CN114134106A - 一种尿源间充质干细胞线粒体及其移植方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种尿源间充质干细胞线粒体及其移植方法与应用，从尿液中提取尿源间充质干细胞线粒体，用于改善卵母细胞的质量，移植方法包括：在卵胞浆内单精子显微注射期间，将精子与尿源间充质干细胞线粒体共同注射到成熟的卵母细胞中，进行囊胚培养。本发明的有益效果：本发明通过在传统ICSI期间联合尿源间充质干细胞线粒体的移植，使得人类体外受精的受精率及胚胎质量方面有了明显改善，可用于不孕症低预后患者的体外受精，治疗效果较好。解决了现有技术中自体线粒体来源的问题，不涉及第三方遗传物质引入及伦理问题；本发明的移植方法，操作简单，可行性强，可用于自体无创治疗。

Description

一种尿源间充质干细胞线粒体及其移植方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种尿源间充质干细胞线粒体及其移植方法与应用，具体涉及一种卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)期间联合自体无创来源的尿源间充质干细胞线粒体移植方法，可用于改善卵母细胞质量，有助于体外受精和胚胎培养。
背景技术
在国家生育力持续降低以及生育年龄不断推后的大环境下，解决不育症女性的生育问题，是目前生殖领域的研究热点。辅助生殖技术中的体外受精/单精子卵胞浆注射技术(In vitro fertilization/Intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI)是目前治疗不孕症的有效措施，国际上成功率达40％左右，但是对于高龄患者或者反复卵子/胚胎质量差的人群，即低预后人群，其治疗后的妊娠结局仍非常之差。该人群目前尚无有效治疗措施，治疗方法仍有待开发。当前文献证据表明，该类人群的卵母细胞或胚胎质量差主要原因在于线粒体的问题，线粒体作为重要的细胞器，为卵母细胞及胚胎发育提供重要的能量来源。高龄患者卵子老化常常伴随线粒体数量减少与生物学功能降低，这些线粒体异常会导致卵母细胞有丝分裂过程供能不足，非整倍体率增加，最终导致胚胎质量差、生育能力下降等一系列问题。因此，通过改善线粒体来提高该类人群的预后是一种临床上可行的治疗方式。
早在20世纪末，欧洲一部分国家实施了将年轻人群的部分卵胞浆线粒体移植到高龄女性的卵母细胞，来治疗高龄女性的不孕症，该方法取得了显著的疗效。该技术即在ICSI期间将精子和约1％-5％年轻供体来源的卵细胞质同时注射到受体卵母细胞中，以改善患者尤其是高龄女性的卵子质量。1997-2001年，约有30个孩子因此技术出生。但是，由于异体第三方遗传物质的引入，该技术涉及伦理和遗传安全性问题。
由于异体线粒体移植存在异质性问题及伦理问题，自体线粒体移植疗法日前受到广泛关注。该技术即通过提取自体细胞来源的线粒体，将其在ICSI的同时注射卵母细胞来改善自身高龄或卵母细胞质量差的不孕症问题，目前用于自体线粒体移植的文献报道的细胞来源较少，主要有卵巢干细胞(OSC)及生殖系颗粒细胞(GC)，但这两类细胞均属卵巢生殖系来源，均存在伴随高龄继发老化的现象。此外，OSC需要通过手术获取大块卵巢皮质提取，这无疑对卵巢功能本身不佳的患者造成了第二次损伤，而且，成人体内OSC的存在性一直备受争议，许多证据指出成年人体内不存在OSC。因此寻找最佳的自体线粒体来源的供体细胞是一个十分有必要深入研究的方向。
干细胞，由于其多能性、代谢方式与卵子时期相似，理论上干细胞来源的线粒体更适用于卵母细胞及胚胎质量的改善，但目前自体干细胞线粒体移植的基础及临床研究报道并不多。2017年动物实验发现自体脂肪来源的间充质干细胞(ASC)线粒体移植入卵子后可以明显提高老龄小鼠卵子的发育潜能。2018年中山大学梁晓燕团队报道了首例应用自体骨髓间充质干细胞(BMSC)来源的线粒体移植治疗1例反复助孕失败不孕患者，并成功活产一名男婴的案例。
