KR20200078250A

KR20200078250A - 지방줄기세포 시트를 함유하는 심장조직 모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20200078250A
Application number: KR1020180167971A
Authority: KR
Inventors: 임도선; 김종호; 주형준
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-07-01
Also published as: WO2020130312A1; KR102200341B1

Abstract

본 발명은 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 심장과 유사한 세포구성을 가지는 심장모사 심장이식용 시트는 손상 심장부위에 이식 시에, 높은 생착율과 이식세포증식능을 나타내어, 심장질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

지방줄기세포 시트를 함유하는 심장조직 모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법{Cardiac Transplantation Sheet Mimicked Cardiac Tissue Containing Adipose Stem Cell Sheed and Method for Preparing Therof}

본 발명은 줄기세포를 함유하는 심장이식용 시트에 관한 것으로 더욱 자세하게는 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

줄기세포는 자기 복제 능력을 갖추면서 어떤 조직으로든 분화할 수 있는 능력을 갖춘 세포를 말하며 미분화 세포이다. 미분화 상태의 세포를 각각의 적절한 조건을 제공해주면, 다양한 세포와 조직으로 분화할 수 있는 강점을 가지는데 이러한 줄기세포의 분화 능력을 이용한 손상된 조직의 재생 치료연구가 활발히 연구되고 있다.

대표적으로 지방줄기세포와 같은 다분화능 줄기세포는 조직이나 기관의 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 조직의 성장과 발달 및 성체 조직의 유지와 재생을 유도하는 기능이 있다. 이러한 조직 특이적 다분화능 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다(Miranville A et al., Circulation. 2004 Jul 20;110(3):349-55). 이는 다른 조직에서보다 많은 양의 줄기세포를 얻을 수 있으며, 추출과정이 안전하고 용이하다는 장점이 있다 (Zuk PA et al., Tissue Eng. 2001 Apr;7(2):211-28).

최근 손상된 장기와 조직의 재생을 위하여 줄기세포를 이식한 후, 손상된 장기와 조직이 회복되는 것이 보고되고 있다(Strauer BE et al., Circulation. 2002 Oct 8;106(15):1913-8). 이에 손상된 장기와 조직으로의 다양한 세포이식 방법이 시도되었다. 줄기세포를 이식하기 위해 손상된 장기나 조직에 줄기세포를 직접 주사하는 방법과 정맥혈관 등으로 주사하여 전신 투여하는 방법 등이 있다. 하지만 이식된 줄기세포는 생착률이 낮으며, 대부분이 씻겨나가는 것으로 보고되고 있다. 이를 극복하기 위하여, 줄기세포의 양과 빈도를 높여 이식을 시행하고 있지만, 고농도의 세포 수를 지속해서 반복해야 하는 문제점이 있으며, 이식을 성공적으로 할지라도 빈곤한 세포환경의 등으로 기대 이상의 치료 효과를 보기에 한계가 있다.

최근 연구보고에 의하면 인간 심장조직에서 유세포 분석을 통한 구성 세포들의 비율을 조사한 결과, 심근세포가 33%, 혈관세포가 24%, 섬유아세포가 43% 정도로 보고되고 있다(Zhou P et al., Circ Res. 2016 Feb 5;118(3):368-70). 그러므로, 생체 심장조직을 모사하기 위해서 심근세포 또는 혈관 단일세포만을 이용한 세포시트 형성 시 견고성, 분비능 및 조직의 치밀도 등이 심장과는 많이 상이할 가능성이 높고, in vitro 에서 오랜 기간 생존성 및 3차원적 형태를 유지하지 못할 수가 있다.

