WO2020130312A1 - 지방줄기세포 시트를 함유하는 심장조직 모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법 - Google Patents
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- A61L2430/20—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of the heart, e.g. heart valves
Definitions
- the present invention relates to a sheet for transplanting a heart containing stem cells, and more particularly, a sheet composed of adipose stem cells, a sheet for transplanting a heart simulating a heart including fibroblasts, and a method for manufacturing the same.
- Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into any tissue and are undifferentiated cells. Providing appropriate conditions for each cell in an undifferentiated state has a strength capable of differentiating into various cells and tissues, and research into regenerative treatment of damaged tissues using stem cell differentiation ability has been actively studied.
- multipotent stem cells such as adipose stem cells
- adipose stem cells are stem cells that can differentiate only into specific cells of tissues or organs, and have the function of inducing tissue growth and development, and maintenance and regeneration of adult tissues.
- tissue-specific multipotent cells are collectively referred to as adult stem cells (Miranville A et al., Circulation . 110:349-55, 2004). This has the advantage that more stem cells can be obtained than in other tissues, and the extraction process is safe and easy (Zuk PA et al., Tissue Eng ., 7:211-28, 2001).
- transplanting stem cells for regeneration of damaged organs and tissues, damaged organs and tissues are restored.
- Various methods of cell transplantation into damaged organs and tissues have been attempted.
- stem cells there are a method of directly injecting stem cells into damaged organs or tissues, and a method of systemic administration by injecting intravenous blood vessels.
- transplanted stem cells have a low engraftment rate, and most are reported to be washed away.
- transplantation is carried out by increasing the amount and frequency of stem cells, but there is a problem that the number of cells in a high concentration must be continuously repeated. There is a limit to the look.
- cardiomyocytes are reported to be 33%, vascular cells to 24%, and fibroblasts to 43% (Zhou P et al., Circ Res ., 118:368-70, 2016). Therefore, a long time survival in myocardial cells or blood vessel a high single-cell potential for only is the cell sheet formed upon compactness, such as the heart of robustness, secretion and tissue lot with different, in vitro in order to simulate the in vivo heart tissue resistance and 3 The dimensional shape may not be maintained.
- the present inventors tried to develop a stem cell support capable of proliferating with a high engraftment rate in transplanted organs, and as a result, prepared a stem cell mixture sheet with a cell combination similar to that of the cardiac constituent cells, to the myocardial infarction model of the rat.
- the myocardial infarction site was confirmed to be reduced by high engraftment rate and proliferation rate, and the present invention was completed.
- An object of the present invention is to provide a sheet for stem transplant containing heart cells with high engraftment rate and proliferation rate.
- Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing the heart transplant sheet.
- Another object of the present invention is to provide a method for treating or preventing cardiac ischemic disease, comprising the step of implanting the sheet for heart transplantation.
- the present invention provides a sheet for cardiac heart transplantation including a sheet composed of adipose stem cells, cardiac myocytes and fibroblasts.
- the present invention also, (a) preparing a support sheet by culturing adipose-derived stem cells; And (b) seeding and culturing cardiomyocytes and fibroblasts on the support sheet to produce a heart-mimicking heart transplantation sheet.
- the present invention also provides a composition for a heart transplant comprising the sheet for heart transplantation.
- the present invention also provides a method for treating or preventing cardiac ischemic disease, comprising the step of implanting the sheet for heart transplantation.
- the present invention also provides the use of the heart-implanted heart transplant sheet for the treatment or prevention of ischemic disease.
- the present invention also provides the use of the heart-simulating heart transplant sheet for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of ischemic disease.
- Figure 1 shows the results of comparing the sheet formation according to the number of seeding cells, in the manufacture of human-derived adipose stem cell sheet.
- the scale bar is 100 ⁇ m.
- Figure 2 is a human-derived adipose stem cell sheet mixed with cardiomyocytes and fibroblasts incubated for 24 hours, a photograph confirming the proliferation of each cell using a fluorescent microscope, the cardiomyocytes are shown in red color, fibroblasts Is indicated in green.
- the scale bar is 100 ⁇ m.
- Figure 3 shows the results of comparing the cell number conditions for producing a heart tissue simulating heart transplant sheet according to the present invention.
- the scale bar is 100 ⁇ m.
- FIG. 4 is a photograph obtained through H&E staining by acquiring a cross section of a sheet for transplanting heart tissue simulating the heart according to the present invention.
- the scale bar is 100 ⁇ m.
- Figure 5 shows the results of comparing the secretion capacity of cytokines/chemokines and growth factors secreted from the sheet for transplanting heart tissue and sheet of fat stem cells according to the present invention through a cytokine array.
- Figure 6 is a myocardial infarction mouse model according to the present invention in the heart transplanted heart tissue-simulating heart transplantation sheet, adipose stem cell sheet, and mixed sheet mixed with muscle cells in adipose stem cell sheet, fibroblasts (Masson's trichrome) staining
- fibroblasts Masson's trichrome
- stem cell transplantation methods Various methods of transplanting stem cells into damaged organs or tissues have been attempted. Recently, a method using a cell sheet has been implemented as one of the stem cell transplantation methods. Expected, or by increasing the injection of growth factors and cytokines, has maximized the efficacy of transplantation. However, these stem cells are mostly washed out, or transplanted cells do not guarantee differentiation and proliferation, and have limitations in terms of low efficiency and temporal, economical transplantation, and post-transplant side effects.
- Adipose stem cells can use autologous cells, provide a stable base for culturing cardiac cells, increase the engraftment rate, and maximize the function of mixed cells in proliferation and survival.
