JPWO2006093276A1 - 心臓組織由来の多能性幹細胞 - Google Patents
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Abstract
採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液を利用して、(1)密度勾配法による細胞の分離、(2)繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地での浮遊培養、(3)浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択分離することにより、多能性幹細胞を得、これを利用して再生治療を行う。
Description
項1. 下記工程を経て調製される、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞を調製する方法:
(i)ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程。
項2. 多能性幹細胞が、c-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性である、項1に記載の調製方法。
項3. 多能性幹細胞が、更にCD105陽性である、項2に記載の調製方法。
項4. 多能性幹細胞がヒト由来である、項1に記載の調製方法。
項5. 多能性幹細胞が、少なくとも心筋細胞に分化する能力を有するものである、項1に記載の調製方法。
項6. 多能性幹細胞が、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群から選択される1種又は2種以上の細胞に分化する能力を有するものである、項1に記載の調製方法。
項7. 項1乃至6のいずれかに記載の調製方法によって得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。
項8. c-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性である、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。
項9. CD105陽性である、項8に記載の幹細胞。
項10. ほ乳動物がヒトである、項8に記載の幹細胞。
項11. 少なくとも心筋細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、項8に記載の幹細胞。
項12. 心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群から選択される1種又は2種以上の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、項8に記載の幹細胞。
項13. 項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞の治療有効量を、患者の組織又は臓器に移植することを特徴とする、組織又は臓器の疾患の治療方法。
項14. 心疾患の治療方法である、項13に記載の治療方法。
項15. 心疾患の治療方法であって下記工程を含有する、項13に記載の治療方法:
(i)ヒトから採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程、
(iv)上記工程(iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び
(v)上記工程(iv)で増殖させた細胞の治療有効量を心疾患の患者の心臓に移植する工程。
項16. 項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、組織又は臓器の疾患の治療用組成物。
項17. 項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、心疾患の治療用組成物。
項18. 項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞の、心疾患の治療用組成物を調製するための使用。
項19 項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用組成物を調製するための使用。
以下、本発明の多能性幹細胞の調製方法を工程毎に詳述する。
1.細胞懸濁液の調製
まず、ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する(工程(i))。
酵素濃度:例えば、collagenase type 2(Worthington社製;205U/mg)を使用する場合であれば、マウス由来の心筋組織を処理する場合、通常0.1〜0.3重量%、好ましくは0.2重量%程度;ヒト由来の心筋組織を処理する場合、通常0.2〜0.6重量%、好ましくは0.4重量%程度となる濃度が挙げられる。また、例えば、酵素濃度は、心筋組織100mg当たり、通常4100〜12300U、好ましくは8200U程度となる濃度が例示される。
処理温度:通常37℃程度となる温度が挙げられる。
処理時間及び回数:通常20〜30分の処理時間で酵素処理を2回繰り返す条件、好ましくは20分程度の処理時間で酵素処理を2回繰り返す条件が挙げられる。
次いで上記細胞懸濁液から、密度勾配法により心臓組織由来細胞群を分離する(工程(ii))。
次いで、上記工程(ii)で得られた心臓組織由来細胞群を、上皮細胞増殖因子(EGF;epidermal growth factor)及び繊維芽細胞成長因子(FGF;fibroblast growth factor)を含有する培地で浮遊培養した後に、浮遊状のスフェアー(細胞塊)を形成している細胞を選択し分離する(工程(iii))。