이에, 본 발명자들은 이식된 장기에서 높은 생착률을 가지면서 증식할 수 있는 줄기세포 지지체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 심장 구성세포와 유사한 세포 조합으로 줄기세포 혼합시트를 제조하여, 랫트의 심근경색 모델에 이식하는 경우, 높은 생착율과 증식율에 의하여, 심근경색 부위가 감소되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 생착율과 증식율이 높은 줄기세포 함유 심장이식용 시트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 심장이식용 시트의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 지방유래 줄기세포를 배양하여 지지체 시트를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 지지체 시트 위에 심장근 세포와 섬유아세포를 시딩하고 배양하여 심장모사 심장이식용 시트를 제조하는 단계를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 심장모사 심장이식용 시트를 포함하는 심장이식용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 심장과 유사한 세포구성을 가지는 심장모사 심장이식용 시트는 손상 심장부위에 이식 시에, 높은 생착율과 이식세포증식능을 나타내어, 심장질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 인간유래 지방줄기세포 시트제조시에, 시딩되는 세포 수의 따른 시트 형성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 2는 인간유래 지방줄기세포 시트에 심장근세포 및 섬유아세포를 혼합하여 24시간 동안 배양한 후, 형광현미경을 이용하여 각 세포의 증식을 확인한 사진으로, 심장근세포는 붉은 색으로 나타내었으며, 섬유아세포는 녹색으로 나타내었다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 3은 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제조하기 위한 세포수 조건을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 4는 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트의 단면을 획득하여 H&E 염색을 통하여 획득한 사진이다. 스케일 바는 100㎛이다.
도 5는 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트와 지방쥴기세포 시트에서 분비한 싸이토카인/키모카인 및 성장인자의 분비능을 싸이토카인 어레이를 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 심근경색 마우스 모델에 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트, 지방줄기세포 시트 및 지방줄기세포 시트에 근세포를 혼합한 혼합시트를 각각 이식한 심장에서, 섬유화세포(Masson's trichrome) 염색기법으로 확인한 심장 단면 사진이다.

손상된 장기나 조직에 줄기세포를 이식하는 다양한 방법으로 시도되어 왔으며, 최근 줄기세포 이식방법 중 하나로 세포시트를 이용하는 방법이 시행되고 있으면, 대표적으로 줄기세포만을 다층으로 형성하여 이식하여 패러크라인 영향을 기대하거나, 혹은 성장인자와 싸이토카인들의 추가주입을 통해 이식 효능을 극대화 시켜왔다. 그러나 이들은 줄기세포들은 대부분이 씻겨나가거나, 이식된 세포가 분화 및 증식을 보장하지 못하며, 이식의 저효율 및 시간적, 경제적, 이식 후의 부작용 측면에서 한계를 가졌다.

기존의 방법은 시간과 비용이 많이 들고 생체 이외의 재료 사용으로 그에 따른 부작용이 존재하였다. 지방줄기세포는 자가세포를 사용할 수 있고, 심장 구성세포들이 배양될 수 있는 터전을 제공함으로써 안정적인 생착률 높이며, 증식 및 생존에 있어서 혼합된 세포의 기능을 극대화할 수 있다. 본 발명에서는 심장의 구성세포인 심장근세포와 섬유아세포를 지방줄기세포 시트를 지지체로 하여 배양한 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제작하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트에 관한 것이다.

본 발명에서 지지체로 사용된 인간유래 지방줄기세포 시트는 지방줄기세포를 일반 배양접시에 시딩하여, 심장 구성세포 중 심장근세포 및 섬유아세포를 추가로 동시 시딩하여 시트를 제조하였으며, 본 발명에 따른 시트의 회수가 쉬우며, 손상된 심장조직으로 이식이 가능하다.

또한, 지지체로서의 다양한 줄기세포 및 심장조직을 모사하기 위해 추가 시딩하는 세포의 종류를 변경할 수 있으며, 특정한 종류에 대해 한정하는 것이 아니며, 본 발명의 기술 범위에 포함되는 모든 세포를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 손상된 심장조직으로의 이식에 있어서, 지지체로 쓰이는 세포는 지방줄기세포인 것이 특징이다. 지지체로 사용된 지방줄기세포는 다양한 세포로의 분화 및 손상된 장기 및 조직에서의 회복효과가 보고된 만큼 혼합하는 세포와의 협력효과를 극대화를 위해 지방줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 인간유래 지방줄기세포를 사용하고 있으나, 이에 한정하지 않고, 마우스, 백서, 돼지 그리고 원숭이들을 포함하는 모든 포유류에서 분리한 지방줄기세포를 사용할 수 있다.

본 발명의 이식 가능한 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트는 하기와 같은 제조방법에 따라 제조된 것을 사용할 수 있다.

