KR20210015911A - 망막 색소 상피 세포 막 및 그의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 망막 색소 상피 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 분리 방법에 의해 망막 색소 상피 세포를 분리하고, 분리된 세포를 사용하여 세포 막을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 방법에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포 막, 및 관련 질환 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2019년 2월 28일에 제출된 중국 특허 출원 번호 CN 201910149326.3 (발명의 명칭: "망막 색소 상피 세포 시트 및 그의 제조 방법")을 우선권 주장한다. 상기 중국 특허 출원 개시내용은 그 전문이 본 출원의 일부로서 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 조직 공학 및 재생 의학 분야, 특히 망막 색소 상피 세포 분리 및 망막 색소 상피 세포 시트 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 방법에 의해 분리된 망막 색소 상피 세포 시트 및 관련 질환의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 관련된 안구 질환, 예컨대 망막 변성의 경우, 망막 색소 세포 이식이 중요한 치료 접근법 중 하나이다. 그러나, 이식을 위한 다수의 고활성 망막 색소 상피 세포를 수득하는 방법은 관련 기술분야에서 시급한 문제이다.
전통의 망막 색소 상피 세포 분리 및 배양 방법은 보통 판크레아틴 소화의 화학적 방법을 사용하지만, 이에 대한 단점 중 하나는 망막 색소 층으로부터 다량의 활성 망막 색소 상피 세포를 효과적으로 수득할 수 없다는 것이다. 한편, 효소 소화 시간은 조절하기 어렵다. 시간이 너무 짧으면, 조직이 완전히 소화되지 않고, 충분한 양의 세포를 수득할 수 없고; 반면에, 너무 긴 시간은 세포 활성을 손상시켜 높은 활성인 세포 수득을 방해할 수 있을 것이다. 그러나, 이식 적용에서, 망막 색소 상피 세포의 양 및 품질 둘 모두가 세포 이식의 효과를 결정하는 중요한 요소이다. 따라서, 비교적 다량의 높은 활성인 균질한 망막 색소 상피 세포를 수득하기 위해 세포의 분리 및 배양 방법을 개선시키는 것이 특히 중요하다.
추가로, 망막 색소 상피 세포 이식시 직접적인 세포 주입은 다수의 세포의 손실, 낮은 치료 효율을 초래할 것이며; 비록 세포를 조직 공학 스캐폴드와 조합하는 이식이 세포 손실의 문제를 해결하기는 하지만, 스캐폴드 물질은 생체 내에서 상이한 정도의 염증 반응을 유발할 수 있고, 스캐폴드 물질의 분해 과정 뿐만 아니라 그의 분해 생성물이 국소 조직 병변을 유발할 수 있다. 따라서, 관련 기술분야에는 망막 색소 상피 세포 및 관련 생성물의 적용 방법이 여전히 요구되고 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은
a. 안구 후방에 배상 조직을 제공하는 단계;
b. 망막 조직을 꺼내고, 색소 상피층 조직을 분리하는 단계;
c. 색소 상피층 조직을 조각으로 절단하고, 기계적으로 분산시킨 후 우태아 혈청으로 미리 코팅된 다중 웰 플레이트에 플레이팅하는 단계; 및
d. 망막 색소 상피 세포가 분산된 조직 블록으로부터 이동하도록 하는 데 충분한 기간 동안 다중 웰 플레이트를 인큐베이션하여,
망막 색소 상피 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 세포를 분리하는 방법이며, 여기서 방법은 효소를 이용하여 조직 또는 세포를 소화시키는 단계를 수반하지 않는 것인 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 단계 c에서 사용된 다중 웰 플레이트는 고농도의 우태아 혈청으로 미리 코팅된 것이다. 예를 들어, 다중 웰 플레이트는 본 개시내용의 망막 색소 상피 세포를 분리하는 방법에서 사용하기 위해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 95% 또는 100% 농도의 우태아 혈청으로 미리 코팅될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중 웰 플레이트를 미리 코팅하는 시간은 예를 들어, 6시간 초과일 수 있다. 예를 들어, 미리 코팅하는 시간은 6-48시간, 또는 12-24시간일 수 있다.
다중 웰 플레이트는 세포 배양을 위한 통상의 조건하에서 미리 코팅될 수 있다. 예를 들어, 다중 웰 플레이트를 미리 코팅하는 것은 예를 들어 인큐베이터에서 약 37℃ 온도 및 5% CO2에서 수행될 수 있다.