尿源性间充质干细胞(USC)是从尿液中无创获取，分离培养出的一类具有较强增殖活性和多向分化潜能的成体干细胞，不仅具有MSC的各种生物学特性，还具有泌尿生殖系间充质干细胞来源的优势。另外，USC是从尿液中分离而得，因此具有安全无创、来源不受限、大量可取以及制备过程简便等特点，故成为了细胞替代治疗和组织工程研究中较理想的种子细胞，已有多项研究将其应用于组织器官修复重建和疾病模型构建。但还没有报道采用尿源性间充质干细胞治疗女性的不孕症。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种尿源间充质干细胞线粒体及其移植方法与应用，通过尿源间充质干细胞线粒体的移植，使得人类体外受精的受精率及胚胎质量方面有了明显改善。
本发明的目的是提供一种尿源间充质干细胞线粒体；
本发明的另一目的是提供上述尿源间充质干细胞线粒体的移植方法；
本发明的再一目的是提供上述尿源间充质干细胞线粒体的应用。
本发明采取的技术方案为：
一种尿源间充质干细胞线粒体，通过以下方法进行提取：
(1)收集尿液到容器中，离心，弃上清，向容器中加入PBS缓冲液重悬,再次离心，弃上清，使用尿源间充质干细胞分离培养基(货号AV-1501，Asia Vector)重悬细胞沉淀，接种至明胶包被的六孔板，放入培养箱进行原代培养；待细胞克隆形成时全换液一次，待克隆融合成大片后，使用胰酶消化，消化后吸去胰酶，使用尿源间充质干细胞扩增培养基(货号AV-1501-B，Asia Vector)重悬，接种至新六孔板内，记为P1代(此后传代及培养与此相同)；
(2)将步骤(1)得到的P1代放置在培养箱继续培养，待六孔板内P1代长满85-95％的面积时，使用胰酶消化，消化后吸去胰酶，使用尿源间充质干细胞扩增培养基重悬，离心，弃上清，加入裂解液(货号MITOISO2组分，Sigma),冰上裂解，之后加入线粒体提取液(货号MITOISO2组分，Sigma)，混匀；离心，吸取上清液，转移至另一容器内，再次离心，弃上清，沉淀即为线粒体；
(3)再次重复离心，洗涤，弃上清，使用线粒体保存液(货号MITOISO2组分，Sigma)重悬线粒体沉淀，0-4℃保存即可。
进一步的，步骤(1)中，所述离心均为1200转离心10分钟。
进一步的，步骤(1)中，细胞克隆形成的时间为7天，克隆融合成大片的时间为14天。
进一步的，步骤(1)中，所述明胶的浓度为0.1％；步骤(1)和(2)中，所述培养箱均为37℃，5％CO2培养箱；所述胰酶为0.05％的胰酶水溶液；胰酶的添加量均为1ml左右，接触完整细胞表面即可；所述消化的时间均为1分钟。
进一步的，步骤(2)中，所述裂解的时间为5分钟；胰酶消化后吸去多余的胰酶，每孔加入1mL尿源间充质干细胞扩增培养基重悬，移入离心管中，1200转速离心3分钟，弃上清，加入细胞裂解液500ul,冰上裂解5分钟，之后加入1ml线粒体提取液，混匀。
进一步的，步骤(2)中，加入1ml线粒体提取液，混匀；800g离心10分钟，吸取上清液，转移至另一离心管内，再次5000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为线粒体。
步骤(3)中，5000g离心10分钟，洗涤，弃上清，使用50ul线粒体保存液重悬离心管内的线粒体沉淀，4度或冰上保存至使用。
上述尿源间充质干细胞线粒体的移植方法包括：在卵胞浆内单精子显微注射期间，将精子与尿源间充质干细胞线粒体共同注射到成熟的卵母细胞中。进行囊胚培养，发现本发明提取到的尿源间充质干细胞线粒体可以改善卵母细胞质量，提高受精率及胚胎质量，提高人类体外受精胚胎发育率。
进一步的，所述尿源间充质干细胞线粒体为自体尿源间充质干细胞线粒体。自体尿源间充质干细胞线粒体和卵母细胞来自于同一人，也就是患者自身来源的尿源间充质干细胞，不是第三方来源的。
具体的，所述的移植方法包括：用显微操作针抓取精子并制动，将精子抵到注射针尖端，移入尿源间充质干细胞线粒体微滴(通过上述方法制备的含有尿源间充质干细胞线粒体的线粒体保存液)内，多次抽吸形成匀浆，吸取所述尿源间充质干细胞线粒体液滴，将尿源间充质干细胞线粒体液滴与单精子共注射入成熟的卵母细胞胞浆中，注射完毕，移入胚胎培养液内进行囊胚培养。
