CN110373381A - 一种通过均质器高效胎盘间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胎盘来源的间充质干细胞的分离及其纯化，属于干细胞和组织工程领域。经产妇及其家属同意，得到其剖腹产后的胎盘，立即放入加有多种抗生素的储存液中短期保存。胎盘在实验室内反复清洗血水后进行粉碎，胶原酶消化的同时进行均质器的拍打，从而获得细胞悬液。通过密度梯度离心发获得胎盘间充质干细胞。通过使用均质器分离胎盘间充质干细胞的效率高传统方法数倍，降低酶解时间，提高成功率。所获得的间充质干细胞具有与骨髓来源的间充质干细胞类似的体外扩增能力和多向分化潜力，是组织工程和细胞治疗潜在的种子细胞来源，具有重要的临床意义。

Description

一种通过均质器高效胎盘间充质干细胞的制备方法

发明领域

本发明涉及胎盘来源的间充质干细胞及其分离纯化，属于干细胞与组织工程领域。

背景技术

近年来面临持续流行的组织工程和细胞治疗的首要问题是种子细胞的来源。由于干细胞在体外具有一定的自我更新能力，而且在特定的诱导条件下具有分化为一种或多种，甚至人体内全部类型细胞的潜力，逐渐吸引了科研工作者的注意力，恰巧可以解决自体组织细胞来源匮乏且扩增困难，在体外培养过程中容易丢失表型的问题。因此，干细胞显示出很好的临床应用前景。从目前的研究报道中可知，成功分离纯化的干细胞包括两种：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞 (Embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。由于人类对胚胎干细胞本身在分离、培养、诱导分化和免疫原性等方面上的认识和控制上的不足，潜在的致癌、致畸危险，且现如今舆论导向的影响，胚胎干细胞短期内还不能全面应用于临床治疗上。另一方面，成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够定向分化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。目前研究最多的是来源于骨髓的间充质干细胞，其他包括脂肪、肌肉、神经、牙髓等组织中也发现了间充质干细胞的存在，但它们的获取和分离相对骨髓来说较为困难。但从这些组织中获得间充质干细胞时会对献者造成一定的创伤，献者多会有所顾虑。况且，这些高度分化的组织中获得的间充质干细胞通常具有一定的抗原性，在异体移植中会有免疫排斥的反应，且收获量较少，需要花费大量的时间和金钱进行体外扩增培养，所以在临床应用中会受到很大的限制。有鉴于此，寻求一种容易获得、免疫原性较小、且收获量较大的成体干细胞来源具有非常重要的实际应用价值。

胎盘是受精卵在母体子宫着床后，子宫内膜发育的蜕膜和胎儿的叶状绒毛膜结合形成的组织。胎盘为胎儿进行营养、呼吸和排泄的器官，并产生分泌素。当分娩时，先是子宫收缩，然后子宫口扩张，胎儿突破羊膜产出，结扎并剪断脐带；最后子宫再次收缩，由底蜕膜的海绵层与子宫壁分离，将胎盘及胎膜排出。人胎盘是一种重要的、优良的人源性蛋白类药物。20世纪70年代以后，随着分子生物学、细胞生物学等研究及人类基因组计划的实施，人类对人体生理学调节机制及疾病发病机制认识呈指数发展，许多重大的生物医学方面的突破都原自哺乳动物内那些具有重要生物学活性的物质的发现。近年来的研究表明，胎盘组织中具有大量与骨髓间充质干细胞类似的贴壁细胞。国内很多报道关于利用酶解或者灌注的方法成功从胎盘组织中获得具有体外扩增能力和多向分化潜力的贴壁细胞。胎盘在胎儿出生后就失去了发挥其强大生理功能的作用，通常作为医疗废弃物被处理掉。而且胎盘作为一味中药应用于医疗方面在中国已延续千年。因此，胎盘可以成为间充质干细胞潜在的丰富来源。目前国内外关于胎盘来源贴壁细胞的分离提取及纯化扩增的技术很多，细胞收率也各有差异。本发明的目的在于公开一种从胎盘中大量分离提取间充质干细胞的方法，具体涉及到细胞从胎盘组织中的分离与纯化，体外的扩增与培养。

发明内容

本发明是一种来源于胎盘的间充质干细胞分离纯化及体外扩增培养的方法。该细胞分离提取自顺产或剖腹产后废弃的健康胎盘组织。体外扩增的细胞群具有与骨髓来源的间充质干细胞相类似的生物学特性，是细胞治疗和组织工程研究与应用潜在的细胞来源。其制备方法如下：

