CN114134107A - 一种间充质干细胞参与的人造卵巢及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种间充质干细胞参与的人造卵巢及其制备方法和应用，包括以下步骤：采集小鼠骨片提取得到间充质干细胞；制备卵巢体细胞和生殖细胞悬液；间充质干细胞与卵巢体细胞、生殖细胞、植物凝集充分混合，离心，得到间充质干细胞参与构建的人造卵巢。在小鼠间充质干细胞参与的人造卵巢发育过程中，能够促进卵泡结构形成、降低卵母细胞的凋亡率、提高原始卵泡的利用率及卵母细胞成熟率，并产生能够正常受精的成熟卵母细胞。本发明可推广至临床应用提高患者冻存皮质中原始卵泡利用率和卵母细胞成熟率，优化补充生育力保存现有技术。

Description

一种间充质干细胞参与的人造卵巢及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于人造卵巢制备技术领域，具体涉及一种间充质干细胞参与的人造卵巢及其制备方法和应用。
背景技术
虽然癌症的发病率逐年上升，但随着医学的进步带来更有效的治疗方案，癌症的5年存活率显著提高，在50岁以下的人群中5年生存率可达75%~80%。在我国，每年45岁以下育龄女性的新患肿瘤人数在24万左右，其中大约2-3万为20岁以下的女童或青少年患者。但癌症的放化疗会使超过30％患有恶性肿瘤的育龄妇女不孕。肿瘤放化疗对女性卵巢的影响主要是引起卵泡的凋亡和卵巢间质的损伤。因此，在癌症患者的生活质量越来越受到重视的今天，如何使年轻的患者或儿童，在癌症治愈的同时，保存生育能力，使患者在婚后仍能获得自己健康的后代一直是生殖医学领域不断探索研究和有待优化解决的问题。
生育力保存是指使用手术、药物或实验室技术对存在不育风险的女性或男性提供帮助，保护和保存其产生遗传学后代的能力。对女性而言，目前常用生育力保存方法包括卵子、胚胎和卵巢组织冻存，而对未婚或青春期前女性，卵巢皮质的冻存则更为合适。在患者病情缓解后，冻存皮质里的原始卵泡需要经过体外培养或以结合生物材料构建可移植入患者体内的人造卵巢的方式生长发育，才能产生成熟的卵子。
卵巢作为雌性生殖器官具有不可再生的特性，为了延缓卵巢衰老或为卵巢早衰人群提供生育力保存服务，人造卵巢一直以来都是生殖和再生医学领域研究的难点和热点。3D打印的水凝胶支架接入包括原始，初级，次级卵泡在内的人造卵巢获得了广泛关注，然而这种基于卵泡为单位的卵巢功能的重塑并不能解决那些由于配子缺失、卵泡形成和发育障碍等原因引起的生育力丧失问题。因此，只有进行基于单个细胞层面的卵巢组织重建才能彻底解决上述问题。卵母细胞的发育成熟高度依赖于卵泡结构，所以在人造卵巢构建的过程中，卵泡结构的形成至关重要。卵泡发生是一个漫长而复杂的过程，包括一系列卵母细胞和它周围体细胞的变化。在生理条件下，原始卵泡形成后会进入静息期，为整个生育周期提供卵子储备，只有在卵巢局部的信号调节下激活才能进入生长发育阶段。研究表明，只有在特定发育时期的卵巢体细胞才具有形成卵泡的能力，然而，当它们仅仅与生殖细胞重构形成重组卵巢时，会发生大量卵母细胞凋亡的情况，形成的卵泡也因内部调控机制的紊乱而迅速激活发育，最终导致卵巢在重组后很快丧失功能。可见，要实现卵巢组织的完全三维重构，如何高效率形成卵泡结构并保证卵泡的正常发育，就成为首要解决的问题。