시험관내 세포주 확립 과정에서, 본 개시내용의 방법은 조직을 효소, 예컨대 판크레아틴으로 소화시키는 것은 회피하고, 간단히 기계적 분리 방법을 이용하여 비교적 온화한 방식으로 안구로부터 멜라닌 상피 조직을 분리한다. 분리된 조직 블록을 미리 코팅된 부착성 페트리 디시에서 배양하여 세포가 자발적으로 조직 블록으로부터 이동하도록 한다. 전통 분리 방법으로 수득된 세포와 비교하면, 본 방법은 효소에 의해 유발되는 조직 세포에 대한 손상을 방지하고, 또한 다른 세포로 덜 오염되고, 수득된 망막 색소 상피 세포는 생존력 및 균질성이 더욱 우수하다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은
a. 본 개시내용의 망막 색소 상피 세포를 분리하는 방법에 의해 망막 색소 상피 세포를 분리하는 단계;
b. 망막 색소 상피 세포를 배양하고, 계대배양하는 단계;
c. 혈청 함유 배지로 미리 코팅된 열 감수성 페트리 디시에 망막 색소 상피 세포를 시딩하는 단계;
d. 일정 기간 동안 열 감수성 페트리 디시를 인큐베이션한 후, 온도를 감소시킴으로써 망막 색소 상피 세포를 페트리 디시로부터 탈착시켜,
망막 색소 상피 세포 시트를 수득하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 세포 시트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
세포 시트 기술은 확장 및 부착된 세포를 온도를 변화시키는 물리적 방법에 의해 페트리 디시 바닥으로부터 분리시켜 시트와 유사한 세포 구조를 수득하는 기술이다. 판크레아틴 소화를 이용하여 세포를 수집하는 전통 방법과 비교하였을 때, 상기 기술에 의해 수집된 세포는 시험관내 배양 동안 분비된 세포외 매트릭스, 확립된 세포-매트릭스 연결, 및 세포간 연결과 같은 구조를 유지한다.
상기 기술된 세포 시트 제조의 일부 실시양태에서, 망막 색소 상피 세포는 단계 b에서 DMEM/F12 배지 및 고글루코스 DMEM 배지의 혼합 배지를 사용하여 배양된다.
일부 실시양태에서, 혼합 배지 중 DMEM/F12 배지 대 고글루코스 DMEM 배지의 비는 1:5 내지 5:1이다. 예를 들어, DMEM/F12 배지 대 고글루코스 DMEM 배지의 비는 1:4 내지 4:1; 1:3 내지 3:1; 1:2 내지 3:1; 1:1 내지 3:1; 1:1 내지 2:1; 2:1 내지 4:1, 또는 2:1 내지 3:1일 수 있다. 일부 실시양태에서, DMEM/F12 배지 대 고글루코스 DMEM 배지의 비는 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1 또는 약 4:1일 수 있다.
일부 실시양태에서, 특정 비율의 혈청 및 다른 시토카인 및 첨가제가 혼합 배지에 첨가된다. 예를 들어, 10% 혈청이 혼합 배지에 첨가될 수 있고/거나, EGF, bFGF, 및 B27로부터 선택되는 시토카인이 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 망막 색소 상피 세포는 배양 및 계대배양되어, 세포 시트 제조에 충분한 양의 망막 색소 상피 세포가 수득된다. 예를 들어, 계대수 P2-P15의 망막 색소 상피 세포가 단계 c에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 c에서 사용된 망막 색소 상피 세포의 계대수는 P3-P10이다.
일부 실시양태에서, 망막 색소 상피 세포를 열 감수성 페트리 디시로 시딩할 때, 세포 시트를 더욱 잘 수득하기 위해 세포 밀도가 조절될 수 있다. 예를 들어, 단계 c에서 망막 색소 상피 세포의 시딩 밀도는 1x106 내지 1x107개 세포/ml일 수 있고, 예컨대, 시딩은 약 5x106개 세포/ml 또는 약 6x106개 세포/ml일 수 있다.
페트리 디시의 상이한 크기에 따라 상이한 양의 망막 색소 상피 세포가 시딩될 수 있다. 예를 들어, 35 mm 페트리 디시의 경우, 상기 기술된 바와 같은 밀도로 약 2 ml의 망막 색소 상피 세포가 시딩될 수 있고; 60 mm 페트리 디시의 경우, 상기 기술된 바와 같은 밀도로 약 3 ml의 망막 색소 상피 세포가 시딩될 수 있고; 100 mm 페트리 디시의 경우, 상기 기술된 바와 같은 밀도로 약 5 ml의 망막 색소 상피 세포가 시딩될 수 있다.
