CN103966162B

CN103966162B - 一种经血来源间充质干细胞分离方法

Info

Publication number: CN103966162B
Application number: CN201410232819.0A
Authority: CN
Inventors: 高雪华; 海泉; 赵令卉; 李俊; 陈静娴; 赵峻
Original assignee: CHENGDU QINGKE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHENGDU QINGKE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-05-29
Also published as: CN103966162A

Abstract

本发明提供一种新型经血来源间充质干细胞分离方法，属于从经血中分离干细胞的方法领域。为了解决传统方法中采用淋巴分离液法，其离心时间长，对细胞的损伤较大，细胞得率低等问题。本发明采用来源广泛的经血为材料，采集过程中采用特殊的保存液进行保存，然后通过淋巴细胞分离管的密度梯度离心法进行初步分离，对分离的离心时间和离心转速进行优化，然后通过干细胞贴壁生长的特性进行再次分离，将干细胞分离和扩增同时进行，在分离过程中最大限度地维持干细胞活性，得到的经血来源间充质干细胞纯度高、数量大、应用价值高。本发明操作简单，成本低。

Description

一种经血来源间充质干细胞分离方法

技术领域

本发明涉及从经血中分离干细胞的方法，特别涉及一种经血来源间充质干细胞分离方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在发育生物学研究和临床治疗，如组织和器官修复等方面具有广阔的应用前景，MSCs最先在骨髓中确认存在，随后在成人外周血、骨膜、肌肉和脂肪组织等处均发现有MSCs的存在。MSCs属于多能干细胞，在相应的诱导条件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型的细胞。目前成人骨髓是MSCs临床应用的最主要来源，但也存在一些缺陷，如成人骨髓中的MSCs的量非常少(约0.001％0.01％)。此外，在衰老和疾病状况下，骨髓MSCs的数量和分化潜能下降，且采集骨髓为创伤性过程。所以寻找其它的可替代MSCs来源十分重要。

经血是女性血液和一些脱落的子宫内膜、子宫颈粘液及阴道分泌物的混杂液体。近年来，美国的研究小组从健康女性的月经血中得到重复分离的干细胞；2008年，日本的研究小组也利用女性月经血成功分离培养出具有多重分化功能的干细胞，该干细胞可用于修复受损的心肌组织。

这种干细胞称为经血源性子宫内膜间充质干细胞(menstrualblood-derivedmesenchymalcells，MMCs)，有望用来治疗损伤和衰老的组织。MMSCs不仅来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题。此外，MMSCs还具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞，因此成为寻找人类间充质干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种经血来源间充质干细胞分离方法，采用如下技术方案：

一种经血来源间充质干细胞分离方法，包括以下内容：

a.收集经血：将经血转移到1～2倍经血体积的磷酸盐缓冲液中，得到混合物，并将混合物于4℃下保存；

b.将步骤a中得到的混合物在48h内，加入等体积的PBS缓冲液充分混匀，通过200目筛网过滤得滤液，将滤液用淋巴细胞分离管于2670rpm转速下离心17min，得到4层分离液，除去最上层分离液，提取中间白膜层物质，得到混合物A；

c.将步骤b中得到的混合物A加入PBS缓冲液中洗涤2～3次，然后离心，取沉淀细胞B；

d.将步骤c中得到的沉淀细胞B接种到培养基中，于37℃、体积分数5％CO₂的饱和湿度环境下进行培养；

e.收集步骤d中所述的培养的细胞，即为所述的经血来源间充质干细胞。

优选地，步骤a中所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2，所述的磷酸盐缓冲液包括质量浓度为5μg/ml的EDTA、50μg/ml的枸橼酸钠、50～100mg/ml的海藻糖、0.03～0.05mg/ml青霉素、0.05～0.1mg/ml链霉素、0.05～0.1mg/ml氟康唑。

