 대로 수행되었다. 간단히, 세포들은 고정되었고 BD Cytofix/Cytoperm 버퍼(Buffer)로 투과성으로 되었고, 그 다음에 합쳐진(incorporated) BrdU을 DNase에 노출시켰다. BrdU 염색은 APC-항-BrdU 항체 (BD Pharmingen,　Franklin Lakes, NJ)로 수행되었다. 샘플들은 Gallios (Beckman Coulter, Brea, CA)로 분석되었다. 하기 시약들이 분석에 사용되었다 BD Cytofix/Cytoperm Buffer (BD Pharmingen,　Franklin Lakes, NJ); BD Perm/Wash Buffer (10X) (BD Pharmingen,　Franklin Lakes, NJ); BD Cytoperm Plus Buffer (10X) (BD Pharmingen,　Franklin Lakes, NJ); BrdU (10 mg/mL) (BD Pharmingen,　Franklin Lakes, NJ); DNase (BD Pharmingen,　Franklin Lakes, NJ).

<타임(Time)-랩스(laps) 촬영>

샘플들은 BZ-9000 Fluorescence Microscope (Keyence, Osaka, Japan)으로 37 ℃에서 5% CO₂로 5일 관찰되었다.

총 RNA는 제조업자의 지시에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 이용하여 추출되었다. 총 RNA는 제조업자의 지시에 따라 Qiagen RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 더 정제되었다.

RNA 양과 질은 추천되는 대로, Nanodrop ND-1000 분광 광도계 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) 및 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)을 이용하여 확인되었다.

cRNA 증폭 및 표지를 위하여, 총 RNA가 증폭되고 Agilent Low Input Quick Amp Labeling Kit, one-color (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 Cyanine 3 (Cy3)으로 표지되었다. 간단히, 100 ng의 총 RNA가 폴리 dT-T7 프로모터 프라이머를 이용하여 이중-가닥 cDNA로 역전사되었다. 알려진 농도 및 양의 프라이머, 주형 RNA 및 양-통제 전사체들이 10 분 동안 65 ℃에서 처음 변성되었고 그리고 5X 첫 번째 가닥 Buffer, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP mix, 및 Affinity Script RNase Block Mix로 40 ℃에서 2 시간 동안 배양되었다. AffinityScript 효소는 15 분 동안 70 ℃에서 배양되었다.

cDNA 산물들은 그 다음에 형광성 cRNA를 만들기 위하여 인 비트로에서 주형으로 사용되었다. cDNA 산물들은 Cy3 표지된-CTP 및 T7 RNA 폴리메라제의 존재 하 전사 마스터 믹스와 혼합되었고 그리고 2 시간 동안 40 ℃에서 배양되었다. 표지된 cRNA들은 QIAGEN의 RNeasy 미니(mini) 스핀(spin) 칼럼들(columns)을 이용하여 정제되었고 30 μl의 뉴클레아제-없는 물에 용출되었다. 증폭 및 표지 후, cRNA 양 및 사이닌(cyanine) 혼합(incorporation)이 Nanodrop ND-1000 분광 광도계 및 Agilent Bioanalyzer을 이용하여 확인되었다.

샘플 혼성화를 위하여, 1.65 μg의 Cy3 표지된 cRNA가 단편화되었고, 65 ℃에서 17 시간 동안 Agilent Mouse GE 4x44Kv2 Microarray (Design ID: 026655)로 혼성화되었다. 세척 후, 마이크로어레이들이 Agilent DNA 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 스캔되었다.

마이크로어레이의 데이터 분석을 위하여, 각각의 스캔된 특성의 강도 값들이 백그라운드 제거들을 수행하는 Agilent feature extraction software version 10.7.3.1을 이용하여 정량화되었다.

우리는 에러들이 없는 것들로서(플래그들 존재), 플래그된 것만을 특징들로 사용하였고, 양성이 아니고, 중요하지 않고, 균일하지 않고, 배경 이상이지 않고, 포화되고, 그리고 집단(population) 외에 있는 것들(outliers)(미미하고 없는 플래그들(flags))인 특징들을 배재하였다. 정규화는 Agilent GeneSpring GX version 11.0.2.을 이용하여 수행되었다(칩 당: 75 백분위 수 변화로 표준화; 유전자 당: 모든 샘플들의 중간값으로 정규화). 대조군 프로브들 없이 Agilent Mouse GE 4x44Kv2 Microarray (Design ID: 026655) 상 총 39,429 프로브들이 있다.