일부 실시양태에서, 열 감수성 페트리 디시는 세포의 페트리 디시에의 부착을 증가시키기 위해 시딩 이전에 혈청을 함유하는 배지로 미리 코팅된다. 일부 실시양태에서, 열 감수성 페트리 디시는 5%-30%, 예컨대, 10%-20%, 예컨대, 약 10% 혈청을 함유하는 배지로 미리 코팅된다. 열 감수성 페트리 디시는 세포 배양을 위해 사용된 것과 동일한 배지 또는 상이한 배지로 미리 코팅될 수 있다.
일부 실시양태에서, 열 감수성 페트리 디시를 미리 코팅하는 시간은 예를 들어, 6시간 초과일 수 있다. 예를 들어, 미리 코팅하는 시간은 6-48시간, 예컨대, 12-36시간, 예컨대, 12-24시간 또는 24-36시간일 수 있다.
열 감수성 페트리 디시는 세포 배양을 위한 통상의 조건하에서 미리 코팅될 수 있다. 예를 들어, 열 감수성 페트리 디시를 미리 코팅하는 것은 예를 들어, 인큐베이터에서 약 37℃ 온도 및 5% CO2에서 수행될 수 있다.
온도 지능 페트리 디시는 대개는 페트리 디시 바닥에 공유적으로 코팅된 폴리 N-이소프로필아크릴아미드 (PIPAAm) 중합체 물질을 이용함으로써 제조된다. 배양 온도가 약 37℃일 때, 시딩된 세포는 부착되어 증식한다. 온도를 약 32℃ 미만으로 감소시키면, 코팅된 중합체 물질은 소수성 상태에서 친수성 상태로 변하고, 세포 시트는 또한 부착 상태에서 해리 상태로 변하고, 이에 따라 효소 소화 없이 완전한 세포 시트를 수득할 수 있다.
단계 d에서, 열 감수성 페트리 디시의 온도를 다양한 방식으로 감소시킬 수 있고, 이에 따라 망막 색소 상피 세포는 페트리 디시로부터 탈착되어 세포 시트를 형성한다. 일부 실시양태에서, 온도는 단계 d에서 배양 배지를 꺼내고 미리 냉각된 HBSS 완충제, 예컨대, 4℃로 미리 냉각된 HBSS 완충제를 열 감수성 페트리 디시에 첨가함으로써 감소되고, 이에 따라 망막 색소 상피 세포가 페트리 디시로부터 탈착된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포 시트에 관한 것이다. 본 개시내용의 분리 방법 및 세포 시트 제조 방법에 의해 수득된 망막 색소 상피 세포 시트는 시험관내 배양 동안 분비된 세포외 매트릭스, 확립된 세포-매트릭스 연결, 및 세포간 연결과 같은 구조는 유지하고, 여기서 망막 색소 상피 세포는 높은 생존력 및 균질성을 갖고, 이식과 같은 적용에서 더욱 잘 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 시트는 제조 공정 동안 페트리 디시와 접촉하지 않는 표면 (상부 표면) 및 페트리 디시와 접촉하는 기저 표면 (기저 표면)을 갖고, 기저 표면은 세포 코넥신이 풍부하고, 비교적 거칠다. 거친 기저 표면은 더욱 큰 마찰을 제공할 수 있으며, 이는 적용 동안 세포 시트가 적용 부위에 더욱 잘 부착되도록 하는 데 유익하다.
일부 실시양태에서, 세포 시트는 피브로넥틴 및 인테그린 β1이 풍부하다.
일부 실시양태에서, 세포 시트 중 망막 색소 상피 세포는 다양한 시토카인, 예컨대, 혈관신생 인자 및 면역조정 인자를 분비할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈관신생 인자 및 면역조정 인자로는 간세포 성장 인자 (HGF), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-8 (IL-8) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 하나 이상을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료를 필요로 대상체의 안구에 본 개시내용의 망막 색소 상피 세포 시트를 적용하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료를 필요로 대상체에서 상기 안구 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 안구 질환은 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 당뇨성 망막병증, 망막 박리, 중심 망막 동맥 폐색, 중심 망막 정맥 폐색, 망막 위축, 망막 색소 상피 박리, 포도막염, 및 병적 근시로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서의 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료에서의 본 개시내용의 망막 색소 상피 세포 시트의 용도에 관한 것이다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서의 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료를 위한 제약 조성물의 제조에서의 본 개시내용의 망막 색소 상피 세포 시트의 용도에 관한 것이다.
