KR20130112028A - 무혈청 합성 세포배양 배지 - Google Patents

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KR20130112028A
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송주 안
야난 주
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스템알디, 인크.
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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포와 같은 배양 세포에 대한 임의의 혈청이 제거된 영양소 및 성장인자를 함유하는 합성 세포배양 배지의 실시양태 및 다능성 표현형을 유지하면서 중간엽 줄기세포와 같은 세포 모집단을 확장하기 위한 세포배양 배지의 실시양태를 이용하는 방법 및 세포배양 배지의 실시양태 내로 분화인자를 혼합함으로써 중간엽 줄기세포의 연골형성 및 골형성을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

무혈청 합성 세포배양 배지{SERUM-FREE CHEMICALLY DEFINED CELL CULTURE MEDIUM}
본 국제 특허 협력 조약 특허 출원은 2010년 6월 17일자 미국 특허 가출원 제 61/397,847호의 이익을 주장하고, 이는 참조로서 본 명세서에 편입된다.
I. 기술분야
본 발명은 일반적으로, 세포의 배양을 위한 무혈청 합성 세포배양 배지(serum-free chemically defined cell culture medium)에 관한 것이다. 구체적으로, 연골세포 및 골세포가 파생될 수 있는 다능성 표현형을 유지하면서 확장을 허용하는 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 무혈청 합성 세포배양 배지 및 이러한 확장된 및 분화된 중간엽 줄기세포 모집단의 치료량 투여에서 유용한 질환 치료를 위한 확장된 중간엽 줄기세포의 이러한 모집단을 이용하는 방법에 관한 것이다.
II . 배경기술
뼈 및 연골 이식은 성형수술, 외상성 수술에서 또는 종양성 병변의 제거 후에 뼈와 연골 조각의 재구성에서 수행된다. 현재, 자가 조직 공급원으로부터의, 또는 살아있는 또는 사망한 공여자로부터의 인간 조직은 이 목적을 위해 이용되어 왔다. 줄기세포 연구의 진보와 함께, 중간엽 줄기세포로부터 파생된 뼈 및 연골세포는 골격복구를 위한 세포 공급원이 되고 있다.
중간엽 줄기세포 (MSC)는 골수, 혈액, 피부 및 골막과 같은, 신체의 특정 조직에서 찾아볼 수 있다. 이들은 다른 유형의 세포로 분화하는 능력을 지니고 있고, 따라서 부상 후 조직의 치유에 기여할 수 있다. MSC는 골수로부터 단리 및 정제될 수 있고 시험관 내(in-vitro)에서 배양하여 확장될 수 있다.
현재, MSC의 시험관내 확장은 소태아혈청 (이하 "FBS")으로 또는 인간 자기유래 혈청, 또는 실질적으로 유사하거나 등가의 혈청 (또한 "혈청"으로 언급됨)으로 보충된 배양 배지에서 일어난다. 하지만, MSC 배양물에서 동물 또는 인간 혈청의 존재는 이들 배양물의 잠재적인 치료학적 적용을 고려하여 특정한 난점 및 제한을 갖는다. 첫째, 소혈청, 인간 혈청, 또는 다른 동물의 혈청은 바이러스 및 광우 프리온, 소해면상뇌증 ("BSE") 등과 같은 혈액매개 병원균(blood born pathogen)을 함유할 수 있다. 둘째, 소혈청은 수용 환자에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 생체이물 단백질에 대한 항체 발생을 일으킨다. 셋째, 소혈청은 일관성 없는 수행을 야기할 수 있는 로트 대 로트 변이(lot to lot variation)를 보인다.
분명하게, 합성물질 및 무혈청 및 생체이물만을 함유한 세포배양 배지는 MSC (및 다른 세포)의 배양을 위해 매우 바람직할 수 있으며, 이는 본 발명의 세포배양 배지 및 본 발명의 세포배양 배지의 활용 방법이 MSC를 포함한 세포의 확장을 제공하고 배양물내 MSC의 분화를 추가로 제공한다는 것 모두를 가정한다.
III . 본 발명의 개시
따라서, 본 발명의 전반적인 목적은 세포배양을 위해 그리고 인간 MSC ("hMSC")를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시험관 내에서 MSC 모집단을 확장하기 위한 본 발명의 무혈청 배지의 특정 비-제한 실시양태에 관하여 본 발명의 무혈청 합성 배지 (또한 "무혈청 배지"로 언급됨)의 하나 이상의 실시양태를 제공하기 위한 것 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 전반적인 목적은 생체외(ex-vivo) 시험관내 세포 배양에서, 특히 소태아 혈청, 자기유래 혈청, 또는 다른 동물의 혈청과 같은 임의의 혈청을 함유하지 않은 MSC 시험관내 배양에서 MSC 생존력, 성장 및 분화를 지원할 수 있는 화학 성분의 조합물을 함유하는 무혈청 배지의 실시양태를 제공하기 위함일 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 배지의 실시양태는 혈청을 함유한 기존의 세포배양 배지와 비교하여 실질적으로 유사하거나 더 큰 유효성 또는 결과를 갖는 MSC 생존력, 성장 및 분화를 지원하기 위해 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 전반적인 목적은 연골세포 및 골세포를 생성하기 위해 MSC 모집단의 확장 및 MSC의 분화를 야기하는 본 발명의 배지에서 MSC, 특히 인간 MSC와 같은 세포를 배양하는 방법일 수 있다.
본 발명의 또 다른 전반적인 목적은 피브로넥틴, 또는 유사한 것으로 표면을 코팅하는 단계를 기피한 폴리스티렌 플라스틱의 음전하 표면과 같은 음전하 플라스틱 표면상에서 MSC와 같은 세포를 배양하는 방법일 수 있다.
자연적으로, 본 발명의 추가적 목적은 타 영역의 명세서, 도면, 사진, 및 청구항을 통틀어 개시된다.
IV . 도면의 간단한 설명
도 1은 10% FBS 를 함유한 기존 배지에서 배양된 hMSC와 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 배양된 hMSC 간의 세포배양 형태학을 비교한 이미지를 제공한다.
도 2는 10% FBS 를 함유한 기존 배지에서 배양된 hMSC의 성장률과 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 배양된 hMSC의 성장률을 비교한 경과일 동안 세포수의 그래프이다.
도 3은 10% FBS를 함유한 기존 배지로부터 본 발명의 실시양태의 무혈청 배지 또는 10% FBS를 함유한 기존 배지로의 개시 계대 횟수(passage number)가 4인 각 계열에서 hMSC 전체수를 비교한 계대 횟수에 따른 세포수의 그래프이다.
도 4는 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 배양된 hMSC와 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 배양된 hMSC의 콜로니(colony) 형성 능력을 비교한 이미지를 제공한다.
도 5는 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 배양된 hMSC와 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 장기간 배양 후 hMSC의 다중계통 분화능을 비교한 이미지를 제공한다.
도 6은 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 hMSC의 성장률은 배양 용기에서 플레이트-코팅의 사용 여부와 관계없이 유사하다는 것을 보여주는 계대 횟수에 따른 세포수의 그래프이다.
도 7은 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 배양된 제대혈 유래 MSC와 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지의 실시양태에서 배양된 제대혈 유래 MSC의 성장률을 비교한 계대 횟수에 따른 세포수의 그래프이다.
도 8은 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 배양된 지방조직 유래 MSC와 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지에서 배양된 지방조직 유래 MSC의 성장률을 비교한 계대 횟수에 따른 세포수의 그래프이다.
도 9는 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 hMSC를 배양하는데 활용된 배양 플라스크의 유형에 대한 전체 세포수의 막대 그래프이다.
V. 본 발명을 수행하기 위한 방식(들)
본 발명은 세포의 배양을 위한 무혈청 합성 세포배양 배지에 관한 것이다. 구체적으로, 연골세포 및 골세포가 중간엽 줄기세포로부터 파생될 수 있는 다능성 표현형을 유지하면서 생체외 단핵세포 확장을 위해 사용될 수 있는 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 무혈청 합성 세포배양 배지에 관한 것이다. 시험관 내에서 확장된 중간엽 줄기세포 모집단으로부터 연골세포 및 골세포의 분화를 위한 및 파생된 연골세포 및 골세포 모집단에서 유용한 뼈 및 연골 질환 치료를 위한 무혈청 합성 세포배양 배지를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적에 대하여, 용어 "무혈청"은 소태아혈청, 송아지혈청, 인간 혈청 등, 또는 이들의 조합물의 부재를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 종의 임의의 혈청의 부재를 의미한다.