변화된 전사체들은 비교 방법을 이용하여 정량화되었다. 우리는 이 연구에서 유전자 발현의 중요한 차이들을 확인하기 위하여 신호 강도에서 ≥ 2-배수(fold) 변화를 적용하였다.

<정량적 실시간 PCR 분석>

상보적 DNA는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied biosystems)로 총 RNA로부터 만들어졌다. PCR-관련 프라이머들로서, VCAM-1 Gene Express Assays (life Technology)이 사용되었다.

각각의 RT-PCR는 iCycler (BIO-RAD)으로 25 ℃에서 10분, 37 ℃에서 120 분, 85 ℃에서 5초를 포함하였다. cDNA 주형 (1 μg)이 각 샘플로부터 사용되었다. TaqMan 프로브 실시간 PCR 연구들이 TaqMan Gene Expression Assays (Applied biosystems)으로 수행되었다. 모든 실험들은 3회 수행되었다. 샘플들은 하기와 같이 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems)으로 40 회 주기로 되었다: 50 ℃에서 2 분 및 95 ℃에서 10 분, 그 후 95 ℃에서 15초의 40 주기 및 60 ℃에서 1 분이 이어졌다. 상대적인 정량화가 내생 대조군으로서 Gap DH 유전자를 이용하여 정량적 실시간 PCR을 위하여 △△CT 방법에 EK라 계산되었다.

[0040] <웨스턴 블롯팅>

NCF들 또는 ADF들은 Laemmli 샘플 버퍼 (BIO-RAD, CA, USA), 프로테아제 억제제 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 및 2-메르캅토에탄올 (Wako Pure Chemical Industries, Japan)에서 용해되었다. 샘플들은 4% 내지 12% Bis-Tris Gels (Life Technologies, MD, United States) 상에서 분리되었고, iBlot 7-Minute Blotting System(Life technologies, MD, United States)으로 iBlot Transfer Stack, nitrocellulose, regular-size (Life technologies, MD, United States)로 전기이동되었고(electrotransfer) 그리고 Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, PA, United States)으로 화학발광(chemiluminescence) 분석이 처리되었다. 밴드 강도는 LAS4000 (Fujifilm, Tokyo, Japan) 및 NIH 이미지 소프트웨어 (version 1.46r)를 이용하여 분석되었다. 하기 세포 일시적 과발현 용해물들이 양성 대조군들을 위하여 사용되었다: Col11a1 (Abcam, CB, UK)을 위하여 K562 (Human erythromyeloblastoid leukemia cell line); Vcam-1을 위하여 Sol8 (SantaCruz, CA, USA); β1/CD29 (Abnova, Taipei, Taiwan)을 위하여 ITGB1 293T; 인테그린 α4β1 (SantaCruz, CA, USA)을 위하여 Jurkat Whole Cell Lysate.

<중화 항체들 분석>

하기 항체들 및 배양 접시들이 항체 분석을 중화하기 위하여 사용되었다: 항-VCAM-1 (LifeSpan Biosciences, Seattle, WA); 염소 IgG 동기준 표본(isotype) 대조군 (LifeSpan Biosciences, Seattle, WA). 24-웰 플레이트들을 위한 Cell Culture Inserts. 0.4 μm pores, Translucent, High Density PET Membrane (BD Pharmingen,Franklin Lakes, NJ).

30 분 동안 10 μg/mL에서 항체들로 전처리한 후, 섬유아세포들이 삽입(insert) 배양 접시들 (2.4 x 10⁵세포들)의 윗층 상에 시딩되었다. mESC-유래 심근세포들이 아래 층에 시딩되었다 (4.8 x 10⁵ 세포들). 10 μg/mL에서 항체를 갖는 배양 배지가 5일까지 매일 변화하였다.

