WO2022019450A1 - 줄기세포 시트를 제조하는 방법 - Google Patents

줄기세포 시트를 제조하는 방법 Download PDF

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WO2022019450A1
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cells
stem
stem cells
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cell sheet
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김동성
이성진
최이현
박훈준
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포항공과대학교 산학협력단
가톨릭대학교 산학협력단
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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a stem cell sheet, and more particularly, to a method for culturing and priming stem cells, and producing the same in the form of a sheet.
  • Tissue engineering is a field of research aimed at repairing and regenerating damaged tissues.
  • various types of cell tissues cultured outside the body are transplanted and injected into the body. (mesenchymal stem cell)' efficacy is outstanding.
  • Patent Registration No. 2097191 discloses a composition capable of activating mesenchymal stem cells.
  • the present invention provides a cell culture method capable of priming the desired type and amount of paracrine factors in the stem cells, and producing the stem cells in the form of a sheet.
  • the present invention comprises the steps of inoculating stem cells on one side of a cell culture membrane comprising a porous membrane and a cell culture layer on the surface of the porous membrane; And it provides a method for producing a stem cell sheet, comprising the step of inoculating the co-cultured cells on the opposite side of the stem cell inoculated side.
  • the type and amount of a desired paracrine factor can be primed in the stem cells, and further, the stem cells can be prepared in the form of a sheet through temperature change.
  • FIG. 1 (a) shows an image of the porous membrane observed by SEM in an embodiment of the present invention
  • FIG. 1 (b) is SEM showing that a cell culture layer containing polyisopropyl acrylamide is formed on the porous membrane. represents the observed image.
  • Figure 2 shows the change in the surface roughness of the cell culture layer according to the temperature and time according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3(a) shows an image taken at X100 magnification of a phase-contrast inverted fluorescence microscope of stem cells primed by a method for manufacturing a stem cell sheet according to an embodiment of the present invention
  • Figure 3 (b) shows the stem cell sheet harvested after priming is complete.
  • Figure 4 (a) in one embodiment of the present invention, according to the type of co-cultured cells used in the method for producing the stem cell sheet, the image of the primed stem cells taken at X40 magnification of an inverted periodic fluorescence microscope.
  • 4(b) shows the amount and type of paracrine factors stored in the finally harvested stem cell sheet according to the type of co-cultured cells used.
  • the present invention provides a method for manufacturing a stem cell sheet using a cell culture membrane capable of attaching and detaching cells according to a change in temperature.
  • the present invention comprises the steps of inoculating stem cells on one side of a cell culture membrane comprising a porous membrane and a cell culture layer on the surface of the porous membrane; And it provides a method for producing a stem cell sheet, comprising the step of inoculating the co-cultured cells on the opposite side of the surface inoculated with the stem cells.
  • the porous membrane may be formed by randomly intertwining a plurality of polymer nanofibers, or may be formed by molding a polymer synthetic resin.
  • the porous membrane When the porous membrane is formed of a plurality of polymer nanofibers, it may include a plurality of pores formed in a region between the polymer nanofibers. In this case, the pores may have a diameter of several tens of nm to several ⁇ m. That is, the porous membrane can act as a selective permeation membrane that selectively permeates other materials while not allowing cells to permeate due to the pores, thus serving as a material transfer barrier and passage.
  • the porous membrane may include pores having a pore size of an average diameter of 100 nm to 20 ⁇ m, preferably, a pore size of 100 nm to 5 ⁇ m in average diameter.
  • the polymer nanofiber or polymer synthetic resin may be formed of a material containing at least one of a thermoplastic resin, a thermosetting resin, an elastic polymer, and a biopolymer, for example, polycaprolactone, polyurethane ( polyurethane), polyvinylidene fluoride (PVDF), polystyrene, collagen, gelatin, and chitosan It may include at least one selected from the group consisting of, but not limited
  • the cell culture membrane of the present invention has a cell culture layer formed on both sides instead of one side, so that it can be cultured by inoculating stem cells on one side and co-cultured cells on the other side.
  • the cell culture membrane of the present invention may include a cell culture layer whose surface structure changes according to temperature by coating or applying a composition having a surface structure change according to temperature on the porous membrane.
  • the surface structure of the cell culture membrane of the present invention changes according to temperature, so that the cells to be cultured can be easily attached and detached.
