CN100999723A

CN100999723A - 经促排分离的或从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞体外培养成熟方法

Info

Publication number: CN100999723A
Application number: CNA200710019243XA
Authority: CN
Inventors: 冯定庆; 凌斌; 高婷; 周颖; 沈国栋; 朱园园; 姚凤球; 陈峥峥
Original assignee: Anhui Provincial Hospital
Current assignee: Anhui Provincial Hospital
Priority date: 2007-01-08
Filing date: 2007-01-08
Publication date: 2007-07-18
Anticipated expiration: 2027-01-08
Also published as: CN100999723B

Abstract

经促排分离的或从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞体外培养成熟方法，其特征是选择雌性小鼠骨髓间充质干细胞作为饲养细胞，或以所述MSC的条件培养液对不成熟的卵母细胞进行培养。经培养，共培养体系中雌二醇、孕酮和黄体生成素含量明显上升；不成熟卵母细胞90％以上发育成熟；本发明方法的建立在珍稀及濒危动物保存、畜牧良种培育和商业化生产、胚胎干细胞的细胞生物学研究和建立人类“卵子库”，提供生殖保险等领域发挥重要作用。

Description

经促排分离的或从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞体外培养成熟方法

技术领域

本发明涉及细胞培养方法，更具体地说是一种经促排分离的或从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞体外培养成熟方法。

背景技术

未成熟卵母细胞体外培养成熟(IVM)技术是伴随人工辅助生殖技术(ART)的发展而出现的，IVM可以缩短生殖周期，最大限度利用优良遗传物质，用于珍稀或濒危动物的人工繁殖，及畜牧良种的培育和商业化生产；便于研究卵母细胞的发育机制，结合体外受精或孤雌激活技术获取大量胚胎干细胞用于科研；IVM在人类生殖领域拓宽了卵母细胞来源且不成熟卵母细胞更容易冻存，有助于建立“卵子库”，为女性提供生殖保险。

培养液是卵母细胞IVM技术的一项关键内容，但目前还没有一种价廉、稳定和安全的商品化的IVM培养液提供。目前IVM常用的基础培养液有Ham’s F-10、TCM-199、α-MEM、DMEM、HTF等，但单独使用这些培养液卵母细胞的成熟率非常低。英国《自然》杂志(nature，1965，208：349)报道在这些基础培养基内添加高浓度的血清，体外培养的小鼠、绵羊、奶牛、恒河猴和人的卵母细胞可以向成熟方向分化，但大部分停滞于第一次减数分裂前期，仅低于30％的卵母细胞能达到MII期。目前常用的添加因子有类固醇激素类：FSH、Gn、LH、HCG、E2、P等，细胞因子类：转铁蛋白、IL-1、IL-6等，生长因子类：EGF、FGF、IGF等，英格兰牛津《人类生殖》(Human Reproduction，1998，13：115)报道添加相关物质之后卵母细胞成熟率高达85.3％。但是这些物质非常昂贵，并且很不稳定，容易出现卵母细胞核浆成熟不一致的情况。英格兰剑桥《生殖》杂志(Reproduction，2001，121：925)报道利用猴肾细胞、颗粒细胞和输卵管上皮细胞作为饲养细胞，利用细胞的分泌作用减少添加物质，提高卵母细胞的成熟率，但均没有达到促排时卵母细胞90％的成熟率，并且还存在病原体和外源基因污染的危险。

上述原因的存在，极大地限制了IVM技术优势的发挥和应用。

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的问题，提供一种经促排分离的或从卵巢组织内抽吸获得的不成熟卵母细胞体外培养成熟方法，利用雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC获取容易，分泌细胞因子和生长因子的多样性，建立以雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC作为饲养细胞促进分离的不成熟卵母细胞体外培养成熟的方法，克服以往IVM培养液及饲养细胞的诸多缺陷和不足，同时提高培养成熟率，为IVM技术更好服务于珍稀及濒危动物保存、畜牧良种培育和商业化生产、胚胎干细胞的细胞生物学研究和建立人类“卵子库”，提供生殖保险开辟更为广阔的前景。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

本发明方法的特点是选择雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC作为饲养细胞，或以所述MSC的条件培养液对不成熟的卵母细胞进行培养。

本发明方法的特点也在于：

首先获取雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC：获取8-10周龄雌性小鼠骨髓腔冲洗液，利用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化原代MSC，在含体积百分比为10％的胎牛血清DMEM、37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养至原代MSC 80％铺满培养瓶底，再以重量体积比为0.25％的胰蛋白酶消化传代获得二代MSC；所述二代MSC同样在含体积百分比为10％的胎牛血清DMEM、37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养3天后，离心取上清即为条件培养液；