<통계 분석>

모든 데이터들은 평균 ± 표준편차로서 나타내어졌다. 다른 군들 사이의 차이의 유의성은 One-Way ANOVA Analysis에 의하여 결정되었다. 그리고 나서, 두 군 사이의 차이는 Statcel Software를 이용하여 Tukey-Kramer Multiple Comparison Test에 의하여 결정되었다. p value < 0.05이 유의하게 다른 것으로 고려되었다.

실험 결과들

<mESC-유래 심근세포들 및 섬유아세포을 이용한 세포 시트 제작>

처음에 우리는 공-배양 실험들을 위하여 사용할 세포들의 특성을 평가하였다. 위상 차 이미지들은 신생아 심장들, 성체 심장들 및 성체 피부 조직으로부터 분리된 세포들이 섬유아세포-유사 형태를 보였다는 것을 밝혔다 (도 1A 참조). 섬유아세포들에 특이적 항체들이 없기 때문에, 우리는 DDR2 (CD167b), 미멘틴(vimentin) 및 αSM과 같은 섬유아세포들에서 발현되는 것으로 알려진 단백질들의 발현을 평가하는 것을 시도하였다. 도 1B 내지 1E에 보이는 대로, 거의 모든 각각의 타입의 세포들이 DDR2, 비멘틴(vimentin) 및 αSMA을 발현하였으나, Calponin (평활근 세포 마커), Cytokeratin (상피세포 마커) 및 NG2 (혈관주위세포(pericyte) 마커)는 아니었다. 이들 발견들에 기초하여, 우리는 하기 실험들의 섬유아세포들로서 이들 세포들을 이용하였다.

어느 정도 양의 섬유아세포들이 mESC-유래 심근세포들를 이용하여 세포 시트를 제작하는데 필요하고, 심근세포들/섬유아세포들의 최적의 비율이 8:2 (Biomaterials. 2011:32:7355-7362)라는 우리의 예전 발견들에 따라, 우리는 UpCell 온도-반응성 배양 접시들 상에 3 타입들의 섬유아세포들 (ACF들, ADF들 및 NCF들) 및 mESC-유래 심근세포들을 이용하여 심장 세포 시트들을 만드는 것을 시도하였다. 심근세포들이 ACF들 또는 NCF들과 함께 공-배양될 때, 심근세포들을 박동하는 것은 모든 영역에 걸쳐 동일하게 분포되었다. 역으로, 심근세포들이 ADF들과 함께 공-배양될 때 근처의 박동하는 세포들이 합쳐졌다(aggregate). 5 일 배양 후, 배양 조건이 37 ℃에서 20 ℃로 변화했을 때, 단층인 세포 시트들이 섬유아세포들과 모든 조건에서 만들어졌으나, 섬유아세포들이 없는 조건에서는 아니었다(도 2A).

그 다음에 우리는 MED 시스템 (Biomaterials. 2011; 32:7355-7362, Biomaterials. 2006;27:4765-4774)을 이용하여 세포 시트들의 전기생리학적 평가를 시험하였다. 현미경 관찰 (도 2A)과 일치하게, 세포외 활동 전위가 ACF들 및 NCF들과 세포 시트들에서 각 채널에서 관찰되었다 (도 2B). 이들 세포 시트들에서, 전체 시트들이 균일하게 박동한다는 것이 인식되었기 때문에, 전기적 네트워크가 시트들에 제작되어 있으며, 이들 세포 시트들이 전기 전달을 수행할 수 있다는 것이 제안되었다. 한편, ADF들과 공-배양된 세포 시트들에서, 세포외 활동 전위만이 제한된 영역들에서 관찰되었다.

세포 시트들 사이에서 심근세포들 분포의 차이를 확인하기 위하여, 공초점(cofocal) 현미경 분석이 수행되었다. 도 2C 내지 2E에 나타난 바와 같이, ACF들 및 NCF들과 함께 세포 시트들에서 YFP(+) 세포들 및 심장 트로포닌(troponin) T (cTnT) (+) 세포들의 수는 mESC-derived 세포들을 나타낸다. ADF들과 세포 시트들에서 심근세포들의 수는 섬유아세포들 없는 조건에서 그것에 필적하였다. 게다가 ACF들 및 NCF들과 공-배양되는 세포 시트들 사이에서는 심근세포들의 수에 유의한 상관관계가 없다. 이들 발견들은 모든 종류의 섬유아세포들이 세포 시트를 제작하는데 유용하였으나, 심장들 유래 섬유아세포들이 더욱 기능적인 심장 세포 시트들을 제작하는데 더 나을 수 있다는 것을 제안한다.