지방줄기세포의 유래는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지 않으나, 지방조직은 성숙한 지방세포를 포함한 이를 둘러싸고 있는 다양한 주변조직과의 결합되어 구성된 것을 말한다. 체내 위치에 상관없이 모든 지방조직을 총칭한다. 상기 분리되어 배양배지에서 2계대까지 배양된 지방줄기세포를 사용을 권장한다. 본 발명에서는 대표적으로 인간유래 지방줄기세포를 이용하였다.

이러한 줄기세포의 속성을 확인하고 특별히 그 종류를 한정하지 않으나, 대표적으로 일반 6 웰 플레이트에 시트제작이 가능한 밀도인 500,000개/웰 이상을 시딩하는 하는 것이 바람직하다. 만약 상기 지방줄기세포의 개수가 상기 제시된 세포 수 미만이면 지지체의 역할을 수행할 수 없는 조밀한 시트가 형성되지 않는 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 제시된 범위에서 세포 수가 2배 이상 초과하면 상대적으로 사멸한 세포가 많아지며, 배양액의 혼탁 등 오염의 가능성이 커지는 문제점이 있으므로 상기 면적당 밀도가 가장 적합하다.

본 발명의 실시예 1을 참고하면, 본 발명의 지지체로서의 지방줄기세포 시트를 제작을 위한 시딩하는 최적의 면적 당 세포 양을 도출할 수 있었다 (도 1 참조).

본 발명에 있어서, 시트 제작시에 시딩되는 지방줄기세포는 6웰 플레이트에서 300,000~1,000,000개/웰로 시딩하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 300,000개 세포 이하일 경우는 세포가 찢어지거나 시트형성이 제대로 되지 않으며, 1,000,000개/웰의 이상의 세포를 시딩할 경우, 사멸한 세포가 많아지고 시트 회수가 쉽지 않다. 아울러, 상기에서는 6웰 플레이트일 경우의 세포 시딩 개수를 기재하였으나, 다른 종류의 배양기를 쓸 경우는 배양기의 면적에 비례하여 시딩되는 세포 개수를 늘릴 수 있는 것은 당업자에게 자명한 사항이다.

본 발명의 심장모사 심장이식용 시트에서 지방줄기세포와 함께 시딩하는 심장근세포와 섬유아세포는 각각 150,000~400,000개/웰로 시딩하는 것이 바람직하며, 150,000개 이하일 경우에는 심장이식 시에 생착율과 증식능이 저하되며, 400,000개 이상일 경우는 시트에 수용이 불가하다.

본 발명의 심장모사 심장이식용 시트를 형성시키기 위하여는, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양이 바람직하다. 만약 배양 시간이 상기 시간 미만이면 지방줄기세포가 지지체로 형성되기까지 충분하지 않아 찢어지는 문제점이 있으며, 상기 시간 이상이면 오랜 배양 시간으로 인해 지방줄기세포의 줄기세포 역가의 저하, 저산소에 의한 세포사멸로 이어질 수 있는 문제점이 있으므로 상기 시간이 가장 적절하다.

본 발명의 심장모사 심장이식용 시트에서 상기 지방줄기세포: 심장근세포: 섬유아세포의 비율은 1 : 0.3~0.6 : 0.3~0.6의 비율인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:0.4:0.4인 것이 바람직하다. 다만 섬유아세포의 비율이 높으면 증식속도에 따라 심장근세포가 사멸할 수 있다. 이에 상기의 비율조건으로 동시배양하는 것이 가장 적절하다(도 2 참조).

본 발명의 일 양태에서, 심장 구성세포인 심장근세포 및 섬유아세포 동시배양에 있어서 지방줄기세포의 시트와 심장근세포 및 섬유아세포의 비율은 1 : 0.4 : 0.4의 세포 수 비율로 시딩하여 24시간 동안 동시배양하는 것이 바람직하다.