상기 용도의 일부 실시양태에서, 안구 질환은 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 당뇨성 망막병증, 망막 박리, 중심 망막 동맥 폐색, 중심 망막 정맥 폐색, 망막 위축, 망막 색소 상피 박리, 포도막염, 및 병적 근시로부터 선택된다.
도 1은 본 개시내용의 배양 방법에 의해 배양된 망막 상피 세포, 및 전통 배지를 사용하여 배양된 세포의 시간 경과에 따른 성장의 선 차트를 보여준다.
도 2는 배양된 세포를 상응하는 항체로 염색한 결과를 형광 현미경법으로 보여준다. 도 2a는 상피 세포-특이적 마커 CK19의 염색 결과를 보여주고; 도 2b는 네스틴(Nestin)의 염색 결과를 보여주고; 도 2c는 RPE-65의 염색 결과를 보여준다.
도 3은 배양된 세포의 분자 발현을 시험한 결과를 유세포 분석법으로 보여준다. 세포에 대해 CD14, HLA-DR, CD44, CD34 및 CD45의 발현 결과가 제시된다.
도 4는 계대수가 P8인 망막 색소 상피 세포 집단의 세포 주기 분석 결과를 보여준다.
도 5는 망막 색소 상피 세포 증식을 시험한 결과를 Ki67 염색으로 보여준다.
도 6은 망막 색소 상피 세포 시트의 주사 전자 현미경 영상 사진을 보여준다. 도 6a: 세포 시트의 상부 표면. 도 6b: 세포 시트의 하부 표면 (기저 표면).
도 7은 망막 색소 상피 세포 시트의 면역형광 영상 사진을 보여준다. 도 7a: 피브로넥틴. 도 7b: 인테그린 β1.
도 8은 ELISA 방법으로 시험된 망막 색소 상피 세포 시트의 배양 상청액 중에서의 시토카인 발현 결과를 보여준다.
도 2는 배양된 세포를 상응하는 항체로 염색한 결과를 형광 현미경법으로 보여준다. 도 2a는 상피 세포-특이적 마커 CK19의 염색 결과를 보여주고; 도 2b는 네스틴(Nestin)의 염색 결과를 보여주고; 도 2c는 RPE-65의 염색 결과를 보여준다.
도 3은 배양된 세포의 분자 발현을 시험한 결과를 유세포 분석법으로 보여준다. 세포에 대해 CD14, HLA-DR, CD44, CD34 및 CD45의 발현 결과가 제시된다.
도 4는 계대수가 P8인 망막 색소 상피 세포 집단의 세포 주기 분석 결과를 보여준다.
도 5는 망막 색소 상피 세포 증식을 시험한 결과를 Ki67 염색으로 보여준다.
도 6은 망막 색소 상피 세포 시트의 주사 전자 현미경 영상 사진을 보여준다. 도 6a: 세포 시트의 상부 표면. 도 6b: 세포 시트의 하부 표면 (기저 표면).
도 7은 망막 색소 상피 세포 시트의 면역형광 영상 사진을 보여준다. 도 7a: 피브로넥틴. 도 7b: 인테그린 β1.
도 8은 ELISA 방법으로 시험된 망막 색소 상피 세포 시트의 배양 상청액 중에서의 시토카인 발현 결과를 보여준다.
본 발명은 하기에서 구체적인 실시예와 조합하여 추가로 기술된다. 본 발명의 장점 및 특징은 본 설명으로 더욱 명확해질 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 기술적 해결안의 세부 사항 및 형태가 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않고 변형 또는 치환될 수 있지만, 이러한 변형 및 치환은 본 발명의 보호 범주 내에 포함된다는 것을 이해하여야 한다.
실시예
1. 망막 색소 상피 세포 분리
망막 색소 상피 세포를 제조하는 기존 방법은 샘플링 공정 동안 세포에 비교적 큰 손상을 발생시키고, 수득된 1차 세포의 수는 적고, 품질은 불량하다. 본 실시예에서, 조직 블록을 기계적 수단으로 파쇄하고, 조직 블록을 배양하고, 이에 따라 망막 색소 상피 세포는 활발히 밖으로 이동한다. 이러한 방법에서, 조직 블록을 충분하게 부착시키는 방법은 고려되어야 할 중요 인자 중 하나이다. 본 실시예의 방법은 하기 단계를 포함한다.
다중 웰 플레이트를 미리 코팅하는 단계: 6-웰 플레이트를 100% 우태아 혈청으로 미리 코팅하고, 1 ml의 우태아 혈청을 각 웰에 첨가한다. 인큐베이션을 위해 6-웰 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 세포 인큐베이터에 넣는다.