<세포 시트들 상 심장 근육 세포 증식>

심장-유래 섬유아세포들 및 피부 조직-유래 섬유아세포들과 공-배양된 세포 시트들 사이의 심근세포들의 다른 수의 원인을 조사하기 위하여, 심근세포들의 수가 공-배양 1일 및 5일에 시험되었다 (도 3A 내지 C). 1일에, 심근세포들의 수는 조건들 사이에서 동일하였는데, 이는 각 타입의 섬유아세포들이 시딩 후 심근세포들의 초기 부착에 영향을 미치지 않는다는 것을 제안한다. ACF들 및 NCF들과의 공-배양에서, 5일에 YFP (+) and cTnT (+) 심근세포들의 수는 1일에서 그것보다 유의하게 더 높았다. 반면, ADF들과의 공-배양에서 또는 심근세포들 단일배양 조건에서, 5일에 심근세포들의 수는 1일의 것과 유사하였다. DsRed 마우스들로부터 분리된 섬유아세포들 및 YFP(+) 심근세포들을 이용한 저속 촬영 이미지 분석은 심근세포들이 이동하였고, 증식하였고, 그리고 NCF들과의 공-배양에서 상호간 네트워크 형성을 구축하였다는 것을 보여주었다. ADF들과의 공-배양에서 역으로, 심근세포들은 덜 증식을 보여주었으며, 네트워크 형성을 구축하지 않았다. 이들 발견들은 그러나 피부 조직으로부터의 섬유아세포들은 아닌, 심장으로부터의 섬유아세포들이 공-배양 조건에서 mESC-유래 심근세포들의 증식을 유도할 수 있다는 것을 제안한다.

조건들 사이에서 심근세포들의 증식은 면역 세포화학적 분석에 의하여 확인되었다. 도 4A 내지 D에 보여진 대로, NCF들과의 공-배양에서 Ki67(+) 세포들 및 포스포(phospho) 히스톤(histone) H3 (PHH3) (+) 심장근육세포들의 퍼센트가 ADF들과의 공-배양에서 그리고 심근세포들 단일배양 조건에서의 그것들보다 유의하게 더 높았다. 게다가 BrdU 혼합(incorporation) 분석은 또한 심근세포들 단일배양 조건에서 및 ADF들과의 공-배양에서의 그것과 비교하여 NCF들과의 공-배양에서 증식성 심근세포들의 퍼센트의 중요한 증가를 보여주었다 (도 4E 및 F). 이들 발견들은 심장-유래 섬유아세포들은 심근세포들의 증식을 유도한다는 것을 강하게 제안한다.

NCF들과 공-배양에서 심근세포들의 증식 상에 근본적인 메커니즘들을 조사하기 위하여, mESC-유래 심근세포들 및 NCF들이 세포 배양 삽입들을 이용하여 배양되었다. 이 실험에서, NCF들이 윗쪽 층 상에서 배양되었고 그리고 심근세포들이 아래쪽 층 상에서 배양되었다. 5 일에 심근세포들의 수는 NCF들의 존재 하 1일에서의 것보다 현저히 더 높았다 (도 4G). 그러나 1일 및 5일 사이에 세포 배양 삽입 실험들에서 심근세포 수의 증가의 정도는 (~1.8 배) (도 4H) 공-배양 조건에서의 것(~2.5 배)보다 더 낮았다. 이들 발견들은 심장 섬유아세포들과 심근세포들 사이의 세포-세포 상호작용 및 NCF들로부터 분리된 가용성 인자들인 심근세포 증식을 촉진할 수 있다는 것을 가리킨다.

