CN109576216A - 尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尿来源间充质干细胞的提取及体外扩增培养的技术方法，主要是通过从无菌尿液中分离获得间充质干细胞，并采用易于配制的培养基体外进行扩增。用本发明提取及扩增培养的尿来源间充质干细胞可用于临床免疫相关疾病的治疗及多种组织器官的损伤修复。本发明的优势在于尿来源间充质干细胞分离和提取过程完全无创，无需特殊仪器，成本低，提取过程易于被患者接受。本发明的尿来源间充质干细胞另一个优势是可进行自体移植，无免疫排斥反应、无伦理争议，能避免疾病传播风险。尿来源间充质干细胞显示出良好的扩增能力，能满足细胞治疗时所需的细胞数量。

Description

尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法
技术领域
本发明涉及一种尿来源间充质干细胞的提取和体外扩增培养方法，属于细胞生物学、再生医学及组织工程领域。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)是一类中胚层来源的多能成体干细胞，具有低免疫原性、多向分化潜能及免疫调节作用。目前，间充质干细胞被越来越多的应用于治疗临床难治性的免疫性疾病，为免疫性疾病的治疗提供了新的思路和方向。与此同时，MSC作为理想的种子细胞，与再生医学和组织工程技术相结合，为组织的再生和修复提供了新的手段。
间充质干细胞最早由骨髓分离提取。随着研究的进一步深入，目前研究人员能够从脐带、脐血、脂肪、滑膜等组织中分离提取间充质干细胞。但传统的间充质干细胞取材始终存在取材不便、有创性、成本较高的缺点，并且伦理问题也是阻碍间充质干细胞应用的重要原因之一。因此，寻找一种更理想来源的间充质干细胞显得尤为迫切。尿来源间充质干细胞(USCs)具有稳定表达间充质干细胞相关细胞表面标志物、多向分化潜力和免疫调节功能的特性。与传统间充质干细胞来源相比，其收集方法简单、非侵袭性、安全、成本低，且便于自体移植从而避免伦理问题，易于推广应用，是理想的间充质干细胞来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿来源间充质干细胞的提取及体外扩增培养方法。为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：
1尿液获取：无菌条件下，收集清洁中段非晨尿200ml，立即进行下一步骤；
2初步离心：将清洁尿液分装至50ml离心管中，4℃，400g离心10min；
3洗涤：用含有抗生素的基础培养基充分洗涤沉淀，4℃，300g离心5min；
4用1ml完全培养基重悬，种入24孔板中，置于细胞培养箱中培养；
5细胞扩增：培养3天后，显微镜下观察，如观察到细菌污染则弃去，无污染则换液，继续培养。5-7天后，可见多个单个细胞贴壁生长。标记长梭形单细胞克隆位置，随后每隔2天换液，培养14-21天直至多个单细胞克隆达到70％融合。随后，采用0.25％胰蛋白酶消化约3min，完全培养基终止，800rpm，5min离心，2ml完全培养基重悬细胞，转移至六孔板中继续培养；
6细胞表面标记物的鉴定：通过流式检测，尿来源间充质干细胞表达CD105，CD73，CD90，不表达CD45，CD34，CD11b，CD19，HLA-DR；
7细胞诱导分化：分别取3-5代的尿来源间充质干细胞，与成骨细胞诱导分化培养基和成脂诱导分化培养基共培养14-21天，分别采用茜素红S和油红O染色检测其向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。
上述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中，所述抗生素为含有100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素的抗生素。
上述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中，所述细胞培养箱的培养条件是：温度37℃，5％CO2饱和湿度。
上述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中，所述完全培养基包含：Lonza12-725培养基、10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺及100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素的抗生素。
上述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中，所述的成骨细胞诱导分化培养基含有：50μg/ml维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠、0.1μM地塞米松；所述的成脂诱导分化培养基含有：0.5μM地塞米松、50μM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、50μM吲哚美辛，10μg/ml胰岛素。
本发明着重解决从尿液中分离、提取、扩增间充质干细胞并对其鉴定。
本发明提供的分离培养尿来源间充质干细胞的方法是通过尿液离心、利用成分简洁的培养基和操作简便的培养方法来扩增尿来源间充质干细胞。
