JP2023079206A - 尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアおよびその移植方法ならびに用途 - Google Patents
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Abstract
【課題】尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア、その移植方法およびその用途を提供する。【解決手段】尿液から尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出して、卵細胞の品質を改善し、移植方法は、卵細胞質内単一精子マイクロインジェクション期間中、精子と尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを成熟した卵細胞に注入して、胚盤胞培養を行うステップを含む。【効果】従来のＩＣＳＩ期間尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植を組み合わせて、ヒト体外受精の受精率および胚品質を顕著に改善でき、予後不良の不妊患者の体外受精に、より優れた治療効果で使用することができる。第三者の遺伝物質の導入や倫理的問題を伴うことなく、従来技術における自己ミトコンドリア源の問題を解決でき、本発明の移植方法は、操作しやすく、自己非侵襲的な治療を簡単で実現することができる。【選択図】図２
Description
本発明は、バイオメディカルの技術分野に属し、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアおよびその移植方法ならびに用途に関し、具体的には、卵細胞質内単一精子マイクロインジェクション（ＩＣＳＩ）期間自己非侵襲的な尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア移植方法に関し、卵細胞品質を改善し、体外受精や胚培養に寄与することができる。
少子化や出産年齢の引き下げが進む中、不妊症女性の不妊問題への取り組みは、生殖工学の分野では現在ホットな研究テーマとなっている。生殖補助医療技術の一つである体外受精／卵細胞質内精子注入技術（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ／Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ）は、現在、国際的に約４０％の成功率を誇る不妊症の有効な治療法ですが、高齢の患者や卵／胚の不良が繰り返される患者、すなわち予後不良の患者では、治療後の妊娠成績は非常に悪く、その治療法の確立が急務となっている。現在、文献上では、このグループの卵や胚の品質不良の主な原因は、卵や胚の発生に重要なエネルギー源を提供する重要な小器官であるミトコンドリアの問題であることが示唆されている。高齢者における卵の老化は、しばしばミトコンドリアの数と生物学的機能の減少を伴い、これらのミトコンドリア異常は、卵の分裂過程へのエネルギー供給不足や異数性率の上昇を招き、最終的には胚の質の低下や生殖能力の低下など、様々な問題を引き起こす可能性がある。したがって、ミトコンドリアを改善することによってこのグループの予後を改善することは、臨床的に実現可能な治療方法である。
２０世紀後半、高齢女性の不妊治療のために、若いグループの卵ミトコンドリアを高齢女性の卵に部分的に移植する方法がヨーロッパの一部の国で実施され、めざましい成果を上げたことがある。この技術は、顕微授精の際に精子と若いドナー源の卵細胞質の約１～５％をレシピエント卵に同時に注入し、特に高齢の女性において患者の卵の質を改善するものである。この技術により、１９９７～２００１年に約３０人の子供が生まれた。しかし、異種第三者の遺伝子を導入するため、倫理面や遺伝子の安全性に問題がある。
自己ミトコンドリア移植は、異種ミトコンドリア移植の異質性や倫理的な問題から、最近注目されている。この技術は、自己細胞からミトコンドリアを抽出し、ＩＣＳＩと同時に卵細胞に注入することで自身の高齢や卵細胞品質が悪い場合の不妊症問題を改善する。現在、自己ミトコンドリア移植の文献で報告される細胞源が少なく、主に卵巣乾細胞（ＯＳＣ）と生殖系顆粒細胞（ＧＣ）があるが、このような細胞はいずれも卵巣生殖系由来で、高齢化に伴う二次老化の現象がある。また、ＯＳＣは、卵巣の皮質を大きく切り取る手術が必要で、卵巣機能が低下している患者自身にとって、二次的な傷害となることは間違いなく、さらに、成人におけるＯＳＣの存在については賛否両論あり、成人ではＯＳＣが存在しないことを指摘する証拠が多くある。したがって、最適な自己ミトコンドリア由来ドナー細胞の探索は、今後の研究にとって非常に必要な方向性にある。
幹細胞は、その多能性から卵子期の代謝と類似しているため、理論的には幹細胞由来のミトコンドリアよりも卵子や胚の品質向上に適しているとされるが、自己幹細胞ミトコンドリア移植に関する基礎的・臨床的研究はあまり多く報告されていない。２０１７年の動物実験では、卵に移植した自己脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）のミトコンドリアが、高齢マウスの卵の発育能力を有意に高めることが分かった。２０１８年、中山大学のＸｉａｏｙａｎ Ｌｉａｎｇのチームは、不妊治療を繰り返す患者の治療に自家骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）由来のミトコンドリア移植を適用し、男性の生児出産に成功した初の事例を報告した。