- a heart tissue-simulating heart transplantation sheet was prepared by culturing cardiac muscle cells and fibroblasts, which are the constituent cells of the heart, as a support for adipose stem cell sheets.
- the present invention in one aspect, relates to a sheet for heart-mimicking heart transplantation, comprising a sheet composed of adipose stem cells, cardiomyocytes and fibroblasts.
- the human-derived adipose stem cell sheet used as a support was seeded with adipose stem cells in a general culture dish to prepare a sheet by additionally seeding cardiomyocytes and fibroblasts among cardiac constituent cells, and the sheet according to the present invention. It is easy to recover and can be transplanted into damaged heart tissue.
- the cells used as a support are characterized by fat stem cells.
- Adipose stem cells used as a support are preferred to use adipose stem cells for maximizing the cooperative effect with mixing cells, as differentiation into various cells and recovery effect in damaged organs and tissues have been reported.
- human-derived fat stem cells are used, but not limited to, fat stem cells isolated from all mammals including mice, white paper, pigs, and monkeys can be used.
- a sheet for transplanting heart tissue into a heart transplant can be used according to the following manufacturing method.
- adipose stem cells The origin of adipose stem cells is not particularly limited in its type in the present invention, but adipose tissue refers to a combination of various surrounding tissues surrounding it, including mature adipose cells. Generic term for all fat tissues, regardless of their location. It is recommended to use fat stem cells separated and cultured up to 2 passages in the culture medium. In the present invention, representative human-derived adipose stem cells were used.
- the properties of the stem cells are confirmed and the type is not particularly limited, it is preferable to seed more than 500,000 densities/well, which is a density capable of producing sheets, in a typical 6-well plate. If the number of adipose stem cells is less than the number of cells suggested, there is a problem in that a dense sheet that cannot function as a support is not formed, and on the contrary, if the number of cells exceeds 2 times or more in the above-mentioned range, it is relatively killed. The density per area is most suitable because there are problems in that the number of cells increases and the possibility of contamination such as turbidity of the culture medium increases.
- Example 1 of the present invention it was possible to derive the optimal amount of cells per seeding area for the production of adipose stem cell sheet as a support of the present invention (see FIG. 1).
- adipose stem cells seeded at the time of sheet production may be characterized by seeding and cultured at 300,000 to 1,000,000 cells/well in a 6-well plate, and if less than 300,000 cells, cells are torn or sheet formation is properly performed. When seeding more than 1,000,000 cells/well, the number of dead cells increases and sheet recovery is not easy.
- the number of cell seeding in the case of a 6-well plate is described above, it is apparent to those skilled in the art that the number of cells to be seeded can be increased in proportion to the area of the incubator when using other types of incubators.
- Cardiomyocytes and fibroblasts seeding together with adipose stem cells in the heart-implanted heart transplantation sheet of the present invention are preferably seeded at 150,000-400,000/well, respectively, and if it is 150,000 or less, engraftment rate and proliferation ability are lowered at heart transplantation. If it is more than 400,000, the sheet cannot be accommodated.
- a heart-implanting heart transplant sheet of the present invention it is preferable to incubate in a 37°C, 5% CO2 incubator for 24 hours. If the incubation time is less than the time, there is a problem that the adipose stem cells are not sufficiently formed to form a support, and if it is more than the above time, the stem cell titer of the adipose stem cells decreases due to the long incubation time, and cell death due to hypoxia Since there is a problem that can lead to the above time is most appropriate.
- the ratio of the adipose stem cells: cardiomyocytes: fibroblasts in the heart-implanted heart transplant sheet of the present invention may be characterized by a ratio of 1: 0.3 to 0.6: 0.3 to 0.6, most preferably 1:0.4: It is preferably 0.4. However, if the proportion of fibroblasts is high, cardiomyocytes may die depending on the proliferation rate. Therefore, it is most appropriate to co-culture at the above ratio conditions (see FIG. 2).
- the ratio of adipose stem cell sheets to cardiomyocytes and fibroblasts is seeded at a cell number ratio of 1: 0.4: 0.4 and simultaneously for 24 hours. It is preferable to cultivate.
- the present invention provides a support sheet by culturing adipose-derived stem cells (a); And (b) seeding and incubating cardiomyocytes and fibroblasts on the support sheet to produce a heart-mimicking heart transplantation sheet.
- the origin of stem cells is not specifically limited for establishing a sheet for human tissue-mimicking heart transplantation using human-derived adipose stem cells as a support, and is typically a density capable of producing a sheet in a general 6-well plate. It is preferable to simultaneously seed the cardiomyocytes and fibroblasts on 500,000 fat stem cell sheets. Whether or not to recover the sheet for transplantation was dependent on the amount of adipocytes used as a support, and when attempted to detach from a small amount of human-derived adipocytes (250,000), tearing occurred, making it difficult to recover.
- the density per area is most suitable for co-cultivation in order to produce a heart tissue-mimicking sheet for multi-layered adipose stem cells with a minimum number of adipose stem cells of sheet formation (500,000) or more as a support (FIG. 3 and See Figure 4).
- a method of recovering a cardiac tissue-implanted heart transplant sheet of the present invention it is most preferable to remove and recover with a scraper, but is not limited thereto. Sheets can be recovered from normal culture dishes.
- Example 4 of the present invention as a support for human-derived adipose stem cell sheet and human-derived adipose stem cell as a support, a tissue secretion cytokine/chemokine and growth factor secreting sheet for cardiac transplantation is confirmed.