  • the cell culture layer changes the surface of the cell culture layer in the temperature range so that the cells are attached at more than 32 ° C. to 40 ° C. or less, and the cells are detached at 0 ° C. or more to less than 32 ° C. facilitates dismounting.
  • the cell culture layer may include polyisopropyl acrylamide polymerized using a coating composition comprising an N -isopropyl acrylamide monomer, a crosslinking agent, a polymerization initiator, and the remainder of water, wherein the crosslinking agent is N -iso It may be 1 part by weight or more to less than 5 parts by weight based on 100 parts by weight of the mixture of propylacrylamide monomer and water. Preferably, it may contain more than 1 part by weight to less than 3% by weight.
  • the content of the crosslinking agent is less than 1 part by weight, there may be a problem that cells do not adhere well to the cell culture layer, and if it is more than 5 parts by weight, cells at a temperature less than LCST (lower critical solution temperature) There may be a problem in that detachment of the cultured cells from the culture layer is delayed.
  • LCST lower critical solution temperature
  • the crosslinking agent serves to polymerize the N -isopropyl acrylamide monomer into polyisopropyl acrylamide, and is a conventional method used for preparing polyisopropyl acrylamide, that is, homopolymerization, copolymerization, and 3
  • Any crosslinking agent that can be used for terpolymerization, crosslinked polymerization, etc. can be used without limitation, preferably N,N'-methylenebisacrylamide (N,N-Methylenebisacrylamide; MBAAm) and tetramethylethylenediamine ( tetramethylethylenediamine, TEMED) or a mixture thereof may be used as a crosslinking agent.
  • the polymerization initiator may be, for example, a photoinitiator, wherein the photoinitiator helps the monomer to perform crosslinking by UV in the coating aqueous solution, and in this case, the photoinitiator may initiate crosslinking through UV.
  • a photoinitiator wherein the photoinitiator helps the monomer to perform crosslinking by UV in the coating aqueous solution, and in this case, the photoinitiator may initiate crosslinking through UV.
  • 2-hydroxy-1-1 [4- (hydroxyethoxy) phenyl] -2-methyl-1 propanone may be used.
  • the cell culture layer has a surface roughness of 4 to 37 nm, preferably 20 to 32 nm, at more than 32 ° C. to 40 ° C. or less, and a surface roughness of 4 ⁇ m or more at 0 ° C. or more to less than 32 ° C. It may have a surface roughness change characteristic.
  • the surface roughness was measured with a non-contact atomic force microscope (Park Systems, Korea) using a PPPNCHR cantilever using a frequency of 300 kHz or a BL-AC40TS cantilever using a frequency of 25 kHz. .
  • the stem cells used in the present invention are not limited to their types, and for example, induced pluripotent stem (IPS) cells, neural stem cells, liver stem cells, hematopoietic stem cells, cord blood stem cells, epidermal stem cells, gastrointestinal stem cells , is selected from the group consisting of endothelial stem cells, muscle stem cells, mesenchymal stem cells, and pancreatic stem cells, more preferably IPS (induced pluripotent stem) cells, liver stem cells, hematopoietic stem cells, umbilical cord blood stem cells, and mesenchymal cells. It may include at least one selected from the group consisting of stem cells.
  • IPS induced pluripotent stem
  • co-cultured cells used in the present invention include, for example, at least one selected from the group consisting of muscle cells, fibroblasts, endothelial cells, and epidermal cells. can do.
  • the co-cultured cells are composed of aortic smooth muscle cells, human dermal fibroblasts, human umbilical vein endothelial cells, and human epidermal cells. At least one selected from the group may be used.
  • the cell culture membrane may be disposed in a chamber filled with a cell culture solution and the cells may be cultured.
  • the cell culture medium may include materials necessary for cell culture, and is not limited as long as it is a culture medium used in the art.
  • the step of inoculating the stem cells and the step of inoculating the co-cultured cells may be performed at a temperature of more than 32 ° C. to 40 ° C. or less, which depends on the detachment effect of the cell culture membrane described above, the adhesion of the cells is It is desirable to control the temperature so that it can be facilitated.
  • the stem cells are inoculated in an amount of 1X10 4 cells/cm 2 to 1X10 5 cells/cm 2 , and when the inoculation amount of the stem cells is less than 1X10 4 cells/cm 2 or 1X10 If it exceeds 5 cells/cm 2 , it may cause problems in cell adhesion/proliferation.