尿由来間葉系幹細胞（ＵＳＣ）は、強い増殖活性と多方向の分化能を有する成体幹細胞の一種で、尿から非侵襲的に得られ、培養により単離された細胞であり、ＭＳＣの生物学的特性をすべて備えているだけでなく、泌尿器系間葉系幹細胞の供給源となる利点もある。また、ＵＳＣは尿から分離されるため、安全で非侵襲性、由来が限定されず、大量に入手でき、調製が容易なことから、細胞置換療法や組織工学研究の種細胞として理想的な細胞であり、組織や臓器の修復再構築や疾患モデル構築に応用するための研究がいくつか行われている。しかし、尿由来の間葉系幹細胞を女性の不妊治療に用いることは、これまで報告されていない。
そこで、本特許出願を提出する。
従来技術における問題を解決するために、本発明は、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアおよびその移植方法ならびに用途を提供し、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを移植することにより、ヒト体外受精の受精率および胚品質を大幅に向上させることができる。
本発明の目的は、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを提供することである。
本発明の別の目的は、上記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの用途を提供することである。
本発明は以下の技術手段を採用する。
尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアは、以下の方法によって抽出され、
（１）尿液を容器に収集し、遠心分離して上澄み液を捨て、容器にＰＢＳ緩衝液を加えて再懸濁し、再び遠心分離して上澄み液を捨て、尿由来間葉系幹細胞分離培地を使用して細胞沈殿を再懸濁し、ゼラチンコート６穴プレートに接種し、培養箱に入れて初代培養し、細胞クローンが形成されたら液を全部交換し、クローンが大片に融合した後、トリプシンで消化し、消化後トリプシンを吸引して除去し、尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、新しい６穴プレート内に接種し、Ｐ１世代として記録する（以後、継代や培養は同じである）。
尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアは、以下の方法によって抽出され、
（１）尿液を容器に収集し、遠心分離して上澄み液を捨て、容器にＰＢＳ緩衝液を加えて再懸濁し、再び遠心分離して上澄み液を捨て、尿由来間葉系幹細胞分離培地を使用して細胞沈殿を再懸濁し、ゼラチンコート６穴プレートに接種し、培養箱に入れて初代培養し、細胞クローンが形成されたら液を全部交換し、クローンが大片に融合した後、トリプシンで消化し、消化後トリプシンを吸引して除去し、尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、新しい６穴プレート内に接種し、Ｐ１世代として記録する（以後、継代や培養は同じである）。
（２）ステップ（１）で得られたＰ１世代を培養箱に入れて培養を続け、６穴プレート内のＰ１世代が８５～９５％の面積になるとき、トリプシンで消化し、消化後トリプシンを吸引して除去し、尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、遠心分離して上澄み液を捨て、細胞溶解液を加え、氷上溶解した後ミトコンドリア抽出液を加えて均一に混合し、遠心分離し、上澄み液を吸引し、別の容器に移し、再び遠心分離して上澄み液を捨て、沈殿物をミトコンドリアとする。
ステップ（２）の後、ステップ（３）を実施し、再び遠心分離、洗浄、上澄み液捨てを繰り返し、ミトコンドリア保存液でステップ（２）で得られた尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア沈殿を再懸濁し、０～４℃で保存する。
さらに、ステップ（１）において、前記遠心分離はいずれも１２００ｒｐｍで１０分間行われる。
さらに、細胞クローンが形成されたら液を全部交換し、クローンが大片に融合した後（１００倍顕微鏡視野全体を占める）、トリプシンで消化する。
消化後トリプシンを吸引して除去し、尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、新しい６穴プレート内に接種し、Ｐ１世代として記録する（以後、継代や培養は同じである）。
またさらに、ステップ（１）において、細胞クローンの形成時間が７日間であり、クローンが大片に融合する時間が１４日間である。
またさらに、ステップ（１）において、細胞クローンの形成時間が７日間であり、クローンが大片に融合する時間が１４日間である。
さらに、ステップ（１）において、前記ゼラチンの濃度が０．１％であり、ステップ（１）および（２）において、前記培養箱はいずれも３７℃、５％ ＣＯ２培養箱であり、前記トリプシンが０．０５％のトリプシン水溶液であり、トリプシンの添加量はいずれも約１ｍｌであり、細胞表面全体に接触すればよく、前記消化時間はいずれも１分間である。