- cytokine/chemokine and growth factors As a cardiac tissue simulating cardiac transplant sheet, cytokine/chemokine and growth factors (Adiponectin, aFGF, ICAM-1, ICAM-2, LIF, SDF-1a, TGF alpha, TGF beta2, TGF beta3 in human derived fat stem cell sheet) , CT-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-AB, Troponin I, E-Selectin, L-Selectin, E-Cadherin, P-Cadherin, VE-Cadherin, GRO) were confirmed. Secretion is not necessarily limited to this. These will maximize the paracline effect when compared to the existing adipose stem cell sheet, and can give a better transplant effect (see FIG. 5).
- the inventors of the present invention have produced a mixed sheet containing muscle fibers in adipose stem cell sheet (Republic of Korea Patent Registration 10-1586839).
- the mixed sheet it was confirmed that the proliferative capacity and engraftment rate at the time of cardiac transplantation were lower than those of the cardiac tissue transplantation sheet of the present invention. This is shown in Example 6 and Figure 6 below.
- the animal model of acute myocardial infarction through ligation of the coronary arteries induced infarction using a white paper, and a human-derived fat stem cell sheet, a human-derived fat stem cell sheet and a mixed sheet of muscle cells, and the present invention Following the heart tissue, a heart transplant sheet was implanted. After 42 days of transplantation, the heart of the transplanted group was collected and histological area of the myocardial infarction between the groups was compared for histological analysis. The thickness of the infarct was compared with Masson's trichrome staining, a fibroblast staining technique. , It was confirmed that the area of myocardial infarction was reduced in the heart transplantation sheet transplantation group according to the present invention than in the other groups (see FIG. 6 ).
- the myocardial infarction animal model was transplanted around the infarction caused by coronary artery ligation to the heart surface including the infarct, and the amount of transplantation was a human-derived fat stem cell sheet (about 1 cm in diameter) and human-derived fat stem cells.
- a heart transplant sheet (diameter of about 1 cm) was implanted.
- the sheets of the present invention are due to the appropriate number of seeding cells, and can be freely sized to replenish the area of damaged heart tissue. There is no particular limitation on the shape and area of the sheet.
- the present invention relates to a composition for cardiac transplantation, comprising a sheet for heart transplantation.
- the pharmaceutical composition of the present invention may preferably use a physically appropriate buffer solution such as Hank's solution, Ringer's solution, or physically buffered saline.
- Aqueous injection suspensions can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran.
- suspensions of the active ingredients can be prepared as suitable oily injection suspensions.
- Suitable lipophilic solvents or carriers include fatty acids such as sesame oil or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate, triglycerides or liposomes. Polycationic amino polymers can also be used as carriers.
- the suspension may use suitable stabilizers or medicaments to increase the solubility of the compound and prepare a high concentration solution.
- the present invention relates to a method of treating or preventing cardioischemic disease, comprising implanting the sheet for transplanting a heart replica.
- the present invention relates to the use of the sheet for cardiac heart transplantation for the treatment or prevention of ischemic disease.
- the present invention relates to the use of the sheet for cardiac heart transplantation for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of ischemic disease.
- Example 1 Preparation of human-derived adipose stem cell sheet
- a human-derived adipose stem cell sheet used as a support in a heart-mimicking stem cell sheet was prepared by the following method.
- a sheet as a support was established using adipose stem cells cultured in two passages using human-derived adipose stem cells (LONZA, USA). Specifically, in order to secure the adipose stem cell support sheet, adipose stem cells with various cell densities were seeded in a 6-well plate to confirm whether or not the sheet was formed according to the cell density per area. The culture conditions were seeded and incubated in a 37°C, 5% CO2 cell incubator for 24 hours each. In order to determine whether or not the sheet was formed according to the density of cells per area, 6-well plates were seeded with various cell numbers per well (250,000 500,000 and 1,000,000). MesenCult MSC Basal Medium (Stemcell technologies, Canada) was used as the medium composition for preparing human-derived adipose stem cell sheets.
- a support sheet for co-culture at a predetermined amount (500,000 cells) was established.
- cultivation was preferably performed in a 5% CO2 cell incubator at 37°C for 24 hours, and when seeding a cell number of less than 500,000 cells, a complete sheet was not formed due to perforation (FIG. 1).
- Example 2 Preparation of heart tissue simulating heart transplant sheet using human-derived adipose stem cells as a support
- the human-derived adipose stem cell sheet culture conditions of Example 1 were used to prepare a highly functional heart tissue-simulating heart transplantation sheet, and the optimal number of cells capable of forming a mixed sheet was 500,000 cells/well of adipose stem cells 6 wells. After seeding, the cells were cultured for 24 hours to form a sheet of human-derived adipose stem cells, and then human-derived cardiac myocytes (AC16; ATCC, Red) and human-derived cardiac fibroblasts (NHCF; LONZA, Green) were added for 24 hours. Cultured.
- AC16 human-derived cardiac myocytes
- NHCF human-derived cardiac fibroblasts
- 200,000/well human-derived cardiomyocytes and 200,000/well cardiac fibroblasts were additionally seeded on the human-derived adipose stem cell sheet, and cultured for 24 hours.
- the human-derived adipose stem cell sheet was cultured for 24 hours by adjusting the number of adipose stem cells to determine whether or not to transplant (detachable) a heart tissue-mimicking heart transplant sheet as a support.
- heart tissue-mimicking heart transplant sheet The presence or absence of multiple layers of the heart tissue-mimicking heart transplant sheet was confirmed by immunofluorescence staining. Presence or absence of multiple layers of heart tissue-mimicking heart transplantation sheets made by incubating for 24 hours using 500,000 fat stem cells, which are established conditions, and incubating for 24 hours by adding human-derived cardiac myocytes and human-derived cardiac fibroblasts. The sheet was collected to confirm and H&E stained the cross section.