본 발명의 목적에 대하여, 본 명세서에서 모든 수치값은 명백하게 명시되든지 안되든지, 용어 "약"에 의해 변경되는 것으로 간주된다. 본 발명의 목적에 대하여, 범위는 "약" 하나의 특정값 내지 "약" 또 다른 특정값으로서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 실시양태에는 하나의 특정값 내지 다른 특정값을 포함한다. 종점에 의한 수치 범위의 열거는 그 범위 이내에 포괄되는 모든 수치값을 포함한다. 1 내지 5의 수치 범위는 예를 들어 수치값 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다. 각 범위의 종점은 다른 종점에 관하여, 및 다른 종점에 관계없이 둘 다 유의적이라는 것이 추가로 이해될 것이다. 값이 선행사 "약"의 용도로써 근사치로 표현될 때, 특정값이 또 다른 실시양태를 형성한다는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 목적에 대하여, 용어 "조합물" 또는 "조합하는"은 2개 이상의 물질을 조합하는 임의의 방법을 나타낸다. 이러한 방법은 혼합(mixing), 블렌딩(blending), 뒤섞음(commingling), 섞어 만듦(concocting), 균질화(homogenizing), 결합시킴(incorporating) 섞음(intermingling), 교반(stirring) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적에 대하여, 용어 "a" 또는 "an" 실체(entity)는 하나 이상의 실체를 나타낸다; 예를 들어, "단백질" 또는 "펩티드"는 하나 이상의 이들 화합물 또는 적어도 하나의 화합물을 나타낸다. 따라서, 용어 "a" 또는 "an", "하나 이상" 및 "적어도 하나의"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 더욱이, "로 구성된 그룹에서 선택된" 화합물은 다음에 나오는 목록에서 하나 이상의 화합물을 나타내며, 이는 2개 이상의 화합물의 조합물을 포함한다. 본 발명에 따라서, 단리된 화합물은 이의 자연적 환경으로부터 제거된 화합물이다. 따라서, "단리된"은 화합물이 정제된 정도를 반드시 나타내지는 않는다. 본 발명의 단리된 화합물은 이의 자연적 공급원으로부터 얻을 수 있고, 분자생물학을 이용하여 생산될 수 있거나 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 실시양태의 특정한 성분 또는 요소를 위한 특정 공급원 및 성분 또는 요소를 위한 특이적 생산물의 수가 설명되지만; 본 발명은 그다지 제한되지 않으며, 그리고 본 발명의 실시양태에서의 이용에 적합한 동일한, 등가의 또는 실질적으로 유사한 성분 또는 요소는 수많은 및 매우 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 최고의 방식을 포함하는 본 발명의 배지의 실시양태는 무혈청 기초배지 (또한 "기초배지"로 언급됨)를 제공할 수 있다. 무혈청 기초배지는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 또는 동일한, 등가의, 또는 실질적으로 유사한 조성물의 배지 (본 명세서에서 "DMEM"로 언급됨) (본 발명의 실시양태에서 이용하기 위해 적합한 DMEM은 액형 PN 11965으로 또는 PN 12100으로서 분말로, Invitrogen, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA로부터 얻어질 수 있고, 제조자의 설명서에 따라 제조될 수 있다) 및 MCDB201 배지 또는 동일한, 등가의, 또는 실질적으로 유사한 조성물의 배지 (본 명세서에서 "MCDB"로 언급됨) (본 발명의 실시양태에서 이용하기 위해 적합한 MCDB는 Sigma-Aldrich PN M6770으로부터 얻어질 수 있다)의 혼합물을 포함할 수 있다. 이들 기존 배지 각각은 또한 글루타민, 소듐 피루베이트, HEPES, 페놀 레드, 글루코오스와 같은 특정 첨가된 성분과 함께, 및 메티오닌, 시스틴, 또는 칼슘과 같은 특정 성분이 없이 이용가능하며, 이러한 각 배지는 적용에 따라 기초배지의 특정 실시양태에서 활용될 수 있다.
기초배지의 특정 실시양태는 약 0.75:1.25 내지 약 1.25:0.75의 범위에서 DMEM:MCDB (v/v) 의 비율로 조합된 DMEM 및 MCDB를 포함할 수 있다; 하지만, 본 발명은 그다지 제한되지 않으며, 그리고 특정 적용에서 이점을 부여하는 실시양태는 약 0.75:1.25 내지 약 0.85:1.15, 약 0.80:1.20 내지 약 0.90:1.10, 약 0.85:1.15 내지 약 0.95:1.05, 약 90:110 내지 약 1.05:0.95, 약 1.00:1.00 내지 약 1.10:0.90, 약 1.05:0.95 내지 약 1.15:0.85, 약 1.10: 0.90 내지 약 1.20:0.80, 및 약 1.15:0.85 내지 약 1.25:0.75를 포함하는 그룹에서 선택된 범위 이내에서 DMEM:MCDB의 비율을 이용하여 제조될 수 있다. 중간엽 줄기세포 ("MSC"), 특히 인간 중간엽 줄기세포 ("hMSC")의 배양을 위한 본 발명의 특정 실시양태에 대하여, 약 1 v/v의 DMEM:MCDB의 비율은 적합한 결과로 활용될 수 있다.
기초배지의 실시양태는 적용에 따라,　 여러 가지　순열(permutation), 조합,　농도 또는 양에서 DMEM 및 MCDB의 조합물로 조합될 수 있는 하기에 추가로 설명된 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 경우,　하나 이상의 성분은 설명된 양으로 또는 범위 이내에서 그리고 특정한 이점이 임의의 특정 성분 또는 요소에 대해 설명된 범위의 선택된 부분을 이용하여 성취될 수 있는 적용 또는 성분의 조합에 따라 이용될 수 있다.
기초배지의 실시양태는 기초배지의 약　3.2 g/L　내지 약　4.2 g/L의 범위에서, 그리고 특정 실시양태 관하여 약 3.7g/L의 양의 소듐 바이카보네이트와 같은 버퍼를 추가로 포함할 수 있다.　기초배지의　pH는 소듐 하이드록사이드의 양으로 약　7.3　내지 약　7.5의 범위에서의 최종　pH로 조정될 수 있으며,　여기서 특정 실시양태는 약　7.4의　pH를 갖는다.
기초배지의 실시양태는 배양되는 세포의 수용체와 결합시 철의 양을 방출하는 조절된 철 공급원 추가로 포함할 수 있다. 조절된 철 공급원의 비-제한 예시는 약 2mg/L 내지 약 10mg/L의 범위에서 상기 기초배지의 농도를 갖는 트랜스페린의 양이 될 수 있다. 기초배지의 특정 실시양태에 관하여, 트랜스페린의 양은 약 2mg/L 내지 약 4mg/L, 약 3mg/L 내지 약 5mg/L, 약 4mg/L 내지 약 6mg/L, 약 5mg/L 내지 약 7mg/L, 약 6mg/L 내지 약 8mg/L, 약 7mg/L 내지 약 9mg/L, 및 약 8mg/L 내지 약 10mg/L를 포함하는 그룹에서 선택될 수 있다.
기초배지의 실시양태는 전자 전달 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 전자 전달 활성제는 셀레늄의 양 또는 셀레노우스 산의 양을 포함할 수 있다; 하지만, 본 발명은 그다지 제한되지 않으며 그리고 다른 미량원소, 금속효소 또는 단백질은 전자 전달을 지원하기 위해 활용될 수 있다. 기초배지내 셀레노우스 산의 양을 포함하는 이들 실시양태에 관하여, 상기 양은 약 0.0000025g/L 내지 약 0.0000050 g/L의 범위 내일 수 있으며, 여기서 특정 실시양태는 약 0.0000037 g/L를 포함한다.
기초배지의 실시양태는 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함할 수 있다. 항산화제는 비-제한 예시로서 α-토코페롤 아세테이트의 양 또는 아스코르빈산-2 포스페이트의 양, 또는 둘 모두의 양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 0.0001 g/L 내지 약 0.0003 g/L의 범위에서 α-토코페롤 아세테이트의 양 및 약 0.02 g/L 내지 약 0.04 g/L의 범위에서 아스코르빈산-2 포스페이트의 양을 포함할 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 0.0002 g/L의 α-토코페롤 아세테이트의 양 및 0.0322 g/L의 아스코르빈산-2 포스페이트의 양을 포함한다.
기초배지의 실시양태는 하나 이상의 스테로이드를 추가로 포함할 수 있다. 스테로이드는 비-제한 예시로서 덱사메타손의 양 또는 하이드로코르티손의 양, 또는 둘 모두의 양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 0.5mg/mL 내지 약1.5mg/mL의 하이드로코르티손의 양와 조합하여 약 2.0μg/L 내지 약 5.0μg/L 의 범위에서 덱사메타손의 양을 포함할 수 있다. 기초배지의 하나의 비-제한 예시는 약 0.001 g/L의 하이드로코르티손의 양과 조합하여 약 0.000004 g/L의 덱사메타손의 양을 포함한다.
기초배지의 실시양태는 약 0.001 g/L 내지 약 0.003 g/L의 범위에서 5-하이드록시트립타민의 양을 추가로 포함할 수 있다. 기초배지의 하나의 비-제한 예시는 약 0.002 g/L의 5-하이드록시트립타민의 양을 포함한다.
기초배지의 실시양태는 인간 혈청 알부민 ("HSA") (재조합 인간 혈청 알부민 ("rHSA") 이 될 수 있는)의 양을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 0.1 g/L 내지 약 0.3 g/L의 범위에서 HSA의 양을 포함할 수 있다. 기초배지의 하나의 비-제한 예시는 약 0.25 g/L의 HSA의 양을 포함한다.
MSC 또는 hMSC의 배양을 위한 기초배지의 특정 비-제한 실시양태는 표 1에서 기술된 최종 농도에서 각각 구성요소의 조합물을 포함할 수 있고, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 이로 구성될 수 있다.
