MX2012014232A - Medio de cultivo celular definido quimicamente libre de suero. - Google Patents

Medio de cultivo celular definido quimicamente libre de suero.

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Abstract

Las modalidades de medios de cultivo celular definidos químicamente que contienen nutrientes y factores de crecimiento libres de cualquier suero para cultivar células tales como células madre mesenquimales y métodos de uso de modalidades del medio de cultivo celular para expandir poblaciones de células tales como células madre mesenquimales mientras que mantiene un fenotipo pluripotente y métodos para inducir condrogenesis y osteogenesis de células madre mesenquimales al mezclar factores de diferenciación a modalidades del medio de cultivo celular.

Description

MEDIO DE CULTIVO CELULAR DEFINIDO QUIMICAMENTE LIBRE DE SUERO CAMPO TÉCNICO En general, se describe un medio de cultivo . celular definido químicamente libre de suero para el cultivo de células. Específicamente, un. medio dé cultivo celular definido químicamente libre de suero para el cultivo de células madre mesenquimales permiten la expansión mientras que mantiene un genotipo pluripoténte a partir del cual condrocitos y osteocitos pueden ser derivados y métodos de uso de tales poblaciones de células madre mesenquimales expandidas para el tratamiento de alteraciones beneficiadas por la administración de una cantidad terapéutica de tales poblaciones de células madres mesenquimales expandidas y diferenciadas. ¡ ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los trasplantes de hueso y cartílagos son efectuados en la reconstrucción de segmentos de hueso y cartílago en cirugía plástica, cirugía traumática o después de la remoción de lesiones neoplásicas. Actualmente, tejidos humanos de una fuente autologa o de donadores vivos O' muertos han sido usados para este propósito. Con el avance de investigación de células madre, las células de hueso y cartílago derivadas de células madre mesenquimales se están volviendo las fuentes celulares para la reparación esqueletal. para diferenciarse de otros tipos de - células y por consiguiente pueden contribuir a la cicatrización de los tejidos después de- lesiones. Las MSC pueden ser aisladas y purificadas de la medula ósea y expandidas in' vitro en cultivo .
Actualmente, la expansión in vitro dé MSC toma lugar en un medio de cultivo complementado con suero bovino fetal (de aquí en adelante en la presente "FBS") o con suero autólogo humano o suero sustancialmente similar o equivalente (también denominado como "suero") . Sin embargo, la presencia de suero animal o humano en cultivos de MSC tienen ciertas desventajas y limitaciones en vista de las aplicaciones terapéuticas potenciales de estos cultivos. En primer lugar, el suero bovino, suero humano u otro suero de animal puede contener patógenos nacidos en la sangre, tales como virus y priones de • vacas loca, encefalopatía espongiforme bovino ("BSE") o los semejantes. En segundo lugar, el suero; bovino invoca la generación de anticuerpo a proteínas xenobioticas que pueden invocar respuestas inmunes en los pacientes receptores. En tercer lugar, el suero bovino exhibe variaciones de lote a lote lo que puede dar como resultado desempeño inconsistente.
Claramente, los medios de cultivo celular contienen solo i sustancias definidas químicamente y libres de suero y los xenobioticos pueden ser altamente deseables para el cultivo de. MSC (u otras células) suponiendo que lqs medios de cultivo celular de la invención y ...métodos para utilizar los medios de cultivo celular de la invención proveen tanto la expansión de células incluyendo MSC y provee además di erenciación de MSC en el cultivo. i BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Así, . un amplio objeto de la invención puede ser proveer una o más modalidades de un medio libre' de suero definido químicamente de la invención (también denominado como "el medio libre de suero") para el cultivo celular y en cuanto a modalidades particulares no limitantes del medio libre de suero de la invención para expandir poblaciones de MSC in vitro incluyendo pero no limitado a MSC humanas ("hMSC") .
Otro objeto amplio de la invención puede ser proveer modalidades de u medio libre de suero que contiene una combinación de componentes químicos aptos de soportar la viabilidad, proliferación y diferenciación de MSC en cultivo celular in vitro ex vivo y en particular cultivo in vitro de MSC sin contener ningún suero, tal como suero bovino fetal, suero autólogo o suero de otro animal. Adicionalmente, modalidades de los medios de la invénción pueden ser utilizadas para soportar la viabilidad; proliferación y diferenciación de MSC con efectividad o resultados sustancialmente similares o mayores en comparación con el medio de cultivo celular convencional que contiene suero.