- the heart tissue-simulating heart transplant sheet is a multi-layer sheet.
- Example 4 Confirmation of cytokines/chemokines and growth factors secreted by the sheet for transplanting heart tissue according to the present invention.
- Heart tissue simulating prepared in Example 3 Various cytokines/chemokines and growth factors secreted from the heart transplantation sheet were confirmed by cytokine array techniques, and compared with human-derived adipose stem cell sheets.
- the human-derived adipose stem cell sheet and the heart tissue-simulating heart transplant sheet according to the present invention were cultured for 24 hours, and then the culture solution was recovered.
- the cytokine array was designed by selecting a target marker, and the method of execution was analyzed by proceeding according to a conventional method in the manufacturer's manual.
- cytokine/chemokine and growth factors (Adiponectin, aFGF, ICAM-1, ICAM-2, LIF) in human tissue-derived adipose stem cell sheet in a heart tissue-mimicking sheet according to the present invention , SDF-1a, TGF alpha, TGF beta2, TGF beta3, CT-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-AB, Troponin I, E-Selectin, L-Selectin, E-Cadherin, P-Cadherin, VE-Cadherin , GRO).
- Example 5 Transplanting a sheet for transplanting heart tissue into a heart tissue in a rat myocardial infarction animal model
- a 6-7 week old white paper (SD; Orient Bio) was prepared to induce myocardial infarction by ligation of the coronary arteries.
- SD Orient Bio
- a human-derived adipose stem cell sheet and a heart tissue-simulating heart transplantation sheet prepared by the method of Example 3 were implanted in the infarct region of the induced myocardial infarction. After transplantation, the presence of adipocytes and cardiac function were checked over time for 28 days.
- the myocardial infarction animal model was implanted on the heart surface including the infarct area around the infarction caused by coronary artery ligation, and the amount of transplantation was a human-derived fat stem cell sheet (about 1 cm in diameter) and a heart prepared by the method of Example 3
- a tissue simulating heart transplant sheet (diameter of about 1 cm) and adipose stem cell sheet were used as a support, and a mixed sheet in which muscle cells were mixed was transplanted.
- a control sheet, a human-derived adipose stem cell sheet, a mixed sheet in which muscle cells are mixed with adipose stem cell sheet, and a heart tissue-simulating heart transplant sheet according to the present invention are collected to recover the heart of the transplanted group for histological analysis.
- the area of the myocardial infarction between groups was compared, and the thickness of the heart wall was compared, and the change of the infarct was compared with Masson's trichrome staining, a fibroblast staining technique. Masson's trichrome staining was performed by a conventional tissue staining method (Kim JH et al., PLoS One . 11:e015806, 2016).
- the control group Only AMI (A)
- human-derived adipose stem cell sheet hASC sheet
- mixed sheet hASC based muscle cell sheet transplantation group mixed with muscle cells in the adipose stem cell sheet
- the area of the part showing the infarct area (blue; part between the arrows) in the heart tissue-simulating heart transplant sheet transplantation group (hASC based Mix sheet) according to the present invention was the smallest, the thickness of the heart wall was the thickest, the infarction The site was also confirmed to be the most reduced.
- the heart-simulating heart transplant sheet having a cell structure similar to the heart according to the present invention exhibits high engraftment rate and transplant cell proliferation ability when transplanted into an injured heart region, and can be effectively used for the treatment of heart disease.
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Abstract
본 발명은 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 심장과 유사한 세포구성을 가지는 심장모사 심장이식용 시트는 손상 심장부위에 이식 시에, 높은 생착율과 이식세포증식능을 나타내어, 심장질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 줄기세포를 함유하는 심장이식용 시트에 관한 것으로 더욱 자세하게는 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포는 자기 복제 능력을 갖추면서 어떤 조직으로든 분화할 수 있는 능력을 갖춘 세포를 말하며 미분화 세포이다. 미분화 상태의 세포를 각각의 적절한 조건을 제공해주면, 다양한 세포와 조직으로 분화할 수 있는 강점을 가지는데 이러한 줄기세포의 분화 능력을 이용한 손상된 조직의 재생 치료연구가 활발히 연구되고 있다.
대표적으로 지방줄기세포와 같은 다분화능 줄기세포는 조직이나 기관의 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 조직의 성장과 발달 및 성체 조직의 유지와 재생을 유도하는 기능이 있다. 이러한 조직 특이적 다분화능 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다(Miranville A et al., Circulation. 110:349-55, 2004). 이는 다른 조직에서보다 많은 양의 줄기세포를 얻을 수 있으며, 추출과정이 안전하고 용이하다는 장점이 있다 (Zuk PA et al., Tissue Eng.,7:211-28, 2001).
최근 손상된 장기와 조직의 재생을 위하여 줄기세포를 이식한 후, 손상된 장기와 조직이 회복되는 것이 보고되고 있다(Strauer BE et al., Circulation. 106:1913-8, 2002). 이에 손상된 장기와 조직으로의 다양한 세포이식 방법이 시도되었다. 줄기세포를 이식하기 위해 손상된 장기나 조직에 줄기세포를 직접 주사하는 방법과 정맥혈관 등으로 주사하여 전신 투여하는 방법 등이 있다. 하지만 이식된 줄기세포는 생착률이 낮으며, 대부분이 씻겨나가는 것으로 보고되고 있다. 이를 극복하기 위하여, 줄기세포의 양과 빈도를 높여 이식을 시행하고 있지만, 고농도의 세포 수를 지속해서 반복해야 하는 문제점이 있으며, 이식을 성공적으로 할지라도 빈곤한 세포환경의 등으로 기대 이상의 치료 효과를 보기에 한계가 있다.