MSC 배양을 위한 배지.
구성요소 최종 농도
MCDB201 0.5L/L
DMEM 0.5L/L
소듐 바이카보네이트 3.7g/L DMEM
1L 혼합을 위한 NaOH 최종 pH = 7.39
rHSA 0.25 g/L
트랜스페린 0.005 g/L
셀레노우스 산 0.0000037 g/L
아스코르빈산-2 포스페이트 0.032205 g/L
5-하이드록시트립타민 0.002127 g/L
덱사메타손 0.000003925 g/L
하이드로코르티손 0.001 g/L
α-토코페롤 아세테이트 0.0002 g/L
당연하게도, 기초배지의 특정 실시양태는 제한되는 것이 아니라 등가의 또는 실질적으로 유사한 성분을 이용하여 제조될 수 있는, 특정 세포, 세포주, MSC, 또는 hMSC에 기반한 농도로 조정될 수 있는 수많은 및 여러 가지 실시양태의 예시적인 것으로 의도된다. 표 1의 실시양태에 대해 나열된 최종 농도는 특정 적용에 따라, MSC 또는 hMSC를 배양하는 것에 유용한 생산에서 정상 변화와 관련된 범위내 절대값으로부터 변화할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 특정 실시양태는 표 1에서 나열된 것보다 더 적은 성분을 포함할 수 있으며 이들 실시양태는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 실시양태는 기초배지와 조합될 수 있는 기초배지 보충물 (또한 "보충된 배지"로 언급되는 조합물)을 추가로 포함한다. 기초배지 보충물은 여러 가지 순열 및 조합에서 하나 이상의 세포 성장인자, 하나 이상의 인지질 성장인자, 및 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제를 포함할 수 있다. 당연하게도, 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태는 적용에 따라 여러 가지 조합 및 순열에서, 하나 이상의 세포 성장인자, 하나 이상의 인지질 성장인자, 또는 WNT 신호전달 경로 활성제를 포함할 필요는 없지만, 포함할 수 있다.
따라서, 기초배지 보충물의 실시양태는 Sigma-Aldrich PN I6634 (CAS NO.: 11070-73-8)로부터 얻을 수 있는 인슐린, Sigma-Aldrich PN F0291-25UG (CAS No.: 106096-93-9)로부터 얻을 수 있는 기본 섬유아세포 성장인자 인간 (bFGF) , Sigma-Aldrich PN P3201로부터 얻을 수 있는 혈소판-유래 성장인자 bb (PDGF-bb), Sigma-Aldrich PN E9644 (CAS NO.: 62253-63-8)로부터 얻을 수 있는 외피층 성장인자 (EGF), 및 Sigma-Aldrich PN I8779 또는 PN I3769로부터 얻을 수 있는 인슐린 유사 성장인자-1 (IGF-1) (CAS NO.: 7733-29-1)과 같은 하나 이상의 세포 성장인자를 포함할 수 있다.
기초배지 보충물의 실시양태는 인슐린의 양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 0.004 g/L 내지 약 0.006 g/L의 범위에서 무혈청 배지내 농도를 가질 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 0.005 g/L의 인슐린의 양을 포함한다.
기초배지 보충물의 실시양태는 bFGF의 양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL의 범위에서 무혈청 배지내 bFGF의 농도를 가질 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 10 ng/mL의 bFGF의 양을 포함한다.
기초배지 보충물의 실시양태는 PDGF-bb의 양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL의 범위에서 무혈청 배지내 PDGF-bb의 농도를 가질 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 10 ng/mL의 무혈청 배지내 PDGF-bb의 양을 포함한다.
기초배지 보충물의 실시양태는 EGF의 양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 15 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 범위에서 무혈청 배지내 EGF의 농도를 가질 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 20 ng/mL의 무혈청 배지내 PDGF-bb의 양을 포함한다.
기초배지 보충물의 실시양태는 IGF-1의 양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 2 ng/mL 내지 약 10 ng/mL의 범위에서 무혈청 배지내 IGF-1의 농도를 가질 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 5 ng/mL의 무혈청 배지내 IGF-1의 양을 포함한다.
상기 설명된 세포 성장인자: PDGF-bb, bFGF, EGF, 및 IGF-1 각각에 관하여, 약 2 ng/mL 내지 약 4 ng/mL, 약 3 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 4 ng/mL 내지 약 6 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 7 ng/mL, 약 6 ng/mL 내지 약 8 ng/mL, 약 7 ng/mL 내지 약 9 ng/mL, 약 8 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 9 ng/mL 내지 약 11 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 12 ng/mL, 약 11 ng/mL 내지 약 13 ng/mL, 약 12 ng/mL 내지 약 14 ng/mL, 약 13 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 14 ng/mL 내지 약 16 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 17 ng/mL, 약 16 ng/mL 내지 약 18 ng/mL, 약 18 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 및 약 19 ng/mL 내지 약 20 ng/mL를 포함하는 그룹에서 선택된 무혈청 배지내 농도에 대한 이점이 있을 수 있다.
기초배지 보충물의 실시양태는 Sigma-Aldrich PN L7260으로부터 얻을 수 있는 리소포스파티드산 ("LPA")(CAS NO.:22022-87-5), 및 Sigma-Aldrich PN S9666으로부터 얻을 수 있는 스핑고신 1-포스페이트 ("S1P")(CAS NO.: 26993-30-6) 와 같은 하나 이상의 인지질 성장인자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 약 80nM 내지 약 200nM의 범위에서 무혈청 배지내 LPA 또는 S1P 각각, 또는 둘 모두의 농도를 가질 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 150 nM의 무혈청 배지내 S1P의 양과 조합된 약 100 nM의 무혈청 배지내 LPA의 양을 포함한다.
상기 설명된 인지질 성장인자 각각에 관하여, 약 80nM 내지 약 100nM, 약 90nM 내지 약 110nM, 약 100nM 내지 약 120nM, 약 110nM 내지 약 130nM, 약 120nM 내지 약 140nM, 약 130nM 내지 약 150nM, 약 140nM 내지 약 160nM, 약 150nM 내지 약 170nM, 약 160nM 내지 약 180nM, 약 190nM 내지 약 200nM를 포함하는 그룹에서 선택된 무혈청 배지내 농도에 대한 이점이 있을 수 있다.
기초배지 보충물의 실시양태는 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제를 포함할 수 있다. WNT 신호전달 경로 활성제는 StemRD Inc., Burlingame, CA PN W3A-H005로부터 얻을 수 있는 인간 WNT-3a 단백질 ("WNT3A"), 및 StemRD Inc., Burlingame, CA PN RSPO-005로부터 얻을 수 있는 R-스폰딘-1 ("RSPO1") 을 포함하는 비-제한 그룹에서 선택될 수 있다. 특정 실시양태는 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 범위에서 무혈청 배지내 농도에서 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제 각각을 포함할 수 있다. 하나의 비-제한 예시는 약 40 ng/mL의 무혈청 배지내 RSPO1의 양과 조합된 약 20 ng/mL의 무혈청 배지내 WNT3A의 양을 포함한다.
MSC 또는 hMSC의 배양을 위한 기초배지 보충물의 특정 비-제한 실시양태는 표 2에서 기술된 최종 농도에서 각각 구성요소의 조합물을 포함할 수 있고, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 이로 구성될 수 있다.
합성 MSC 배지 성장인자.
성장인자 최종 농도
인슐린 0.005 g/L
PDGF-bb 10 ng/mL
bFGF 10 ng/mL
EGF 20 ng/mL
IGF-l 5 ng/mL
LPA 100 nM
S1P 150 nM
WNT3A 20 ng/mL
RSPO1 40 ng/mL
또, 표 2가 배양에서 MSC의 확장을 위한 본 발명의 무혈청 배지의 특정 실시양태에서 활용되는 여러 가지 세포 성장인자, 지질 성장인자, 및 WNT 신호전달 경로 활성제의 최종 농도를 나열한 반면에; 본 발명은 그다지 제한되지 않으며, 그리고 본 발명의 추가적 실시양태는 적용에 따라 상기 설명된 바와 같은 다양한 성분 또는 요소 각각의 농도와 함께 여러 가지 조합 및 순열로 나열된 하나 또는 하나 이상, 또는 모든 성장인자를 이용하여, MSC 또는 hMSC로부터 연골세포 및 골세포를 유도하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포의 배양을 위해 성취될 수 있다.
무혈청 배지의 실시양태는 StemRD Inc., Burlingame, CA PN TGF-b-005로부터 얻을 수 있는 형질전환 성장인자 베타 1 ("TGFB1") 양을 추가로 포함할 수 있다. TGFB1의 양은 상기 설명된 무혈청 합성 세포배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 유도하는데 충분한 양이 될 수 있다. 무혈청 배지의 특정 실시양태는 약 0.5 ng/mL 내지 약 5 ng/mL의 범위에서 무혈청 배지내 TGFB1의 농도를 포함할 수 있다. 하나의 비-제한 실시예는 약 1 ng/mL의 무혈청 배지내 농도를 갖는 TGFB1 양을 포함한다.