斯くして得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞は、自己複製能と共に、心筋細胞を初めとする各種成熟細胞に分化する能力を備えている。当該多能性幹細胞が分化可能な細胞の一例として、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞が例示される。特に、当該多能性幹細胞は、心筋細胞への分化能に優れていることが1つの特徴として挙げられる。
上記多能性幹細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含有する培地で培養することにより、該多能性幹細胞を増殖させることができる(工程(iv))。
上記多能性幹細胞を、心筋細胞を初めとする各種細胞に分化誘導させる方法としては、例えば、増殖させた上記多能性幹細胞を、デキサメサゾンを含有する培地で培養する方法が挙げられる。
上記多能性幹細胞は、各種組織又は臓器の再生や修復に使用することができる。具体的には、組織又は臓器に疾患がある患者に、上記多能性幹細胞の治療有効量を組織又は臓器の疾患部位に移植することにより、該疾患を治療することができる。
下記工程(i)〜(v)を含有する心疾患の治療方法:
(i)ヒトから採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後に、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程、
(iv)上記工程(iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び
(v)上記工程(iv)で増殖させた細胞を心疾患の患者の心臓に移植する工程。
前述するように、上記多能性幹細胞は、組織又は臓器の疾患の治療に有用である。故に、本発明は、更に、上記多能性幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する組織又は臓器の疾患の治療用組成物を提供する。当該組成物は、組織又は臓器の疾患の治療において、疾患部位に投与されることにより使用される。
マウス由来多能性幹細胞の取得及び該幹細胞の分化誘導
(1)細胞懸濁液の調製
6〜8週齢の雌C57Bl/6Jマウス(清水実験材料株式会社製)(以下、野生型マウスと表記することもある)又は同マウスに緑色蛍光色素タンパク(GFP)発現能を付与したマウス(以下、GFP発現マウスと表記することもある)を、ジエチルエーテル麻酔下に用手的に頸椎脱臼にて安楽死させ、70容量%エチルアルコール水溶液に浸して全身を消毒した。前もって高圧蒸気滅菌を施した尖鋭のピンセット及びはさみを用い、胸骨正中切開した後、心臓を摘出した。摘出した心臓を氷上の冷PBS(Phosphate buffered saline)入りシャーレ内に置いて、23ケージ針付き注射器を用い、大動脈弁輪部から2mlの冷PBSを3回注入し、心臓内の血液を除去した。次いで、心臓中間部に切開を入れ、新たな冷PBS入りシャーレ内で心腔内を洗浄した。更に、この心腔内の洗浄を二回繰り返し、最後にPBSを除去した。その後、滅菌済みのはさみを用いて破砕した心臓組織断片を約1mm3以下になるまで細切した。細切した心臓組織片(約100mg)を100ml容三角フラスコに移し、更に0.2重量% collagenase type2 (Worthington社製)含有溶液20mlを添加し、37℃恒温漕内で20分間震盪して酵素処理を行った。次いで、更に10mlの電動ピペッターを用いて3ml/secの速度でピペッティングを行い、よく撹拌した後、更に0.1重量% DNAse I(Worthington社製)含有溶液2.2mlを添加し、37℃恒温漕内で3分間震盪した。かかる酵素処理後、20mlの10容量%FBS(牛胎仔血清)(Hyclone社製)及び1容量%ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するDMEM(GIBCO社製)培地(以下、「培地1」と表記する)を加えて酵素を中和し、細胞含有液を調製した後、70μm cell strainer(FALCON社製)及び40μm cell strainer(FALCON社製)で濾過した。濾過後の細胞含有液を1500rpmで5分間遠心分離して、その上清を除去した後に、10mlの培地1を添加して細胞懸濁液(以下、細胞懸濁液1と表記する)を調製し、これを氷中保存した。また、100ml容三角フラスコに残存した心臓組織片に対しても、再度同様の処理を行い、同様に細胞懸濁液(以下、細胞懸濁液2と表記する)を調製した。斯くして得られた細胞懸濁液1及び2を混合し、以下記載する工程に供した。
パーコール(percoll)原液(Amersham Biosciences社製):10×PBS(-)(GIBCO社製) = 9:1(容量比)の溶液をパーコールストックとした。パーコールストックを1×PBS(-)(GIBCO社製)で希釈し、パーコールストックの濃度が30容量%、70容量%の溶液を作成した。30容量%パーコール溶液にはフェノールレッド(SIGMA社製)を0.1容量%加えて着色した。容量15mlの円錐状チューブに、まず30容量%パーコール溶液を3ml注ぎ、続いて電動ピペッターを用いて30容量%パーコール溶液の下層に70容量% パーコール溶液を慎重に加えた。続いて、野生型マウス又はGFP発現マウス由来の上記細胞縣濁液3mlを30容量%パーコール溶液の上層に慎重に重層した。室温、1000G 20分で、加速減速を極力遅くして遠心分画した。遠心後、目的の細胞集団は、30容量%パーコール溶液と70容量%パーコール溶液の界面に分布していることが確認された。また、一番底には血球成分が分布しており、30容量%パーコールの上層には主に細胞破砕物が分布していることが確認された。パスツールピペットにてまず細胞破砕物を除去した後、別のピペットで界面に存在する目的の細胞集団を容量50mlの円錐状チューブに回収した。円錐状チューブに、DMEM/F12Ham(GIBCO社製)培地を30ml加え、十分に撹拌した後、遠心して上清を除去した。次いで、トリプシン-EDTA(0.05重量%トリプシン、0.53mM EDTA・4Na含有)(GIBCO社製)溶液1mlを添加して、37℃恒温漕内で10分間震盪し、細胞同士の凝集や結合を解消させた。次いで、トリプシン阻害剤(Roche社製)500μlを添加し、更にDMEM/F12Ham培地(GIBCO社製)8.5mlを添加し、十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。