间充质干细胞（MSC）是一类具有定向分化为脂肪、骨、软骨和其它类型细胞能力的多潜能成体干细胞。因其具有方便获得、自我复制、定向分化、低免疫原性等特点，已经成为再生医学领域研究最广泛细胞类型。动物模型的研究成果已应用于临床，将病人的骨髓间充质干细胞移植用于修复受损子宫内膜，可以使子宫恢复正常孕育功能。MSC应用于改善卵巢功能的研究显示：MSC可以明显改善POF小鼠卵巢内环境，恢复血清中E2，AMH，FSH水平，减少颗粒细胞凋亡和卵巢间质纤维化，并增加各级卵泡数目，此外，卵巢内一些生长因子，比如HGF，VEGF，IGF表达水平也会显著升高。虽然，上述研究都表明了间充质干细胞在恢复或保护卵巢功能中的作用，然而大多数研究人员都认为这与间充质干细胞分泌因子的调节作用有关，而关于间充质干细胞是否会分化成卵巢内细胞则由于条件的限制并没有过多提及，其在卵巢功能重建中的作用机制有待于进一步的研究。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一种间充质干细胞参与的人造卵巢及其制备方法和应用，本发明能够提高原始卵泡的发育成功率，卵母细胞的成熟率。
技术方案：一种间充质干细胞参与的人造卵巢制备方法，包括以下步骤：（1）采集小鼠骨片提取得到间充质干细胞；（2）制备卵巢体细胞和生殖细胞悬液；（3）间充质干细胞与卵巢体细胞、生殖细胞、植物凝集充分混合，离心，得到间充质干细胞参与构建的人造卵巢。
具体步骤为：（1）用培养基对小鼠骨髓腔内的骨髓进行冲洗至骨片呈白色，骨片剪碎后用PBS清洗三遍，加入1mg/mL Ⅱ型胶原酶2 mL，37℃消化1小时，加入带有胎牛血清的培养基终止消化；加入αMEM清洗骨片中的胶原酶成分，最后将骨片转移到含有胎牛血清10%（v/v）和双抗 0.1%（v/v）细胞培养基的培养皿内，37℃、5 %CO2 培养箱内经培养；3-4天后用显微镜观察细胞生长情况，待细胞汇合度至80%-90%后加入 0.25 wt.%胰酶消化 3 分钟，收获 MSC，按 1:2传代培养，每2-3天更换培养基1次；对细胞进行传代培养后收获P5代细胞用于人造卵巢构建；（2）取游离的小鼠卵巢组织在干净的PBS中清洗2遍后转移至37℃预热的四型胶原酶中，彻底消化成单细胞悬液；9000转离心10秒，去除消化液，加入α-MEM重悬细胞；（3）在卵巢细胞悬液中并加入上述步骤准备好的间充质干细胞，并加入植物凝集素lectin后在37℃、5 %CO2培养箱内孵育10分钟后13000转离心10秒使细胞聚集，从EP管中取出至培养皿中培养过夜，培养皿中的培养基为: a-MEM+3mg/mL BSA+1 wt.%丙酮酸钠+1wt.%双抗+50μg/mL FSH，即得到间充质干细胞参与的人造卵巢。
上述制备方法得到的间充质干细胞参与的人造卵巢。
上述制备方法得到的间充质干细胞参与的人造卵巢在制备间充质干细胞促进卵巢功能重建研究模型中的应用。
上述制备方法得到的间充质干细胞参与的人造卵巢在制备预防和治疗卵巢受损工具中的应用。
本发明提供的间充质干细胞参与的人造卵巢制备方法适用于生育力保存过程中原始卵泡生长发育获得可形成受精卵的健康成熟卵母细胞环节，服务的领域为生殖医学中的生殖健康和辅助生殖技术领域。
有益效果：在小鼠间充质干细胞参与的人造卵巢发育过程中，能够促进卵泡结构形成、降低卵母细胞的凋亡率、提高原始卵泡的利用率及卵母细胞成熟率，并产生能够正常受精的成熟卵母细胞。本发明可推广至临床应用提高患者冻存皮质中原始卵泡利用率和卵母细胞成熟率，优化补充生育力保存现有技术。
附图说明
图1小鼠骨髓间充质干细胞的形态学及诱导分化鉴定图。A： P5代BMSC细胞形态学特征；B：脂滴油红O染色；C：软骨内的酸性粘多糖阿利新蓝染色；D：钙结节茜素红染色。标尺=50μm。
图2小鼠骨髓间充质干细胞表面标志物流式细胞学鉴定图A-C BMSC阳性标志物CD29（98.67%±1.25）、CD44（98.50%±1.31）、SCA-1（96.97%±1.50）表达情况，D-E BMSC不表达内皮细胞标志物CD31（0.41%±0.15）和造血细胞标志物 CD45（1.84%±0.12）。
图3间充质干细胞参与的人造卵巢制备方法过程模型图。