무혈청 배지의 실시양태는 Sigma-Aldrich PN B3555로부터 얻을 수 있는 골형성 단백질 2 ("BMP2")의 양을 추가로 포함할 수 있다. BMP2의 양은 상기 설명된 무혈청 합성 세포배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포로부터 골세포를 유도하는데 충분한 양이 될 수 있다. 무혈청 배지의 특정 실시양태는 약 0.5 ng/mL 내지 약 5 ng/mL의 범위에서 무혈청 배지내 BMP2의 농도를 포함할 수 있다. 하나의 비-제한 실시예는 약 1 ng/mL의 무혈청 배지내 농도를 갖는 BMP2 양을 포함한다.
당연하게도, 실시양태는 MSC 또는 hMSC로부터 연골세포 모집단 또는 골세포 모집단 또는 연골세포 모집단 및 골세포 모집단 둘 모두를 포함한 모집단을 유도하는데 충분한 TGFB1 또는 BMP2 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. hMSC로부터 연골세포 또는 골세포를 유도하는데 적합한 무혈청 배지의 특정 실시양태는 표 1 및 표 2에 열거된 구성요소의 조합물을 포함할 수 있고, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 이로 구성될 수 있으며 이후, 조합물 내로 TGFB1 및 BMP2 중 하나 또는 둘 모두의 양을 혼합할 수 있다.
다음의 작업 실시예는 본 발명에 포함된 광범위의 실시양태를 만들고 이용하기 위해 해당 분야의 통상의 기술자에게 충분한 본 발명의 무혈청 합성 세포배양 배지 (본 발명의 기초배지 및 본 발명의 보충된 배지의 특정 실시양태를 포함함)를 만들고 이용하는 방법의 예시가 되는 것으로 의도된다.
실시예 1. 냉동보존된 세포의 수복
MSC, 특히 hMSC를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 냉동된 세포는 세포를 성장 또는 냉동시키기 위해 앞서 사용된 배지에 상관없이, 상기 설명된 본 발명의 무혈청 배지에 적응될 수 있다. 단계적 절차는 약 37℃의 수조에서 hMSC와 같은, 냉동된 세포를 해동시키는 단계를 포함한다. hMSC를 50mL 원뿔형 튜브 또는 다른 적합한 용기 내로 이동시킬 수 있다. 각각 1mL의 hMSC 현탁액에 대해, 부드럽게 스월링(swirling)하면서, 약 37℃까지 사전-가온된 약 10mL의 본 발명의 무혈청 배지를 점적하여 첨가한다. 원뿔형 튜브의 내용물을 조직 배양 플라스크 또는 조직 배양 플레이트의 도말된 다중 웰(plated multiple well) 내로 이동시킨다. 대안적으로, hMSC를 약 10분 동안 약 250 xg (~1200 rpm)으로 원심분리할 수 있고, 본 발명의 무혈청 배지 (적용에 따라 기초배지 또는 보충된 배지)에서 재현탁할 수 있고, 이후 이동시키거나 도말할 수 있다. 약 4% 내지 약 6% 이산화탄소를 함유한 습한 환경에서 약 36℃ 내지 38℃로 hMSC를 인큐베이션(incubation)할 수 있다. 약 24시간 후, hMSC를 이동시켰거나 도말하였던 본 발명의 무혈청 배지를 새로운 무혈청 배지로 교체한다. 세포 확장이 계대시키는 것(passaging) 또는 나누는 것(splitting)이 요구될 때까지 매 2일에 본 발명의 무혈청 배지를 바꿔줌으로써 hMSC 세포 배양물을 유지한다.
실시예 2. 세포의 계대
본 발명의 무혈청 배지 ("기초배지" 또는 "보충된 배지"와 같은)의 실시양태에서 MSC, 특히 인간 MSC를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포를 배양할 때 세포 배양 용기의 표면에 코팅 또는 다른 처리는 불필요할 수 있다. MSC 및 hMSC를 포함한 세포의 충분한 및 전형적으로 최적의 세포부착 및 성장은 코팅없이 기존의 조직 배양 용기를 활용하여 성취될 수 있다. 비-제한 예시로서, 세포 계대를 위해 BD Primaria, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, New Jersey (BD Cat# 353808) 및 BD Primaria, Falcon 6-웰 플레이트 (BD Cat# 353046)를 통해 이용가능한 25 cm2 조직 배양 플라스크와 같은, 음전하 폴리스티렌 용기를 플레이트-코팅없는 본 발명의 배지의 실시양태로 활용할 수 있다; 하지만, 본 발명은 그다지 제한적이지 않으며, 그리고 원하는 경우 용기의 표면을 약 37℃에서 약 1시간 동안 약 0.5-1.05 마이크로그램/cm2 표면 면적의 피브로넥틴으로 코팅하고, 그 다음 본 발명의 무혈청 배지에서 세포를 도말할 수 있다. 혈청-코팅 또는 무혈청 배지에서 배양된 MSC 및 hMSC를 포함하는 세포는 빠르게 그리고 쉽게 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태에 적응될 수 있다. 대부분의 경우, 혈청-함유 배지에서 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태로의 1단계 변화는 충분할 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 무혈청 배지의 양의 점진적 증가 (가령, 25%, 50% 등)와 함께 단계적 적응이 또한, 다음과 같이, 수행될 수 있다.
현미경으로 세포의 원배양물을 시각적으로 검사 (본 발명의 무혈청 배지 또는 다른 배지에서 성장하였는지 안하였는지)하고 세포를 하위-계대시킬 준비가 되었는지 확인한다. MSC의 성장 잠재성을 유지하기 위해, 세포를 이들이 약 70% 합류(confluency)에 도달할 때 계대시킬 수 있다. MSC 또는 hMSC 배양물이 약 80% 또는 그 이상의 합류에 도달한다면, 세포는 계대 후 증식을 멈출 것이다. 따라서, 이러한 결과를 피하기 위해 80%의 합류에 도달하기에 앞서 MSC 및 hMSC를 계대시킬 수 있다. 용기에 약 0.05% 트립신/EDRA 용액 또는 TrypLE™ Express를 첨가하고 상온에서 모든 세포를 커버하기 위해 용기를 기울인다.
현미경으로 MSC 또는 hMSC 또는 세포를 관찰한다. 세포가 분리되기 시작하면, 남아있는 세포가 느슨하게 되도록 돕기 위해 용기의 옆면을 부드럽게 두드린다. MSC 또는 hMSC가 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태에서 배양되었다면, 세포가 분리되는데 요구되는 시간은 약 1분 내지 약 3분이 되어야한다. 흥미롭게도, 기존의 혈청-함유 배지에서 성장한 세포는 분리되기 위해 더 오랜 인큐베이션을 요구할 수 있다.
일단 세포가 분리되면, 다음 단계를 진행한다. 세포가 분리된 후 연장된 시간량 동안 트립신 또는 TrypLE™ Express과 같은, 세포 해리효소에 MSC를 방치하지 않는데, 이는 MSC의 성장에 악영향을 줄 것이기 때문이다.
세포 분리시, 표면 부위를 커버하기 위해 충분한 둘베코 인산 완충용액 ("DPBS")을 첨가한다 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri as Product No. D4031로부터 이용가능한 본 발명의 방법에서 이용하기 위해 적합한 DPBS). 멸균된 15 mL 원뿔형 튜브에서 세포 현탁액을 수집한다. 필요한 경우, 플라스크를 세게 두드리거나 현탁액을 피펫팅함으로써 세포 덩어리를 부순다.
10분 동안 1200 rpm (250 xg)으로 세포를 원심분리한다. 실질적으로 모든 상청액을 흡인하고 버린다. DPBS 또는 본 발명의 무혈청 배지에서 세포를 재현탁하고, 다시 원심분리한다. 상청액을 흡인하고 사전-가온된 본 발명의 배지에서 세포를 재현탁한다. 세포 계산(cell counting)을 위해 세포 상청액으로부터 분취액(aliquot)을 얻는다.
약 3.6x103 세포/cm2의 밀도로 세포를 조직 배양 용기에 이동시킨다. 세포의 현탁액의 분포를 고르게 하기 위해 용기를 몇 번 기울인다. 4% 내지 6% CO2의 습한 환경에서 36 내지 38℃로 인큐베이션한다. 매 2일에 배양 배지를 새로운, 사전-가온된 본 발명의 배지로 교체한다. 세포 합류가 약 70%에 도달할 때 세포를 계대시킨다 (전형적으로 3일 간격으로).
실시예 3. 세포의 냉동보존
기초배지를 약 10% 보충된 배지 및 10% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)와 혼합함으로써 냉동 보존 용액을 제조한다. 원심분리함으로써 MSC와 같은 세포를 펠릿화하고, 약 1.0x106 세포/mL까지 냉동보존 용액내 세포를 부드럽게 재현탁하고, 그리고 냉동 유리병으로 이동시킨다. 냉동 유리병을 냉동 용기(freezing container) (Nalgene, 5100 Cryo Freezing Container Product No 5100-0001과 같은)에 배치하고 하룻밤 동안 -70℃ 냉동고에 배치한다. 장기간 보관을 위해 냉동 유리병을 액체 질소로 이동시킨다.
