CN103602631A

CN103602631A - 人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法

Info

Publication number: CN103602631A
Application number: CN201310552005.0A
Authority: CN
Inventors: 范国平; 薛志刚
Original assignee: SUZHOU RUIQI BIOLOGICAL MEDICINE SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU RUIQI BIOLOGICAL MEDICINE SCIENCE & TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2014-02-26

Abstract

本发明提供一种人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，涉及了利用机械方法分离出fRPE细胞，并进行体外培养。本发明提供的人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法为体外培养、扩增RPE细胞，治疗AMD等RPE损伤疾病提供了新来源。

Description

人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及人类胎儿视网膜色素上皮细胞（fRPE）的分离培养。

背景技术

RPE是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其骰子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞的OS；促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜-血管屏障等。RPE细胞的这一生理功能异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，如RPE细胞屏障功能异常则易导致Best卵黄样黄斑营养不良（Best vitelliform macular dystrophy, BVMD）和成人卵黄样黄斑营养不良（adult-onset vitelliform macular dystrophy, AVMD）。RPE基底膜与Bruch's membrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）和Sorsby's眼底营养不良的发生相关。

AMD主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分为干性和湿性两种，其中，干性AMD更为常见，它是由于RPE进行性营养不良造成的脉胳膜毛细血管和光受体缺失的一种疾病。湿性AMD的典型特征是有脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）生成，从而造成严重的视力丧失。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并恢复视力的有效方法。

RPE细胞移植治疗AMD的试验显示通过在视网膜下腔移植正常RPE细胞，能够延缓进行性的视觉功能丧失。RPE细胞移植在RPE遗传缺陷动物模型和AMD病人上的试验，都显示能够延缓视网膜的退行性病变，改善视觉功能。RPE细胞在视网膜下腔的自体移植比较稳定，且具有长期的疗效，但是自体RPE细胞来源及数量的有限性限制了该方法在临床上的广泛应用。

本发明针对现有人类RPE细胞来源的不足，开发了一种胎儿视网膜色素上皮细胞（fRPE）的制备及分离方法。为体外培养、扩增RPE细胞，治疗AMD等RPE损伤疾病提供了新来源。

发明内容

本发明解决了现有技术中的不足，提供一种简单易操作的人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法。

本发明的技术方案为：一种人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，具体步骤包括：

（1）取流产胎儿的眼球，用加有P/S的PBS缓冲液清洗眼球2次，每次5 min；

（2）将步骤（1）中的眼球分离角膜和虹膜，去除晶状体和玻璃体，将眼后视杯剪切为4部分，使眼杯平铺；

（3）从脉络膜层揭下视网膜色素上皮细胞（RPE）层，并将RPE层转移到2 mL 0.25% TE缓冲液中，在37℃下消化10 min；

（4）用移液器轻轻吹打步骤（3）中所述的的RPE层，将RPE层吹散；

（5）在步骤（4）中所述的RPE层中加入4 mL RPE培养基，1000 rpm离心5 min，弃上清再用2 mL RPE培养基重悬，然后接种到laminin（层粘连蛋白）包被的六孔板的一个孔中；

（6）培养过夜，第二天换液，每周换液两次，直到细胞达到覆盖80～90%时传代。

本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤（5）中所述的RPE培养基的配方中包括以下组分：500ml的Α修饰低限基本培养基，5ml的N1添加剂，5ml的谷氨酰胺，5ml的青霉素-链霉素，5ml的非必需氨基酸，125 mg的牛磺酸，10 μg氢化可的松，0.0065 μg的三碘甲状腺原氨酸，50ml的灭活胎牛血清。

本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，在配制所述RPE培养基时先将氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸溶解在PBS中，并保存在-20℃条件下，以方便配液。

本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤（6）中所述的传代是将RPE层由P0到P1传代，方法为：1×PBS清洗，6孔板每孔加0.5 mL 0.25％ TE，培养箱中37℃孵育8 min，加1.5 mL RPE培养基，收集RPE细胞至15 mL离心管，细胞计数，1000rpm离心5min，吸除上清，加RPE培养基悬浮RPE细胞，6孔板中每孔接种3×10⁵个细胞。

本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤（1）中所述的流产胎儿的眼球为12～24周的流产胎儿眼球。

本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述PBS缓冲液成份：KH₂PO₄浓度为1.544118mM，NaCl浓度为155.17241mM，Na₂HPO₄-7H₂O浓度为2.708955 mM，pH为7.1-7.3。

本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述TE缓冲液成份：KCl浓度为5.333334mM，KH₂PO₄浓度为0.441176mM，NaHCO₃浓度为4.166666mM，NaCl浓度为137.93103mM，Na₂HPO₄-7H₂O浓度为0.335821mM，右旋葡萄糖（D-glucose）浓度为5.555555mM，酚红（Phenol Red）浓度为0.025126mM，Na₂-EDTA浓度为0.913023mM，胰蛋白酶（Trypsin）浓度为0.105042mM。

本发明的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果：

本发明提供的一种人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，该方法步骤简单易操作，获得的RPE细胞易培养、细胞生长稳定，为体外培养、扩增RPE细胞，治疗AMD等RPE损伤疾病提供了新来源。