进一步的，所述移植方法包括：显微操作台下，选择口径4.5um的显微操作针，抓取精子并制动，将精子抵到注射针尖端，移入线粒体微滴内，多次抽吸形成匀浆，用注射针吸取所述尿源间充质干细胞线粒体液滴，将注射针前端10um体积长度的4-6万个线粒体与单精子共注射入成熟的卵母细胞胞浆中。注射完毕，移入胚胎培养液内进行囊胚培养。
优选的，将5万个尿源间充质干细胞线粒体((通过上述方法提取的尿源间充质干细胞线粒体的线粒体))注射入成熟的卵母细胞胞浆中。
上述的尿源间充质干细胞线粒体在改善卵母细胞质量药物中的应用。
具体的，将4-6万个尿源间充质干细胞线粒体注射入成熟的卵母细胞胞浆中，以改善卵母细胞的质量。
优选的，将4-6万个自体尿源间充质干细胞线粒体注射入成熟的卵母细胞胞浆中，以改善卵母细胞的质量。自体尿源间充质干细胞线粒体和卵母细胞来自于同一人，也就是患者自身来源的尿源间充质干细胞，不涉及第三方遗传物质引入及伦理问题。
更具体的，在卵胞浆内单精子显微注射期间，将精子与4-6万个自体尿源间充质干细胞线粒体共同注射到成熟的卵母细胞中。
进一步的，用显微操作针抓取精子并制动，将精子抵到注射针尖端，移入尿源间充质干细胞线粒体微滴(通过上述方法制备的含有尿源间充质干细胞线粒体的线粒体保存液)内，多次抽吸形成匀浆，吸取所述尿源间充质干细胞线粒体液滴，将4-6万个自体尿源间充质干细胞线粒体液滴与单精子共注射入成熟的卵母细胞胞浆中。
一种用于改善卵母细胞质量药物，所述药物包含所述尿源间充质干细胞线粒体。
本发明人的研发团队对可自体来源的诸多间充质干细胞(骨髓、脂肪、尿液)进行了线粒体功能和代谢能力各个层面的全面评估，并做了安全性验证，发现尿源间充质干细胞的线粒体在成熟度、功能、代谢模式上均较其他类型间充质干细胞更类似于卵母细胞，此外，其可无创获取的优势，亦适合做为自体细胞线粒体来源的首选，因此，其具备多重研究及应用优势。进一步地，本发明人提取患者自体来源的尿源间充质干细胞线粒体在ICSI期间同单精子共注射，发现试验组在受精率及胚胎质量方面有了明显改善。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)通过试验证明，采用本发明的提取尿源间充质干细胞线粒体方法，可以从患者的尿液中提取到活性较强的尿源间充质干细胞线粒体。
本发明提供了一种尿源间充质干细胞线粒体的移植方法，通过尿源间充质干细胞线粒体的移植，改善卵母细胞的质量，使得人类体外受精的受精率及胚胎质量方面有了明显改善。
(2)本发明提供了一种尿源间充质干细胞线粒体的移植方法，在传统ICSI期间联合尿源间充质干细胞线粒体移植，可用于不孕症低预后患者的体外受精，治疗效果较好；
(3)本发明人提取患者自体来源的尿源间充质干细胞线粒体在ICSI期间同单精子共注射，发现试验组在受精率及胚胎质量方面有了明显改善；
(4)本发明解决了现有技术中异体线粒体移植存在异质性问题及伦理等问题，自体线粒体来源不涉及第三方遗传物质引入及伦理问题；而且，安全无创、来源不受限、大量可取，采用本发明的移植方法可以实现自体无创的治疗不孕症；
(5)本发明的尿源间充质干细胞的线粒体移植方法，操作简单，可行性强，无创获取，亦可用于其他类型疾病的自体线粒体治疗，如帕金森综合症、心脏病、退行性神经肌肉疾病、代谢病等与线粒体代谢异常相关的疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示低预后患者的成熟卵母细胞的线粒体生物活性与正常人群比较；
图2显示根据本发明的实施例3的P1代尿源性间充质干细胞光镜图；
图3尿源间充质干细胞流式表面标记物鉴定；
图4为根据本发明的实施例3提取的尿源间充质干细胞线粒体的活性鉴定图；
图5为本发明ICSI期间单精子联合自体尿源间充质干细胞线粒体共注射过程；
图6为本发明体外授精后第一天对照组和试验组的受精情况比较；
图7为本发明体外授精后第三天对照组和试验组的胚胎发育情况比较；
图8为本发明体外授精后第五天对照组和试验组的胚胎发育情况比较；