经促排分离的未成熟卵母细胞的培养：8-10周龄雌性小鼠，腹腔注射10IU PMSG，48小时后再腹腔注射10IU HCG，16-20小时后剪取双侧输卵管，于37℃预温BSS内体视显微镜下捡卵；低于MII期的卵母细胞与二代MSC或以条件培养液在37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养至成熟；

从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞的培养：无菌条件下取出8-10周龄雌性小鼠两侧卵巢，体视显微镜下利用机械抽吸法获得游离卵泡，所获得的游离卵泡与二代MSC或以条件培养液在37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养直至成熟。

本发明方法中：

MSC为小鼠骨髓间充质干细胞，即mesenchymal stem cell，简称：MSC。

DMEM为由Dulbecco改良的MEM，即Dulbecco’s modified Eagle’s medium

本发明中所有用于卵母细胞培养的平衡液、培养基、培养用器皿均需要在37℃、体积比为5％的CO₂环境中平衡过夜，操作过程也必需在体视显微镜37℃恒温载物台上进行，温度偏离会导致卵母细胞成熟阻滞甚至凋亡、卵泡闭锁。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明所采用的饲养细胞为MSC，不仅具有多向分化潜能，而且对周围细胞有很重要的营养作用和抑制细胞凋亡作用。MSC能合成并分泌IL-1、IL-6、EGF、FGF、IGF-1、HGF、LIF、TGF-β等多种生物活性物质，其中很多都是卵母细胞体外成熟培养所必需添加的。另外，MSC还可以促进颗粒细胞合成和分泌多种激素，如E2、P、LH、卵泡液减数分裂激活固醇(FF-MAS)，增强其突触与卵母细胞胞浆相互作用，促进卵母细胞核浆同步成熟。

2、本发明方法对于未成熟卵母细胞成熟率高，重复性好，结果稳定。

3、本发明方法操作简便、安全，极大降低了IVM的成本，在对珍稀及濒危动物保存、畜牧良种培育和商业化生产、胚胎干细胞的细胞生物学研究和建立人类“卵子库”，提供生殖保险等方面有着广阔的应用前景。

4、本发明方法适用于各种哺乳动物。在用于牛、羊等体形较大动物时，MSC和卵母细胞均可通过针刺获取，创伤甚小。

附图说明

图1为本发明中洗去悬浮细胞后的原代MSC×200。

图2为本发明方法中促排卵母细胞与MSC共培养40分钟获得的成熟的卵母细胞×200。

图3为本发明方法中从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞与MSC共培养7天窦前卵泡消化去除颗粒细胞后的卵母细胞×200。

以下通过具体实施方式，并结合附图对本发明作进一步描述。

具体实施方式

本发明中原代和二代MSC的培养基均为DMEM，并在其中添加有体积比为10％的胎牛血清、10mmol/L HEPES、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。其它适合MSC生长的培养基，如RPMI-1640、Ham’sF-12等也可以用于本发明。

本发明方法按如下步骤进行操作：

1、雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC的分离、培养：无菌条件下取出8-10周龄雌性昆明种小鼠双侧股骨和胫骨，剪断骨两端，肝素化的注射器吸取不含血清的DMEM反复冲洗骨髓腔。收集冲洗液，等比例加到离心管内密度为1.077的无菌Percol液上方，2000转/分钟离心20分钟，收集两液层间的单个核细胞层，10倍体积1×PBS 1200转/分钟离心10分钟洗涤2次。含体积比为10％的胎牛血清DMEM重悬细胞，2×10⁶/ml细胞密度接种培养瓶，37℃、体积比为5％的CO₂培养。3天后轻晃培养瓶，倾去未贴壁细胞，1×PBS洗2次即获得纯化的原代MSC；加含体积比为10％的胎牛血清DMEM继续培养至80％铺满瓶底(图1所示)，重量体积比为0.25％的胰蛋白酶消化传代，6×10⁵/ml细胞密度接种6孔板即为二代MSC，培养3天后收集培养上清液即为条件培养液。

2、经促排分离的未成熟卵母细胞的培养：8-10周龄雌性昆明种小鼠，腹腔注射10IUPMSG，48小时后再腹腔注射10IU HCG，16-20小时后剪取输卵管，于37℃、体积比为5％的CO₂平衡过夜的BSS内体视显微镜下捡卵。低于MII期的卵母细胞在37℃、体积比为5％的CO₂条件下，一部分与二代MSC，一部分与条件培养液经过40分钟的培养，获得成熟的卵母细胞(图2所示)。