さらに、ステップ（２）において、前記溶解時間が５分間であり、トリプシン消化後過剰のトリプシンを吸引し、各穴に１ｍＬの尿由来間葉系幹細胞増幅培地を加えて再懸濁し、遠心分離管に移して、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を捨て、５００μｌの細胞溶解液を加え、氷上で５分間溶解した後、１ｍｌのミトコンドリア抽出液を加え、均一に混合する。
さらに、ステップ（２）において、１ｍｌのミトコンドリア抽出液を加え、均一に混合し、８００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を吸引し、別の遠心分離管内に移し、再び５０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨て、沈殿物をミトコンドリアとする。
さらに、ステップ（３）において、５０００ｇで１０分間遠心分離し、洗浄し、上澄み液を捨て、５０μｌのミトコンドリア保存液で遠心分離管内のミトコンドリア沈殿を再懸濁し、４度または氷上で保存して用意する。
上記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法は、卵細胞質内単一精子マイクロインジェクション期間、精子と尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを成熟した卵細胞に注入する。さらに胚盤胞培養を実施し、本発明で抽出した尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアは、卵細胞品質を改善し、受精率および胚品質、人間体外受精胚発育率を向上させることができる。
さらに、前記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアは、自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアである。自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアと卵細胞は同一人、つまり患者自身に由来する尿由来間葉系幹細胞であり、第三者の供給源に由来するものではない。
具体的に、前記の移植方法は、微細操作針で精子を掴んで制動し、精子を注入針の先端に動かし、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア微滴に移し（上記方法で調製した尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを含有するミトコンドリア保存液）、数回吸引してホモジネートを形成し、前記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア液滴を吸引し、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア液滴と単一精子を成熟した卵細胞質に注入し、注入が完了した後、胚培養液内に移して胚盤胞培養を実施することを含む。
さらに、前記移植方法は、マイクロ操作台下で、内径４．５μｍの微細操作針を選択し、精子を掴んで制動し、精子を注入針の先端に動かし、ミトコンドリアの微小液滴に移し、数回吸引してホモジネートを形成し、注入針で前記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア液滴を吸引し、注入針の前端１０μｍ体積長の４～６万個のミトコンドリアと単一精子を成熟した卵細胞質に注入する。注入が完了した後、胚培養液内に移して胚盤胞培養を実施することを含む。
好ましくは、４．８～５．２万個の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア（（上記方法で抽出した尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアのミトコンドリア））を成熟した卵細胞質に注入する。
上記の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの卵細胞品質改善剤における用途である。
具体的に、４～６万個の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを成熟した卵細胞質に注入して、卵細胞の品質を改善する。
具体的に、４～６万個の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを成熟した卵細胞質に注入して、卵細胞の品質を改善する。
好ましくは、４～６万個の自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを成熟した卵細胞質に注入して、卵細胞の品質を改善する。自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアと卵細胞は同一人、つまり患者自身に由来する尿由来間葉系幹細胞であり、第三者の遺伝物質の導入や倫理的問題はない。
より具体的に、卵細胞質内単一精子マイクロインジェクション期間、精子と４～６万個の自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを成熟した卵細胞に注入する。