실시예 4. 세포의 연골형성
본 발명의 무혈청 배지에서 확장된 MSC 또는 hMSC와 같은 세포의 분화 잠재성을 시험관 내에서 검사할 수 있다. 설명된 실험적 조건 하에 연골세포를 형성하기 위해 확장된 세포를 유도할 수 있다.
본 발명의 무혈청 배지에서 확장된 MSC의 연골형성을 유도하기 위해 Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998)에 의해 이전에 설명된 방법을 이용하는 것 이외에 확장된 MSC를 비부착 조건(anchorage-independent condition)으로 이동시키고 본 발명의 무혈청 기초배지에서 약 1 내지 약 4주 동안 펠렛 배양물로서 유지할 수 있다.
결과는 본 발명의 무혈청 기초배지의 실시양태에서 확장된　MSC가 연골 구조를 형성하였다는 것을 명시하며,　상기 연골 구조는 알시안 블루(alcian blue)　및 유형　II　콜라겐에 대해 양성으로 염색될 수 있고, 유형　I　콜라겐에 대해 대부분 음성 염색될 수 있다. 연골형성의 정도는 상기 설명된, 본 발명의 기초배지에 TGFB1 및 WNT 경로 저해제의 첨가, 또는 보충된 배지의 이용으로 향상될 수 있다.
상기 결과는 본 발명의 기초배지, TGFB1 및 WNT 경로 저해제를 추가로 포함하는 본 발명의 기초배지, 또는 보충된 배지의 특정 실시양태가 FBS를 함유한 기존 배지보다 동일한 또는 더 큰 정도, 속도, 또는 효능으로 연골형성을 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 5. 중간엽 줄기세포의 골형성
본 발명의 배지에서 확장된 MSC 또는 hMSC와 같은 세포의 분화 잠재성을 시험관 내에서 검사할 수 있다. 설명된 실험적 조건 하에 골세포를 형성하기 위해 확장된 세포를 유도할 수 있다.
결과는 본 발명의 기초배지에서 확장된 MSC와 같은 세포가 뼈 구조를 형성하였다는 것을 입증하며, 상기 뼈 구조는 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S)에 대해 양성으로 염색될 수 있다. 골형성의 정도는 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 기초배지의 실시양태에 BMP2 및 WNT 경로 활성제의 첨가 또는 보충된 배지의 이용으로 향상될 수 있다.
상기 결과는 본 발명의 기초배지, 또는 보충된 배지를 활용하는 방법이 FBS를 함유한 기존 배지보다 동일한 또는 더 큰 정도, 속도, 또는 효능으로 골형성을 유도할 수 있다는 것을 입증할 수 있다.
실시예 6. 결과
이제 주로 도 1을 참조하여, 상기 도 1은 각각 40% 합류 및 80% 합류로, 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 성장한 hMSC의 세포 배양물과 본 발명의 무혈청 배지 (또한 "MesenGro"로 도면에서 언급됨)에서 성장한 hMSC의 세포 배양물을 비교한 이미지를 제공한다. 상기 이미지의 비교는 본 발명의 무혈청 배지에서의 hMSC 배양물이 10% FBS를 함유한 기존 배지에서의 hMSC보다 실질적으로 상이한 것으로 나타나지 않는다는 것을 입증한다. 본 발명의 무혈청 배지는 조성물 내에서 더 큰 정도로 변화할 수 있는 FBS를 활용할 필요가 없다는 이점을 제공하고, 공여자 동물까지 거슬러 올라가 조사될 수 없고, 그리고 MSC 또는 hMSC 분화를 저해 또는 방지할 수 있다. 본 발명의 무혈청 배지는 하기에 추가로 설명된 바와 같은 다른 이점을 제공할 수 있다.
이제 주로 도 2를 참조하여, 경과일의 시간 동안 세포수의 그래프는 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro")에서 세포 성장과 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 hMSC의 세포 성장을 비교한다. 각 시점에서 웰 (24-웰 플레이트) 당 세포수를 매 2일에 배지를 교체하면서 계산하였다. 놀랍게도, 상기 그래프는 본 발명의 무혈청 배지에서 hMSC의 세포 성장률이 10% FBS를 함유한 기존 배지에서보다 더 클 수 있다는 것을 입증한다. 특정 적용에서, 이는 이전 시점에서 계대를 허용하는 이점을 제공하거나 또는 더 적은 시간량으로 세포의 바람직한 수를 얻는 이점을 제공한다.
이제 주로 도 3을 참조하여, 계대 횟수에 따른 전체 hMSC 수의 그래프는 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨)에서 hMSC의 세포 성장과 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 hMSC의 세포 성장을 비교한다. 각 계열 (매 3일)에서 웰 (6-웰 플레이트) 당 전체 세포수를 계산하였다. 개시 계대 횟수는 (10% FBS를 함유한 기존 배지에서 본 발명의 무혈청 배지 또는 10% FBS를 함유한 기존배지 중 하나로) 4이며, 약 20,000/웰의 시원세포(initial cell) 밀도를 갖는다. 상기 그래프는 기존 배지에서처럼 본 발명의 무혈청 배지에서 유사한 hMSC의 기하급수적인 확장을 입증한다.
이제 주로 도 4를 참조하여, 상기 도 4는 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨)에서 성장한 hMSC의 콜로니 형성 능력과 비교하여, 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 성장한 hMSC의 콜로니 형성 능력의 이미지를 제공한다. 상기 이미지는 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 성장한 이들 hMSC와 비교하여 본 발명의 무혈청 배지에서 성장한 이들 hMSC의 콜로니 형성 능력에 실질적인 상이함이 없음을 입증한다.
이제 주로 도 5를 참조하여, 상기 도 5는 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 장기간 배양 후 hMSC와 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨)에서 장기간 배양 후 hMSC의 다중계통 분화능을 비교한 이미지를 제공한다. 9회 계대에서, 세포를 6-웰 플레이트에 도말하였고, 18-24일 후 본 발명의 무혈청 배지에서 성취된 분화를 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 성취된 분화와 비교하였다. 결과는 본 발명의 무혈청 배지에서 배양된 hMSC가 10% FBS를 함유한 기존 배지에서 배양된 hMSC 보다 더 큰 및 필적할만한 다중계통 분화능을 보유한다는 것을 입증한다.
이제 주로 도 6을 참조하여, 상기 도 6은 계대 횟수에 따른 세포수의 그래프이다. 본 발명의 무혈청 배지에서 골수 유래 hMSC (Cellular Engineering Technologies)의 성장률은 상기 설명된 바와 같은 피브로넥틴 코팅의 사용 여부와 관계없이 BD Primaria Falcon 6-웰 플레이트 (BD Cat# 353046)에서와 유사하다. 이는 Invitrogen (PN A10332-01)의 StemPro MSC SFM 및 StemCell Technologies (PN 05420)의 MesenCult-XF 와 같은, 상업적으로 이용가능한 여러 가지 다른 무혈청 배지에 대한 이점을 제공하며, 이는 계대 횟수 결과에 따른 유사한 세포수를 달성하기 위해 플레이트-코팅의 단계를 요구한다.
이제 주로 도 7을 참조하여, 상기 도 7은 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨)의 실시양태에서 배양된 재대혈 유래 MSC와 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지의 실시양태에서 배양된 재대혈 유래 MSC (Cellular Engineering Technologies)의 성장률을 비교한 계대 횟수에 따른 세포수의 그래프이다.
10% FBS를 함유한 배지에서 2회 내지 6회 계대를 위해 재대혈 유래 MSC를 배양하였다. 이후 배양된 MSC를 두 그룹으로 나누었고 두 그룹 각각은 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지, 또는 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨) 중 하나에서 배양하였다.
두 그룹을 BD Primaria T25 플라스크에서 배양하였고, 매 3 내지 4일에 계대시켰다. 접종 농도는 각 계대에서 플라스크 당 1.25x105 세포였다. 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨)에서 재대혈 유래 MSC의 전체 세포수의 성장률은 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지에서 보다 실질적으로 더 컸다.
이제 주로 도 8을 참조하여, 상기 도 8은 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨)의 실시양태에서 배양된 지방조직 유래 MSC와 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지의 실시양태에서 배양된 지방조직 유래 MSC (Cellular Engineering Technologies)의 성장률을 비교한 계대 횟수에 따른 세포수의 그래프이다.
10% FBS를 함유한 배지에서 2회 내지 6회 계대를 위해 지방조직 유래 MSC를 배양하였다. 이후 배양된 MSC를 두 그룹으로 나누었고 두 그룹 각각은 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지, 또는 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨) 중 하나에서 배양하였다.
두 그룹을 BD Primaria T25 플라스크에서 배양하였고, 매 3 내지 4일에 계대시켰다. 접종 농도는 각 계대에서 플라스크 당 1.25x105 세포였다. 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro"로 언급됨)에서 지방조직 유래 MSC의 전체 세포수의 성장률은 10% FBS, L-글루타민, 및 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 기초배지에서 보다 실질적으로 더 컸다.