Otro objeto amplio de la invención ; puede ser métodos para cultiva células tales como MSC y , en particular MSC humanas en el medio de la. invención dando como resultado la i expansión de poblaciones de, MSC y diferenciación de MSC para producir condrocitos u osteocitos. ; Otro objeto amplio de la invención puede ser un método para cultivar células tales como MSC sobre' una superficie de plástico cargada negativamente, tal cómo · la superficie cargada negativamente de plástico de poliestireno que evita la etapa de recubrimiento de la superficie 'con fibronectina o los semejantes.
Naturalmente, objetos adicionales de, la invención son revelados en todas las otras áreas de la esterificación, figuras, fotografías y reivindicaciones.
IBREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 provee imágenes que comparan la morfología de cultivo celular entre hMSC cultivadas en medio convencional que contiene FBS al 10% y hMSC ,· cultivadas en una modalidad particular del medio libre de suero de la invención. '.
La Figura 2 es una gráfica del número de células con respecto a los días que compara la velocidad de crecimiento de hMSC cultivadas en medio convencional que contiene FSB al 10% y la velocidad de crecimiento de hMSC cultivadas en una modalidad particular del medio libre de suero de la invención.
La Figura 3 es una gráfica del número de células con respecto al número de paso que compara el número total de hMSC en cada división, en donde el número de paso de partida es 4 del medio convencional que contiene FBS al 10% ya sea a una modalidad particular del medio libre de suero de la invención o el medio convencional que contiene FBS al 10%.
La Figura 4 provee imágenes que comparan la habilidad de formación de colonia de hMSC cultivadas: en una modalidad particular del medio libre de suero de la invención a hMSC cultivadas en medio convencional que contiene FBS al 10%.
La Figura 5 provee imágenes que comparan el potencial de diferenciación de multilinaje de hMSC después del cultivo a largo plazo en una modalidad particular del medio libre de suero de la invención a hMSC cultivadas en medio convencional que contiene FBS al 10%.
La Figura 6 es una gráfica del número de células con respecto con al número de paso que muestra las velocidades de crecimiento de hMSC en una modalidad particular del medio libre de suero de la invención que son similares con o sin el uso de un recubrimiento de placa sobre los recipientes de cultivo. i La Figura 7 es una gráfica del número de células con respecto al número de paso que compara la velocidad de crecimiento de MSC derivadas de sangre de cordón umbilical cultivadas en una modalidad de un medio básico complementado con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina estreptomicina a MSC derivada de sangre de cordón umbilical 'cultivadas en una modalidad particular del medio libre ¡ de suero dé la invención. i La Figura 8 es una gráfica del número de células con respecto al número de paso que compara! la velocidad de crecimiento de MSC derivada del tejido adiposo cultivadas en el medio básico complementado con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina estreptomicina, a MSC derivadas1 de tejido adiposo cultivadas en una modalidad particular del medio libre de suero de la invención.
La Figura 9 es una gráfica de barras del número de células totales con respecto al tipo de matraz de cultivo utilizado para cultivar hMSC en una modalidad particular del medio libre de suero de la invención.
MODO(S) PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero para el cultivo de células. Específicamente, un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero para el cultivo de células madre mesenquimales que puede ser usado para, la expansión celular mononuclear ex vivo en tanto que mantiene un fenotipo pluripotente ^ en el cual los condrocitos y osteocitos pueden ser derivados de las células madres mesenquimales. Los métodos de uso de' un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero para diferenciación de condrocitos . y osteocitos de poblaciones de células madre mesenquimales expandidas in vitro y para tratamiento de alteraciones del hueso y cartílago beneficiados por una población de ljos condrocitos u osteocitos derivados. Por propósitos ' de la presente invención, el término "libre de suero" significa la ausencia de cualquier suero sanguíneo de cualquier ¡ especie incluyendo i pero no limitado a la ausencia de suero bovino fetal, suero bovino de becerro, suero humano o los semejantes o combinaciones de los mismos.