다른 관점에서, 본 발명은 (a) 지방유래 줄기세포를 배양하여 지지체 시트를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 지지체 시트 위에 심장근 세포와 섬유아세포를 시딩하고 배양하여 심장모사 심장이식용 시트를 제조하는 단계를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 실시예 3에 따르면, 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트 확립을 위해 특별히 줄기세포의 유래를 한정하지 않으며, 대표적으로 일반 6 웰 플레이트에 시트제작이 가능한 밀도인 500,000개 지방줄기세포 시트 위에 심장근세포와 섬유아세포를 동시 시딩하는 것이 바람직하다. 이식을 위한 시트 회수 여부는 지지체로 사용되는 지방줄기세포의 양에 의존적이었으며, 적은 양의 인간유래 지방줄기세포(250,000개)에서 탈착을 시도하였을 때 찢어짐을 발생하여 견고성 및 회수가 불가능하였다. 그러나 시트형성의 최소 지방줄기세포 수(500,000개) 이상으로 만들어진 다층의 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제작하기 위해 상기 면적당 밀도가 동시배양에 있어 가장 적합하다(도 3 및 도 4 참고). 추가적으로 본 발명의 심장조직 모사 심장이식용 시트를 회수하는 방법으로 스크레이퍼로 박리하여 회수를 하는 것이 가장 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 일반 배양접시에서 시트를 형성하여 회수할 수 있다.

본 발명의 실시예 4를 참고하면, 인간유래 지방줄기세포 시트와 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트 분비 싸이토카인/키모카인 및 성장인자를 확인한 결과 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트에서 인간유래 지방줄기세포 시트에서 싸이토카인/키모카인 및 성장인자(Adiponectin, aFGF, ICAM-1, ICAM-2, LIF, SDF-1a, TGF alpha, TGF beta2, TGF beta3, CT-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-AB, Troponin I, E-Selectin, L-Selectin, E-Cadherin, P-Cadherin, VE-Cadherin, GRO)의 높은 발현을 확인할 수 있었는데, 이들의 분비는 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이들은 기존의 지방줄기세포 시트와 비교하였을 때 패러크라인 효과를 극대화해줄 것이며, 더욱 좋은 이식의 효과를 줄 수 있다(도 5 참조).

본 발명의 발명자들은 지방줄기세포 시트에 근섬유를 포함하는 혼합시트를 제조한 바 있다(대한민국 특허등록 10-1586839). 상기 혼합시트의 경우는 심장이식 시에 증식능과 생착율이 본 발명의 심장조직 모사 심장이식용 시트보다 떨어지는 것으로 확인되었다. 이에 대하여는 아래 실시예 6 및 도 6에 나타내었다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 관상동맥의 결찰을 통해 급성심근경색 동물모델은 백서를 이용하여 경색을 유도하였으며, 인간유래 지방줄기세포 시트, 인간유래 지방줄기세포 시트와 근세포의 혼합시트 및 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트를 이식하였다. 이식 42일 후, 이식군의 심장을 회수하여 조직학적으로 분석을 위해 군 간의 심근경색 부위의 면적, 심장벽 두께 등을 비교하고, 섬유화세포 염색기법인 Masson's trichrome 염색으로 경색 부위의 변화를 비교한 결과, 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식군에서 다른 군보다 심근경색의 부위가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

또한, 심근경색 동물모델은 관상동맥 결찰로 생긴 경색주변주위에 경색부위를 포함한 심장표면에 이식하였으며, 1회 이식량은 인간유래 지방줄기세포 시트(지름 약 1cm)와 인간유래 지방줄기세포를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트(지름 약 1cm)를 이식하였다. 본 발명의 이식되는 모든 시트에 있어서, 본 발명의 시트는 적절한 세포의 시딩 수에 기인하고, 손상된 심장조직의 면적을 보충하기 위해 자유로운 크기로 구성할 수 있다. 상기 시트의 형상 및 면적에 대해서는 특별히 한정은 없다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 심장모사 심장이식용 시트를 포함하는 심장이식용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는, 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인간유래 지방줄기세포 시트의 제작

심장모사 줄기세포시트에서 지지체로 사용되는 인간유래 지방줄기세포 시트는 다음의 방법으로 제조하였다.