이제 주로 도 9를 참조하여, 상기 도 9는 hMSC를 배양하는데 활용된 배양 플라스크 유형에 대한 전체 세포수의 막대 그래프를 제공한다. 냉동된 골수 유래 MSC (Cellular Engineering Technologies)를 실시예 1의 절차에 따라서 해동시켰다. 이후 코팅되지 않은 Primaria T25 플라스크에서의 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro")에서 6회 계대를 위해 계대된 골수 유래 MSC를 2개의 상이한 종류의 플라스크: BD Primaria T25 및 Corning CellBIND T25에 플라스크 당 0.09x106으로 접종하였다. 상이한 종류의 플라스크 각각은 코팅되지 않았고, 세포는 모두 본 발명의 무혈청 배지 ("MesenGro")에서 배양하였다. 4일 후, 각 플라스크로부터 세포수를 계산하였다. 상이한 종류의 코팅되지 않은 배양 플라스크 간에 MSC의 전체 수에서 실질적인 상이함은 없었기 때문에, 이것은 본 발명의 무혈청 배지가 각각 상응하게 상이한 제조자의 설명서에 따라 제조된 여러 가지 상이한 코팅되지 않은 배양 플라스크에서 MSC를 배양하기 위해 이용될 수 있다는 것을 입증한다.
무혈청 배지에서 MSC 를 배양하는 것의 이점
본 발명의 무혈청 배지는 소태아혈청으로 또는 인간 자기유래 혈청으로 보충된 배지 또는 다른 혈청 함유 배지에서 MSC 또는 hMSC를 배양하는 것에 대한 여러 가지의 이점을 부여한다.
첫째, 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태는 소혈청, 인간 혈청, 또는 다른 동물 혈청을 함유하지 않는다. 따라서, 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태는 바이러스 및 광우 프리온, 소해면상뇌증 ("BSE")등과 같은, 임의의 상응하는 혈액매개 병원균을 함유할 수 없다.
둘째, 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태는 연골 및 뼈 질환 치료에서 생체외 확장된 MSC 모집단이 이동될 수 있는 환자에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 생체이물 단백질에 대한 항체 발생을 일으키지 않는다.
셋째, 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태는 조성물에서 실질적으로 더 적은 로트 대 로트 변이를 가지며 따라서 본 발명의 무혈청 배지의 로트 대 로트 수행은 더 큰 일관성으로 활용될 수 있다.
넷째, 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태는 여러 가지의 상이한 제조자에 의해 제조된 코팅되지 않은 배양 플라스크로 활용될 수 있다. 이에 비해, Invitrogen's StemPro MSC SFM, 또는 StemCell Technologies' MesenCult-XF와 같은 상업적으로 이용가능한 다른 무혈청 배지는 부착 물질로 배양 플라스크를 사전-코팅하는 것을 요구한다.
다섯째, 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태는 도 7 및 도 8 및 상기 설명에 의해 입증된 바와 같이 소태아혈청으로 보충된 기존 배지와 비교하여 제대 매트릭스, 제대혈, 골수 및 지방조직-유래 MSC와 같은 여러 가지의 MSC 공급원으로부터 파생된 MSC의 확장의 지원에서 예상치 못하게 좋은 결과를 나타낸다.
무혈청 배지의 실시양태에서 배양된 MSC 의 용도
본 발명의 무혈청 배지의 실시양태의 첫번째 비-제한 용도는 세포, MSC, 또는 hMSC 모집단의 생체외 확장의 목적을 위한 무혈청 배지의 여러 가지 실시양태를 제조하기 위해 여러 가지 순열 및 조합에서 조합된 또는 조합가능한지에 상관없이, 본 발명의 무혈청 배지의 성분의 부분 또는 모두를 포함하는 세포 배양 키트의 공급이 될 수 있다.
추가적으로, 상기 설명된 바와 같은 예상치 못하게 좋은 결과를 갖는 본 발명의 무혈청 배지의 실시양태에서 연골세포 또는 골세포를 생산하기 위해 추가로 분화될 수 있는 일반적인 MSC 모집단, 특히 hMSC 모집단의 생체외 확장을 성취하는 것에 비추어, 분화되든지 또는 안되든지,　하나 이상의 이러한 확장된　MSC　모집단의 이동에서 유용할 수 있는　이러한 확장된 또는 분화된　MSC 모집단의　질환을 치료하기 위한　용도가 명확하다. 비-제한 예시로서, 본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 생체외 확장된 중간엽 줄기세포 모집단은 상기 설명된 바와 같이 얻어질 수 있다. 상기 설명된 바와 같은 치료학적 유효량의 확장된 중간엽 줄기세포 모집단이 개체에 투여될 수 있다.
특정한 예시에서, 상기 개체는 연골조직의 질환을 앓을 수 있고 본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 생체외 확장된 중간엽 줄기세포 모집단으로부터 파생된 골세포 모집단이 얻어질 수 있고 그리고 연골조직을 재구성하는데 유용, 보조하기 위해 치료학적 유효량 또는 충분한 양의 이러한 골세포 모집단이 개체에 투여될 수 있다.
특정한 예시에서, 개체는 뼈 질환을 앓을 수 있고 본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 생체외 확장된 중간엽 줄기세포 모집단으로부터 파생된 연골세포 모집단이 얻어질 수 있고 그리고 뼈를 재구성하는데 유용, 보조하기 위해 치료학적 유효량 또는 충분한 양의 이러한 연골세포 모집단이 개체에 투여될 수 있다.
앞서 말한 것으로부터 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 기본적인 개념은 여러 가지의 방식에서 구현될 수 있다. 본 발명은 세포, MSC 및 hMSC의 생체외 확장 및 분화에 유용한 최고의 방식을 포함한 무혈청 배지의 수많은 및 여러 가지 실시양태 및 이러한 MSC로부터 파생된 MSC 모집단 또는 분화된 모집단의 투여에서 유용한 질환 치료법을 포함한다.
따라서, 설명에 의해 개시된 또는 본 출원에 첨부한 도 또는 표에서 나타난 본 발명의 특정 실시양태 또는 요소가 제한되는 것이 아니라, 총칭적으로 본 발명에 포함된 수많은 및 여러 가지 실시양태 또는 이들의 임의의 특정 요소에 대하여 포함된 등가물의 예시적인 것으로 의도된다. 추가로, 본 발명의 단일 실시양태 또는 요소의 특정 설명은 가능한 모든 실시양태 또는 요소를 명백하게 설명할 수는 없다; 많은 대안이 설명 및 도면에 의해 내재되어 개시된다.
장치의 각 요소 또는 방법의 각 단계는 장치 용어 또는 방법 용어에 의해 설명될 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 용어는 본 발명이 제공하는 넓은 포괄범위에 명백하게 나타내고자 하는 경우에 대체될 수 있다. 하지만 하나의 예시로서, 방법의 모든 단계는 조치, 그 조치를 취하기 위한 수단, 또는 조치를 야기하는 요소로서 개시될 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 장치의 각 요소는 물리적 요소 또는 그 물리적 요소가 촉진시키는 조치로서 개시될 수 있다. 하지만 하나의 예시로서, "세포배양"의 개시는 "세포를 배양하는 것"의 행동의 개시를 포함하는 것으로 -- 명백하게 논의되든 또는 논의되지 않든 -- 이해되어야 하고 그리고, 역으로, "세포를 배양하는 것"의 행동의 개시가 유효하게 있다면, 이러한 개시는 "세포배양" 및 심지어 "세포를 배양하기 위한 수단"의 개시를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 요소 또는 단계를 위한 이러한 대안적인 용어는 본 설명에 명백하게 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
추가로, 사용된 각 용어에 관하여, 본 출원에서 이의 활용이 이러한 해석과 불일치하지 않는 한, 일반적인 사전적 정의는 Random House Webster's Unabridged Dictionary, 제 2판에 포함된 바와 같은 각 용어에 대한 설명에 포함되는 것으로 이해되어야 하며, 각 정의는 참조로서 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에서 모든 수치값은 명백하게 명시되든지 안되든지, 용어 "약"에 의해 변경되는 것으로 간주된다. 본 발명의 목적에 대하여, 범위는 "약" 하나의 특정값 내지 "약" 또 다른 특정값으로서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 실시양태에는 하나의 특정값 내지 다른 특정값을 포함한다. 종점에 의한 수치 범위의 열거는 그 범위 이내에 포괄되는 모든 수치값을 포함한다. 1 내지 5의 수치 범위는 예를 들어 수치값 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다. 각 범위의 종점은 다른 종점에 관하여, 및 다른 종점에 관계없이 둘 다 유의적이라는 것이 추가로 이해될 것이다. 값이 선행사 "약"의 용도로써 근사치로 표현될 때, 특정값이 또 다른 실시양태를 형성한다는 것으로 이해될 것이다.
따라서 출원인(들)은 적어도 다음을 청구하는 것으로 이해되어야 한다: i) 본 명세서에 개시된 및 설명된 바와 같은 무혈청 세포배지 배양, ii) 개시된 및 설명된 관련 방법, iii) 이들 장치 및 방법 각각의 유사한, 등가의, 심지어 내재된 변이, iv) 나타난, 개시된, 또는 설명된 기능 각각을 수행하는 이들의 대안적인 실시양태, v)　개시된 및 설명된 것을 수행하기 위해 내재하는 것으로서 나타난 기능 각각을 수행하는 이들의 대안적인 설계 및 방법, vi) 분리된 및 독립적인 발명으로서 나타난 기능, 성분 및 단계 각각, vii) 개시된 여러 가지 시스템 또는 성분에 의해 개선된 적용성, viii) 이러한 시스템 또는 성분에 의해 생산된 결과물, ix) 실질적으로 앞서 설명된 바와 같은 및 첨부된 실시예 중 어느 하나에 관련한 방법 및 장치, x) 개시된 이전 요소 각각의 여러 가지 조합 및 순열.