(1)对顺产或剖腹产得到的新鲜胎盘组织进行保持活性和除菌的处理；

(2)在超净工作台内用添加抗生素的PBS平衡缓冲盐溶液对胎盘进行挤压清洗，以去除血水和组织碎片；

(3)用无菌手术剪剪取胎盘小叶，用添加抗生素的PBS平衡缓冲盐溶液对小叶进行再次清洗；

(4)用无菌手术剪将胎盘小叶剪碎，用添加抗生素和胎牛血清的DMEM对剪碎的胎盘小叶碎片进行活性保持；

(5)胎盘小叶碎片用胶原酶I和DNase I消化，37℃水浴消化的间隙用均质器对组织进行拍打至肉糜状；

(6)肉糜状组织经钢网过滤后，收集细胞成分；

(7)采用Ficoll密度梯度离心法收集单个核细胞；

(8)单个核细胞的体外扩增培养、冻存与复苏；

(9)采用流式细胞仪鉴定所获得细胞群的表型；

(10)采用常规的体外诱导体系，体外诱导胎盘来源的间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞；

(11)将胎盘来源的间充质干细胞注入小鼠皮下、腹腔及静脉，观察免疫反应情况，以确定所获得的细胞的免疫原性。

有益效果

本发明从产后的废弃物--胎盘组织中分离提取的间充质干细胞。该材料获得容易，细胞产量较高，体外扩增培养简单，且扩增过程中能够良好的保持细胞表型和多向分化能，小鼠实验证明该细胞群具有较低的免疫原性。因此，胎盘来源的间充质干细胞是细胞治疗、基因治疗，以及骨与软骨组织工程中理想的种子细胞，具有十分广阔的临床应用前景。

附图说明

图1、分离提取的胎盘MSC(4d)

图2、胎盘间充质干细胞诱导分化成脂肪(400×)

图3、脐带间充质干细胞诱导分化成脂肪油红O染色结果图(400×)

图4、胎盘间充质干细胞诱导分化成软骨阿利辛蓝染色结果 (左上：40×；右上：100×；左下：200×；右下：200×)

图5、胎盘间充质干细胞诱导分化成骨茜素红染色结果图(400×)

具体实施方式

实施例1 胎盘的运输

顺产或剖腹产手术过程中取出的胎盘，立即放入胎盘储存液中。胎盘储存液为含有10％胎牛血清和四种抗生素的DMEM培养基。胎牛血清为澳牛胎牛血清(Gibco)。抗生素为50-150IU/mL的青霉素、60-130μg/mL的链霉素、20-50 μg/mL的庆大霉素和1-2.5μg/mL的两性霉素B。在4℃环境中由医院带回实验室进行后续处理。

实施例2 胎盘的清洗

将胎盘从运输液中取出，放置于无菌的大烧杯中，加入含有四种抗生素的 PBS平衡盐溶液。抗生素为50-150IU/mL的青霉素、60-130μg/mL的链霉素、 20-50μg/mL的庆大霉素和1-2.5μg/mL的两性霉素B。在无菌条件下，用手轻柔挤压反复清洗，彻底洗去胎盘中残余的血水。胎盘洗至淡粉色。

实施例3 胎盘小叶的剪取

将清洗干净的胎盘放置于无菌的托盘中，用灭菌后的手术剪刀剪取胎盘小叶。再次用含抗生素的PBS平衡盐溶液洗过后，将胎盘小叶置于含5-10％胎牛血清和四种抗生素的DMEM培养基中5min以保持其活性。

实施例4 酶消化法+均质器拍打获得源于胎盘的间充质干细胞

用无菌手术剪刀将胎盘小叶剪碎转移至无菌均质袋内，加入与胎盘小叶等倍量的胶原酶I和DNase I(1∶1)混合液。均质袋密封好后，在均质器内拍打2min，然后于37℃水浴中孵育18min，持续循环1h，得到细胞悬液。无菌条件下，将细胞悬液用70μm孔径的滤布进行过滤，除去未消化好的组织块。将滤液分装入 50ml离心管内，4℃离心机内，800rpm，离心10min。用PBS平衡盐溶液洗涤沉淀两次，用密度为1.073g/mL的Ficoll淋巴组织分离液，采用密度梯度离心法， 25℃离心机内，2500rpm，离心30min，收获分层界面白膜细胞层。用含10％胎牛血清和四种抗生素的DMEM培养基洗涤后接种于培养瓶中。在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱内静置培养(附图1)。