实验表明，低于MII期的卵母细胞部分与二代MSC或以条件培养液培养37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养40分钟成熟率达95％，为避免成熟的卵母细胞在MSC或以条件培养液中继续分裂，对于成熟的卵母细胞再用0.5mg/ml透明质酸酶消化去除颗粒细胞，并卵母细胞转移至含重量体积比为0.4％的BSA的M16培养基中。

同期实验也包括，以低于MII期的卵母细胞与含体积比为10％的胎牛血清DMEM共培养，12小时后的成熟率仅为18％，卵母细胞不能得到很好的发育。

3、从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞的培养：无菌条件下取出8-10周龄雌性昆明种小鼠两侧卵巢，置于37℃、体积比为5％的CO₂平衡过夜的含体积比为10％的胎牛血清DMEM内，体视显微镜下用1ml 25G注射器针头抽吸获得游离窦卵泡和窦前卵泡，在37℃、体积比为5％的CO₂条件下，一部分与二代MSC，一部分与条件培养液经过24小时到7天的培养，获得成熟的卵母细胞(图3所示)。

实验表明，依据卵泡的发育阶段的不同，为获得成熟的卵母细胞，培养时间在从24小时到7天有所不同，对于游离的窦期和窦前卵泡经与MSC共培养7天，卵母细胞成熟率达93％；经与条件培养液培养7天，卵母细胞成熟率为85％。为避免成熟的卵母细胞在MSC或以条件培养液中继续分裂，对于成熟的卵母细胞再用0.5ma/ml透明质酸酶消化去除颗粒细胞，并卵母细胞转移至含重量体积比为0.4％的BSA的M16培养基中。

同期的实验也包括，一部分从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞以含体积比为10％的胎牛血清DMEM培养7天，卵母细胞成熟率仅为10％。

4、体视显微镜下观察卵母细胞的形态学变化：胞浆匀称，色浅，颗粒均匀，在卵周隙可见第一极体判定卵母细胞成熟，即MII期卵母细胞。

卵泡与MSC共培养3天后上清中E2、P、LH水平较MSC或卵泡两者单独培养时上升数倍至十几倍(表1所示)。

表1 卵泡与MSC共培养及单独培养上清中激素水平

组别	E2(pmol/L)	P(nmol/L)	LH(IU/L)
组别	E2(pmol/L)	P(nmol/L)	LH(IU/L)	MSC卵泡MSC+卵泡	51.3983.25322.94	0.4555.73102.43	0.120.140.46

Claims

1、经促排分离的或从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞体外培养成熟方法，其特征是选择雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC作为饲养细胞，或以所述MSC的条件培养液对不成熟的卵母细胞进行培养。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是：

首先获取雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC：获取8-10周龄雌性小鼠骨髓腔冲洗液，利用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化原代MSC，在含体积百分比为10％的胎牛血清DMEM、37℃、5％的CO₂条件下培养至原代MSC80％铺满培养瓶底，再以重量体积比为0.25％的胰蛋白酶消化传代获得二代MSC；所述二代MSC同样在含体积百分比为10％的胎牛血清DMEM、37℃、5％的CO₂条件下培养3天后，离心取上清即为条件培养液；

经促排分离的未成熟卵母细胞的培养：8-10周龄雌性小鼠，腹腔注射10IU PMSG，48小时后再腹腔注射10IU HCG，16-20小时后剪取双侧输卵管，于37℃预温BSS内体视显微镜下捡卵；低于MII期的卵母细胞与二代MSC或以条件培养液在37℃、5％的CO₂条件下培养至成熟；

从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞的培养：无菌条件下取出8-10周龄雌性小鼠两侧卵巢，体视显微镜下利用机械抽吸法获得游离卵泡，所获得的游离卵泡与二代MSC或以条件培养液在37℃、5％的CO₂条件下培养直至成熟。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征是对于经促排分离的未成熟卵母细胞的培养：卵母细胞与二代MSC或以条件培养液在37℃、5％的CO₂条件下培养40分钟。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征是对于从卵巢组织内抽吸获得的未成熟卵母细胞的培养：所获得的游离卵泡与二代MSC或以条件培养液在37℃、体积比为5％的CO₂条件下的培养时间为24小时到7天。