  • a ratio of the number of inoculated stem cells and co-cultured cells may be 3:1 to 1:3. If the ratio of the number of cells is less than 3:1, the content of the collateral non-factor in the stem cells may be significantly reduced, and if it exceeds 1:3, the same problem may also occur.
  • the co-cultured cells are inoculated, when the temperature is below 32°C, the co-cultured cells are not properly attached to the lower surface of the cell culture membrane (that is, the opposite side of the stem cell inoculated surface) due to gravity. Therefore, the co-culture efficiency may be significantly reduced.
  • the present invention may further include the step of priming the stem cells in order to control the type and amount of paracrine factors in the cultured stem cells as desired.
  • the priming refers to a phenomenon in which reactivity (activity) is improved in order to enhance the therapeutic efficacy of stem cells
  • the stem cells of the present invention may be induced by priming by co-cultured cells.
  • the present invention may further include the step of priming the stem cells at a temperature of more than 32 °C to 40 °C or less for 5 to 10 days after inoculating the co-cultured cells.
  • the method of priming stem cells induces stem cell priming by mixing the stem cells with a composition or cells for inducing priming, but in this case, it is difficult to selectively extract only the stem cells. For this reason, when the conventional mixture prepared for inducing stem cell priming is applied to an in vivo environment, problems such as immunogenicity or tumorigenicity may be induced.
  • the priming of the stem cells can be sufficiently induced from the co-cultured cells due to the pores of the porous membrane while culturing the cells separately from the co-cultured cells.
  • priming can be induced by targeting only stem cells.
  • the present invention can desorb the stem cells at a temperature of 0° C. or higher to less than 32° C. after priming the stem cells, desorption of the priming-induced stem cells can also be easily performed.
  • N -isopropyl acrylamide monomer and distilled water were mixed in a 1:1 mass ratio, and the mixture was stirred for 5 minutes so that the N -isopropyl acrylamide monomer was sufficiently dissolved in the distilled water.
  • the low concentration of N -isopropyl acrylamide aqueous solution and the high concentration of N -isopropyl acrylamide aqueous solution were stably divided, and finally, when the N -isopropyl acrylamide aqueous solution was stably separated, pi transferred to each of the solutions using a pipette to the vial N - isopropyl acrylamide: mass ratio of the high water content ratio is 87:13 N - isopropyl acrylamide to give the aqueous solution of 5ml.
  • N,N'-methylenebisacrylamide a crosslinking agent to make it react to UV light when UV-irradiated ( N -isopropyl acrylamide monomer and water 100 weight 0.005 g of 2-hydroxy-1-1[4-(hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1-propanone as photoinitiator ( a mixture of N -isopropylacrylamide monomer and water) 0.01 parts by weight relative to 100 parts by weight) was added to each N -isopropyl acrylamide aqueous solution obtained to prepare an aqueous coating solution.
  • UV-irradiated N -isopropyl acrylamide monomer and water 100 weight 0.005 g of 2-hydroxy-1-1[4-(hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1-propanone as photoinitiator ( a mixture of N -isopropylacrylamide monomer and water) 0.01 parts by weight relative to 100 parts by weight
  • a porous membrane made of collagen and having an average pore size of 5 ⁇ m was prepared, and after coating it entirely using the above aqueous coating solution, it was irradiated with a UV light source for 10 minutes to exceed 32 ° C. to less than 40 ° C.
  • a cell culture membrane coated with a cell culture layer (Fig. 1(b)) to which cells are attached, and to which cells are detached at 0°C or higher to less than 32°C was prepared.
  • the cell culture membrane of the present invention facilitates cell attachment at 37° C. and easy cell detachment at 20° C.
  • Mesenchymal stem cells were inoculated into the prepared membrane for cell culture, and then cultured for 7 days. At this time, the culture medium used for culturing mesenchymal stem cells was used, culture and priming were performed at a temperature of 37 °C, and then harvested the stem cells in the form of 'sheets' in an environment of 20 °C did
  • the stem cells inoculated on the cell culture membrane of the present invention were able to confirm that the culture proceeded normally over time, and as shown in Fig. 3 (b), It was confirmed that the harvested stem cells were in the form of sheets.