上記(2)で得られた、野生型マウス又はGFP発現マウス由来の心臓組織由来細胞群を、mouse expansion medium[DMEM/F12Ham (GIBCO社製)、2重量%B27サプリメント(GIBCO社製)、1容量% penicillin-streptomycin、40ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有]を用いて、細胞培養ディッシュ(noncoat cell culture dish)(Becton Dickinson社製)上で、37℃、5%CO2下で14日間、浮遊培養を行った。なお、培養開始時の細胞濃度は、2.0×104cells/mlになるように設定した。
参考として、上記(2)で得られた野生型マウス心臓組織由来細胞群と、上記(2)で得られたGFP発現マウス心臓組織由来細胞群とを1:1の比率で混合して、上記(3)と同様の条件で浮遊培養を行った。
回収したスフェアーを2mlのDMEM/F12Ham(GIBCO社製)培地に入れ、よく混合した後に、これを遠心分離(4℃、1500rpm、5分間)して、上清を十分に除去した。次いで、トリプシン-EDTA(0.05重量%トリプシン、0.53mM EDTA・4Na含有)(GIBCO社製)溶液1mlを添加し、37℃恒温漕内で20分間震盪することにより、スフェアーを分解して、スフェアーを形成している細胞(以下、スフェアー形成細胞と表記する)を浮遊させた。次いで、トリプシン阻害剤(Roche社製)500μlを添加し十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞について各種細胞表面抗原(Sca-1、c-kit、CD34、CD45、CD31、CD38、CD90及びCD105)をFACS分析した。得られた結果を図2に示す。この結果から、得られたスフェアー形成細胞はc-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性であると共に、CD105陽性であることが確認された。また、該細胞は、Sca-1陽性、CD45陰性、CD38陽性、及びCD90陽性であることも確認された。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8モル/lのデキサメサゾン及び1容量%のpenicillin-streptomycinを含有するMEM培地(GIBCO社製)で、37℃、5%CO2下で21日間培養した。かかる培養により、上記スフェアー形成細胞が拍動性の心筋細胞に分化することが確認された。また、培養中の細胞の形態を観察した写真を図6に示す。図6に示すように、スフェアー形成細胞は、心筋細胞への分化過程において同心円状に増殖して分化することが分かった。なお、心筋細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
<心筋特異的トロポニン−I染色による分析>
培養21日後の細胞を心筋特異的トロポニン−Iで染色して観察したところ、心筋細胞の存在が確認された(図7図参照)。
<PCRによる分析>
PCRにより、分化誘導開始21日後において、培養細胞の各種マーカー(Nkx 2.5、GATA 4、ANP、トロポニン−I(TnI)、MLC2v、MLC2a、α-MHC(α-myosin heavy chain)、β-MHC(β-myosin heavy chain))の発現を分析した。得られた結果を図8に示す。この結果、心筋細胞のマーカーであるcTnI、及びα-MHCの発現が強く認められることが確認された。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞(図9のA参照)について、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞への分化能を確認するために、下記の方法で分化誘導を行った。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を、1×10-8Mのデキサメサゾンを含むMEM培地(GIBCO社製)で、37℃、5%CO2下で14日間培養した。培養後の細胞をα-SMA(α-smooth muscle actin)を用いて染色して観察したところ、平滑筋細胞の存在が確認された(図9のB参照)。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Mのデキサメサゾンを含むMEM培地(GIBCO社製)で、37℃、5%CO2下で14日間培養した。培養後の細胞をCD31を用いて染色して観察したところ、CD31陽性の血管内皮細胞の存在が確認された(図9のC参照)。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Mのデキサメサゾンを含むMEM培地(GIBCO社製)で、37℃、5%CO2下で14日間培養した。培養後の細胞に対してoil-red染色を行って観察したところ、oil-red陽性の脂肪細胞の存在が確認された(図9のD参照)。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Mのデキサメサゾンを含むMEM培地(GIBCO社製)で、37℃、5%CO2下で14日間培養した。培養後の細胞の形態的特徴を観察したところ、グリア細胞の存在が確認された(図9のE参照)。