本发明原代培养所获取的原代细胞可能具有多个细胞形态，选取长梭形的单细胞克隆进行扩增培养，传代后细胞仍保持原有的细胞形态。
本发明中的尿来源间充质干细胞具有传统来源的间充质干细胞的细胞表面标志物，包括表达CD105，CD73，CD90，不表达CD45，CD34，CD11b，CD19，HLA-DR。
本发明分离培养得到的尿来源间充质干细胞在特殊的诱导分化培养基的作用下能分化为成骨细胞和脂肪细胞。
本发明的尿来源间充质干细胞的一个显著优点是分离和提取过程完全无创，避免了从骨髓、脂肪、滑膜等组织提取时造成的供区缺损和损伤。且无需特殊仪器、可操作性、成本低，提取过程易于被患者接受。由该方法制备的尿来源间充质干细胞可显示出良好的扩增能力，能满足细胞治疗时所需的细胞数量。强
本发明的尿来源间充质干细胞另一个优势是可进行自体移植，无免疫排斥反应、无伦理争议，能避免疾病传播风险。
附图说明
图1是人尿来源间充质干细胞在培养基中7天后光镜图，放大倍数20×
图2是第一代人尿来源间充质干细胞光镜图，放大倍数10×
图3是第四代人尿来源间充质干细胞光镜图，放大倍数10×
图4是尿来源间充质干细胞表面特异性标志物CD34、CD45、CD19、CD11b和HLA-DR的流式检测结果(阴性表达)
图5是尿来源间充质干细胞表达特异性标志物CD73的流式检测结果
图6是尿来源间充质干细胞表达特异性标志物CD90的流式检测结果
图7是尿来源间充质干细胞表达特异性标志物CD105的流式检测结果
图8是尿来源间充质干细胞在成骨细胞诱导分化培养基培养21天后茜素红S染色结果，放大倍数10×
图9是尿来源间充质干细胞在成脂诱导分化培养基培养14天后油红O染色结果，放大倍数40×
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：从清洁中段尿液中分离和提取尿来源间充质干细胞
无菌条件下，取志愿者清洁中段非晨尿200ml，立即进行分离提取。将清洁尿液分装至50ml离心管中，4℃，400g离心10min，弃上清。加入含抗生素的基础培养基，于4℃，300g离心5min后弃上清。1ml完全培养基重悬细胞，接种至24孔板中，放置于37℃5％CO饱和湿度的孵箱中培养。
培养3天后，显微镜下观察，如观察到细菌污染则弃去，无污染则换液，继续培养。5-7天后可见单个细胞贴壁生长，标记单个细胞在24孔板中的位置，每隔2天换一次液，可观察单细胞克隆形成情况。培养14-21天，待细胞达到70％融合后，采用0.25％胰蛋白酶消化，800rpm，5min离心后用2ml完全培养重悬细胞，传至六孔板中继续培养。相差显微镜下观察，原代培养的尿来源干细胞呈克隆样生长(见图1)，传代培养的尿来源间充质干细胞呈纤维状(见图2，图3)。经流式细胞术分析，传代培养的尿来源干细胞表达CD105，CD73，CD90，不表达CD45，CD34，CD11b，CD19，HLA-DR(见图4，图5，图6，图7)。结果表明尿来源间充质干细胞符合间充质干细胞表面标志物表达。
实施例2：尿来源间充质干细胞向骨细胞的分化
(1)取实施案例1所获得的尿来源间充质干细胞第3代进行体外分化功能鉴定
(2)向尿来源间充质干细胞中加入含有50μg/ml维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠、0.1μM地塞米松的成骨细胞诱导分化培养基进行诱导培养，1周换2次液。
(3)诱导分化21天后，进行茜素红S染色，可观察到钙结节形成(图8)，表明尿来源间充质干细胞具有向成骨细胞分化的能力。
实施例3：尿来源间充质干细胞向脂肪细胞的分化
(1)取实施案例1所获得的尿来源间充质干细胞第3代培养
(2)向尿来源间充质干细胞中含有0.5μM地塞米松、50μM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、50μM吲哚美辛，10μg/ml胰岛素的成脂诱导分化培养基进行诱导培养。
(3)诱导分化14天后，进行油红O染色。油红O染色后可见大量红色油滴样颗粒(图9)，表明尿来源间充质干细胞具有向脂肪细胞分化的能力。

Claims (6)

1.一种尿来源间充质干细胞的提取及体外扩增培养方法，其特征在于无创，成本低，操作性强。
2.权利要求1所述完全培养基组成为：Lonza12-725基础培养基，10％胎牛血清，1％L-谷氨酰胺，1％抗生素。
3.权利要求1所述的成骨分化培养基包含有：50μg/ml维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠、0.1μM地塞米松。
4.权利要求1所述的成脂肪分化培养基包含有：0.5μM地塞米松、50μM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、50μM吲哚美辛，10μg/ml胰岛素。
5.权利要求1所述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中所述抗生素为含有100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素的抗生素。
6.权利要求1所述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中所述细胞培养箱的培养条件是：温度37℃，5％CO2饱和湿度。
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