  • Stem cells were co-cultured with other types of cells on the prepared cell culture membrane.
  • mesenchymal stem cells were inoculated on one side of the cell culture membrane at 37° C., and untreated, HUVEC, ASMC and hDF were inoculated on the other side, respectively. Thereafter, the mesenchymal stem cells were each primed by culturing for 7 days, and the stem cells were detached in the form of a sheet at 20°C, and then the detached stem cell sheet was observed with a scanning electron microscope, and paracrine stored in the stem cells. The type, content and duration of factors were measured.
  • the stem cell sheet prepared for observation of the detached stem cell sheet was stained with calcein acetoxymethyl (calcein-AM, green) and ethidium homodimer-1 (red), and then this It was observed with an inverted periodic fluorescence microscope (X40/100 magnification).
  • calcein-AM calcein acetoxymethyl
  • red ethidium homodimer-1
  • X40/100 magnification an inverted periodic fluorescence microscope
  • Fig. 4(a) it was confirmed that the shape of the stem cells was changed according to the type of cells to be co-cultured, and as shown in Fig. 4(b), the stem cells and the cells co-cultured with According to the type, it was confirmed that the content and duration differed according to the type of paracrine factor stored in the stem cells.

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Abstract

본 발명은 줄기세포 시트를 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로, 상세하게 본 발명은 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계; 및 상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

줄기세포 시트를 제조하는 방법
본 발명은 줄기세포 시트를 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 줄기세포를 배양 및 프라이밍(Priming)하고, 이를 시트 형태로 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.
조직공학(tissue engineering)은 손상된 조직 치료 및 재생을 목적으로 하는 연구 분야이다. 일반적으로, 손상된 조직을 치료 또는 재생하기 위해 체외에서 배양된 다양한 종류의 세포 조직을 체내에 이식 및 주입하게 되는데, 최근 여러 치료목적으로 사용될 수 있는 다능성(multipotent) 전구 세포인 '중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)'의 효능이 두각을 나타내고 있다.
이러한 효능은 이식된 줄기세포가 체외에서 배양될 때, 상기 줄기세포의 내부에 저장되는 측분비인자(paracrine factor)에 의한 것인데, 그 양과 종류는 세포 배양 환경에 따라 조절된다. 예를 들어, 이를 위해 등록특허 제2097191호에서는 중간엽 줄기세포를 활성화할 수 있는 조성물을 개시하고 있다.
하지만, 현재 체외에서 배양된 줄기세포가 치료목적으로 이식될 때, 내부에 저장된 측분비인자의 지속기간이 낮아, 치료 효능을 발휘하는 데 그 한계가 있다. 이를 위해, 최근 줄기세포 내 측분비인자의 지속기간을 증가시키기 위하여 체외에서 줄기세포를 다른 세포와 공배양하는 방법들이 연구되고 있다. 다만, 이는 궁극적으로 체내 이식될 수 있는 다능성 줄기세포의 숫자(loading dosage)를 현저히 줄어들게 하여 치료 효과를 감소시킬 수 있게 되는 문제점이 생긴다.
따라서, 치료를 위해 체내로 이식되는 줄기세포의 치료 효과를 증가시키기 위한 줄기세포의 배양 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 원하는 측분비인자의 종류 및 양을 상기 줄기세포 내에 프라이밍시킬 수 있고, 상기 줄기세포를 시트 형태로 제조 가능하게 하는 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계; 및 상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 줄기세포 시트를 제조하는 방법에 의해 원하는 측분비인자의 종류 및 양을 상기 줄기세포 내에 프라이밍시킬 수 있으며, 나아가, 온도 변화를 통해 줄기세포를 시트 형태로 제조할 수 있다.
도 1(a)은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 다공성 멤브레인을 SEM으로 관찰한 이미지를 나타내며 도 1(b)는 상기 다공성 멤브레인에 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 세포 배양층이 형성된 것을 SEM으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 세포 배양층 표면 거칠기의 변화를 온도 및 시간에 따라 나타낸 것이다.
도 3(a)는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 줄기세포 시트를 제조하는 방법에 의해 프라이밍되는 줄기세포를 역주기형광현미경(phase-contrast inverted fluorescence microscope)의 X100배율로 촬영한 이미지를 나타내며, 도 3(b)는 프라이밍이 완료되어 수확된 줄기세포 시트를 나타낸다.