조직 분리 단계: 유산된 태아로부터 안구 후방의 배상 조직을 분리하고, 안구 후방의 배상 조직을 멸균 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 철저히 세정하고, 플럼 시트 형상으로 절단한다. 망막 조직을 꺼낸 후, 색소 상피층 조직을 박리시킨다. 박리된 조직을 35 mm 페트리 디시에 넣고, 소량의 배지를 첨가한다. 조직을 안과용 곡면 미세가위로 반복적으로 파쇄하고, 파쇄된 조직에 소량의 배양 배지를 첨가한다.
조직 부착 단계: 미리 코팅된 6-웰 플레이트를 꺼내고, 코팅 용액을 흡인하고, 폐기한다. 날카로운 피펫을 이용하여 조직을 분산시킨 후 조직 현탁액을 코팅된 6-웰 플레이트에 시딩한다. 6-웰 플레이트를 인큐베이터에 넣고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션한다.
실시예
2. 망막 색소 상피 세포 배양
망막 색소 상피 세포의 경우, 전통 배양 방법은 배양을 위해 10% 혈청으로 보충된 DMEM/F12 배지를 사용하는 것으로, 이는 긴 세포 배양 시간, 평균 세포 순도 및 낮은 생존율과 같은 문제를 갖고 있다. 본 실시예에서, 배양 배지는 개선된다.
전통 DMEM/F12 배지는 배지 영양을 더 높히기 위해 제제에 미량 원소 및 무기 이온을 첨가하는 것을 특징으로 하는 반면, 고글루코스 DMEM 배지는 1차 세포 배양에 더 적합하고, 시험관내에서 세포 성장 및 확장을 촉진시킨다. 본 실시예에서, 세포 배양은 60% DMEM/F12 배지, 30% 고글루코스 DMEM 배지 및 10% 혈청을 함유하는, DMEM/F12 배지 및 고글루코스 DMEM 배지의 혼합 배지를 사용하여 수행된다. 추가로, EGF (4 ng/ml), bFGF (4 ng/ml) 및 B27 (2 ml/100 ml)이 보충제로서 첨가된다. 도 1에 제시된 바와 같이, 이러한 혼합 배지 사용에 의해, 망막 색소 상피 세포의 증식 속도는 가속화되고, 세포의 성장 상태는 또한 전통 DMEM/F12 배지를 사용하여 배양된 세포의 것보다 더 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예
3. 망막 색소 상피 세포
특징화
시험관내에서 배양 및 계대배양된 망막 색소 상피 세포에 대한 형태학적 확인을 수행한다. 시험관내에서 분리, 배양 및 계대배양된 세포는 상피 세포와 유사한 형태를 유지하고, 세포 대부분은 단층이고, 다각형이다. 일부 세포는 긴 방추형이다. 분리에 의해 수득된 1차 망막 색소 상피 세포는 멜라닌 입자를 갖고, 15 계대 이내에서 우수한 부착 비율 및 생존가능한 세포 비율을 갖는다. 세포 계대수가 증가함에 따라, 세포는 멜라닌 입자를 점차 상실한다.
추가로, 배양된 망막 색소 상피 세포의 마커를 형광 염색에 의해 확인하며, 그 결과는 도 2에 제시된다. 이들 도면의 결과로부터, 분리 및 배양된 세포는 상피 세포-특이적 마커 CK19 (도 2a), 네스틴 (줄기 세포 특징; 도 2b), 및 RPE-65 (도 2c)를 발현한다는 것을 알 수 있다.
분리된 세포 집단에 대한 일부 마커 분자의 발현을 추가로 유세포 분석법에 의해 시험한다. 도 3의 결과에 제시된 바와 같이, 분리된 세포는 CD44에 대해 강한 양성이고, CD14, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대해 음성이다. 양성 CD44는 배양된 망막 색소 상피 세포가 시험관내에서 증식, 부착 및 이동하는 강력한 능력을 갖는다는 것을 나타내고; 음성 CD14는 배양된 망막 색소 상피 세포가 내피 세포에 의해 오염되지 않음을 나타내고; 음성 CD34 및 CD45는 세포 집단이 조혈 세포를 함유하지 않음을 나타내고; 음성 HLA-DR은 배양된 망막 색소 상피 세포가 인간 백혈구 항원을 발현하지 않고, 이에 따라 면역원성이 낮다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 본 개시내용의 방법에 의해 분리된 망막 색소 상피 세포가 이식 적용에서 사용하기에 적합하다는 것을 나타낸다.