图4间充质参与的人造卵巢模型促进卵泡生长发育效果示意图。人造卵巢构建后受体鼠肾被膜下移植14天后取材形态学观察。A体视镜下观察重组卵巢Control和MSC移植后经过体内生长后的形态、体积大小，标尺=1㎜。B取材后切片HE染色观察重组卵巢内部生长情况，可见MSC组卵巢内卵泡发育情况优于Control组，标尺=50μm。C人造卵巢构建后受体鼠肾被膜下移植14天后取材后卵泡计数，间充质干细胞参与的人造卵巢中，次级卵泡和有腔卵泡占卵泡总数的百分比明显高于control组。D人造卵巢构建后受体鼠肾被膜下移植14天后取材后免疫组化PCNA染色，可见间充质干细胞组中大颗粒细胞处在增殖生长阶段，标尺=50μm。E人造卵巢构建后受体鼠肾被膜下移植14天后取材后免疫组化AMH染色标记次级卵泡和腔前卵泡，可见MSC组中有较多的卵泡被标记，标尺=50μm。
图5间充质干细胞参与构建的人造卵巢中产生正常受精的成熟卵母效果图。A和D为间充质干细胞参与构建的人造卵巢中获取的成熟卵母细胞形态及其正常纺锤体形态。B和C为间充质干细胞参与构建的人造卵巢中获取的成熟卵母细胞经过体外受精形成二细胞并发育至囊胚。标尺=50μm。
具体实施方式
下面将结合实施例详细地描述本发明，但在此提供的实施例仅出于说明目的，而并不意欲限制本发明。
实施例1：骨髓间充质干细胞的提取及培养
采用清洁级ICR、周龄2周的雌性小鼠进行间充质干细胞的提取。小鼠采取二氧化碳处死方法后，用75%酒精浸泡10分钟达到消毒目的。将皮肤和肌肉剪开后露出小鼠的胫骨和股骨，将其胫骨和股骨剥离出来后将胫骨头和股骨头处剪掉，放入含有培养基的培养皿中。用1mL注射器吸取培养基对骨髓腔内的骨髓进行冲洗至骨片呈白色。骨片剪碎后用PBS清洗三遍，加入Ⅱ型胶原酶（1mg/mL）2 mL，37℃消化1小时，加入带有胎牛血清的培养基终止消化。加入αMEM清洗骨片中的胶原酶成分，最后将骨片转移到含有胎牛血清 10%（v/v）和双抗 0.1%（v/v）细胞培养基的培养皿内，37℃、5 %CO2 培养箱内经培养。3-4天后用显微镜观察细胞生长情况，待细胞汇合度至80%-90%后加入 0.25 wt.%胰酶消化 3 分钟，收获MSC，按 1:2传代培养，每2-3天更换培养基1次。残留的骨片可继续培养获得更多的原代间充质干细胞。对细胞进行传代培养后收获P5代细胞用于实验研究（图1：A）。
实施例2：骨髓间充质干细胞的多向诱导分化
P5代细胞培养至汇合度达到70%至80%时，用0.25 wt.%EDTA-胰酶消化，进行诱导分化成脂肪及成骨实验时，需将细胞接种于6孔板中，进行成软骨诱导分化时，细胞以悬浮球的方式培养于15mL离心管底部。
诱导分化成脂肪及鉴定：当细胞融合度达到100%，吸去原培养基，开始进行诱导。按说明书要求交替使用诱导分化培养基A液、B液。到诱导21天后在再用 B 液维持培养4-7天直到脂滴变得大而圆。成脂诱导分化结束后，用 4 wt.%PFA进行固定，用PBS洗去固定液。加入油红O染液进行染色，30分钟后PBS洗去染液并将培养板置于显微镜下观察并拍照记录（图1：B）
诱导分化成软骨及鉴定：以细胞球的方式将细胞培养至15mL离心管内，每2天换用新鲜的成软骨诱导分化培养基当。细胞团出现聚拢时，轻弹离心管底使细胞团悬浮在液体之中。持续诱导28天后，将细胞团（软骨球）进行福尔马林固定和石蜡包埋切片后用阿利辛蓝染色，观察（图1：C）。
诱导分化成骨及鉴定：细胞融合到60%-70%时，加入成骨诱导分化培养基开始进行诱导。每3天换液。诱导21天，成骨诱导分化结束后，用 4wt.%PFA进行固定，用PBS洗去固定液，加入茜素红染液进行染色。3-5分钟后PBS洗去染液用并显微镜观察（图1：D）。
实施例3：骨髓间充质干细胞特异性标志物的流式检测
收取培养到P5代的细胞进行间充质干细胞特异性标志物的流式鉴定。胰酶消化后的细胞用PBS（4-8℃）洗两遍后以每个EP管100微升106个细胞的浓度用冷的PBS重悬细胞，用PE-conjμgated anti-mouse CD29、CD31、CD34、CD44、Sca-1抗体4℃孵育细胞30分钟，避光。为了鉴别细胞活性，加入PI，4℃避光孵育15分钟。抗体孵育结束后用冷的PBS洗涤细胞两遍后用新的PBS重悬细胞，样本及制备完毕。将制备好的样本用分析型流式细胞仪检测细胞各抗体表达情况并进行分析，如图2所示细胞表达阳性标志物 CD29（98.67%±1.25）、CD44（98.50%±1.31）、SCA-1（96.97%±1.50），不表达内皮细胞标志物CD31（0.41%±0.15）和造血细胞标志物 CD45（1.84%±0.12）。