<NCF들 및 ADF들의 포괄적 유전 분석>

이들 효과들에 관여하는데 원인이 되는 인자들을 확인하기 위하여, 우리는 마이크로어레이 분석을 이용하여 NCF들 및 ADF들 사이의 포괄적 유전 분석을 수행하였다. 도 5A에서 보인 바와 같이, 유전자 발현에서 많은 차이들이 NCF들 및 ADF들 사이에서 관찰되었다. 500 개가 넘는 유전자들이 ADF들에 비하여 10배보다 많이 NCF들에서 향상된 발현을 보였다. 목록들로부터 심혈관-관련 유전자들을 선택한 후, 20개 유전자들이 남겨졌다. 게다가 우리가 또한 가용성 인자 및 부착성 인자로서 작용하고, 넉아웃 마우스 모델에서 심장을 만들기 위하여 장애를 야기하는 미발달(embryonic) 치사(lethal) 표현형을오 보고된 유전자들을 선택하였을 때, Vcam-1이 남겨졌다. ADF들에 비하여 NCF들에서 Vcam-1의 향상된 발현이 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석에 의하여 확인되었다 (도 5B 내지 D).

<심장 섬유아세포들과의 공-배양에서 VCAM-1-의존적 심근세포 증식>

인테그린 α4β1이 VCAM-1의 주요한 공동(co)-수용체로 알려져 있기 때문에, 우리는 mESC-유래 심근세포들에서 인테그린 α4β1 발현을 시험하였다. 도 5E 및 F에 보여진 바와 같이 거의 모든 mESC-유래 심근세포들이 인테그린 α4β1의 생성을 보였다.

그 다음, 우리는 항체들을 중화시키는 것을 이용하여 VCAM-1가 심장 섬유아세포들-매개 심근세포 증식에 기여하는지 여부를 설명하였다. 항-VCAM-1 항체들로 NCF들의 전처리 후, NCF들 및 mESC-유래 심근세포들이 세포 배양 삽입들을 이용하여 배양되었다. 항-VCAM-1 항체 처리는 심근세포 수의 심장 섬유아세포-매개 증가를 상당히 억제하였다 (도 6A 및 B).

결국 우리는 심근세포들의 증식에 대한 VCAM-1의 직접적인 영향들을 평가하였다. 배양 시작 1일 후, 심근세포들이 5일까지 VCAM-1 재조합 단백질로 처리되었다. 도 6C 및 D에 보여진 대로, VCAM-1 처리는 대조군에 비하여 심근세포들의 수를 증가시켰다. 이들 발견들언 심장-유래 섬유아세포들이 심근세포들에서 인테그린 α4β1 및 섬유아세포들-매개 VCAM-1을 통한 심근세포 증식을 유도할 수 있다는 것을 제안한다.

기능적 심장 세포 시트들을 구축하는데 있어, VCAM-1 양성 세포들의 중요성을 확인하기 위하여, 우리는 생물-유래 심장 섬유아세포들에서 VCAM-1 양성 세포들의 퍼센트를 측정하였다.

심장 섬유아세포들은 C57/BL6 마우스들의 신생아 마우스들 (1 일)로부터 해부되고 수집되었고, 피부 섬유아세포들이 성체 마우스들 (10-12 주령)으로부터 해부되고 수집되었다. 섬유아세포들 각각이 3번의 계대까지 부착-배양되었고, 조건 당 1×10⁷ 세포들의 세포 용적이 수득되었다. 3번의 계대는 세포 시트들에 의하여 생산되는 상기 언급된 심근세포들의 배양 조건과 동일한 조건이다.

섬유아세포들은 둘 다 염소(Goat) 다클론 항-VCAM-1 항체들 (R&D systems, Minneapolis, MN)로 일차 면역형광 염색되었고, 그리고 Alexa Fluor 488 당나귀(Donkey) 항-염소 IgG (Life Technologies, MD, United States)으로 이차 면역형광 염색되었다. 그 다음으로, FACS 분석이 Gallios (Beckman Coulter, Brea, CA)에서 수행되었고, 그리고 VCAM-1 양성 세포 비율이 측정되었다 (N=3). 중요한 차이의 계산이 스튜던트 t-검정에 의하여 수행되었다.

심장 섬유아세포들 (NCF들)의 결과들이 도 7A-C에 보여져 있다. NCF들에서 VCAM-1 positive 세포들의 퍼센트가 거의 60%라는 것이 발견되었다 (도 7A: 66.57%, 도 7B: 58.95%, 도 7C: 54.73%). 역으로, 피부 섬유아세포들 (ADF들)에서 VCAM-1 양성 세포들의 퍼센트는 거의 5%였고, NCF들에서 VCAM-1 양성 세포들의 퍼센트는 ADF들의 것보다 유의하게 더 많다고 나타났다 (P < 0.001).