세포 시트 제조 이전에, 배양된 망막 색소 상피 세포의 증식 상태를 조사한다. 도 4는 계대수가 P8인 망막 색소 상피 세포 집단에서 세포 주기의 각 단계에서의 세포의 비율을 보여준다. 그 중, S 기 (DNA 합성기)에서의 세포 비율은 18.47±4.95%로 높고, 이는 상기 집단 중 세포가 강한 세포 증식 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.
도 5는 배양된 세포를 Ki67 항체로 염색한 결과를 보여준다. Ki67은 증식 주기에서 세포에 대한 마커이다. 염색 결과는 배양된 망막 색소 상피 세포 집단 중 다수의 세포가 증식 주기에 있고, 세포 상태는 활성 상태라는 것을 나타낸다.
실시예
4. 세포 시트 제조
망막 색소 상피 세포 시트 제조는 하기 단계에 의해 수행된다.
열 감수성 페트리 디시를 미리 코팅하는 단계: 열 감수성 페트리 디시를 미리 코팅하는 것은 10% 혈청을 함유하는 배지를 이용하여 수행한다. 35 mm 페트리 디시의 경우, 혈청 함유 배지를 2 ml 첨가하고; 60 mm 페트리 디시의 경우, 혈청 함유 배지를 3 ml 첨가하고; 100 mm 페트리 디시의 경우, 혈청 함유 배지를 5 ml 첨가한다. 미리 코팅하기 위해 페트리 디시를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이터에 넣고, 미리 코팅하는 시간은 12-24시간이다.
세포 시딩 단계: 배양된 망막 색소 상피 세포를 소화시키고, 계수하고, 현탁액 중 세포 농도가 6 x 106개 세포/ml가 되도록 배양 배지 중에 재현탁시킨다. 미리 코팅된 열 감수성 페트리 디시를 꺼내고, 코팅 용액을 폐기하고, 세포를 열 감수성 페트리 디시에 시딩한다. 35 mm 페트리 디시의 경우, 세포 농도가 상기와 같은 현탁액을 2 ml 첨가하고; 60 mm 페트리 디시의 경우, 세포 농도가 상기와 같은 현탁액을 3 ml 첨가하고; 100 mm 페트리 디시의 경우, 세포 농도가 상기와 같은 현탁액을 5 ml 첨가한다. 망막 색소 상피 세포가 페트리 디시에 부착되어 성장하도록 페트리 디시를 37℃, 5% CO2에서 12-36시간 동안 인큐베이터에 넣는다.
시트 제조 단계: 인큐베이션된 열 감수성 페트리 디시를 꺼내고, 배양 배지를 폐기하고, 4℃의 미리 냉각된 HBSS 완충제를 첨가한다. 35 mm 페트리 디시의 경우, 2 ml의 HBSS 완충제를 첨가하고; 60 mm 페트리 디시의 경우, 3 ml의 HBSS 완충제를 첨가하고; 100 mm 페트리 디시의 경우, 5 ml의 HBSS 완충제를 첨가한다. 약 10분 후, 세포가 디시 가장자리에서부터 탈착되기 시작하고, 세포 시트를 형성하는 것을 볼 수 있다. 이어서, 완전히 박리된 세포 시트를 일반 페트리 디시로 옮기고, HBSS 완충제를 첨가하여 시트를 2-3회 세척한다. 제조된 시트는 4℃에서 보관한다.
전통 망막 색소 상피 세포 생성물과 비교하였을 때, 시트 제조 동안 세포를 소화시키는 데 세포 소화 효소가 사용되지 않기 때문에, 세포의 활성은 크게 보존된다. 동시에, 제조된 세포 시트는 배양 동안 분비된 세포외 매트릭스, 확립된 세포-매트릭스 연결, 및 세포간 연결과 같은 구조를 유지하고, 이는 후속된 시트 적용에 대해 유익한 영향을 제공한다.
실시예
5. 망막 색소 상피 세포 시트의 구조적
특징화
본 실시예에서는 제조된 망막 색소 상피 세포 시트의 구조를 주사 전자 현미경법 및 면역형광 영상을 이용하여 특징화한다.