인간유래 지방줄기세포(LONZA, USA)를 이용하여 2계대 배양한 지방줄기세포를 사용하여 지지체로서의 시트를 확립하였다. 구체적으로 지방줄기세포 지지체 시트를 확보하기 위하여, 다양한 세포밀도로 지방줄기세포를 6웰 플레이트에 시딩하여 면적당 세포의 밀도에 따른 시트 형성의 여부를 확인하였다. 배양조건은 세포를 시딩하여 각각 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다. 면적당 세포의 밀도에 따른 시트 형성의 여부를 알아보기 위하여 웰당 다양한 세포 수(250,000개 500,000개 및 1,000,000개)로 6웰 플레이트에 시딩하였다. 인간유래 지방줄기세포 시트를 제조하기 위한 배지조성은 MesenCult MSC Basal Medium(Stemcell technologies, Canada)를 이용하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 일정량(500,000개)의 세포 수에서 동시배양을 위한 지지체 시트를 확립하였다. 지지체 시트 형성에 있어서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양이 바람직하였으며, 500,000개 미만의 세포 수를 시딩한 경우는 구멍이 나서 완전한 시트가 형성되지 않았다(도 1).

실시예 2: 인간유래 지방줄기세포를 지지체로 사용한 심장조직 모사 심장이식용 시트의 제조

실시예 1의 인간유래 지방줄기세포 시트 배양조건을 이용하여 고기능성 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제조하기 휘하여, 혼합시트를 이룰 수 있는 최적 세포 수인 500,000개/웰의 지방줄기세포를 6웰에 시딩한 후 24시간 동안 배양하여 인간유래 지방줄기세포 시트를 형성한 후, 인간유래 심장근세포(AC16; ATCC, Red) 및 인간유래 심장 섬유아세포(NHCF; LONZA, Green)를 추가하여 24시간 동안 배양하였다. 심장조직 모사 심장이식용 시트를 제작하기 위해 인간유래 지방줄기세포 시트 위에 인간유래 심장근세포는 200,000개/웰, 심장 섬유아세포는 200,000개/웰을 추가적으로 동시 시딩하여 24시간 동안 배양하여 제조하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 형성된 시트 내에서 인간유래 지방줄기세포, 심근세포 및 인간유래 심장 섬유아세포의 증식을 형광현미경을 통해 확인할 수 있었다.

실시예 3: 심장조직 모사 심장이식용 시트의 제조

인간유래 지방줄기세포 시트를 지지체로서 심장조직 모사 심장이식용 시트를 확립하고 이식 여부(탈착성)를 확인하기 위해 지방줄기세포 수를 조절하여 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 이식 여부는 지지체로 사용되는 지방줄기세포의 양에 의존적이었으며, 적은 양의 인간유래 지방줄기세포(250,000개)에서 탈착을 시도하였을 때 찢어짐을 발생하여 견고성 및 회수가 불가능하였다. 그러나 시트형성의 최소 지방줄기세포 수(500,000개) 이상으로 만들어진 지방줄기세포를 지지체 사용한 심장조직 모사 심장이식용 시트는 회수 가능한 것을 확인할 수 있었다.

회수한 심장조직 모사 심장이식용 시트의 다층의 유무를 면역형광염색법을 통하여 확인하였다. 확립된 조건인 500,000개의 지방줄기세포를 이용하여 24시간 동안 배양하여 시트를 만들고 인간유래 심장근세포 및 인간유래 심장 섬유아세포를 추가하여 24시간 배양하여, 만들어진 심장조직 모사 심장이식용 시트의 다층의 유무를 확인하기 위하여 시트를 회수하여 단면을 H&E 염색하였다.

그 결과, 도 4에 나타나난 바와 같이, 심장조직 모사 심장이식용 시트는 다층의 시트인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트가 분비하는 싸이토카인/키모카인 및 성장인자 확인

실시예 3에서 제조한 심장조직 모사 심장이식용 시트에서 분비하는 다양한 싸이토카인/키모카인 및 성장인자를 싸이토카인 어레이 기법으로 확인하고, 인간유래 지방줄기세포 시트와 비교하였다.