최근 연구보고에 의하면 인간 심장조직에서 유세포 분석을 통한 구성 세포들의 비율을 조사한 결과, 심근세포가 33%, 혈관세포가 24%, 섬유아세포가 43% 정도로 보고되고 있다(Zhou P et al., Circ Res.,118:368-70, 2016). 그러므로, 생체 심장조직을 모사하기 위해서 심근세포 또는 혈관 단일세포만을 이용한 세포시트 형성 시 견고성, 분비능 및 조직의 치밀도 등이 심장과는 많이 상이할 가능성이 높고, in vitro 에서 오랜 기간 생존성 및 3차원적 형태를 유지하지 못할 수가 있다.
이에, 본 발명자들은 이식된 장기에서 높은 생착률을 가지면서 증식할 수 있는 줄기세포 지지체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 심장 구성세포와 유사한 세포 조합으로 줄기세포 혼합시트를 제조하여, 랫트의 심근경색 모델에 이식하는 경우, 높은 생착율과 증식율에 의하여, 심근경색 부위가 감소되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 생착율과 증식율이 높은 줄기세포 함유 심장이식용 시트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 심장이식용 시트의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 심장모사 심장이식용 시트를 이식하는 단계를 포함하는, 심장허혈성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 지방유래 줄기세포를 배양하여 지지체 시트를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 지지체 시트 위에 심장근 세포와 섬유아세포를 시딩하고 배양하여 심장모사 심장이식용 시트를 제조하는 단계를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 심장모사 심장이식용 시트를 포함하는 심장이식용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 심장모사 심장이식용 시트를 이식하는 단계를 포함하는, 심장허혈성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 허혈성 질환의 치료 또는 예방을 위한 상기 심장모사 심장이식용 시트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 허혈성 질환의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 상기 심장모사 심장이식용 시트의 사용을 제공한다.
도 1은 인간유래 지방줄기세포 시트제조시에, 시딩되는 세포 수의 따른 시트 형성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 2는 인간유래 지방줄기세포 시트에 심장근세포 및 섬유아세포를 혼합하여 24시간 동안 배양한 후, 형광현미경을 이용하여 각 세포의 증식을 확인한 사진으로, 심장근세포는 붉은 색으로 나타내었으며, 섬유아세포는 녹색으로 나타내었다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 3은 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제조하기 위한 세포수 조건을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 4는 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트의 단면을 획득하여 H&E 염색을 통하여 획득한 사진이다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 5는 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트와 지방쥴기세포 시트에서 분비한 싸이토카인/키모카인 및 성장인자의 분비능을 싸이토카인 어레이를 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 심근경색 마우스 모델에 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트, 지방줄기세포 시트 및 지방줄기세포 시트에 근세포를 혼합한 혼합시트를 각각 이식한 심장에서, 섬유화세포(Masson's trichrome) 염색기법으로 확인한 심장 단면 사진이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
손상된 장기나 조직에 줄기세포를 이식하는 다양한 방법으로 시도되어 왔으며, 최근 줄기세포 이식방법 중 하나로 세포시트를 이용하는 방법이 시행되고 있으며, 대표적으로 줄기세포만을 다층으로 형성하여 이식하여 패러크라인 영향을 기대하거나, 혹은 성장인자와 싸이토카인들의 추가주입을 통해 이식 효능을 극대화 시켜왔다. 그러나 이들은 줄기세포들은 대부분이 씻겨나가거나, 이식된 세포가 분화 및 증식을 보장하지 못하며, 이식의 저효율 및 시간적, 경제적, 이식 후의 부작용 측면에서 한계를 가졌다.
기존의 방법은 시간과 비용이 많이 들고 생체 이외의 재료 사용으로 그에 따른 부작용이 존재하였다. 지방줄기세포는 자가세포를 사용할 수 있고, 심장 구성세포들이 배양될 수 있는 터전을 제공함으로써 안정적인 생착률 높이며, 증식 및 생존에 있어서 혼합된 세포의 기능을 극대화할 수 있다. 본 발명에서는 심장의 구성세포인 심장근세포와 섬유아세포를 지방줄기세포 시트를 지지체로 하여 배양한 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제작하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트에 관한 것이다.
본 발명에서 지지체로 사용된 인간유래 지방줄기세포 시트는 지방줄기세포를 일반 배양접시에 시딩하여, 심장 구성세포 중 심장근세포 및 섬유아세포를 추가로 동시 시딩하여 시트를 제조하였으며, 본 발명에 따른 시트의 회수가 쉬우며, 손상된 심장조직으로 이식이 가능하다.
또한, 지지체로서의 다양한 줄기세포 및 심장조직을 모사하기 위해 추가 시딩하는 세포의 종류를 변경할 수 있으며, 특정한 종류에 대해 한정하는 것이 아니며, 본 발명의 기술 범위에 포함되는 모든 세포를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 손상된 심장조직으로의 이식에 있어서, 지지체로 쓰이는 세포는 지방줄기세포인 것이 특징이다. 지지체로 사용된 지방줄기세포는 다양한 세포로의 분화 및 손상된 장기 및 조직에서의 회복효과가 보고된 만큼 혼합하는 세포와의 협력효과를 극대화를 위해 지방줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 인간유래 지방줄기세포를 사용하고 있으나, 이에 한정하지 않고, 마우스, 백서, 돼지 그리고 원숭이들을 포함하는 모든 포유류에서 분리한 지방줄기세포를 사용할 수 있다.