附图说明

下面结合附图和实施例对发明进一步说明。

图1为分离角膜和虹膜，去除晶状体和玻璃体的示意图。

图2为剪切眼后视杯为4部分使眼杯平铺的示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

首先按照表1中的配方配制RPE培养基；配制PBS缓冲液，该缓冲液由以下成份组成：KH₂PO₄浓度为1.544118mM，NaCl浓度为155.17241mM，Na₂HPO₄-7H₂O浓度为2.708955 mM，pH为7.1-7.3。配制TE缓冲液，该缓冲液由以下成份组成：KCl浓度为5.333334mM，KH₂PO₄浓度为0.441176mM，NaHCO₃浓度为4.166666mM，NaCl浓度为137.93103mM，Na₂HPO₄-7H₂O浓度为0.335821mM，右旋葡萄糖（D-glucose）浓度为5.555555 mM，酚红（Phenol Red）浓度为0.025126mM，Na₂-EDTA浓度为0.913023mM，胰蛋白酶（Trypsin）浓度为0.105042mM。

表1 RPE培养基中的配方

组分	含量
		Α修饰低限基本培养基（MEM, α modification）	500 mL
N1添加剂（N1 supplement）	5 mL
		谷氨酰胺（Glutamine）	5 mL
青霉素-链霉素（Penicillin-streptomycin）	5 mL
		非必需氨基酸（Non essential amino acids）	5 mL
牛磺酸（Taurine）	125 mg
		氢化可的松（Hydrocortisone）*	10 μg
三碘甲状腺原氨酸（Triiodo-thyronin）*	0.0065 μg
		灭活胎牛血清（Fetal bovine serum, heat inactivated）	50 mL

其次，再按照以下步骤分离培养人类胎儿视网膜色素上皮细胞：

（1）取12～24周的流产胎儿的眼球，用加有P/S的PBS缓冲液清洗眼球2次，每次5 min；

（2）在角膜边缘2 mm处切一小口，仔细的分离角膜和虹膜，去除晶状体和玻璃体（如图1所示），将眼后视杯剪切为4部分，使眼杯平铺（如图2所示），这样很容易剥离视网膜神经感觉层；

（3）从脉络膜层揭下视网膜色素上皮细胞（RPE）层，并将RPE层转移到2 mL 0.25% TE缓冲液中，在37℃下消化10 min，这步中要避免其他类型的细胞污染；

（6）培养过夜，第二天换液，每周换液两次，直到细胞达到覆盖80～90%时传代；

（7）P0到P1传代：1×PBS清洗，6孔板每孔加0.5 mL 0.25％ TE，培养箱中37℃孵育8 min，加1.5 mL RPE培养基，收集RPE细胞至15 mL离心管，细胞计数，1000 rpm离心5 min，吸除上清，加RPE培养基悬浮RPE细胞，6孔板中每孔接种3×10⁵个细胞。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

Claims

1.一种人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，具体步骤包括：

（3）从脉络膜层揭下视网膜色素上皮细胞（RPE）层，并将RPE层转移到2 mL 0.25%TE缓冲液中，在37℃下消化10min；

（5）在步骤（4）中所述的RPE层中加入4 mL RPE培养基，1000 rpm离心5 min，弃上清再用2 mL RPE培养基重悬，然后接种到层粘连蛋白包被的六孔板的一个孔中；

2.根据权利要求1所述的人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（5）中所述的RPE培养基的配方中包括以下组分：

500ml的Α修饰低限基本培养基，5ml的N1添加剂，5ml的谷氨酰胺，5ml的青霉素-链霉素，5ml的非必需氨基酸，125 mg的牛磺酸，10 μg氢化可的松，0.0065 μg的三碘甲状腺原氨酸，50ml的灭活胎牛血清。

3.根据权利要求2所述的人类胎儿视网膜色素上皮细胞分离培养方法，其特征在于，在配制所述RPE培养基时先将氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸溶解在PBS中，并保存在-20℃条件下。

4.根据权利要求1所述的人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（6）中所述的传代是将RPE层由P0到P1传代，方法为：1×PBS清洗，6孔板每孔加0.5 mL 0.25％ TE，培养箱中37℃孵育8 min，加1.5 mL RPE培养基，收集RPE细胞至15 mL离心管，细胞计数，1000 rpm离心5 min，吸除上清，加RPE培养基悬浮RPE细胞，6孔板中每孔接种3×10⁵个细胞。

5.根据权利要求1所述的人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述的流产胎儿的眼球为12～24周的流产胎儿眼球。

6.根据权利要求1所述的人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述PBS缓冲液包括以下各组分：KH₂PO₄浓度为1.544118 mM，NaCl浓度为155.17241 mM，Na₂HPO₄-7H₂O浓度为2.708955 mM，pH为7.1-7.3。

7.根据权利要求1所述的人类胎儿视网膜色素上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述TE缓冲液包括以下各组分：KCl浓度为5.333334 mM，KH₂PO₄浓度为0.441176 mM，NaHCO₃浓度为4.166666 mM，NaCl浓度为137.93103 mM，Na₂HPO₄-7H₂O浓度为0.335821 mM，右旋葡萄糖（D-glucose）浓度为5.555555 mM，酚红（Phenol Red）浓度为0.025126 mM，Na₂-EDTA浓度为0.913023 mM，胰蛋白酶（Trypsin）浓度为0.105042 mM。