实施例4：间充质干细胞参与的人造卵巢构建
处于原始卵泡时期的3日龄ICR小鼠冰上冷冻20 分钟，待小鼠完全死亡，酒精消毒后放置在10mm无菌培养皿中。在无菌室环境自小鼠背部肋脊角取出双侧卵巢，置于L15培养基的微滴中，于体视镜下小心剥除卵巢包膜，需保证卵巢的完整性。将游离的卵巢组织在干净的PBS中清洗2遍后转移至37℃预热的四型胶原酶中，彻底消化成单细胞悬液。9000转离心10秒，去除消化液，加入α-MEM重悬细胞。在卵巢细胞悬液中并加入上述步骤准备好的间充质干细胞，并加入植物凝集素lectin后在37℃、5 %CO2培养箱内孵育10分钟后13000转离心10秒使细胞聚集，从EP管中取出至培养皿中培养过夜（培养基为: a-MEM+3mg/mL BSA+1wt.%丙酮酸钠+1 wt.%双抗+50μg/mL FSH），即得到间充质干细胞参与的人造卵巢。
实施例5：人造卵巢制备后肾被膜下移植
进行人造卵巢移植时，同一只受体鼠的两侧肾被膜下，左侧为间充质干细胞参与组，右侧为对照组。选取6-8周龄健康未交配过的ICR雌鼠作为移植受体。腹腔注射阿佛丁240mg/kg使其麻醉；待小鼠完全麻醉，用剃毛机剃去其背部腰侧、预切口附近毛发，并用75%酒精消毒暴露皮肤，小鼠取侧卧位，横放于无菌手术台上。手指在小鼠肋弓和脊柱交叉处轻轻触之以确认小鼠的肾脏位置，在肾脏下端将皮肤剪出一个一公分左右、垂直于脊柱的小口，暴露皮下组织。用镊子夹起皮下组织和腹壁，逐层剪开，注意开口不宜太大，切开大小的标准以肾脏容易拉出并能自然卡注为宜；腹壁打开后可看到肾周脂肪组织和卵巢附件。顺着脂肪组织找到肾的下机与卵巢连接的结缔组织，并双手持眼科镊，一手夹住连接处牵拉，另一手顺势将肾脏从切口处挤出，调整方位将肾脏自然卡主。等肾脏表面包膜略微干燥后，用精细钟表镊提起肾包膜并撕开一小口，将培养过夜的重组卵巢组织小心推入受体鼠肾包膜下，调整到合适位置，防止卵巢从肾包膜开口处滑出；摘除受体鼠两侧的卵巢，移植完成后将肾脏还原至体内。暴露卵巢和附件组织，用烧热的眼科剪剪去卵巢以及少许周围脂肪组织，观察卵巢是否完全去除以及出血情况；检查无误后依次缝合腹膜和皮肤上的切口。将做完手术的小鼠放置在温台上，苏醒后将受体鼠送入实验动物中心常规饲养，每天注射10IU FSH，观察伤口恢复情况。移植14天后取回部分小鼠，二氧化碳处死后，取受体鼠肾脏组织，仔细将移植入的人造卵巢剥离，于体视镜下拍照（图4：A），使用4%中性福尔马林常温固定过夜，包埋切片，进行HE染色、免疫组化PCNA、AMH染色。如图4：B\C\D\E显示间充质干细胞参与的人造卵巢体积大于Control，卵泡形成与发育情况优于Control组，同时卵泡计数的结果显示加入间充质干细胞的人造卵巢中，次级和有腔卵泡占卵泡总数的比例高于Control组。PCNA免疫组化结果显示间充质干细胞参与的人造卵巢内的增殖信号强于Control组。AMH免疫组化的结果中间充质干细胞参与的人造卵巢有更多的次级卵泡和腔前卵泡被标记。可见，间充质干细胞参与的人造卵巢构建方法能够促进卵泡发育。
实施例6：间充质干细胞参与的人造卵巢产生正常受精的成熟卵母细胞