본 발명의 이식 가능한 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트는 하기와 같은 제조방법에 따라 제조된 것을 사용할 수 있다.
지방줄기세포의 유래는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지 않으나, 지방조직은 성숙한 지방세포를 포함한 이를 둘러싸고 있는 다양한 주변조직과의 결합되어 구성된 것을 말한다. 체내 위치에 상관없이 모든 지방조직을 총칭한다. 상기 분리되어 배양배지에서 2계대까지 배양된 지방줄기세포를 사용을 권장한다. 본 발명에서는 대표적으로 인간유래 지방줄기세포를 이용하였다.
이러한 줄기세포의 속성을 확인하고 특별히 그 종류를 한정하지 않으나, 대표적으로 일반 6 웰 플레이트에 시트제작이 가능한 밀도인 500,000개/웰 이상을 시딩하는 하는 것이 바람직하다. 만약 상기 지방줄기세포의 개수가 상기 제시된 세포 수 미만이면 지지체의 역할을 수행할 수 없는 조밀한 시트가 형성되지 않는 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 제시된 범위에서 세포 수가 2배 이상 초과하면 상대적으로 사멸한 세포가 많아지며, 배양액의 혼탁 등 오염의 가능성이 커지는 문제점이 있으므로 상기 면적당 밀도가 가장 적합하다.
본 발명의 실시예 1을 참고하면, 본 발명의 지지체로서의 지방줄기세포 시트를 제작을 위한 시딩하는 최적의 면적 당 세포 양을 도출할 수 있었다 (도 1 참조).
본 발명에 있어서, 시트 제작시에 시딩되는 지방줄기세포는 6웰 플레이트에서 300,000~1,000,000개/웰로 시딩하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 300,000개 세포 이하일 경우는 세포가 찢어지거나 시트형성이 제대로 되지 않으며, 1,000,000개/웰의 이상의 세포를 시딩할 경우, 사멸한 세포가 많아지고 시트 회수가 쉽지 않다. 아울러, 상기에서는 6웰 플레이트일 경우의 세포 시딩 개수를 기재하였으나, 다른 종류의 배양기를 쓸 경우는 배양기의 면적에 비례하여 시딩되는 세포 개수를 늘릴 수 있는 것은 당업자에게 자명한 사항이다.
본 발명의 심장모사 심장이식용 시트에서 지방줄기세포와 함께 시딩하는 심장근세포와 섬유아세포는 각각 150,000~400,000개/웰로 시딩하는 것이 바람직하며, 150,000개 이하일 경우에는 심장이식 시에 생착율과 증식능이 저하되며, 400,000개 이상일 경우는 시트에 수용이 불가하다.
본 발명의 심장모사 심장이식용 시트를 형성시키기 위하여는, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양이 바람직하다. 만약 배양 시간이 상기 시간 미만이면 지방줄기세포가 지지체로 형성되기까지 충분하지 않아 찢어지는 문제점이 있으며, 상기 시간 이상이면 오랜 배양 시간으로 인해 지방줄기세포의 줄기세포 역가의 저하, 저산소에 의한 세포사멸로 이어질 수 있는 문제점이 있으므로 상기 시간이 가장 적절하다.
본 발명의 심장모사 심장이식용 시트에서 상기 지방줄기세포: 심장근세포: 섬유아세포의 비율은 1: 0.3~0.6: 0.3~0.6의 비율인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:0.4:0.4인 것이 바람직하다. 다만 섬유아세포의 비율이 높으면 증식속도에 따라 심장근세포가 사멸할 수 있다. 이에 상기의 비율조건으로 동시배양하는 것이 가장 적절하다(도 2 참조).
본 발명의 일 양태에서, 심장 구성세포인 심장근세포 및 섬유아세포 동시배양에 있어서 지방줄기세포의 시트와 심장근세포 및 섬유아세포의 비율은 1 : 0.4 : 0.4의 세포 수 비율로 시딩하여 24시간 동안 동시배양하는 것이 바람직하다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 지방유래 줄기세포를 배양하여 지지체 시트를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 지지체 시트 위에 심장근 세포와 섬유아세포를 시딩하고 배양하여 심장모사 심장이식용 시트를 제조하는 단계를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예 3에 따르면, 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트 확립을 위해 특별히 줄기세포의 유래를 한정하지 않으며, 대표적으로 일반 6 웰 플레이트에 시트제작이 가능한 밀도인 500,000개 지방줄기세포 시트 위에 심장근세포와 섬유아세포를 동시 시딩하는 것이 바람직하다. 이식을 위한 시트 회수 여부는 지지체로 사용되는 지방줄기세포의 양에 의존적이었으며, 적은 양의 인간유래 지방줄기세포(250,000개)에서 탈착을 시도하였을 때 찢어짐을 발생하여 견고성 및 회수가 불가능하였다. 그러나 시트형성의 최소 지방줄기세포 수(500,000개) 이상으로 만들어진 다층의 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제작하기 위해 상기 면적당 밀도가 동시배양에 있어 가장 적합하다(도 3 및 도 4 참고). 추가적으로 본 발명의 심장조직 모사 심장이식용 시트를 회수하는 방법으로 스크레이퍼로 박리하여 회수를 하는 것이 가장 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 일반 배양접시에서 시트를 형성하여 회수할 수 있다.