さらに、微細操作針で精子を掴んで制動し、精子を注入針の先端に動かし、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア微滴に移し（上記方法で調製した尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを含有するミトコンドリア保存液）、数回吸引してホモジネートを形成し、前記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア液滴を吸引し、４～６万個の自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア液滴と単一精子を成熟した卵細胞質に注入する。
卵細胞品質改善剤は、前記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを含有する。
本発明者の開発チームは、自己由来の多くの間葉系幹細胞（骨髄、脂肪、尿）をミトコンドリア機能と代謝能力の各レベルで総合的に評価し、安全性の検証を行った結果、尿由来間葉系幹細胞のミトコンドリアは成熟度、機能、代謝モードにおいて他の種類の間葉系幹細胞よりも卵細胞に近く、さらに非侵襲的に入手できる利点を有し、自己細胞ミトコンドリアの供給源として適するため、研究および応用において複数の利点がある。さらに、本発明者は、患者自己に由来する尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出してＩＣＳＩ期間単一精子とともに注入した結果、試験組では受精率および胚品質が大幅に改善されることを見だした。
従来技術と比較すると、本発明は以下の有益な効果を有する。
（１）本発明の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの抽出方法を用いることにより、患者の尿液から高活性の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出できることが、試験により実証された。
本発明は尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法を提供し、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを移植することにより、卵細胞の品質を改善して、ヒト体外受精の受精率および胚品質を大幅に向上させることができる。
（２）本発明は尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法を提供し、従来ＩＣＳＩ期間尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植を組み合わせて、予後不良の不妊患者の体外受精に適用でき、治療効果が良好である。
（３）本発明者は、患者自己に由来する尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアをＩＣＳＩ期間単一精子とともに注入した結果、試験組では受精率および胚品質が大幅に改善されることを見だした。
（４）本発明は従来技術における異種ミトコンドリア移植の異種問題および倫理的問題を解決し、自己ミトコンドリア源は第三者の遺伝物質の導入や倫理的問題を伴わず、さらに、安全で非侵襲的であり、供給源が限定されず大量に入手でき、本発明の移植方法は自己非侵襲的な不妊症治療を実現することができる。
（５）本発明の尿由来間葉系幹細胞のミトコンドリア移植方法は、操作が簡単で、実用的であり、非侵襲的に入手でき、パーキンソン症候群、心臓病、変性神経筋疾患、代謝性疾患などミトコンドリア代謝異常に関連する他の種類の疾患に対する自己ミトコンドリア治療にも使用することができる。
本発明の実施例または従来技術の技術手段をより明確にするために、以下、実施例または従来技術の説明で使用される必要な図面を簡単に説明するが、明らかに、以下で説明される図面は本発明のいくつかの実施例に過ぎず、当業者にとって、創造的な労働をすることなく、これらの図面に基づいて他の図面を得ることができる。
予後不良の患者の成熟卵細胞のミトコンドリア生物活性と正常者との比較を示す図である。
本発明の実施例３によるＰ１世代の尿由来間葉系幹細胞の光顕微鏡写真である。
尿由来間葉系幹細胞フローサーフェスマーカーの同定を示す図である。
本発明の実施例３により抽出した尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの活性同定を示す図である。
本発明のＩＣＳＩ期間単一精子と自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを合わせて注入する過程を示す図である。
本発明の体外授精後１日目対照組と試験組の受精状況の比較を示す図である。
本発明の体外授精後３日目対照組と試験組の胚発育状況の比較を示す図である。
本発明の体外授精後５日目対照組と試験組の胚発育状況の比較を示す図である。
尿、骨髓、脂肪由来の間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞のミトコンドリアのコピー数の違いの比較を示す図である。
尿、骨髓、脂肪由来の間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞の細胞外酸産生能力（ＥＣＡＲ）の比較を示す図である。