图9为尿源、骨髓、脂肪来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞的线粒体拷贝数差异比较；
图10为尿源、骨髓、脂肪来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞的胞外产酸能力(ECAR)比较；
图11为尿源、骨髓、脂肪来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞的耗氧量(OCR)比较；
图12为尿源、骨髓、脂肪来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞的线粒体编码的电子传递链基因的表达图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例通过以下方法进行提取得到尿源间充质干细胞线粒体：
(1)收集尿液到容器中，离心，弃上清，向容器中加入PBS缓冲液重悬,再次离心，弃上清，使用尿源间充质干细胞分离培养基重悬细胞沉淀，接种至明胶包被的六孔板，放入培养箱进行原代培养；待小克隆形成后全换液一次，待克隆融合成大片后，使用胰酶消化，消化后吸去胰酶，使用USC扩增培养基重悬，接种至新六孔板内，记为P1代(此后传代及培养与此相同)；
(2)将步骤(1)得到的P1代放置在培养箱继续培养，待六孔板内P1代长满95％的面积时，使用胰酶消化，消化后吸去胰酶，使用尿源间充质干细胞扩增培养基重悬，离心，弃上清，加入细胞裂解液,冰上裂解，之后加入线粒体提取液，混匀；离心，吸取上清液，转移至另一容器内，再次离心，弃上清，沉淀即为线粒体；
(3)再次重复离心，洗涤，弃上清，使用线粒体保存液重悬线粒体沉淀，4℃以下保存即可。
实施例2
本实施例提供了一种尿源间充质干细胞线粒体的移植方法包括：在卵胞浆内单精子显微注射期间，将精子与尿源间充质干细胞线粒体(使用线粒体保存液重悬线粒体沉淀得到的线粒体溶液微滴)共同注射到成熟的卵母细胞中，进行囊胚培养，以改善卵母细胞质量，提高受精率及胚胎质量，提高人类体外受精胚胎发育率。
实施例3
本实施例中的低预后患者的成熟卵母细胞的线粒体生物活性与正常人群进行比较
共聚焦显微镜下观察正常人群与低预后患者的成熟卵母细胞线粒体活性，TMRE为四甲基罗丹明乙酯,即线粒体膜电位指示剂，红色荧光代表线粒体活性强度，结果如图1所示。
从图1结果显示，正常人群卵母细胞线粒体生物活性显著高于低预后患者。
通过以下步骤(1)-(3)进行提取得到同一低预后患者的尿源间充质干细胞线粒体：
(1)收集上述低预后患者尿液200mL，分装至50mL无菌离心管，1200转速离心10分钟，弃上清，20mLPBS重悬,再次1200转速离心10分钟，弃上清，使用USC分离培养基重悬细胞沉淀，接种至0.1％明胶包被的六孔板，放置在37℃，5％CO2培养箱中进行原代培养，第7天待小克隆形成后全换液一次，第14天待克隆融合成大片(充满整个100倍显微镜视野)后，加入0.05％胰酶消化，消化1分钟后吸去多余的胰酶，使用USC扩增培养基重悬，接种至新六孔板内，记为P1代(P1代尿源性间充质干细胞光镜图如图2所示)；
尿源间充质干细胞流式表面标记物鉴定
利用流式细胞仪检测得到的尿源间充质干细胞的阳性表达间充质干细胞表面阳性标记物CD29,CD73,CD90,CD13,CD44,SSEA-4，阴性表达CD45,CD34,CD31,HLA-DR等其造血干细胞及内皮细胞标记物，证明其间充质来源，结果图3所示，由图可见，本发明分离的细胞为尿源间充质干细胞。
(2)将步骤(1)得到的P1代尿源性间充质干细胞放置在37℃，5％CO2培养箱继续培养，此后传代及培养与此相同；待六孔板内P1代尿源间充质干细胞长满90％，使用0.05％胰酶消化，消化1分钟后吸去多余的胰酶，使用1mL尿源间充质干细胞扩增培养基重悬，吸取至1.5mL无菌EP管内，1200转速离心3分钟，弃上清，加入细胞裂解液500ul,冰上裂解5分钟(每1分钟颠倒混匀一次)，之后加入1ml线粒体提取液，混匀；800g离心10分钟，吸取上清液，转移至新的1.5mL无菌EP管内，再次5000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为线粒体；