본 발명의 실시예 4를 참고하면, 인간유래 지방줄기세포 시트와 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트 분비 싸이토카인/키모카인 및 성장인자를 확인한 결과 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트에서 인간유래 지방줄기세포 시트에서 싸이토카인/키모카인 및 성장인자(Adiponectin, aFGF, ICAM-1, ICAM-2, LIF, SDF-1a, TGF alpha, TGF beta2, TGF beta3, CT-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-AB, Troponin I, E-Selectin, L-Selectin, E-Cadherin, P-Cadherin, VE-Cadherin, GRO)의 높은 발현을 확인할 수 있었는데, 이들의 분비는 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이들은 기존의 지방줄기세포 시트와 비교하였을 때 패러크라인 효과를 극대화해줄 것이며, 더욱 좋은 이식의 효과를 줄 수 있다(도 5 참조).
본 발명의 발명자들은 지방줄기세포 시트에 근섬유를 포함하는 혼합시트를 제조한 바 있다(대한민국 특허등록 10-1586839). 상기 혼합시트의 경우는 심장이식 시에 증식능과 생착율이 본 발명의 심장조직 모사 심장이식용 시트보다 떨어지는 것으로 확인되었다. 이에 대하여는 아래 실시예 6 및 도 6에 나타내었다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 관상동맥의 결찰을 통해 급성심근경색 동물모델은 백서를 이용하여 경색을 유도하였으며, 인간유래 지방줄기세포 시트, 인간유래 지방줄기세포 시트와 근세포의 혼합시트 및 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트를 이식하였다. 이식 42일 후, 이식군의 심장을 회수하여 조직학적으로 분석을 위해 군 간의 심근경색 부위의 면적, 심장벽 두께 등을 비교하고, 섬유화세포 염색기법인 Masson's trichrome 염색으로 경색 부위의 변화를 비교한 결과, 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식군에서 다른 군보다 심근경색의 부위가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
또한, 심근경색 동물모델은 관상동맥 결찰로 생긴 경색주변주위에 경색부위를 포함한 심장표면에 이식하였으며, 1회 이식량은 인간유래 지방줄기세포 시트(지름 약 1cm)와 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트(지름 약 1cm)를 이식하였다. 본 발명의 이식되는 모든 시트에 있어서, 본 발명의 시트는 적절한 세포의 시딩 수에 기인하고, 손상된 심장조직의 면적을 보충하기 위해 자유로운 크기로 구성할 수 있다. 상기 시트의 형상 및 면적에 대해서는 특별히 한정은 없다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 심장모사 심장이식용 시트를 포함하는 심장이식용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는, 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 심장모사 심장이식용 시트를 이식하는 단계를 포함하는, 심장허혈성 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 허혈성 질환의 치료 또는 예방을 위한 상기 심장모사 심장이식용 시트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 허혈성 질환의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 상기 심장모사 심장이식용 시트의 사용에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인간유래 지방줄기세포 시트의 제작
심장모사 줄기세포시트에서 지지체로 사용되는 인간유래 지방줄기세포 시트는 다음의 방법으로 제조하였다.
인간유래 지방줄기세포(LONZA, USA)를 이용하여 2계대 배양한 지방줄기세포를 사용하여 지지체로서의 시트를 확립하였다. 구체적으로 지방줄기세포 지지체 시트를 확보하기 위하여, 다양한 세포밀도로 지방줄기세포를 6웰 플레이트에 시딩하여 면적당 세포의 밀도에 따른 시트 형성의 여부를 확인하였다. 배양조건은 세포를 시딩하여 각각 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 면적당 세포의 밀도에 따른 시트 형성의 여부를 알아보기 위하여 웰당 다양한 세포 수(250,000개 500,000개 및 1,000,000개)로 6웰 플레이트에 시딩하였다. 인간유래 지방줄기세포 시트를 제조하기 위한 배지조성은 MesenCult MSC Basal Medium(Stemcell technologies, Canada)를 이용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 일정량(500,000개)의 세포 수에서 동시배양을 위한 지지체 시트를 확립하였다. 지지체 시트 형성에 있어서 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양이 바람직하였으며, 500,000개 미만의 세포 수를 시딩한 경우는 구멍이 나서 완전한 시트가 형성되지 않았다(도 1).
실시예 2: 인간유래 지방줄기세포를 지지체로 사용한 심장조직 모사 심장이식용 시트의 제조
실시예 1의 인간유래 지방줄기세포 시트 배양조건을 이용하여 고기능성 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제조하기 휘하여, 혼합시트를 이룰 수 있는 최적 세포 수인 500,000개/웰의 지방줄기세포를 6웰에 시딩한 후 24시간 동안 배양하여 인간유래 지방줄기세포 시트를 형성한 후, 인간유래 심장근세포(AC16; ATCC, Red) 및 인간유래 심장 섬유아세포(NHCF; LONZA, Green)를 추가하여 24시간 동안 배양하였다. 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제작하기 위해 인간유래 지방줄기세포 시트 위에 인간유래 심장근세포는 200,000개/웰, 심장 섬유아세포는 200,000개/웰을 추가적으로 동시 시딩하여 24시간 동안 배양하여 제조하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 형성된 시트 내에서 인간유래 지방줄기세포, 심근세포 및 인간유래 심장 섬유아세포의 증식을 형광현미경을 통해 확인할 수 있었다.
실시예 3: 심장조직 모사 심장이식용 시트의 제조
인간유래 지방줄기세포 시트를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트를 확립하고 이식 여부(탈착성)를 확인하기 위해 지방줄기세포 수를 조절하여 24시간 동안 배양하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 이식 여부는 지지체로 사용되는 지방줄기세포의 양에 의존적이었으며, 적은 양의 인간유래 지방줄기세포(250,000개)에서 탈착을 시도하였을 때 찢어짐을 발생하여 견고성 및 회수가 불가능하였다. 그러나 시트형성의 최소 지방줄기세포 수(500,000개) 이상으로 만들어진 지방줄기세포를 지지체 사용한 심장조직 모사 심장이식용 시트는 회수 가능한 것을 확인할 수 있었다.