尿、骨髓、脂肪由来の間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞の酸素消費量（ＯＣＲ）の比較を示す図である。
尿、骨髓、脂肪由来の間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞のミトコンドリアコードの電子輸送系遺伝子の発現プロファイルを示す図である。
本発明の目的、技術手段および利点をより明確にするために、以下、実施例と図面を参照しながら本発明の技術手段をさらに詳細に説明する。当然のことながら、説明される実施例は本発明の一部の実施例に過ぎず、すべての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者は創造的な労働をすることなく得られた他の実施形態は、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
以下の実施例で使用される尿由来間葉系幹細胞分離培地、尿由来間葉系幹細胞増幅培地、溶解液、ミトコンドリア抽出液、トリプシンおよびミトコンドリア保存液はいずれも市販品である。そのうちに、尿由来間葉系幹細胞分離培地（品番ＡＶ-１５０１、Ａｓｉａ Ｖｅｃｔｏｒ）、尿由来間葉系幹細胞増幅培地（品番ＡＶ-１５０１-Ｂ、Ａｓｉａ Ｖｅｃｔｏｒ）、溶解液 （品番ＭＩＴＯＩＳＯ２成分、Ｓｉｇｍａ）、ミトコンドリア抽出液（品番ＭＩＴＯＩＳＯ２成分、Ｓｉｇｍａ）、トリプシン（Ｓｉｇｍａ）ミトコンドリア保存液（品番ＭＩＴＯＩＳＯ２成分、Ｓｉｇｍａ）を使用する。
＜実施例１＞
本実施例は、以下の方法によって尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出する。
本実施例は、以下の方法によって尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出する。
（１）尿液を容器に収集し、遠心分離して上澄み液を捨て、容器にＰＢＳ緩衝液を加えて再懸濁し、再び遠心分離して上澄み液を捨て、尿由来間葉系幹細胞分離培地を使用して細胞沈殿を再懸濁し、ゼラチンコート６穴プレートに接種し、培養箱に入れて初代培養し、細胞クローンが形成されたら液を全部交換し、クローンが大片に融合した後、トリプシンで消化し、消化後トリプシンを吸引して除去し、ＵＳＣ増幅培地で再懸濁し、新しい６穴プレート内に接種し、Ｐ１世代として記録する（以後、継代や培養は同じである）。
（２）ステップ（１）で得られたＰ１世代を培養箱に入れて培養を続け、６穴プレート内のＰ１世代が８５～９５％の面積になるとき、トリプシンで消化し、消化後トリプシンを吸引して除去し、尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、遠心分離して上澄み液を捨て、細胞溶解液を加え、氷上溶解した後ミトコンドリア抽出液を加えて均一に混合し、遠心分離し、上澄み液を吸引し、別の容器に移し、再び遠心分離して上澄み液を捨て、沈殿物をミトコンドリアとする。
（３）再び遠心分離、洗浄、上澄み液捨てを繰り返し、ミトコンドリア保存液でミトコンドリア沈殿を再懸濁し、４℃以下で保存する。
＜実施例２＞
本実施例は尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法を提供する。この移植方法は、卵細胞質内単一精子マイクロインジェクション期間、精子と尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア（ミトコンドリア保存液でミトコンドリア沈殿を再懸濁して得られたミトコンドリア溶液微滴）を成熟した卵細胞に注入し、胚盤胞培養を実施して、卵細胞品質を改善し、受精率および胚品質、人間体外受精胚発育率を向上させる。
本実施例は尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法を提供する。この移植方法は、卵細胞質内単一精子マイクロインジェクション期間、精子と尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア（ミトコンドリア保存液でミトコンドリア沈殿を再懸濁して得られたミトコンドリア溶液微滴）を成熟した卵細胞に注入し、胚盤胞培養を実施して、卵細胞品質を改善し、受精率および胚品質、人間体外受精胚発育率を向上させる。
＜実施例３＞
本実施例中の予後不良患者の成熟卵細胞のミトコンドリア生物活性と正常者の比較
共焦点顕微鏡で正常者と予後不良患者の成熟卵細胞ミトコンドリア活性を観察する。図１に示すように、ミトコンドリア膜電位指標であるテトラメチルローダミンエチルエステル、赤い蛍光はミトコンドリア活性の強さを表す。
本実施例中の予後不良患者の成熟卵細胞のミトコンドリア生物活性と正常者の比較
共焦点顕微鏡で正常者と予後不良患者の成熟卵細胞ミトコンドリア活性を観察する。図１に示すように、ミトコンドリア膜電位指標であるテトラメチルローダミンエチルエステル、赤い蛍光はミトコンドリア活性の強さを表す。
図１の結果から分かるように、正常者の卵細胞ミトコンドリア生物活性が予後不良患者よりも顕著に高い。
以下のステップ（１）～（３）を経って同一予後不良患者の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出する。