싸이토카인 어레이(Ray biotech; USA)를 진행하기 위하여, 인간유래 지방줄기세포 시트와 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트를 24시간 배양한 후, 배양액을 회수하였다. 싸이토카인 어레이는 타깃 마커를 선택하여 디자인하였으며 수행방법은 제조사 매뉴얼 내 통상적인 방법을 따라 진행하여 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트에서 인간유래 지방줄기세포 시트보다 싸이토카인/키모카인 및 성장인자(Adiponectin, aFGF, ICAM-1, ICAM-2, LIF, SDF-1a, TGF alpha, TGF beta2, TGF beta3, CT-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-AB, Troponin I, E-Selectin, L-Selectin, E-Cadherin, P-Cadherin, VE-Cadherin, GRO)의 높은 발현을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 랫 심근경색 동물모델에 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식

장기나 조직 내로의 이식여부 및 이식의 효과를 확인하기 위해 6-7주령 백서(SD; 오리엔트바이오)를 준비하여 관상동맥의 결찰로 심근경색을 유도하였다. 유도된 심근경색의 경색부위에 인간유래 지방줄기세포 시트와 실시예 3의 방법으로 제조한 심장조직 모사 심장이식용 시트를 이식하였다. 이식 후, 28일 동안 경시적으로 지방줄기세포의 존재 여부 및 심장 기능의 효과를 확인하였다.

심근경색 동물모델은 관상동맥 결찰로 생긴 경색 주변주위에 경색부위를 포함한 심장표면에 이식하였으며, 1회 이식량은 인간유래 지방줄기세포 시트(지름 약 1cm)와 실시예 3의 방법으로 제조한 심장조직 모사 심장이식용 시트(지름 약 1cm) 및 지방줄기세포 시트를 지지체로 사용하고, 근세포를 혼합한 혼합시트를 이식하였다.

이식 42일 후, 대조군, 인간유래 지방줄기세포 시트, 지방줄기세포 시트에 근세포를 혼합한 혼합시트와 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식군의 심장을 회수하여 조직학적으로 분석을 위해 군 간의 심근경색 부위의 면적, 심장벽 두께 등을 비교하고, 섬유화세포 염색기법인 Masson's trichrome 염색으로 경색 부위의 변화를 비교하였다. Masson's trichrome 염색은 통상적인 조직 염색방법으로 진행하였다(Kim JH et al., PLoS One. 2016 Jun 23;11(6):e0158067).

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군(Only AMI(A)), 인간유래 지방줄기세포 시트(hASC sheet) 및 지방줄기세포 시트에 근세포를 혼합한 혼합시트(hASC based muscle cell sheet) 이식군보다, 본 발명에 따른 심장조직 모사 심장이식용 시트 이식군(hASC based Mix sheet)에서 경색부위를 나타내는 부분(파란색; 화살표 사이 부분)의 면적이 가장 작아졌고, 심벽의 두께도 가장 두꺼워 졌으며, 경색 부위 또한 가장 감소된 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

지방줄기세포로 구성된 시트, 심장근세포 및 섬유아세포를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트.
제1항에 있어서, 상기 지방줄기세포: 심장근세포 : 섬유아세포의 비율은 1 : 0.3~0.6 : 0.3~0.6의 비율인 것을 특징으로 하는 시트.
제1항에 있어서, 지방줄기세포는 6웰 플레이트에서 300,000~1,000,000개/웰로 시딩되어 배양된 것을 특징으로 하는 시트.
제1항에 있어서, 상기 심장근세포 및 섬유아세포는 6웰 플레이트에서 각각
150,000~400,000개/웰로 시딩되어 배양된 것을 특징으로 하는 시트.
다음 단계를 포함하는 심장모사 심장이식용 시트의 제조방법:
(a) 지방유래 줄기세포를 배양하여 지지체 시트를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 지지체 시트 위에 심장근 세포와 섬유아세포를 시딩하고 배양하여 심장모사 심장이식용 시트를 제조하는 단계.
제5항에 있어서, 상기 지방줄기세포는 6웰 플레이트에서 300,000~1,000,000개/웰로 시딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 심장근세포 및 섬유아세포는 6웰 플레이트에서 각각 150,000~400,000개/웰로 시딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 지방줄기세포, 심장근세포 및 섬유아세포의 시딩 비율은 1 : 0.3~0.6 : 0.3~0.6의 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 심장모사 심장이식용 시트를 포함하는 심장이식용 조성물.