(3)再次重复5000g离心10分钟，洗涤，弃上清，使用50ul线粒体保存液重悬线粒体沉淀，得到的线粒体液，冰上保存至使用。
对尿源性间充质干细胞线粒体进行活性鉴定
尿源性间充质干细胞线粒体提取后，共聚焦显微镜下观察线粒体活性，结果如图4所示，图中，TMRE为四甲基罗丹明乙酯,即采用TMRE为线粒体膜电位指示剂，红色荧光代表线粒体活性强度；FCCP为氧化磷酸化解偶联剂，左图为实施例3得到的尿源性间充质干细胞线粒体中加入TMRE未加入FCCP，红色荧光强度显示尿源性间充质干细胞线粒体具有活性；右图为加入TMRE和FCCP做为阴性对照，加入后红色荧光显著减弱，线粒体活性显著降低。
然后，使用成熟卵母细胞进行ICSI体外授精，具体为：显微操作台下，选择口径4.5um的显微操作针，抓取精子并制动，将精子抵到注射针尖端，移入线粒体微滴内，反复抽吸并吸取线粒体液滴(来自于步骤(3)使用50ul线粒体保存液重悬线粒体沉淀得到的线粒体液)，保证注射所需要的线粒体浓度，将前端10um体积长度(约5万左右个线粒体)与之前抓取制动的精子共同注射入成熟的卵母细胞胞浆中(如图5所示)，注射器的尖端部分为线粒体，线粒体后是单精子，注射完毕，移入胚胎培养液内进行囊胚培养。
比较同一患者姊妹卵的传统ICSI组(对照组)与ICSI期间自体USC线粒体移植试验组间差异
试验组：对3位病患者的姊妹卵采用实施例3的方法进行ICSI线粒体共注射体外授精；
对照组和试验组的区别在于：传统ICSI体外授精，未进行自体尿源间充质干细胞线粒体移植；具体方法为：使用成熟卵母细胞进行传统ICSI体外授精，显微操作台下，选择口径4.5um的显微操作针，抓取精子并制动，将精子抵到注射针尖端，注射入成熟的卵母细胞胞浆中，注射完毕，移入胚胎培养液内进行囊胚培养。
将对照组和试验组的受精情况、胚胎情况进行比较，结果如图6-8。由图可以看出，第一天，对照组受精异常；试验组正常受精，双原核(2PN)形成(图6)；第三天，对照组为Ⅳ级胚胎(碎片)，试验组为9细胞Ⅲ级胚胎，卵裂速度正常(图7)；第五天，对照组胚胎发育阻滞，试验组为BC级早期囊胚(图8)。上述试验说明试验组在正常受精率、卵裂速度、胚胎质量均得到改善。
本发明人通过对可自体来源的诸多间充质干细胞(骨髓、脂肪、尿液)进行了线粒体功能和代谢能力各个层面的全面评估，并做了安全性验证，发现尿源间充质干细胞的线粒体在成熟度、功能、代谢模式上均较其他类型间充质干细胞更类似于卵母细胞，具体如下：
1、尿源(USC)、骨髓(BMSC)、脂肪(ASC)来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞(GC)的线粒体拷贝数差异比较，结果如图9所示。
由图9可知，年轻人群GC,USC,BMSC,ASC的线粒体拷贝数未有显著性差异；高龄GC、BMSC的线粒体拷贝数较年轻人群显著下降，而USC、ASC的线粒体拷贝数下降幅度不大；高龄USC的线粒体拷贝数显著高于高龄GC、BMSC。
2、尿源(USC)、骨髓(BMSC)、脂肪(ASC)来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞(GC)的细胞代谢及线粒体功能比较，结果如图10和图11所示，图10显示检测细胞的胞外产酸能力(ECAR)，间接显示胞浆糖酵解能力；图11显示检测细胞的耗氧量(OCR)，反应线粒体氧化磷酸化能力。
由图10和图11可知，无论年轻还是高龄患者，尿源间充质干细胞(USC)的整体细胞代谢能力(包含糖酵解和氧化磷酸化)均较同龄骨髓、脂肪来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞旺盛。
3、尿源(USC)、骨髓(BMSC)、脂肪(ASC)来源间充质干细胞及卵巢颗粒细胞(GC)的线粒体编码的电子传递链基因的表达图谱如图12所示。