间充质干细胞参与的人造卵巢移植受体鼠行移植手术24天后，于当日夜间22：00腹腔注射hCG 5IU，12小时后，二氧化碳法处死，暴露腹腔，小心将移植入肾包膜下的重组卵巢剥出，将卵巢移至置于M2培养基的无菌培养皿中，用1mL注射器针头戳破卵泡，用口吸针吸取M2期卵细胞置于M2培养基进行后续实验（如图5：A）。提前1小时进行，二氧化碳法处死雄鼠，消毒后暴露腹腔，小心取附睾尾。于镜下将附睾尾周围脂肪组织剥离干净后转移至获能滴中，用1mL注射器针头切碎，释放精子，在37℃，5%CO2培养箱中获能1小时。将上述收集的M2卵母细胞中加入10-15μL获能后的精子后置于培养箱中。受精后6-8小时后，用口吸管将受精后的卵母细胞移至清洗滴中吹洗去周围残留的精子，观察雌雄原核后转移KSOM培养基中，继续培养，后续观察胚胎发育情况，拍照并记录（图5：B\C）。可见间充质干细胞参与人造卵巢可以完成正常卵泡生长、卵母细胞发育成熟的过程。
实施例7：间充质干细胞参与的人造卵巢产生卵母细胞免疫荧光染色
在M2培养基中收集卵细胞，透明质酸酶脱去颗粒细胞，将收集的卵放入3.7% PFA固定液中固定保持30分钟，将固定后的卵转入的0.1% BSA/PBS清洗液中洗5分钟×3次后，将卵放入0.5% Triton X-100/PBS穿透液中保持20 分钟，穿透完成后，用0.1% BSA/PBS清洗液清洗5分钟×3次，在1% BSA/PBS封闭液中封闭1小时以上，将卵转入一抗中孵育，4℃冰箱过夜；第二天将卵转入20μL的0.1% BSA/PBS清洗液中洗10分钟×3次，将卵细胞转移至荧光二抗内孵育50分钟后，用0.1% BSA/PBS清洗液中清洗10分钟×3次，后将卵细胞转移至1:1000配制的Hoechst中孵育15分钟进行核的染色，最后将卵母细胞移入0.1% BSA/PBS清洗液中快速洗3次，清洗结束后转移至玻片上用反淬灭剂进行封片。4℃保存或显微镜观察（图5：D）。上述各步无特殊说明均在室温下进行，在20μL的微滴中操作，二抗孵育开始的后续步骤均需要避光。可见间充质干细胞参与人造卵巢可以产生正常的卵母细胞。

Claims (5)

1.一种间充质干细胞参与的人造卵巢制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采集小鼠骨片提取得到间充质干细胞；（2）制备卵巢体细胞和生殖细胞悬液；（3）间充质干细胞与卵巢体细胞、生殖细胞、植物凝集充分混合，离心，得到间充质干细胞参与构建的人造卵巢。
2.权利要求1所述间充质干细胞参与的人造卵巢制备方法，其特征在于，步骤为：（1）用培养基对小鼠骨髓腔内的骨髓进行冲洗至骨片呈白色，骨片剪碎后用PBS清洗三遍，加入1mg/mL Ⅱ型胶原酶2 mL，37℃消化1小时，加入带有胎牛血清的培养基终止消化；加入αMEM清洗骨片中的胶原酶成分，最后将骨片转移到含有胎牛血清 10%（v/v）和双抗 0.1%（v/v）细胞培养基的培养皿内，37℃、5 %CO2 培养箱内经培养；3-4天后用显微镜观察细胞生长情况，待细胞汇合度至80%-90%后加入0.25wt.%胰酶消化 3 分钟，收获 MSC，按 1:2传代培养，每2-3天更换培养基1次；对细胞进行传代培养后收获P5代细胞用于人造卵巢构建；（2）取游离的小鼠卵巢组织在干净的PBS中清洗2遍后转移至37℃预热的四型胶原酶中，彻底消化成单细胞悬液；9000转离心10秒，去除消化液，加入α-MEM重悬细胞；（3）在卵巢细胞悬液中并加入上述步骤准备好的间充质干细胞，并加入植物凝集素lectin后在37℃、5 %CO2培养箱内孵育10分钟后13000转离心10秒使细胞聚集，从EP管中取出至培养皿中培养过夜，培养皿中的培养基为: a-MEM+3mg/mL BSA+1 wt.%丙酮酸钠+1 wt.%双抗+50μg/mL FSH，即得到间充质干细胞参与的人造卵巢。
3.权利要求2所述制备方法得到的间充质干细胞参与的人造卵巢。
4.权利要求2所述制备方法得到的间充质干细胞参与的人造卵巢在制备间充质干细胞促进卵巢功能重建研究模型中的应用。
5.权利要求2所述制备方法得到的间充质干细胞参与的人造卵巢在制备预防和治疗卵巢受损工具中的应用。
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