본 특허 출원 배경기술 섹션은 본 발명을 적용시키기 위해 시도하는 분야의 진술을 제공한다. 또한 이 섹션은 본 발명이 도출하는 첨단기술에 관한 관련 정보, 문제점, 또는 관심사에 유용한 특정 미국 특허, 특허 출원, 공개공보, 또는 청구된 본 발명의 주제의 의역을 편입 및 포함한다. 본 명세서에 인용된 또는 편입된 임의의 미국 특허, 특허 출원, 공개공보, 진술 또는 다른 정보는 본 발명에 대하여 선행 기술로서 공인되기 위해 해석, 이해 또는 간주되는 것으로 의도되지 않는다.
본 국제 PCT 특허 명세서에 공표된 청구범위는 본 발명의 설명 중 일부로서 참고로서 본 명세서에 편입되고, 본 출원인은 이의 어느 하나 또는 모든 청구항 또는 어느 한 요소 또는 성분을 뒷받침하기 위한 추가적인 설명과 같은 이러한 청구범위의 이러한 편입된 내용 중 모두 또는 부분을 사용할 권리를 분명하게 가지며, 본 출원인은 추가로 본 출원 또는 임의의 차후 출원 또는 이들의 계속, 분할, 또는 부분계속출원(continuation in part application)에 의해 보호되는 주제를 명시하기 위해, 또는 어느 한 국가 또는 조약의 특허법, 법칙, 또는 규칙의 임의의 이익, 이에 따른 요금의 감소를 얻기 위해 또는 이에 부합하기 위해 이러한 청구범위의 어느 한 부분 또는 모든 편입된 내용 또는 어느 한 요소 또는 성분을 설명으로부터 청구범위로 또는 필요한 경우 그 반대로 옮길 권리를 분명하게 가지며 참고로서 편입된 이러한 내용은 이들의 임의의 차후 계속, 분할, 또는 부분계속출원 또는 임의의 발행 또는 이에 대한 연장을 포함한 본 출원의 전체의 계류 동안 존속할 것이다.
국제 PCT 출원 명세서에서 공표된 청구범위는 본 발명의 제한된 상당수의 바람직한 실시양태의 경계 및 구역을 설명하는 것으로 추가로 의도되고 그리고 청구될 수 있는 본 발명의 가장 광범위한 실시양태 또는 본 발명의 실시양태의 완전한 리스트로서 이해되는 것으로 의도되지는 않는다. 본 출원인은 임의의 계속, 분할, 또는 부분계속출원 중 일부, 또는 유사한 출원으로서 상기 공표된 설명에 기초한 추가적인 청구항의 발생에 대해 어떠한 권리도 포기하지 않는다.

Claims (73)

  1. 다음을 포함하는, 무혈청 합성 세포배양 배지(serum-free chemically defined cell culture medium):
    a) 기초배지, 여기서 상기 기초배지는 무혈청이다; 및
    b) 다음을 포함하는, 기초배지 보충물:
    i) 인슐린;
    ii) 하나 이상의 인지질 성장인자; 및
    iii) 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 기초배지는 약 0.75:1.25 v/v 내지 약 1.25:0.75 v/v의 범위에서 DMEM 대 MCDB의 비율을 갖는 DMEM의 양 및 MCDB의 양을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 DMEM 대 MCDB의 비율은 약 0.75:1.25 내지 약 0.85:1.15, 약 0.80:1.20 내지 약 0.90:1.10, 약 0.85:1.15 내지 약 0.95:1.05, 약 90:110 내지 약 1.05:0.95, 약 1.00:1.00 내지 약 1.10:0.90, 약 1.05:0.95 내지 약 1.15:0.85, 약 1.10: 0.90 내지 약 1.20:0.80, 및 약 1.15:0.85 내지 약 1.25:0.75로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  4. 제 1항에 있어서, bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-베타1 및 IGF-1로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 세포 성장인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 인슐린은 약 4 mg/L 내지 약 6 mg/L의 범위에서 상기 무혈청 합성 세포배양 배지내 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-베타1 및 IGF-1 각각은 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL의 범위에서 상기 무혈청 합성 세포배양 배지내 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  7. 제 6항에 있어서, bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-베타1 및 IGF-1 각각은 약 1 ng/mL 내지 약 4 ng/mL, 약 3 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 4 ng/mL 내지 약 6 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 7 ng/mL, 약 6 ng/mL 내지 약 8 ng/mL, 약 7 ng/mL 내지 약 9 ng/mL, 약 8 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 9 ng/mL 내지 약 11 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 12 ng/mL, 약 11 ng/mL 내지 약 13 ng/mL, 약 12 ng/mL 내지 약 14 ng/mL, 약 13 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 14 ng/mL 내지 약 16 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 17 ng/mL, 약 16 ng/mL 내지 약 18 ng/mL, 약 18 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 및 약 19 ng/mL 내지 약 20 ng/mL로 구성된 그룹에서 선택된 범위에서 상기 무혈청 합성 세포배양 배지내 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 성장인자는 LPA, 및 S1P로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 성장인자는 약 100nM 내지 약 200nM의 범위에서 상기 기초배지내 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 성장인자는 약 100nM 내지 약 120nM, 약 110nM 내지 약 130nM, 약 120nM 내지 약 140nM, 약 130nM 내지 약 150nM, 약 140nM 내지 약 160nM, 약 150nM 내지 약 170nM, 약 160nM 내지 약 180nM, 약 190nM 내지 약 200nM로 구성된 그룹에서 선택된 상기 기초배지내 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  11. 제 2항에 있어서, 상기 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제는 인간 WNT3A 및 RSPO1로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제는 약 20 ng/mL 내지 약 200 ng/mL의 범위에서 상기 기초배지내 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제는 약 20 ng/mL의 농도를 갖는 인간 WNT3A 및 약 40ng/mL의 농도를 갖는 RSPO1의 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  14. 제 2항에 있어서, 하나 이상의 스테로이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 하나 이상의 스테로이드는 덱사메타손 및 하이드로코르티손으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 하나 이상의 스테로이드는 약 2.0μg/mL 내지 약 5.0μg/mL의 농도를 갖는 상기 덱사메타손 그리고 약 0.5mg/mL 내지 약 1.5mg/mL의 농도를 갖는 상기 하이드로코르티손의 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  17. 제 2항에 있어서, 조절된 철 공급원을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 조절된 철 공급원은 약 2mg/L 내지 약 10mg/L의 범위에서 상기 기초배지내 농도를 갖는 트랜스페린의 양을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  19. 제 18항에 있어서, 트랜스페린의 농도는 약 2mg/L 내지 4mg/L, 약 3mg/L 내지 약 5mg/L, 약 4mg/L 내지 약 6mg/L, 약 5mg/L 내지 약 7mg/L, 약 6mg/L 내지 약 8mg/L, 약 7mg/L 내지 약 9mg/L, 약 8mg/L 내지 약 10mg/L로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  20. 제 2항에 있어서, 전자 전달 활성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 전자 전달 활성제는 셀레늄의 양, 및 셀레노우스 산의 양으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  22. 제 2항에 있어서, HSA의 양을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 HSA의 양은 약 100μg/mL 내지 약 350μg/mL의 범위에서 상기 기초배지내 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 HSA의 양은 재조합 HSA의 양을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  25. 제 2항에 있어서, 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 항산화제는 α-토코페롤 아세테이트 및 아스코르빈산-2 포스페이트로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  27. 제 2항에 있어서, 약 0.001 g/L 내지 약 0.003 g/L의 범위에서 5-하이드록시트립타민의 양을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  28. 제 2항에 있어서, 버퍼를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 버퍼는 약 3.2 g/L 내지 약 4.2 g/L의 범위에서 소듐 바이카보네이트의 양을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  30. 제 2항에 있어서, 상기 무혈청 합성 세포배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 유도하는데 충분한 TGFB1의 양을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  31. 제 2항에 있어서, 상기 무혈청 합성 세포배양 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 유도하는데 충분한 BMP2의 양을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  32. 제 1항에 있어서, 상기 기초배지는
    a) 약 0.5L/L의 MCDB201의 양;
    b) 약 0.5L/L의 DMEM의 양;
    c) 약 3.7g/L의 소듐 바이카보네이트의 양;
    d) 약 0.25 g/L의 재조합 인간 혈청 알부민의 양;
    e) 약 0.005 g/L의 트랜스페린의 양;
    f) 약 0.005g/L의 인슐린의 양;
    g) 약 0.0000037 g/L의 셀레노우스 산의 양;
    h) 약 0.032205 g/L의 아스코르빈산-2 포스페이트의 양;
    i) 약 0.002127 g/L의 5-하이드록시트립타민의 양;
    j) 약 0.000003925 g/L의 덱사메타손의 양;
    k) 약 0.001 g/L의 하이드로코르티손의 양; 및
    l) 약 0.0002 g/L의 α-토코페롤 아세테이트의 양
    으로 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 기초배지는 보충물은
    a) 약 10 ng/mL의 PDGF-bb의 양;
    b) 약 10 ng/mL의 bFGF(155aa)의 양;
    c) 약 20 ng/mL의 EGF의 양;
    d) 약 5 ng/mL의 IGF1의 양;
    e) 약 100 nM의 LPA의 양;
    f) 약 150nM의 S1P의 양;
    g) 약 20 ng/mL의 WNT3A의 양; 및
    h) 약 40 ng/mL의 RSPO1의 양
    으로 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 기초배지 보충물은 TGFB1의 양으로 추가 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  35. 제 33항에 있어서, 상기 기초배지 보충물은 BMP2의 양으로 추가 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  36. 다음의 단계를 포함하는, 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법:
    a) 기초배지를 제공하는 단계, 여기서 상기 기초배지는 무혈청이다; 및
    b) 다음을 추가로 포함하기 위해 상기 기초배지를 보충하는 단계:
    i) 인슐린;
    ii) 하나 이상의 인지질 성장인자; 및
    iii) 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제.