도 4(a)는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 줄기세포 시트를 제조하는 방법에 사용되는 공배양 세포의 종류에 따라, 프라이밍된 줄기세포를 역주기형광현미경의 X40배율로 촬영한 이미지를 나타내며, 도 4(b)는 사용되는 공배양 세포의 종류에 따라, 최종적으로 수확된 줄기세포 시트 내에 저장되는 측분비인자의 양 및 종류를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 온도 변화에 따라 세포의 탈부착이 가능한 세포 배양용 멤브레인을 이용하여 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계; 및 상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 다공성 멤브레인은 복수개의 고분자 나노섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 형성되거나, 고분자 합성 수지가 성형됨으로써 형성될 수 있다. 상기 다공성 멤브레인이 복수개의 고분자 나노섬유로 형성되는 경우 고분자 나노섬유들의 사이 영역에 형성된 다수의 공극을 포함할 수 있다. 이때, 상기 공극은 수십nm 내지 수㎛의 직경을 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 멤브레인은 상기 공극으로 인해, 세포들은 투과시키기 않으면서 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 멤브레인은 평균 직경 100nm 내지 20㎛의 직경의 기공 사이즈, 바람직하게는 평균 직경 100nm 내지 5㎛의 기공 사이즈를 가지는 공극을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 고분자 나노섬유 또는 고분자 합성 수지는 열가소성수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함하는 재료로 형성될 수 있으며, 예를 들어 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(polystyrene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 일면이 아닌 양면에 세포 배양층이 형성되어 있어, 일면에는 줄기세포를, 다른 면에는 공배양 세포를 접종시켜 배양시킬 수 있다.
나아가, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 상기 다공성 멤브레인 상에 온도에 따라 표면구조 변화를 갖는 조성물을 코팅 또는 도포하여, 온도에 따라 표면 구조가 변하는 세포 배양층을 포함할 수 있다.
상기 세포 배양층으로 인해, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 온도에 따라 표면 구조가 변하여, 배양되는 세포의 탈부착이 용이하게 될 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되도록, 상기 온도 범위에서 세포 배양층의 표면을 변화시켜 세포의 부착 및 탈착을 용이하게 한다.
상기 세포 배양층은 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체, 가교제, 중합 개시제 및 잔부의 물을 포함하는 코팅 조성물을 이용하여 중합된 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함할 수 있으며, 이때, 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부를 기준으로 1중량부 이상 내지 5중량부 미만일 수 있다. 바람직하게는 1중량부 초과 내지 3중량% 미만을 포함할 수 있다. 상기 가교제의 함량이 1중량부 미만인 경우에는 세포 배양층에 세포가 잘 부착되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 5중량부를 이상인 경우에는 LCST(하한 임계 용액 온도, lower critical solution temperature) 미만의 온도에서 세포 배양층으로부터 배양된 세포의 탈착이 지연되는 문제가 생길 수 있다.
상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체를 폴리이소프로필아크릴아마이드로 중합시키는 역할을 하는 것으로, 폴리이소프로필아크릴아마이드 제조에 사용되는 통상의 방법, 즉 단일중합(homopolymerization), 공중합(copolymerization) 및 3원공중합(terpolymerization), 가교중합(crosslinkedpolymerization) 등에 사용될 수 있는 가교제라면 제한 없이 사용 가능하며, 바람직하게는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide;MBAAm) 및 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine, TEMED) 또는 이들의 혼합이 가교제로서 사용될 수 있다.