Por propósitos de la presente invención, se supone que todos los valores numéricos en la presente están modificados por el término "alrededor" ya sea indicado explícitamente o no. Por propósitos de la presente invención, los intervalos pueden ser expresados como de "alrededor" un valor particular a "alrededor" otro valor particular. Cuando tal intervalo es expresado, otra modalidad incluye de un valor particular al i otro valor particular. La cita de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los valores numéricos contenidos I I I dentro de aquel intervalo. Un intervalo numérico de uno a cinco incluye por ejemplo los valores numéricos 1, 1.5, 2, 2.75, 3,· 3.80, 4, 5 y asi sucesivamente. Se comprenderá además que los puntos . finales de cada uno¡ de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final e independientemente del otro punto final. ¡Cuando un valor es expresado como una aproximación por el uso del antecedente "alrededor" se comprenderá que el valor particular forma otra modalidad.
· Por propósitos de la presente invención, los términos "combinación" o "combinar" se refieren a cualquier método para poner dos o más materiales conjuntamente. Tales métodos incluyen pero no están limitados a mezcla, combinación, I entremezcla, concordación, homogeneización, incorporación, entremezcla, agitación o los semejantes.
I Por propósitos de la presente inve'nción, el término "uno" o "un" entidad se refiere a una ; o más de aquella entidad; por ejemplo, "una proteína" o' "un péptido" se refiere a uno o más de aquellos compuestos, o por lo menos un I I compuesto. Como tal, los términos "uno" o un", "uno o más" y "por lo menos uno" pueden ser usados intercambiablemente en la presente. Además, un compuesto "seleccionado del grupo que consiste de" se refiere a uno o más de los compuestos de la lista que sigue incluyendo combinaciones dé dos o más de los compuestos. De acuerdo con la presente invención, un i compuesto aislado es un compuesto que ha sido removido de su medio natural, como tal, "aislado" no refleja necesariamente la extensión a la cual el compuesto ha sido purificado. Un compuesto aislado de la presente invención : puede ser obtenido de su fuente natural, puede ser producido utilizando técnicas de biología molecular o puede ser producido mediante síntesis química.
Adicionalmente, mientras que . ciertas fuentes de componentes o elementos particulares de modalidades de la invención y números de producto específico para los componentes o elementos son descritos; la invención no está limitada de esta manera y los mismos componentes, componentes equivalentes o sustancialmente similares o elementos apropiados para uso en modalidades de la invención pueden ser obtenidas de una numerosa y amplia variedad de fuentes.
Las modalidades del medio de la invención- incluyen el mejor modo de la invención que puede proveer un medio básico libre de suero (también denominado como el "medio base") . El medio base libre de suero puede incluir una mezcla del medio de Eagle modificado por Dulbecco o un medio de la misma composición, composición equivalente | o composición sustancialmente similar (de aquí en adelante en la presente denominado como " DME ") (un DMEM apropiado para uso en modalidades de la invención puede ser obtenido de Invitrogen, 5791 Van Alien Way, Carlsbad, CA, PN en forma líquida 11965 o como un polvo PN 12100 y preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y medio MCDB201 o un medio de la misma composición, composición equivalente o sustancialmente similar (de aquí en adelante en la presente denominado como "MCDB") (un MCDB apropiado para uso en modalidades de la invención puede ser obtenido de Sigma-Aldrich PN M6770). Cada uno de estos medios convencionales también está disponible con ciertos componentes agregados tales como glutamina, piruvato de sodio, HEPES, rojo de fenol, glucosa y sin ciertos componentes tales como metionina, cisteina o calcio, cada uno de tales medios puede ser utilizado en ciertas modalidad del medio base dependiendo de la aplicación.
Modalidades particulares del medio base pueden incluir DMEM y MCDB combinados en una proporción de DMEM : MCDB (v/v) en el intervalo de alrededor de 0.75:1.25 a alrededor de 1.25:0.75; sin embargo, la invención no está limitada de esta manera y modalidades que confieren ventajas en aplicaciones particulares pueden ser preparadas utilizando proporciones de DMEM: MCDB dentro de un intervalo seleccionado del grupo que incluye: alrededor de 0.75:1.25 y alrededor de 0.85:1.15, alrededor de 0.80:1.20 y alrededor de 0.90:1.10, alrededor de 0.85:1.15 y alrededor de 0.95:1.05, alrededor de 90:110 y alrededor de 1.05:0.95, alrededor de 1.00:1.00 y alrededor de 1.10:0.90, alrededor de 1.05:0.95 y alrededor de 1.15:0.85, alrededor de 1.10: 0.90 y alrededor de 1.20:0.80, y alrededor de 1.15:0.85 y alrededor de 1.25:0.75'. Con respecto a modalidades particulares de la invención para el cultivo de células madre mesenquimales ("MSC") y en .particular células madre mesenquimales humanas ("hMSC") una proporción de DMEM:MCBD de alrededor.de 1:1 v/v pueden ser utilizada con resultados apropiados. i Modalidades del medio base pueden incluir además uno o más de los componentes descritos adicionalmente más adelante que pueden ser combinados con la combinación de DMEM y MCDB en varias permutaciones, combinaciones, 1 concentraciones o cantidades dependiendo de la aplicación. Eiji cada caso, el uno o más componentes pueden ser usados dentrp del intervalo en las cantidades descritas y dependiendo de la aplicación o combinación de componentes ciertas ventajas pueden ser obtenidas utilizando una porción seléccionada de los intervalos descritos para cualquier componente o elemento particular.