많은 VCAM-1 양성 세포들을 포함하는 심장 섬유아세포들이 VCAM-1의 발현을 통하여 마우스들 ES로부터 유래된 심근세포들을 증식시킴으로써 기능적 심근 조직들의 구축에 기여한다는 것이 제안되었다. 나아가, VCAM-1 양성 심장 섬유아세포들이 발생학의 관점에서 외막-유래 세포로부터 비롯되는 것이 고려되었고, 그리고 우리는 발생학의 관점에서 섬유아세포들을 분류하고, 형태학적 분류를 수행하는 것이 아니라, 기능적 조직의 구축을 위하여 세포 소스로서 기능적 분류를 수행하는 것이 효과적이라는 제안을 얻었다.

NCF들에서, VCAM-1를 발현시키지 않는 대다수의 세포들이 CD31를 발현시키는 것으로 생각된다 (혈관 내피 세포 마커). 이 이유는 하기와 같다: 조직-상주성(resident) 심장 섬유아세포들이 상피(epithelial) 간엽성(mesenchymal) 이동(transition) (EMT)을 통하여 외심막-유래 세포들로부터 생산되고, 또한 내피(endothelial) 간엽성(mesenchymal) 이동(transition) (EndMT)을 통한 혈관 내피 세포들로부터 분화되는 것이 알려져 있다. 게다가 심장 섬유아세포들과의 경우와 같이, EndMT를 통한 혈관 내피 세포들로부터 분화하는 신장 섬유아세포들은 CD31을 발현시킨다 (J Am Soc Nephrol 19:2282-2287, 2008). 이는 NCF들이 CD31을 발현시킨다는 것을 지지하는 기반들 중 하나가 될 수 있다.

상기로부터, 피부 섬유아세포들이 아닌 심장 섬유아세포들이 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 유래 심근세포들의 증식을 향상시키고, 더욱 기능적인 심장 세포 시트들의 구축에 기여한다는 것이 명확하였다. 게다가 심장 섬유아세포들이 피부 섬유아세포들과 비교하여 VCAM-1를 더 풍부하게 발현시키고, 그리고 심장 섬유아세포들의 VCAM-1가 기능적으로 생물학적으로-디자인된 심장 조직들의 구축 및 심장 세포들의 증식에 중요한 역할을 한다는 것이 가리켜진다.

산업상 이용가능성

본 발명의 심장 세포 배양 재료들을 이용하여 배양함으로써, 기능적 심장 조직들이 바람직하게는 구축된다. 배양에 의하여 수득되는 심장 세포들은 이식과 같은 재생 의학, 또는 심장 조직 모델들과 같은 인공 장기 재료들로서 사용될 수 있다.

Claims

VCAM-1 단백질을 포함하는 심장 세포 배양 재료.
제 1항에 있어서,
VCAM-1 단백질은 동물 재료, VCAM-1 재조합 단백질, 또는 VCAM-1 단백질을 발현시키는 stpvh로부터 분리되고 정제된 VCAM-1인, 심장 세포 배양 재료.
심장 조직을 구축하기 위하여 배양하는데 사용되는 제 1항 또는 제 2항에 따른 심장 배양 재료.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,
VCAM-1 단백질을 발현시키는 세포는 VCAM-1 단백질을 발현시키는 섬유아세포인, 심장 세포 배양 재료.
제 4항에 있어서,
상기 섬유아세포는 심장-유래 섬유아세포인, 심장 세포 배양 재료.
제 4항 또는 제 5항에 있어서,
상기 섬유아세포는 심외막-유래 섬유아세포인 심장 세포 배양 재료.
벽 표면 및/또는 바닥 표면을 갖는 배양 기판의 벽 표면 및/또는 바닥 표면이 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 심장 세포 배양 재료로 코팅된, 세포 배양 기판.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 심장 세포 배양 재료와 심장 세포를 공-배양함으로써 얻어지는 인공 장기 재료.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 심장 세포 배양 재료와 심장 세포를 공-배양하는 단계를 포함하는 인공 장기 재료를 생산하는 방법.