한편, 상기 중합개시제는 예를 들어 광개시제일 수 있으며, 이때 광개시제는 코팅 수용액에서 단량체가 UV에 의해 가교결합을 수행할 수 있도록 도와주며, 이때, 상기 광개시제는 UV를 통해 가교결합을 개시할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1프로파논을 사용할 수 있다
나아가, 상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서 표면 거칠기가 4 내지 37nm이고, 바람직하게는 20 내지 32nm일 수 있고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서 표면 거칠기가 4㎛ 이상인 온도에 따른 표면 조도 변화 특성을 가질 수 있다. 이 때 상기 표면 거칠기는 300kHz의 진동수를 사용하는 PPPNCHR 캔틸레버 또는 25kHz의 진동수를 사용하는 BL-AC40TS 캔틸레버를 이용한 비접촉 방식의 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 줄기세포는 그 종류에 제한되지 않으며, 예를 들어, IPS(induced pluripotent stem) 세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포　및 췌장 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 IPS(induced pluripotent stem) 세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포　및 중간엽 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 공배양 세포는 예를 들어 근세포(muscle cell), 섬유아세포(fibroblasts), 내피세포(endothelial cells), 및 표피 세포(epidermal cells)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
바람직하게는 공배양 세포는 대동맥평활근세포(aortic smooth muscle cell), 인간 섬유아세포(human dermal fibroblasts), 인간 제정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells), 및 인간 표피 세포(human epidermal cells)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 배양을 위해, 상기 세포 배양용 멤브레인을 세포 배양액이 채워진 챔버에 배치하고 세포를 배양할 수 있다. 상기 세포 배양액은 세포 배양에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있으며, 당업계에서 사용되는 배양액이라면 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 줄기세포를 접종하는 단계 및 공배양 세포를 접종하는 단계는 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 수행될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 세포 배양용 멤브레인의 탈부착 효과에 따라, 세포의 부착이 용이하게 될 수 있도록 온도를 조절하는 것이 바람직하다.
이 때, 상기 줄기세포를 접종하는 단계에서 줄기세포는 1X10 4 cells/cm 2 내지 1X10 5 cells/cm 2의 양으로 접종되며, 상기 줄기세포의 접종량이 1X10 4 cells/cm 2 미만인 경우나, 1X10 5 cells/cm 2을 초과하는 경우에는 세포의 부착/증식에 문제를 일으킬 수 있다.
접종되는 줄기세포 및 공배양 세포의 수의 비는 3:1 내지 1:3일 수 있다. 상기 세포 수의 비가 3:1미만인 경우에는 줄기세포 내의 측부비인자의 함량이 현저 히 줄어들수 있으며, 1:3을 초과하는 경우에 역시 동일 문제가 발생할 수 있다.
따라서, 공배양 세포를 접종할 때, 32℃이하의 온도가 되면, 중력에 의해 상기 세포 배양용 멤브레인의 하면(즉, 줄기세포가 접종된 면의 반대면)에 상기 공배양 세포가 제대로 부착되지 않아, 공배양 효율이 현저히 감소할 수 있다.
나아가, 본 발명은 배양하는 줄기세포에 측분비인자의 종류 및 양을 원하는 대로 조절하기 위해, 줄기세포를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 프라이밍(Priming)은 줄기세포의 치료 효능을 증진시키기 위하여 반응성(활성)이 향상되도록 하는 현상을 의미하며, 본 발명의 줄기세포는 공배양 세포에 의해 프라이밍이 유도될 수 있다. 구체적으로 본 발명은 상기 공배양 세포를 접종한 후, 5 내지 10일 동안 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 줄기세포를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로 줄기세포를 프라이밍하는 방법은 줄기세포와 프라이밍을 유도하는 조성물 또는 세포와 혼합하여 줄기세포의 프라이밍을 유도하나, 이 경우 줄기세포만을 선택적으로 추출하는데 어려움이 있다. 이로 인해, 종래의 줄기세포 프라이밍 유도를 위하여 제작된 혼합물이 체내환경에 적용될 시, 면역원성(immunogenicity) 또는 종양원성(tumorigenicity)과 같은 문제가 유발될 수 있다.
반면, 본 발명의 줄기세포 시트를 제조하는 방법은 공배양 세포와 분리되어 세포를 배양하면서, 동시에 다공성 멤브레인의 공극으로 인해 공배양 세포로부터 줄기세포의 프라이밍을 충분히 유도할 수 있기 때문에, 종래 줄기세포를 프라이밍하는 방법과는 달리, 줄기세포만을 표적으로 프라이밍을 유도할 수 있다.
나아가, 본 발명은 줄기세포를 프라이밍한 후, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만의 온도에서 상기 줄기세포를 탈착할 수 있기 때문에, 프라이밍이 유도된 줄기세포의 탈착 역시 용이하게 수행될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
1. 세포 배양용 멤브레인의 제조.