Modalidades del medio base pueden incluir .además una solución reguladora del pH tal como : una cantidad de bicarbonato de sodio en el intervalo de alrededor de 3.2 g/1 y alrededor de 4.2 g/1 del medio base y en cuanto a i modalidades particulares alrededor de 3.7 g/1. El pH del medio base puede ser ajustado a un pH final en el intervalo de alrededor de 7.3 a alrededor de 7.5 cbn una cantidad de I I hidróxido de sodio con modalidades particulares que tienen un pH de alrededor de 7. .
Modalidades del medio base pueden incluir además una fuente de hierro regulada que libera una cantidad de hierro después del enlace con receptores de la's células que son cultivadas. Un ejemplo no limitante de una fuente de hierro regulada puede ser una .cantidad de transferrina que tiene una concentración . en dicho medio base en 1 el intervalo de alrededor de 2 mg/1 y alrededor de 10 mg/1. En cuanto a modalidades particulares del' medio base;, la cantidad de j transferrina puede ser seleccionada del grupo que incluye: alrededor de 2mg/L y alrededor de 4mg/L, alrededor de 3mg/L y I alrededor de 5mg/L, alrededor de 4mg/L y álrededor de 6mg/L, alrededor de 5mg/L y alrededor de 7mg/L, alrededor de 6mg/L y alrededor de 8mg/L, alrededor de 7mg/L y álrededor de 9mg/L, y alrededor de 8mg/L y alrededor de 10mg/L. Modalidades particulares de medio base pueden incluir una cantidad de transferrina de alrededor de 5 mg/1. ' Modalidades del medio base pueden iincluir además un activador de transporte de electrones. ; El activador de transporte de electrones puede comprender una cantidad de selenio o una cantidad de ácido selenoso; sin embargo, la invención no está asi limitada y otros elementos en trazas, metaloenzimas o proteínas pueden ser utilizados para soportar i el transporte de electrones. En cuanto a aquellas modalidades que incluyen una cantidad de. ácido selenoso en el medio base, la cantidad puede estar en un intervalo de alrededor de 0.0000025· g/1 y alrededor de 0.0000050 g/1, con una modalidad particular que incluye alrededor de 0.0000037 .g/1.
Modalidades del medio base pueden incluir además uno o más antioxidantes. Los antioxidantes pueden incluir como ejemplos no limitantes una ; cantidad de . acetato de alfa-tocoferol o una cantidad de ácido ascórbico-2-fosfato o una cantidad de ambos. Modalidades particulares pueden incluir una cantidad de acetato de alfa-tocoferol ¡en el intervalo de alrededor de 0.0001 g/1 y alrededor de : 0.0003 g/1 y una cantidad de ácido ascórbico-2 fosfato en el intervalo de alrededor de 0.02 g/1 y alrededor de 0.04 :g/l. un ejemplo no limitante, incluye una cantidad de acetato -tocoferol de alrededor de 0.0002 g/1 y una cantidad de ácido ascórbico-2 fosfato de alrededor de 0.0322 g/1. ; Modalidades del medio base pueden incluir además uno o más esteroides. Los esteroides pueden incluir como ejemplo no limitante una cantidad de dexametasona q una cantidad de hidrocortisona o una cantidad de ambos. Modalidades particulares pueden incluir una cantidad de dexametasona en el intervalo de alrededor de 2.0 µg/l y alrededor de 5.0 g/l en combinación con una cantidad de hidrocortisona de 0.5 pg/l y alrededor de 1.5 g/l. Un ejemplo no limitante del medio base incluye una cantidad de dexametasona de alrededor de 0.000004 g/1 en combinación con üna cantidad de hidrocortisona de alrededor de 0.001 g/1.