（１）上記予後不良患者の尿液２００ｍＬを収集し、５０ｍＬ減菌遠心分離管に分注し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨て、２０ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、再び１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨て、ＵＳＣ分離培地で細胞沈殿を再懸濁し、０．１％ゼラチンコート６穴プレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２培養箱で初代培養し、７日目に小さなクローンが形成された後液体全体を置換し、１４日目にクローンが大片に融合した後（１００倍顕微鏡の視野全体を占める）、０．０５％のトリプシンを加えて消化し、１分間消化した後過剰のトリプシンを吸引し、ＵＳＣ増幅培地で再懸濁し、新しい６穴プレート内に接種し、Ｐ１世代として記録する（Ｐ１世代の尿由来間葉系幹細胞光顕微鏡の写真は図２に示される）。
尿由来間葉系幹細胞フローサーフェスマーカーの同定
フローサイトメトリーを用いて尿由来間葉系幹細胞の陽性発現間葉系幹細胞表面陽性マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＳＳＥＡ-４、陰性発現ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＨＬＡ-ＤＲなどの造血乾細胞および内皮細胞マーカーを検出し、その間葉系源が確認され、結果が図３に示される。図３から分かるように、本発明で分離した細胞は尿由来間葉系幹細胞である。
フローサイトメトリーを用いて尿由来間葉系幹細胞の陽性発現間葉系幹細胞表面陽性マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＳＳＥＡ-４、陰性発現ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＨＬＡ-ＤＲなどの造血乾細胞および内皮細胞マーカーを検出し、その間葉系源が確認され、結果が図３に示される。図３から分かるように、本発明で分離した細胞は尿由来間葉系幹細胞である。
（２）ステップ（１）で得られたＰ１世代の尿由来間葉系幹細胞を３７℃、５％ＣＯ２培養箱に入れて培養を続ける。以後、継代や培養は同じであり、６穴プレート内のＰ１世代の尿由来間葉系幹細胞が９０％に増殖したら、０．０５％のトリプシンで消化し、１分間消化した後過剰のトリプシンを吸引し、１ｍＬの尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、１．５ｍＬの減菌ＥＰ管内に吸引し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を捨て、細胞溶解液５００μｌを加え、氷上で５分間溶解し（１分ごとに転倒させて均一に混合する）、その後１ｍｌのミトコンドリア抽出液を加え、均一に混合し、８００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を吸引し、新しい１．５ｍＬの減菌ＥＰ管内に移し、再び５０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨て、沈殿物をミトコンドリアとする。
（３）再び５０００ｇで１０分間遠心分離し、洗浄、上澄み液捨てを繰り返し、５０μｌのミトコンドリア保存液でミトコンドリア沈殿を再懸濁して得られたミトコンドリア液を氷上で保存して用意する。
尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの活性同定
尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出した後、共焦点顕微鏡でミトコンドリア活性を観察し、結果が図４に示される。図４では、ＴＭＲＥはテトラメチルローダミンエチルエステルであり、つまりＴＭＲＥをミトコンドリア膜電位指標として使用し、赤い蛍光はミトコンドリア活性の強さを表し、ＦＣＣＰは酸化的リン酸化アンカプラーであり、左図は実施例３で得られた尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアにＦＣＣＰではなくＴＭＲＥを添加したものであり、赤い蛍光強度は尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアが活性を有することを示し、右図はＴＭＲＥとＦＣＣＰを添加して陰性対照とし、添加した後赤い蛍光が著しく減少し、ミトコンドリア活性が著しく低下することを示す。
尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを抽出した後、共焦点顕微鏡でミトコンドリア活性を観察し、結果が図４に示される。図４では、ＴＭＲＥはテトラメチルローダミンエチルエステルであり、つまりＴＭＲＥをミトコンドリア膜電位指標として使用し、赤い蛍光はミトコンドリア活性の強さを表し、ＦＣＣＰは酸化的リン酸化アンカプラーであり、左図は実施例３で得られた尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアにＦＣＣＰではなくＴＭＲＥを添加したものであり、赤い蛍光強度は尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアが活性を有することを示し、右図はＴＭＲＥとＦＣＣＰを添加して陰性対照とし、添加した後赤い蛍光が著しく減少し、ミトコンドリア活性が著しく低下することを示す。