上記(5)で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を1×10-8Mのデキサメサゾンを含むMEM培地(GIBCO社製)で、37℃、5%CO2下で14日間培養した。培養後の細胞の形態的特徴を観察したところ、上皮細胞の存在が確認された(図9のF参照)。
以上に示す実施例1の結果から、得られたスフェアー形成細胞は、自己複製能と共に、各種細胞に分化する特性を備えており、多能性幹細胞であることが明らかとなった。
マウス由来心筋幹細胞の移植
上記実施例1で得られたGFP発現マウス由来のスフェアー形成細胞(多能性幹細胞)を、mouse expansion medium[DMEM/F12Ham (GIBCO社製)、2重量%B27サプリメント(GIBCO社製)、1容量% penicillin-streptomycin、40ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有]で培養して増殖させた。次いで、増殖させた幹細胞(約1×106cells)を、15μlのPBS(-)(GIBCO社製)に懸濁し、これを、BD Ultra Fine IIランセット(Becton Dickinson社製)を用いて、10〜12週齢のN0D/SCIDマウス(Jackson Laboratoryより購入)に作成した梗塞心筋に移植した。幹細胞の移植21日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋について、緑色蛍光(GFP)発色する幹細胞のホスト心筋への生着を確認した(図10のA図参照)。また、図10のA図と同一視野において、cTnT染色(赤色として認識される)を行った(図10のB図参照)。図10のA及びB図を重ね合わせると、幹細胞の存在(緑色)と、cTnI発現の存在(赤色)が重なっており(図10のC及びD図参照)、移植した心臓組織由来の幹細胞が心筋細胞に分化し、心臓の修復に寄与していることが確認された。
ヒト由来多能性幹細胞の取得及び該幹細胞の各種細胞への分化誘導
ヒトから採取した心臓組織片を用いて、上記実施例1に記載の「(1)細胞懸濁液の調製」及び「(2)パーコールの密度勾配遠心法による心臓組織由来細胞群の分離」の方法に従って、ヒト心臓組織由来の細胞群を分離した。
増殖させたスフェアー形成細胞を、上記実施例1に記載の「(7)心筋細胞への分化の確認」の方法に従って、心筋細胞への分化誘導を行った。これによって、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞が、拍動する心筋細胞に分化することが確認された。なお、心筋細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
<ヒト心筋特異的トロポニン−T染色による分析>
分化誘導後の細胞をヒト心筋特異的トロポニン−Tで染色して観察したところ、心筋細胞の存在が確認された(図14図参照)。
<PCRによる分析>
分化誘導開始21日後の細胞について、各種マーカー(Nkx-2.5、GATA4、ANP、α-ca-actin、TnT、MLC2v、MLC2a、α-MHC(α-myosin heavy chain)、β-MHC(β-myosin heavy chain)、βactin)の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図15に示す。図15から分かるように、デキサメサゾンの存在下で培養することによって、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞が心筋細胞に分化したことが確認された。
増殖させたスフェアー形成細胞を、上記実施例1に記載の「(8−2)血管内皮細胞への分化」の方法に従って、分化誘導を行った。これによって、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞が、平滑筋細胞に分化することが確認された。なお、心筋細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
<顕微鏡による分析>
分化誘導後の細胞について、α-SMAを染色して観察したところ、平滑筋細胞の存在が確認された(図16図参照)。
<PCRによる分析>
分化誘導開始21日後の細胞について、各種マーカー(SM-22α及びcalponin)の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図17に示す。図17から分かるように、分化誘導後には、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞が平滑筋細胞に分化したことが確認された。
増殖させたスフェアー形成細胞を、上記実施例1に記載の「(4)他の細胞への分化の確認」の方法に従って、内皮細胞への分化誘導を行った。これによって、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞が、血管内皮細胞に分化することが確認された。なお、血管内皮細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。
<顕微鏡による分析>
分化誘導後の細胞について、CD31を染色して観察したところ、内皮細胞の存在が確認された(図18図参照)。
<PCRによる分析>