주사 전자 현미경은 샘플 표면에 미세 집속 전자 빔을 주사할 때 여기된 물리적 신호를 이용하여 영상을 변조하고, 제조된 세포 시트의 표면 구조를 관찰할 수 있다. 망막 색소 상피 세포 시트는 실시예 4에 기술된 방법에 의해 제조되고, 주사 전자 현미경 샘플을 영상 분석을 위해 추가로 제조한다. 도 6에 제시된 바와 같이, 주사 전자 현미경법 영상을 통해, 세포 시트의 상부 및 하부 표면 구조는 매우 상이하고: 상부 표면 (도 6a)의 경우, 생성된 표면은 세포의 자연 침강으로 인해 더욱 매끄럽고; 열 감수성 페트리 디시와 접촉하는 하부 표면 (기저 표면, 도 6b)의 경우, 세포 코넥신이 풍부하고, 비교적 거친 표면을 갖는다는 것을 알 수 있다. 기저 표면은 그의 구조적 특징에 기인하여, 더욱 큰 마찰을 제공할 수 있으며, 이는 세포 시트가 적용 부위에 더욱 잘 부착되도록 하는 데 유익하다.
망막 색소 상피 세포 시트에서의 피브로넥틴 및 인테그린 β1의 발현을 면역형광 방법에 의해 추가로 시험한다. 실시예 4에 기술된 방법에 의해 제조된 세포 시트를 고정시키고, 동결 절편화하고, 플루오레세인 표지된 피브로넥틴 및 인테그린 β1 항체로 염색하고, 면역형광 영상에 의해 분석한다. 도 7에 제시된 결과로부터 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 세포 시트가 다량의 피브로넥틴 (도 7a) 및 인테그린 β1 (도 7b)을 함유한다는 것을 알 수 있다.
피브로넥틴은 동물 조직 및 조직액에 광범위하게 존재하고, 세포 부착 및 성장을 촉진시키는 작용을 하며, 세포 부착 및 성장은 신체 조직 구조를 유지하고 복구하는 데 필요하다. 인테그린 β1은 인테그린 패밀리의 중요한 구성원이며, 세포-세포 부착, 세포-세포 세포외 매트릭스 (ECM) 부착, 및 세포와 ECM 사이의 양방향 신호전달을 매개하는 데 중요한 역할을 하고, 조직 복구 및 섬유증 형성과 밀접한 관련이 있다. 상기 결과는 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포 시트가 단순한 세포 축적에 의해 형성되기 보다는, 세포외 매트릭스 연결에 의해 형성되는 조밀한 조직의 생물학적으로 활성인 시트라는 것을 나타낸다. 추가로, 세포 시트에서의 피브로넥틴 및 인테그린 β1의 높은 수준의 발현은 세포 시트가 조직 복구 작용을 하고 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 관련된 질환에서 조직 손상 복구를 달성하는 데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
6. 망막 색소 상피 세포 시트의
시토카인
분비
본 개시내용의 망막 색소 상피 세포의 작용을 추가로 특징화하기 위해, 하기의 분비된 시토카인을 시험한다: 간세포 성장 인자 (HGF); 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-8 (IL-8) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF). 상기 시토카인은 세포 성장 및 분화를 촉진시키고, 혈관신생 과정을 개시 및 촉진시키는 작용을 하며, 조직 복구에서 중요한 역할을 한다. 추가로, IL-6 및 IL-8은 또한 면역 반응을 조절하는 데 관여하고, 면역 세포의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있다.
세포 시트 제조 동안, 배양 상청액을 취하고, 상청액 중 시토카인을 ELISA 방법에 의해 시험한다. 본 결과는 도 8에 제시된다. 결과는 상기 4개의 시토카인이 모두 상청액에서 발현되고, IL-6 및 IL-8의 발현 수준이 비교적 높다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 본 개시내용의 세포 시트가 혈관신생 인자 및 면역조정 인자를 비롯한 다양한 시토카인을 분비할 수 있으며 (이는 세포 시트가 높은 생물학적 활성 및 기능을 갖는다는 것을 입증함), 국소 혈관신생 및 조직 복구 과정을 촉진시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, IL-6 및 IL-8의 높은 발현 수준은 세포 시트가 면역 반응을 촉진시키고 사용하는 동안 박테리아를 억제시키는 작용을 하며, 이는 세포 시트가 그의 생물학적 작용을 더욱 잘 발휘하는 데 유익한 것임을 나타낸다.
비록 본 발명의 구체적인 실시양태가 기술되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 이는 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 보호 범주는 첨부된 청구범위에 의해 정의된다는 것을 이해하여야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 원리 및 본질로부터 벗어나지 않고 이들 실시양태를 다양하게 변경 또는 변형시킬 수 있지만, 이러한 변경 및 변형은 모두 본 발명의 보호 범주 내에 포함된다.