由图12可知，无论年轻还是高龄患者，尿源间充质干细胞线粒体(USC)编码的电子传递链基因表达水平均较其他细胞类型增高。
通过上述试验可以看出，尿源间充质干细胞的线粒体在数量、线粒体功能、基因表达模式上均较其他类型间充质干细胞更具备应用优势，再加上其可无创大量获取的特性，适宜作为自体线粒体来源的首选。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种尿源间充质干细胞线粒体，其特征在于，所述尿源间充质干细胞线粒体通过以下方法进行提取：
(1)收集尿液到容器中，离心，弃上清，向容器中加入PBS缓冲液重悬,再次离心，弃上清，使用尿源间充质干细胞分离培养基重悬细胞沉淀，接种至明胶包被的六孔板，放入培养箱进行原代培养；待细胞克隆形成时全换液一次，待克隆融合成大片后，使用胰酶消化，消化后吸去胰酶，使用尿源间充质干细胞扩增培养基重悬，接种至新六孔板内，记为P1代；
(2)将步骤(1)得到的P1代放置在培养箱继续培养，待六孔板内P1代长满85-95％的面积时，使用胰酶消化，消化后吸去胰酶，使用尿源间充质干细胞扩增培养基重悬，离心，弃上清，加入细胞裂解液,冰上裂解，之后加入线粒体提取液，混匀；离心，吸取上清液，转移至另一容器内，再次离心，弃上清，沉淀即为线粒体；
(3)再次重复离心，洗涤，弃上清，使用线粒体保存液重悬线粒体沉淀，0-4℃保存即可。
2.根据权利要求1所述的尿源间充质干细胞线粒体，其特征在于，步骤(1)中，所述离心均为1200转离心10分钟；细胞克隆形成的时间为7天，克隆融合成大片的时间为14天。
3.根据权利要求1所述的尿源间充质干细胞线粒体，其特征在于，步骤(1)中，所述明胶的浓度为0.1％明胶水溶液；步骤(1)和(2)中，所述培养箱均为37℃，5％CO2培养箱；所述胰酶为0.05％胰酶水溶液；所述消化的时间均为1分钟。
4.根据权利要求1所述的尿源间充质干细胞线粒体，其特征在于，步骤(2)中，所述裂解的时间为5分钟；胰酶消化后吸去多余的胰酶，每孔加入1mL尿源间充质干细胞扩增培养基重悬，移入离心管中，1200转速离心3分钟，弃上清，加入细胞裂解液500ul,冰上裂解5分钟，之后加入1ml线粒体提取液，混匀。
5.根据权利要求5所述的尿源间充质干细胞线粒体，其特征在于，步骤(2)中，加入1ml线粒体提取液，混匀；800g离心10分钟，吸取上清液，转移至另一离心管内，再次5000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为线粒体。
6.权利要求1-5任一所述的尿源间充质干细胞线粒体的移植方法，其特征在于，所述移植方法包括：在卵胞浆内单精子显微注射期间，将精子与尿源间充质干细胞线粒体共同注射到成熟的卵母细胞中；优选的，所述尿源间充质干细胞线粒体为自体尿源间充质干细胞线粒体。
7.根据权利要求6所述的尿源间充质干细胞线粒体的移植方法，其特征在于，所述的移植方法包括：用显微操作针抓取精子并制动，将精子抵到注射针尖端，移入尿源间充质干细胞线粒体微滴内，多次抽吸形成匀浆，之后，将尿源间充质干细胞线粒体液滴与之前抓取制动的精子共注射入成熟的卵母细胞胞浆中。
8.根据权利要求7所述的尿源间充质干细胞线粒体的移植方法，其特征在于，所述移植方法包括：显微操作台下，选择口径4.5um的显微操作针，抓取精子并制动，将精子抵到注射针尖端，移入线粒体微滴内，多次抽吸形成匀浆，用注射针吸取所述尿源间充质干细胞线粒体液滴，将注射针前端10um体积长度的4-6万个线粒体与单精子共注射入成熟的卵母细胞胞浆中；优选的，将5万个线粒体注射入成熟的卵母细胞胞浆中。
9.权利要求1-5任一所述的尿源间充质干细胞线粒体在改善卵母细胞质量药物中的应用。
10.一种用于改善卵母细胞质量药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1-5任一所述的尿源间充质干细胞线粒体。
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