分化誘導後の細胞について、各種マーカー(CD31及びVEGF-R2)の発現を、PCRにより分析した。得られた結果を図19に示す。図19から分かるように、分化誘導後には、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞が血管内皮細胞に分化したことが確認された。
以上に示す実施例3の結果から、得られたヒト由来スフェアー形成細胞は、自己複製能と共に、各種細胞に分化する特性を備えており、多能性幹細胞であることが確認された。
ヒト由来心筋幹細胞の移植
上記実施例3で得られたヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞(多能性幹細胞)を、human expansion medium[DMEM/F12Ham(GIBCO社製)、1容量% penicillin-streptomycin、40ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び20ng/ml human EGF(SIGMA社製)含有]で培養して増殖させた。次いで、増殖させたヒト心臓組織由来多能性幹細胞(約1×106cells)を、上記実施例2と同様の方法で虚血心筋マウスに移植した。心筋幹細胞の移植21日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋について、細胞内の核をDAPI(4'6-diamino-2-pheny1indo1e)を用いて青色に染色し、更にスフェアー形成細胞から分化した心筋細胞をヒト心筋特異的トポロニン−Tを用いて赤色に染色した。この結果、菲薄化した梗塞巣内に移植したヒト心臓組織由来細胞が遊走し生着しており、主に心内膜側に新たな心筋細胞が再生されていることが確認された(図20のA−E参照)。また、摘出した心臓について、併せて、CD31の染色を行ったところ、ヒト心臓組織由来細胞が血管内皮細胞にも分化して生着していることが確認された(図20のF参照)。
Claims (19)
- 下記工程を経て調製される、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞を調製する方法:
(i)ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程。 - 多能性幹細胞が、c-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性である、請求項1に記載の調製方法。
- 多能性幹細胞が、更にCD105陽性である、請求項2に記載の調製方法。
- 多能性幹細胞がヒト由来である、請求項1に記載の調製方法。
- 多能性幹細胞が、少なくとも心筋細胞に分化する能力を有するものである、請求項1に記載の調製方法。
- 多能性幹細胞が、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群から選択される1種又は2種以上の細胞に分化する能力を有するものである、請求項1に記載の調製方法。
- 請求項1乃至6のいずれかに記載の調製方法によって得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。
- c-kit陰性、CD31陰性及びCD34陰性である、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。
- CD105陽性である、請求項8に記載の幹細胞。
- ほ乳動物がヒトである、請求項8に記載の幹細胞。
- 少なくとも心筋細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、請求項8に記載の幹細胞。
- 心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群から選択される1種又は2種以上の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、請求項8に記載の幹細胞。
- 請求項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞の治療有効量を、患者の組織又は臓器に移植することを特徴とする、組織又は臓器の疾患の治療方法。
- 心疾患の治療方法である、請求項13に記載の治療方法。
- 心疾患の治療方法であって下記工程を含有する、請求項13に記載の治療方法:
(i)ヒトから採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、
(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程、
(iv)上記工程(iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び
(v)上記工程(iv)で増殖させた細胞の治療有効量を心疾患の患者の心臓に移植する工程。 - 請求項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、組織又は臓器の疾患の治療用組成物。
- 請求項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、心疾患の治療用組成物。
- 請求項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞の、心疾患の治療用組成物を調製するための使用。
- 請求項8乃至12のいずれかに記載の幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用組成物を調製するための使用。
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