次に、成熟卵細胞を用いてＩＣＳＩ体外授精を実施する。具体的には、マイクロ操作台下で、内径４．５μｍの微細操作針を選択し、精子を掴んで制動し、精子を注入針の先端に動かし、ミトコンドリアの微小液滴に移し、抽出を繰り返してミトコンドリア液滴を吸引し（ステップ（３）で５０μｌのミトコンドリア保存液でミトコンドリア沈殿を再懸濁して得られたミトコンドリア液）、注入に必要なミトコンドリア濃度を確保し、前端１０μｍ体積長（約５万個のミトコンドリア）と先に掴んで制動した精子を成熟した卵細胞質に注入し（図５に示され）、注射器の先端部分がミトコンドリアであり、ミトコンドリアの後が単一精子であり、注入が完了した後、胚培養液内に移して胚盤胞培養を開始する。
同一患者姉妹卵に対する従来ＩＣＳＩ組（対照組）とＩＣＳＩ期間自己ＵＳＣミトコンドリア移植試験組との違い
試験組：３人患者の姉妹卵を実施例３の方法でＩＣＳＩミトコンドリア注入体外授精を行った。
試験組：３人患者の姉妹卵を実施例３の方法でＩＣＳＩミトコンドリア注入体外授精を行った。
対照組：試験組との違いは、対照組は、自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植を行わず、従来ＩＣＳＩ体外授精を採用した。具体的な方法は以下のとおりであり、成熟卵細胞を用いて従来ＩＣＳＩ体外授精を実施し、マイクロ操作台下で、内径４．５μｍの微細操作針を選択し、精子を掴んで制動し、精子を注入針の先端に動かし、成熟した卵細胞質に注入し、注入が完了した後、胚培養液内に移して胚盤胞培養を実施する。
対照組と試験組の受精状況、胚状況を比較し、結果が図６～図８に示される。図から分かるように、１日目に対照組が異常受精し、試験組が正常受精し、複式前駆核（２ＰＮ）を形成し（図６）、３日目に対照組がIV級胚（断片）、試験組が９細胞III級胚であり、卵割速度が正常であり（図７）、５日目に対照組が胚発育不良であり、試験組がＢＣ級初期胚盤胞が得られる（図８）。上記試験から分かるように、試験組の正常受精率、卵割速度、胚品質がいずれも改善される。
本発明者は、自己由来の多くの間葉系幹細胞（骨髓、脂肪、尿液）に対してミトコンドリア機能および代謝能力を各レベルで総合的に評価し、安全性の検証を行った結果、尿由来間葉系幹細胞のミトコンドリアは、成熟度、機能、代謝モードにおいて他の種類の間葉系幹細胞よりも卵細胞に近く、具体的には以下のとおりである。
１、尿由来（ＵＳＣ）、骨髓由来(ＢＭＳＣ)、脂肪由来(ＡＳＣ)間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞(ＧＣ)のミトコンドリアコピー数の違いを比較し、結果を図９に示す。
図９から分かるように、若年グループＧＣ、ＵＳＣ、ＢＭＳＣ、ＡＳＣのミトコンドリアコピー数は著しい違いがなく、高齢ＧＣ、ＢＭＳＣのミトコンドリアコピー数は若年グループよりも著しく減少し、ＵＳＣ、ＡＳＣのミトコンドリアコピー数の減少幅が大きくなく、高齢ＵＳＣのミトコンドリアコピー数が高齢ＧＣ、ＢＭＳＣよりも著しく高い。
２、尿由来（ＵＳＣ）、骨髓由来(ＢＭＳＣ)、脂肪由来(ＡＳＣ)間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞(ＧＣ)の細胞代謝およびミトコンドリア機能を比較し、結果が図１０および図１１に示され、図１０は検出細胞の細胞外酸産生能力（ＥＣＡＲ）を示し、細胞質糖分解能を間接に表し、図１１は検出細胞の酸素消費量（ＯＣＲ）を示し、ミトコンドリア酸化的リン酸化能力を反映する。
図１０および図１１から分かるように、尿由来間葉系幹細胞（ＵＳＣ）の全体細胞代謝能力（糖分解と酸化リン酸化）は、若年者、高齢患者を問わず同齢者の骨髓由来、脂肪由来間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞よりも旺盛である。
３、尿由来（ＵＳＣ）、骨髓(ＢＭＳＣ)、脂肪(ＡＳＣ)由来間葉系幹細胞および卵巣顆粒細胞(ＧＣ)のミトコンドリアコードの電子輸送系遺伝子の発現パターンが図１２に示される。
図１２から分かるように、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア（ＵＳＣ）コードの電子輸送系遺伝子発現レベルは、若年者、高齢患者ともに他の細胞種よりも増加した。
上記の試験から分かるように、尿由来間葉系幹細胞のミトコンドリアは、数、ミトコンドリア機能、遺伝子発現モードの点で他の種類の間葉系幹細胞よりも優れ、非侵襲的に大量に入手できる特性と併せて、自己ミトコンドリア由来の好ましい供給源として適している。
以上、本発明の具体的な実施形態を説明したが、本発明の保護範囲はこれに限定されず、当業者は、本発明の技術範囲内で容易に想到した変更や置換は、すべて本発明の保護範囲に含まれる。したがって、本発明の保護範囲は前記特許請求の範囲の保護範囲に従うものとする。
Claims (10)
- （１）尿液を容器に収集し、遠心分離して上澄み液を捨て、容器にＰＢＳ緩衝液を加えて再懸濁し、再び遠心分離して上澄み液を捨て、尿由来間葉系幹細胞分離培地を使用して細胞沈殿を再懸濁し、ゼラチンコート６穴プレートに接種し、培養箱に入れて初代培養し、細胞クローンが形成されたら液を全部交換し、クローンが大片に融合した後、トリプシンで消化し、消化後トリプシンを吸引して除去し、尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、新しい６穴プレート内に接種し、Ｐ１世代として記録するステップと、