实施例5 源于胎盘的间充质干细胞的鉴定

根据文献报道体外诱导骨髓间充质干细胞分化的方法诱导胎盘来源的间充质干细胞多向分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。采用流式细胞仪检测胎盘来源间充质干细胞的表面抗原CD73、CD90、CD105、CD45、CD146等。

流式细胞的检测结果表明收获的胎盘来源的间充质干细胞表面抗原标志 CD73、CD90、CD105阳性，CD45、CD146阴性。

实施例6 源于胎盘的间充质干细胞的冻存与复苏

按照上述传代方法，用胰酶消化下来的细胞，离心后，用冻存液 (90％FBS+10％DMSO)重悬，1mL/支冻存管，冻存管标记时间，代数，名称，实验者。冻存程序为4℃30min——-20℃ 1h——-80℃ 过夜——放入液氮罐内。

复苏时，将所需离心管和培养基准备好，快速拿出超低温冰箱或液氮中的冻存管，于37℃水浴锅内边摇匀边解冻，待剩少量冰块时，快速喷酒精后拿至实验台上，加入到预先装有培养基的15mL离心管内，轻柔混匀，800rpm，5min 离心，弃上清，细胞沉淀用培养基重悬，接种到T75培养瓶内，37℃，5％CO₂培养箱孵育，过夜后换液处理，继续培养直至传代。

实施例7 源于胎盘的间充质干细胞的小鼠致畸实验

按照上述传代方法，用胰酶消化下来的细胞，离心后，用PBS重悬，细胞计数后调整细胞浓度至1×10⁷个/mL，经鼠尾静脉注射小鼠血液中或腹腔注射，每次200μL，每周2次，连续四周，然后观察小鼠健康状况

实验结果表明，分离提取的胎盘间充质干细胞并没有引起小鼠的不良反应，在合适的剂量下，小鼠的各项生命体征与健康鼠无异。

实施例8 源于胎盘的间充质干细胞的定向分化

实施例6所述的第4-5代的源于胎盘的间充质干细胞接种到T75培养瓶内，37℃，5％CO₂培养箱孵育，过夜后换液处理，加入诱导分化介质，经QPCR及染色鉴定，可分别成功地定向分化成成脂肪细胞(附图2，3)及成软骨细胞(附图4)及成骨细胞(附图5)。

Claims (10)

1.一种胎盘来源间充质干细胞的制备方法，其特征在于：应用均质器拍打同时酶消化的方法从清洗除菌的胎盘中分离间充质干细胞。通过使用均质器分离胎盘间充质干细胞的效率高传统方法数倍，降低酶解时间，提高成功率。所获得的间充质干细胞具有与骨髓及其它间充质干细胞相似的特征，有扩增培养和多向分化潜力。

2.权利要求1中所述的胎盘可以是人自然分娩或剖腹产后废弃的胎盘，也可以是哺乳动物的胎盘。产妇或动物必须经过健康检查，无遗传性、感染性疾病，不携带致病病原体。胎盘本身必须新鲜，或放血后4℃保存2-8小时，或冷冻保存后仍然具有活力，同时离体后保持清洁无污染。

3.权利要求1中所述的清洗除菌是指胎盘从短期储存液中取出后，用PBS类的平衡盐溶液进行反复清洗并揉搓挤压，去除胎盘表面及内部的残余的血水。PBS平衡盐溶液中添加多种抗生素。抗生素可以是青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B。

4.权利要求1中所述的酶消化法是指应用胶原酶I(浓度可以是0.5-1.5％)和DNase I(浓度可以是0.5-1.5％)在37℃水浴锅中孵育消化。

5.权利要求1中所述的均质器拍打是指在37℃水浴酶解的间隙，通过均质器的拍打使组织块更容易与酶解液充分接触，促进消化的进行，大大缩短酶解的时间，获得更多的细胞。

6.权利要求1中所述的胎盘来源的间充质干细胞表面抗原标志CD73、CD90、CD105阳性，CD45、CD146阴性。细胞在相应的诱导分化试剂处理后，可以分化成为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞等多种细胞类型。

7.权利要求1中所述的胎盘来源的间充质干细胞可以通过Ficoll密度梯度离心法得到纯化。

8.权利要求3中所述的储存液是指胎盘从产房到实验室暂时保持细胞活性的无菌液体，含有多种营养和抗生素，为含5％胎牛血清的DMEM培养基及青链霉素。

9.权利要求7中所述的Ficoll的密度可以是1.073g/mL。

10.权利要求1中所述的胎盘来源间充质干细胞可以用于细胞治疗、基因治疗，也可以作为种子细胞用于组织工程。