회수한 심장조직 모사 심장이식용 시트의 다층의 유무를 면역형광염색법을 통하여 확인하였다. 확립된 조건인 500,000개의 지방줄기세포를 이용하여 24시간 동안 배양하여 시트를 만들고 인간유래 심장근세포 및 인간유래 심장 섬유아세포를 추가하여 24시간 배양하여, 만들어진 심장조직 모사 심장이식용 시트의 다층의 유무를 확인하기 위하여 시트를 회수하여 단면을 H&E 염색하였다.
그 결과, 도 4에 나타나난 바와 같이, 심장조직 모사 심장이식용 시트는 다층의 시트인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트가 분비하는 싸이토카인/키모카인 및 성장인자 확인
실시예 3에서 제조한 심장조직 모사 심장이식용 시트에서 분비하는 다양한 싸이토카인/키모카인 및 성장인자를 싸이토카인 어레이 기법으로 확인하고, 인간유래 지방줄기세포 시트와 비교하였다.
싸이토카인 어레이(Ray biotech; USA)를 진행하기 위하여, 인간유래 지방줄기세포 시트와 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트를 24시간 배양한 후, 배양액을 회수하였다. 싸이토카인 어레이는 타깃 마커를 선택하여 디자인하였으며 수행방법은 제조사 매뉴얼 내 통상적인 방법을 따라 진행하여 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트에서 인간유래 지방줄기세포 시트보다 싸이토카인/키모카인 및 성장인자(Adiponectin, aFGF, ICAM-1, ICAM-2, LIF, SDF-1a, TGF alpha, TGF beta2, TGF beta3, CT-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-AB, Troponin I, E-Selectin, L-Selectin, E-Cadherin, P-Cadherin, VE-Cadherin, GRO)의 높은 발현을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 랫 심근경색 동물모델에 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식
장기나 조직 내로의 이식여부 및 이식의 효과를 확인하기 위해 6-7주령 백서(SD; 오리엔트바이오)를 준비하여 관상동맥의 결찰로 심근경색을 유도하였다. 유도된 심근경색의 경색부위에 인간유래 지방줄기세포 시트와 실시예 3의 방법으로 제조한 심장조직 모사 심장이식용 시트를 이식하였다. 이식 후, 28일 동안 경시적으로 지방줄기세포의 존재 여부 및 심장 기능의 효과를 확인하였다.
심근경색 동물모델은 관상동맥 결찰로 생긴 경색 주변주위에 경색부위를 포함한 심장표면에 이식하였으며, 1회 이식량은 인간유래 지방줄기세포 시트(지름 약 1cm)와 실시예 3의 방법으로 제조한 심장조직 모사 심장이식용 시트(지름 약 1cm) 및 지방줄기세포 시트를 지지체로 사용하고, 근세포를 혼합한 혼합시트를 이식하였다.
이식 42일 후, 대조군, 인간유래 지방줄기세포 시트, 지방줄기세포 시트에 근세포를 혼합한 혼합시트와 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식군의 심장을 회수하여 조직학적으로 분석을 위해 군 간의 심근경색 부위의 면적, 심장벽 두께 등을 비교하고, 섬유화세포 염색기법인 Masson's trichrome 염색으로 경색 부위의 변화를 비교하였다. Masson's trichrome 염색은 통상적인 조직 염색방법으로 진행하였다(Kim JH et al., PLoS One. 11:e015806, 2016).
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군(Only AMI(A)), 인간유래 지방줄기세포 시트(hASC sheet) 및 지방줄기세포 시트에 근세포를 혼합한 혼합시트(hASC based muscle cell sheet) 이식군보다, 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식군(hASC based Mix sheet)에서 경색부위를 나타내는 부분(파란색; 화살표 사이 부분)의 면적이 가장 작아졌고, 심벽의 두께도 가장 두꺼워 졌으며, 경색 부위 또한 가장 감소된 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 심장과 유사한 세포구성을 가지는 심장모사 심장이식용 시트는 손상 심장부위에 이식 시에, 높은 생착율과 이식세포증식능을 나타내어, 심장질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트.
- 제1항에 있어서, 상기 지방줄기세포: 심장근세포 : 섬유아세포의 비율은 1 : 0.3~0.6 : 0.3~0.6의 비율인 것을 특징으로 하는 시트.
- 제1항에 있어서, 지방줄기세포는 6웰 플레이트에서 300,000~1,000,000개/웰로 시딩되어 배양된 것을 특징으로 하는 시트.
- 제1항에 있어서, 상기 심장근세포 및 섬유아세포는 6웰 플레이트에서 각각 150,000~400,000개/웰로 시딩되어 배양된 것을 특징으로 하는 시트.
- 다음 단계를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트의 제조방법:(a) 지방유래 줄기세포를 배양하여 지지체 시트를 제조하는 단계; 및(b) 상기 지지체 시트 위에 심장근 세포와 섬유아세포를 시딩하고 배양하여 심장모사 심장이식용 시트를 제조하는 단계.
- 제5항에 있어서, 상기 지방줄기세포는 6웰 플레이트에서 300,000~1,000,000개/웰로 시딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 심장근세포 및 섬유아세포는 6웰 플레이트에서 각각 150,000~400,000개/웰로 시딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 지방줄기세포, 심장근세포 및 섬유아세포의 시딩 비율은 1 : 0.3~0.6 : 0.3~0.6의 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항의 심장모사 심장이식용 시트를 포함하는 심장이식용 조성물.
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