（２）ステップ（１）で得られたＰ１世代を培養箱に入れて培養を続け、６穴プレート内のＰ１世代が８５～９５％の面積になるとき、トリプシンで消化し、消化後トリプシンを吸引して除去し、尿由来間葉系幹細胞増幅培地で再懸濁し、遠心分離して上澄み液を捨て、細胞溶解液を加え、氷上溶解した後ミトコンドリア抽出液を加えて均一に混合し、遠心分離し、上澄み液を吸引し、別の容器に移し、再び遠心分離して上澄み液を捨て、沈殿物をミトコンドリアとするステップと、
（３）再び遠心分離、洗浄、上澄み液捨てを繰り返し、ミトコンドリア保存液でミトコンドリア沈殿を再懸濁し、０～４℃で保存するステップと、を含む方法によって抽出される、ことを特徴とする尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア。 - ステップ（１）において、前記遠心分離はいずれも１２００ｒｐｍで１０分間行われ、細胞クローンの形成時間が７日間であり、クローンが大片に融合する時間が１４日間である、ことを特徴とする請求項１に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア。
- ステップ（１）において、ゼラチンの濃度が０．１％ゼラチン水溶液であり、ステップ（１）および（２）において、前記培養箱はいずれも３７℃、５％ ＣＯ２培養箱であり、前記トリプシンは０．０５％トリプシン水溶液であり、消化時間はいずれも１分間である、ことを特徴とする請求項１に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア。
- ステップ（２）において、前記溶解時間が５分間であり、トリプシン消化後過剰のトリプシンを吸引し、各穴に１ｍＬの尿由来間葉系幹細胞増幅培地を加えて再懸濁し、遠心分離管に移して、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を捨て、５００μｌの細胞溶解液を加え、氷上で５分間溶解した後、１ｍｌのミトコンドリア抽出液を加えて均一に混合する、ことを特徴とする請求項１に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア。
- ステップ（２）において、１ｍｌのミトコンドリア抽出液を加え、均一に混合し、８００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を吸引し、別の遠心分離管内に移し、再び５０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を捨て、沈殿物をミトコンドリアとする、ことを特徴とする請求項１に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法であって、前記移植方法は、卵細胞質内単一精子マイクロインジェクション期間、精子と尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを成熟した卵細胞に注入するステップを含み、好ましくは、前記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアは自己尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアである、ことを特徴とする尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア移植方法。
- 前記の移植方法は、微細操作針で精子を掴んで制動し、精子を注入針の先端に動かし、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの微小液滴に移し、数回吸引してホモジネートを形成した後、尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア液滴と先に掴んで制動した精子を成熟した卵細胞質に注入することを含む、ことを特徴とする請求項６に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法。
- 前記移植方法は、マイクロ操作台下で、内径４．５μｍの微細操作針を選択し、精子を掴んで制動し、精子を注入針の先端に動かし、ミトコンドリアの微小液滴に移し、数回吸引してホモジネートを形成し、注入針で前記尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリア液滴を吸引し、注入針の前端１０μｍ体積長の４～６万個のミトコンドリアと単一精子を成熟した卵細胞質に注入することを含む、ことを特徴とする請求項７に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの移植方法。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアの卵細胞品質改善剤における用途。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の尿由来間葉系幹細胞ミトコンドリアを含有することを特徴とする卵細胞品質改善剤。
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