优选地，步骤c中所述的PBS缓冲液的配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.2。

优选地，步骤d中所述的培养基包括质量浓度为1.34％DMEM粉末和0.22％NaHCO₃。

优选地，步骤d中所述的培养包括以下内容：每隔3～4天则去掉未贴壁的细胞，并更换培养基，培养的总时间为7～10天。

优选地，步骤d中所述的培养基，细胞首次传代前的培养基均含0.03～0.05mg/ml青霉素、0.05～0.1mg/ml链霉素、0.05～0.1mg/ml氟康唑，首次传代后的细胞所用培养基则不添加抗生素。

本发明的有益效果如下：

1.本发明提供的间充质干细胞分离方法，采用来源广泛的经血为材料，通过采用淋巴分离管法进行初步分离，利用干细胞贴壁生长的特性进行再次分离，并且将干细胞分离和扩增同时进行，可以得到纯度高、数量大的经血来源间充质干细胞。传统用于经血干细胞分离多采用淋巴分离液法，其离心时间长，对细胞的损伤较大，细胞得率低。

2.本发明提供的经血来源间充质干细胞分离方法，在收集经血时，采用特殊的保存液进行初步保存。经血易污染，本发明在磷酸盐缓冲液中加入的青霉素和链霉素，具有很好的抗菌作用，避免经血在从采取到分离的时间内遭受外界污染；本发明在缓冲液中还加入呋康痤，抑制经血自身真菌感染，提高间充质干细胞的存活率，为得到数量大的经血来源间充质干细胞提供保障；经血中含有纤溶酶，能使经血不凝，但是采集后的经血需要保存在4℃，纤溶酶在4℃下酶活低，不能达到为经血抗凝的效果，所以本发明提供的缓冲液中加入枸橼酸钠和EDTA，不仅可以改善经血细胞结团现象，还能对细胞起保护作用，维持细胞活性，降低细胞离体后的死亡率；本发明提供的缓冲液中加入海藻糖，在细胞表面能形成独特的保护膜，提高细胞活性，进一步提高经血来源间充质干细胞的应用价值。

3.本发明提供的经血来源间充质干细胞分离方法，采用淋巴分离管法进行初步分离，结合本发明提供的经血保存液(即收集经血时的磷酸盐缓冲液)，对分离的离心时间和离心转速进行优化，在分离过程中最大限度地维持干细胞活性，提高经血来源间充质干细胞的应用价值，并且对间充质干细胞的高得率、高纯度提供保障。

4.本发明提供的经血来源间充质干细胞分离方法，对经血的采集和分离的各步骤进行优化处理，操作简单，成本低，可以得到纯度高、数量大的经血来源间充质干细胞。

附图说明

图1为本发明中培养2-3天的经血来源间充质干细胞图；

图2为本发明中培养6-7天的经血来源间充质干细胞图；

图3为传统方法中培养2-3天的经血来源间充质干细胞图；

图4为传统方法中培养6-7天的经血来源间充质干细胞图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

处理十份不同年龄来源的经血，均匀地分成两份，分布标记为样品A和样品B，将样品A采用本发明提供的方法进行分离，具体内容见下：

一种经血来源间充质干细胞分离方法，包括以下内容：

所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2，所述的磷酸盐缓冲液包括质量浓度为5μg/ml的EDTA、50μg/ml的枸橼酸钠、50～100mg/ml的海藻糖、0.03～0.05mg/ml青霉素、0.05～0.1mg/ml链霉素、0.05～0.1mg/ml氟康唑。

b.将步骤a中得到的混合物在48h内，转移到等体积的PBS缓冲液中充分混匀后，通过200目筛网过滤得滤液，将滤液用淋巴细胞分离管于2670rpm转速下离心17min，得到4层分离液，小心除去最上层分离液，提取中间白膜层物质，得到混合物B；

c.将步骤b中得到的混合物A加入PBS缓冲液进行洗涤，然后离心，取沉淀细B；

所述的PBS缓冲液的配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.2。

d.将步骤c中得到的沉淀细胞B接种到培养基中，于37℃、体积分数5％CO2的饱和湿度环境下进行培养；

所述的培养基包括质量浓度为1.34％DMEM粉末和0.22％NaHCO3。

所述的培养基，细胞首次传代前的培养基均含0.03～0.05mg/ml青霉素、0.05～0.1mg/ml链霉素、0.05～0.1mg/ml氟康唑，首次传代后的细胞所用培养基则不添加抗生素。