Claims (24)
- a. 안구 후방에 배상 조직을 제공하는 단계;
b. 망막 조직을 꺼내고, 색소 상피층 조직을 분리하는 단계;
c. 색소 상피층 조직을 조각으로 절단하고, 기계적으로 분산시킨 후 우태아 혈청으로 미리 코팅된 다중 웰 플레이트에 플레이팅하는 단계; 및
d. 망막 색소 상피 세포가 분산된 조직 블록으로부터 이동하도록 하는 데 충분한 기간 동안 다중 웰 플레이트를 인큐베이션하여,
망막 색소 상피 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 세포를 분리하는 방법이며, 여기서 방법은 효소를 이용하여 조직 또는 세포를 소화시키는 단계를 수반하지 않는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 단계 c에서 사용된 다중 웰 플레이트가 100% 우태아 혈청으로 미리 코팅된 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 미리 코팅하는 시간이 12-24시간인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 코팅하는 단계가 약 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 수행되는 것인 방법.
- a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 망막 색소 상피 세포를 분리하는 단계;
b. 망막 색소 상피 세포를 배양하고, 계대배양하는 단계;
c. 혈청 함유 배지로 미리 코팅된 열 감수성 페트리 디시에 망막 색소 상피 세포를 시딩하는 단계;
d. 일정 기간 동안 열 감수성 페트리 디시를 인큐베이션한 후, 온도를 감소시킴으로써 망막 색소 상피 세포를 페트리 디시로부터 탈착시켜,
망막 색소 상피 세포 시트를 수득하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 세포 시트를 제조하는 방법. - 제5항에 있어서, 망막 색소 상피 세포를 단계 b에서 DMEM/F12 배지 및 고글루코스 DMEM 배지의 혼합 배지를 사용하여 배양하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 혼합 배지 중 DMEM/F12 배지 대 고글루코스 DMEM 배지의 비가 1:5 내지 5:1인 방법.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c에서 사용된 망막 색소 상피 세포의 계대수가 P2-P15인 방법.
- 제8항에 있어서, 단계 c에서 사용된 망막 색소 상피 세포의 계대수가 P3-P10인 방법.
- 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c에서 망막 색소 상피 세포의 시딩 밀도가 1x106 내지 1x107개 세포/ml인 방법.
- 제10항에 있어서, 단계 c에서 망막 색소 상피 세포의 시딩 밀도가 약 6x106개 세포/ml인 방법.
- 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 열 감수성 페트리 디시가 10% 혈청을 함유하는 배지로 미리 코팅된 것인 방법.
- 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 열 감수성 페트리 디시를 단계 d에서 12-36시간 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
- 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 온도가 단계 d에서 배양 배지를 꺼내고 미리 냉각된 HBSS 완충제를 열 감수성 페트리 디시에 첨가함으로써 감소되고, 이에 따라 망막 색소 상피 세포가 페트리 디시로부터 탈착되는 것인 방법.
- 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포 시트.
- 제15항에 있어서, 세포 시트가 제조 공정 동안 페트리 디시와 접촉하지 않는 표면 및 페트리 디시와 접촉하는 기저 표면을 갖고, 기저 표면은 세포 코넥신이 풍부하고 비교적 거친 것인 망막 색소 상피 세포 시트.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 세포 시트가 피브로넥틴 및 인테그린 β1이 풍부한 것인 망막 색소 상피 세포 시트.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 시트 중 망막 색소 상피 세포가 다양한 혈관신생 인자 및 면역조정 인자를 분비할 수 있는 것인 망막 색소 상피 세포 시트.
- 제18항에 있어서, 혈관신생 인자 및 면역조정 인자가 간세포 성장 인자 (HGF), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-8 (IL-8) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 하나 이상을 포함하는 것인 망막 색소 상피 세포 시트.
- 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료를 필요로 대상체의 안구에 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 망막 색소 상피 세포 시트를 적용하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료를 필요로 대상체에서 상기 안구 질환을 치료하는 방법.
- 제20항에 있어서, 안구 질환이 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 당뇨성 망막병증, 망막 박리, 중심 망막 동맥 폐색, 중심 망막 정맥 폐색, 망막 위축, 망막 색소 상피 박리, 포도막염, 및 병적 근시로부터 선택되는 것인 방법.
- 대상체에서의 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료에서의 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 망막 색소 상피 세포 시트의 용도.
- 대상체에서의 망막 색소 상피 세포의 손상 또는 손실과 연관된 안구 질환 치료를 위한 제약 조성물의 제조에서의 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 망막 색소 상피 세포 시트의 용도.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 안구 질환이 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 당뇨성 망막병증, 망막 박리, 중심 망막 동맥 폐색, 중심 망막 정맥 폐색, 망막 위축, 망막 색소 상피 박리, 포도막염, 및 병적 근시로부터 선택되는 것인 용도.
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