N-이소프로필아크릴아마이드 단량체와 증류수를 1:1 질량비로 혼합하고, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체가 증류수에 충분히 녹을 수 있도록 5분 동안 교반하였다. 시간이 지남에 따라서, 낮은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액과 높은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액은 안정적으로 나뉘게 되었고, 최종적으로 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액이 안정적으로 분리되었을 때, 파이펫을 이용하여 각각의 용액을 바이알에 옮겨 N-이소프로필아크릴아마이드:물의 질량비가 87:13인 높은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액 5ml을 수득하였다.
그 다음, 자외선 조사처리를 할 때 자외선에 반응하게 만들기 위한 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide; MBAAm) 0.05g ( N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 1중량부) 와 광개시제인 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 0.005g ( N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 0.01중량부)를 수득한 각각의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액에 첨가하여 코팅 수용액을 제조하였다.
나아가, 콜라겐으로 이루어지며 평균 공극이 5㎛인 다공성 멤브레인(도 1(a))을 제조하고, 이를 상기 코팅 수용액을 이용하여 전체적으로 코팅한 후 UV 광원을 10분간 조사하여 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층이 코팅된 세포 배양용 멤브레인(도 1(b))을 제조하였다.
2. 표면 거칠기의 변화 측정
표면 거칠기의 변화를 측정하기 위해 제조된 세포 배양용 멤브레인의 표면에서, 온도 및 시간에 따른 표면 거칠기 변화를 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 보이는 바와 같이, LCST를 초과하는 온도인 37℃에서는 상기 세포 배양용 멤브레인 표면의 거칠기 변화가 거의 없는 반면, LCST 미만의 온도인 20℃에서는 상기 세포 배양용 멤브레인의 표면의 거칠기 변화가 급격하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인은 37℃에서는 세포의 부착이 용이하며, 20℃에서는 세포의 탈착이 용이함을 확인할 수 있었다.
3. 줄기세포 시트의 제조
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 상기 제조된 세포 배양용 멤브레인에 접종하고, 그 후 7일간 배양하였다. 이 때, 배양액은 중간엽 줄기세포를 배양하는 데 사용되는 배양액을 사용하였으며, 배양 및 프라이밍은 37℃의 온도에서 수행하고, 그 후 20℃의 환경에서 상기 줄기세포를 '시트'의 형태로 수확하였다.
그 결과 도 3(a)에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 세포 배양용 멤브레인에 접종된 줄기세포는 시간이 지남에 따라 배양이 정상적으로 진행되는 것을 확인할 수 있었으며, 도3(b)에서 보이는 바와 같이, 수확된 줄기세포는 시트의 형태임을 확인할 수 있었다.
4. 공배양 세포의 종류에 따른 줄기세포 시트의 제조.
상기 제조된 세포 배양용 멤브레인에 줄기세포를 다른 종류의 세포와 공배양시켰다.
구체적으로는 37℃에서 상기 세포 배양용 멤브레인의 일면에 중간엽 줄기세포를 접종하였으며, 반대면에는 무처리, HUVEC, ASMC 및 hDF를 각각 접종하였다. 그 후 7일간 배양하여 상기 중간엽 줄기세포를 각각 프라이밍하였으며, 20℃에서 상기 줄기세포를 시트 형태로 탈착한 후, 탈착된 줄기세포 시트를 주사전자현미경으로 관찰하였으며, 상기 줄기세포 내에 저장된 측분비인자의 종류, 함량 및 지속시간을 측정하였다.
구체적으로 탈착된 줄기세포 시트의 관찰을 위하여 제작된 줄기세포 시트를 칼세인 아세톡시메틸(calcein-AM, green)과 에티듐 호모다이머(ethidium homodimer-1, red)를 사용하여 염색시킨 후, 이를 역주기형광현미경(X40/100배율)으로 관찰하였다. 또한, 측분비인자 (VEGF, Angiopoietin-1)의 함량 및 지속시간 측정을 위하여는 해당인자 검증을 위한 엘라이자 키트(Elisa kit, R&D systems)를 사용하였다.