所述的培养包括以下内容：每隔3～4天则去掉未贴壁的细胞，并更换培养基，培养的总时间为7～10天。

细胞基本生物学特征的鉴定：

将上述步骤d中的沉淀细胞B培养2～3天左右，就可培养容器壁上有少量细胞生长，呈短梭形，形态饱满(如图1所示)；经过6～7天左右的培养，在倒置相差显微镜下可见有较多量的细胞生长(如图2所示)；经过7-10天培养、收集的干细胞，倒置相差显微镜下可见分离得到的干细胞为典型的纤维状细胞。

经血来源的间充质细胞干细胞特异性标志物分析：

选取实施例中得到的经血来源的充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液于离心管中，调整细胞浓度为1×105·μL－1；取6只试管，每管分别加15μL鼠抗人单克隆抗体CD29－PE、CD34－PE、CD44－FITC、CD105－FITC，以鼠抗人IgG2a－FITC、IgG1－PE作为阴性对照，再分别加入150μL细胞悬液混匀，室温避光放置10min，之后再用PBS洗2次，流式细胞仪检测，Cellquest软件获取与分析，见表1。

表1.本发明中干细胞特异性标志物分析结果

检测项目	检测结果	检测标准
			CD19/34/35/HLA-DR	0.37％	<2％
CD73	99.23％	>95％
			CD90	99.48％	>95％
CD105	99.91％	>95％

利用流式细胞仪对经血间充质细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD19、CD34、CD35、HLA-DR进行分析，结果表明，经血间充质细胞高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD19、CD34、CD35、HLA-DR间充质干细胞表面标志，证明其具有间充质干细胞特性。

实施例2

处理十份不同年龄来源的经血，均匀地分成两份，分布标记为样品A和样品B，分别用传统的提取方法和本发明所述方法(实施例1)进行提取并分别从样品的污染几率、提取细胞形态及细胞纯度进行对比。将样品B采用传统的方法进行，具体内容见下：

传统的经血来源间充质干细胞分离方法，包括以下内容：

a.收集经血：将经血样品A存放在含有0.2ml两性霉素B、0.2ml青霉素混合液的磷酸盐缓冲液PBS中，于4℃下保存；

b.将步骤a中得到的混合物样品A在48h内，转移到等体积的PBS缓冲液中充分混匀后，缓慢的加入到Ficoll淋巴细胞分离液上(Ficoll：样品的体积比为1:1～1:2之间)于1800rpm转速下离心25min，得到4层分离液，小心除去最上层分离液，提取中间白膜层物质，得到混合物B；

c.将步骤b中得到的混合物B加入PBS缓冲液进行洗涤，然后离心，取沉淀细胞C；

所述的PBS缓冲液的配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.2；

d.台盼蓝染色计数；

e.将步骤c中得到的沉淀细胞C接种到培养基中，于37℃、体积分数5％CO2的饱和湿度环境下进行培养；

所述的培养基包括质量浓度为1.34％DMEM粉末和0.22％NaHCO3；

所述的培养包括以下内容：每隔3～4天则去掉未贴壁的细胞，并更换培养基；

f.收集步骤e中所述的培养的细胞，即为所述的经血来源间充质干细胞。

传统分离方法中，细胞基本生物学特征的鉴定：

将上述步骤c中的沉淀细胞C培养2～3天左右，就可见培养容器壁上有很少量细胞生长，呈短梭形，形态饱满(如图3所示)；经过6～7天左右的培养，在倒置相差显微镜下可见有较多量的细胞生长(如图4所示)；经过15～20天左右培养、收集的干细胞，倒置相差显微镜下可见分离得到的干细胞为典型的纤维状细胞。