  37. 제 36항에 있어서, 기초배지를 제공하는 상기 단계는 약 0.75:1.25 v/v 내지 약 1.25:0.75 v/v의 범위에서 DMEM 대 MCDB의 비율을 갖는 DMEM의 양 및 MCDB의 양을 조합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 기초배지를 보충하는 단계는 다음을 상기 기초배지와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법:
    a) bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-베타1 및 IGF-1로 구성된 그룹에서 선택된 인슐린뿐만 아니라 하나 이상의 성장 인자;
    b) LPA, 및 S1P로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 지질 성장인자; 및
    c) 인간 WNT3A 단백질, 및 RSPO1로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제.
  39. 제 36항에 있어서, 덱사메타손 및 하이드로코르티손으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 스테로이드를 상기 기초배지에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 트랜스페린의 양을 상기 기초배지에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 셀레노우스 산의 양을 상기 기초배지에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 5-하이드록시트립타민의 양을 상기 기초배지에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, rHSA의 양을 상기 기초배지에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, α-토코페롤 아세테이트 및 아스코르빈산-2 포스페이트로 구성된 그룹에서 선택된 항산화제의 양을 상기 기초배지에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 소듐 바이카보네이트의 양을 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  46. 제 36항에 있어서, TGFB1의 양으로 상기 기초배지를 보충하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  47. 제 36항에 있어서, BMP2의 양으로 상기 기초배지를 보충하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  48. 제 36항에 있어서, 상기 기초배지는
    a) 약 0.5L/L의 MCDB201의 양;
    b) 약 0.5L/L의 DMEM의 양;
    c) 약 3.7g/L의 소듐 바이카보네이트의 양;
    d) 약 0.25 g/L의 재조합 인간 혈청 알부민의 양;
    e) 약 0.005 g/L의 트랜스페린의 양;
    f) 약 0.005g/L의 인슐린의 양;
    g) 약 0.0000037 g/L의 셀레노우스 산의 양;
    h) 약 0.032205 g/L의 아스코르빈산-2 포스페이트의 양;
    i) 약 0.002127 g/L의 5-하이드록시트립타민의 양;
    j) 약 0.000003925 g/L의 덱사메타손의 양;
    k) 약 0.001 g/L의 하이드로코르티손의 양; 및
    l) 약 0.0002 g/L의 α-토코페롤 아세테이트의 양
    으로 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 기초배지 보충물은
    a) 약 10 ng/mL의 PDGF-bb의 양;
    b) 약 10 ng/mL의 BFGF155aa의 양;
    c) 약 20 ng/mL의 EGF의 양;
    d) 약 5 ng/mL의 IGF1의 양;
    e) 약 100 nM의 리소포스파티딘 산의 양;
    f) 약 150nM의 스핑고신 1-포스페이트의 양;
    g) 약 20 ng/mL의 WNT-3a의 양; 및
    h) 약 40 ng/mL의 R스폰딘-1의 양
    으로 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  50. 제 44항에 있어서, 상기 기초배지 보충물은 TGFB1의 양으로 추가 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  51. 제 44항에 있어서, 상기 기초배지 보충물은 BMP의 양으로 추가 구성되는 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  52. 다음을 포함하며, 세포배양 배지를 이용하여 생체외 중간엽 줄기세포 모집단을 확장하는 단계를 포함하는 세포배양의 방법:
    a) 기초배지, 여기서 상기 기초배지는 무혈청이다; 및
    b) 다음을 포함하는, 기초배지 보충물:
    i) 하나 이상의 세포 성장인자;
    ii) 하나 이상의 인지질 성장인자; 및
    iii) 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제.
  53. 제 52항에 있어서, 제대혈, 골수, 제대 맥트릭스, 및 지방조직을 구성하는 그룹에서 선택된 공급원으로부터 상기 중간엽 줄기세포 모집단을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 혈장에 사전 노출하지 않고 생체외 확장을 위해 중간엽 줄기세포 모집단을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  55. 제 52항에 있어서, 혈장에 사전 노출하지 않고 생체외 확장에 의해 중간엽 줄기세포 모집단을 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  56. 제 52항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포 모집단으로부터 연골세포 모집단을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  57. 제 56항에 있어서, TGFB1의 양으로 상기 세포배양 배지를 보충하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제는 인간 WNT3A로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  58. 제 52항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포 모집단으로부터 골세포 모집단을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  59. 제 58항에 있어서, BMP2의 양으로 상기 세포배양 배지를 보충하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제는 인간 WNT-3a 단백질로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  60. 제 52항 또는 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅되지 않은 배양 플라스크에서 상기 중간엽 줄기세포 모집단을 확장하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양의 방법.
  61. 다음의 단계를 포함하는, 처리 방법:
    a) 다음의 단계를 포함하며, 세포 배양배지를 이용하여 생체외 확장된 중간엽 줄기세포 모집단을 얻는 단계:
    i) 기초배지, 여기서 상기 기초배지는 무혈청이다; 및
    ii) 다음을 포함하는, 기초배지 보충물:
    - 하나 이상의 세포 성장인자;
    - 하나 이상의 인지질 성장인자; 및
    - 하나 이상의 WNT 신호전달 경로 활성제; 그리고
    b) 치료학적 유효량의 상기 중간엽 줄기세포 모집단을 개체에 투여하는 단계.
  62. 제 61항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포 모집단을 얻는 단계는 제 1항의 상기 세포배양 배지를 이용하여 생체외 확장된 중간엽 줄기세포 모집단으로부터 파생된 연골세포 모집단을 얻는 단계를 포함하고, 상기 치료학적 유효량의 상기 중간엽 줄기세포 모집단을 개체에 투여하는 단계는 치료학적 유효량의 상기 연골세포 모집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 처리 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 치료학적 유효량의 상기 연골세포 모집단은 뼈를 재구성하는데 충분한 상기 연골세포 모집단의 양을 포함하는 것을 특징으로 하는 처리 방법.
  64. 제 61항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포 모집단을 얻는 단계는 청구항 1의 상기 세포배양 배지를 이용하여 생체외 확장된 중간엽 줄기세포 모집단으로부터 파생된 골세포 모집단을 얻는 단계를 포함하고, 상기 치료학적 유효량의 상기 중간엽 줄기세포 모집단을 개체에 투여하는 단계는 치료학적 유효량의 상기 골세포 모집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 처리 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 치료학적 유효량의 상기 골세포 모집단은 연골조직을 재구성하는데 충분한 상기 골세포 모집단의 양을 포함하는 것을 특징으로 하는 처리 방법.
  66. 제 1항, 제 32항, 제 33항, 제 34항, 또는 제 35항 중 어느 한 항의 무혈청 세포배양 배지를 포함하는 세포배양을 위한 키트.
  67. 제 1항, 제 32항, 제 33항, 제 34항, 또는 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 중간엽 줄기세포의 무혈청 세포배양의 방법에서의 용도를 위한 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  68. 제 1항에 있어서, 개시된 임의의 실시양태를 참고로 하여 본 명세서에서 실질적으로 설명된 바와 같은 것을 특징으로 하는 무혈청 합성 세포배양 배지.
  69. 첨부한 도면에서 나타난 임의의 실시양태를 참고로 하여 본 명세서에서 설명된 바와 같은 무혈청 합성 세포배양 배지.
  70. 개시된 임의의 실시양태를 참고로 하여 본 명세서에서 실질적으로 설명된 바와 같은 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  71. 첨부한 도면에서 나타난 임의의 실시양태를 참고로 하여 본 명세서에서 설명된 바와 같은 무혈청 합성 세포배양 배지를 생산하는 방법.
  72. 제 61항에 있어서, 개시된 임의의 실시양태를 참고로 하여 본 명세서에서 실질적으로 설명된 바와 같은 것을 특징으로 하는 처리 방법.
  73. 본 명세서에서 설명된 또는 청구된 임의의 발명.
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