그 결과, 도 4(a)에 보이는 바와 같이, 공배양되는 세포의 종류에 따라 줄기세포의 형태가 바뀌는 것을 확인할 수 있었으며, 도4(b)에 보이는 바와 같이, 줄기세포와 공배양되는 세포의 종류에 따라, 줄기세포 내에 저장되는 측분비인자의 종류에 따른 함량과 지속시간이 달라짐을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (12)

  1. 다공성 멤브레인 및 상기 다공성 멤브레인 표면의 세포 배양층을 포함하는 세포 배양용 멤브레인의 일면에 줄기세포를 접종하는 단계; 및
    상기 줄기세포가 접종된 면의 반대면에 공배양 세포를 접종하는 단계를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양층은 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체, 가교제, 중합 개시제 및 잔부의 물을 포함하는 코팅 조성물을 이용하여 중합된 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100 중량부를 기준으로 1 중량부 이상 내지 5 중량부 미만인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양층은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서 표면 거칠기가 4 내지 37nm이고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서 표면 거칠기가 4㎛ 이상인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 가교제는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide;MBAAm), 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine,TEMED) 또는 이들의 혼합인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 멤브레인의 공극은 평균 직경 100nm 내지 20㎛의 기공 사이즈를 갖는 것인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 IPS(induced pluripotent stem) 세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포　및 췌장 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나이며,
    상기 공배양 세포는 근세포(muscle cell), 섬유아세포(fibroblasts), 인간 내피세포(endothelial cells), 및 표피 세포(epidermal cells)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포를 접종하는 단계 및 공배양 세포를 접종하는 단계는 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 수행되는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포를 접종하는 단계에서 줄기세포는 1X10 4 cells/cm 2 내지 1X10 5 cells/cm 2의 양으로 접종되며,
    상기 공배양 세포를 접종하는 단계에서 공배양 세포는 1X10 4 cells/cm 2 내지 1X10 5 cells/cm 2의 양으로 접종되는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 공배양 세포를 접종하는 단계에 후속적으로, 5 내지 10일 동안 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 줄기세포를 프라이밍하는 단계를 추가로 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 줄기세포를 프라이밍한 후, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만의 온도에서 상기 줄기세포를 탈착하는 단계를 추가로 포함하는, 줄기세포 시트를 제조하는 방법.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090120665A (ko) * 2008-05-20 2009-11-25 주식회사 원바이오젠 온도응답성 고분자를 이용한 세포배양/회수용 매트릭스 및그 제조방법
KR20150111535A (ko) * 2014-03-25 2015-10-06 주식회사 아모그린텍 줄기세포 배양용 나노섬유 하이브리드 멤브레인 및 이를 이용한 줄기세포의 배양 방법
KR20190032917A (ko) * 2017-09-20 2019-03-28 포항공과대학교 산학협력단 형상 맞춤형 세포층 시트 제조를 위한 형상 기억 수지 지지체 시트
KR20200068758A (ko) * 2014-10-01 2020-06-15 샌바이오, 인크. 줄기 세포 배양을 위한 유도 배지 및 방법 및 요법
KR20200078250A (ko) * 2018-12-21 2020-07-01 고려대학교 산학협력단 지방줄기세포 시트를 함유하는 심장조직 모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101586839B1 (ko) * 2015-07-29 2016-01-19 고려대학교 산학협력단 줄기세포 지지체를 이용한 근세포 혼합시트 및 그의 제조방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090120665A (ko) * 2008-05-20 2009-11-25 주식회사 원바이오젠 온도응답성 고분자를 이용한 세포배양/회수용 매트릭스 및그 제조방법
KR20150111535A (ko) * 2014-03-25 2015-10-06 주식회사 아모그린텍 줄기세포 배양용 나노섬유 하이브리드 멤브레인 및 이를 이용한 줄기세포의 배양 방법
KR20200068758A (ko) * 2014-10-01 2020-06-15 샌바이오, 인크. 줄기 세포 배양을 위한 유도 배지 및 방법 및 요법
KR20190032917A (ko) * 2017-09-20 2019-03-28 포항공과대학교 산학협력단 형상 맞춤형 세포층 시트 제조를 위한 형상 기억 수지 지지체 시트
KR20200078250A (ko) * 2018-12-21 2020-07-01 고려대학교 산학협력단 지방줄기세포 시트를 함유하는 심장조직 모사 심장이식용 시트 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG JUN, PENG CHING-AN: "Poly(N-isopropylacrylamide) modified polydopamine as a temperature-responsive surface for cultivation and harvest of mesenchymal stem cells", BIOMATERIALS SCIENCE, vol. 5, no. 11, 1 January 2017 (2017-01-01), GB , pages 2310 - 2318, XP055832409, ISSN: 2047-4830, DOI: 10.1039/C7BM00371D *

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