将图1和图3、图2和图4分别进行比较，可以看出，分离后的干细胞在相同时间内，本发明提供的方法生长的细胞量更多，说明本发明提供的经血来源间充质干细胞分离方法，细胞得率更高，可以在短时间内获得纯度高、数量大的经血来源间充质干细胞。

选取传统分离方法得到的经血来源的充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液于离心管中，调整细胞浓度为1×105·μL－1；取6只试管，每管分别加15μL鼠抗人单克隆抗体CD29－PE、CD34－PE、CD44－FITC、CD105－FITC，以鼠抗人IgG2a－FITC、IgG1－PE作为阴性对照，再分别加入150μL细胞悬液混匀，室温避光放置10min，之后再用PBS洗2次，流式细胞仪检测，Cellquest软件获取与分析，见表2。

表2.传统分离方法中干细胞特异性标志物分析结果

检测项目	检测结果	检测标准
			CD19/34/35/HLA-DR	1.2％	<2％
CD73	92.55％	>90％
			CD90	90.27％	>90％
CD105	94.01％	>90％

利用流式细胞仪对经血间充质细胞表面分子CD73、CD90、CD105、CD19、CD34、CD35、HLA-DR进行分析，结果表明，经血间充质细胞高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD19、CD34、CD35、HLA-DR间充质干细胞表面标志，证明其具有间充质干细胞特性。

按照实施例1、实施例2中的方法分别对10份不同来源的血样进行分离、提取、培养，分别对两种方法的污染率进行统计，结果如表3：

表3.污染几率比较结果

项目	传统方法	本方法
			样本量(ml)	2	2
污染几率	6/10	0/10

由表3可以看出，利用本发明提供的分离方法，污染几率比传统的分离方法要低很多。

Claims

1.一种经血来源间充质干细胞分离方法，其特征在于，包括以下内容：

a．收集经血：将经血转移到1~2倍经血体积的磷酸盐缓冲液中，得到经血混合物，并将混合物于4℃下保存；

b．将步骤a中得到的混合物在48h内，加入等体积的PBS缓冲液充分混匀，通过200目筛网过滤得滤液，将滤液用淋巴细胞分离管于2670rpm转速下离心17min，得到4层分离液，除去最上层分离液，提取中间白膜层物质，得到混合物A；

c.将步骤b中得到的混合物A加入PBS缓冲液中洗涤2~3次，然后离心，取沉淀细胞B；

d.将步骤c中得到的沉淀细胞B接种到培养基中，于37℃、体积分数5%CO₂的饱和湿度环境下进行培养；

e.收集步骤d中所述的培养的细胞，即为所述的经血来源间充质干细胞；

步骤a中所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2，所述的磷酸盐缓冲液是添加了质量浓度为5μg/ml的EDTA、50μg/ml的枸橼酸钠、50~100mg/ml的海藻糖、0.03~0.05mg/ml青霉素、0.05~0.1mg/ml链霉素和0.05~0.1mg/ml氟康唑的磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的经血来源间充质干细胞分离方法，其特征在于，步骤c中所述的PBS缓冲液的配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.2。

3.根据权利要求1所述的经血来源间充质干细胞分离方法，其特征在于，步骤d中所述的培养基包括质量浓度为1.34%DMEM粉末和0.22%NaHCO₃。

4.根据权利要求1所述的经血来源间充质干细胞分离方法，其特征在于，步骤d中所述的培养包括以下内容：每隔3~4天去掉未贴壁的细胞，并更换培养基，培养的总时间为7~10天。

5.根据权利要求1所述的经血来源间充质干细胞分离方法，其特征在于，步骤d中所述的培养基，细胞首次传代前的培养基均含0.03~0.05mg/ml青霉素、0.05~0.1mg/ml链霉素、0.05~0.1mg/ml氟康唑，首次传代后的细胞所用培养基则不添加抗生素。