Modalidades del medio base pueden incluir además una cantidad de 5-hidroxitriptamina en el intervalo de alrededor de 0.001 g/1 y alrededor de 0.003 g/1. Un ejemplo no limitante del medio base incluye una1 cantidad de 5-hidroxitriptamina de alrededor de 0.002 g/1.
Modalidades del medio base pueden incluir además una cantidad de albúmina de suero humano ("HSA") que puede ser una albúmina de suero humano recombinante ("hHSA") .
Modalidades particulares pueden incluir una cantidad de HSA en un intervalo de alrededor de 0.1 g/1 y alrededor de 0.3 g/1. un ejemplo no limitante del medio! base incluye una cantidad de HSA de alrededor de 0.25 g/1. .; Una modalidad particular no limitante del medio base para el cultivo de MSC o hMSC pueden comprender, consistir esencialmente de, o consistir de la combinación de ingredientes cada uno en la concentración' final resumida en la Tabla 1. i TABLA 1. Medio para cultivo de MSC Comprensiblemente, esta modalidad particular del medio base no pretende ser limitante, sino más bien ejemplar de las numerosas y variadas modalidades que pueden ser preparadas utilizando componentes equivalentes o sustancialmente similares, ajustados en concentración en base a las células particulares, lineas celulares, MSC o hMSC que son cultivadas. Las concentraciones finales enlistadas para la modalidad en la tabla 1 pueden variar del valor absoluto en intervalo relacionado con las variaciones normales en la producción, dependiendo de la aplicación particular útil para cultivar SC o h SC. Adicionalmente, ciertas modalidades de la invención pueden incluir menos componentes de los que son enlistados en la Tabla 1 y se pretende que: estas modalidades sean abarcadas por el alcance de la invención.
Modalidades de la invención pueden incluir además un complemento de medio base que puede ser combinado con el medio' base (la combinación también denominada como el "medio complementado") . El complemento de medio base puede incluir uno o más factores de crecimiento celular, uno o más factores de crecimiento de fosfolípido y uno o más activadores de ruta de señalización de WNT, en varias permutaciones y i combinaciones. Comprensiblemente, modalidades del medio libre de suero de la invención no tienen pero pueden incluir el uno o más factores de crecimiento celular, el uno o más factores de crecimiento de fosfolipido ;o el uno o más activadores de ruta de señalización de WNT en varias combinaciones y permutaciones dependiendo de la aplicación.
Asi, modalidades del complemento del medio base pueden incluir el uno más factores de crecimiento celular tales como: insulina que puede ser obtenida del Simga-Aldrich PN 16634 (CAS NO.: 11070-73-8), factor dé crecimiento de fibroblasto básico humano (bFGF) que puede ser obtenido de Sigma-Aldrich PN F0291-25UG (CAS No.: 106096-93-9), factor de crecimiento derivado de plaqueta bb (PDGF-j-bb) que puede ser obtenido de Sigma-Aldrich PN P3201, Factor de crecimiento epidérmico (EGF) que puede ser obtenido de Sigma-Aldrich PN E9644 (GAS NO. : 62253-63-8), y Factor-l. de crecimiento semejante a insulina (IGF-1) (CAS NO.:. 7733-29-1) que puede ser obtenido de Sigma-Aldrich PN 18779 o PN, 13769.
Modalidades, del complemento del medio base pueden incluir una cantidad de insulina. Modalidades particulares pueden tener una concentración en el medio . libre de suero en el intervalo de alrededor de 0.004 g/1 y alrededor de 0.006 g/1. un ejemplo no limitante incluye una cantidad de insulina de alrededor de 0.005 g/1.
Modalidades del complemento de medio base pueden incluir una cantidad de bFGF. Modalidades particulares pueden tener una concentración de bFGF en el medio libre de suero en el intervalo de alrededor de 5 ng/ml y alrededor de 20 ng/ml. Un ejemplo no limitante incluye una cantidad de bFGF de alrededor de 10 ng/ml.
Modalidades del complemento de medio base pueden incluir una cantidad de PDGF-bb. Modalidades particulares pueden tener una concentración de PDGF-bb en el medio libre de suero en el intervalo de alrededor de 5 ng/ml y alrededor de 20 ng/ml. Un ejemplo no limitante incluye una ¡cantidad de PDGF-bb en el medio libre de suero de alrededor de 10 ng/ml.
Modalidades del complemento de medio base pueden incluir una cantidad- de EGF. Modalidades particulares pueden tener una concentración de EGF en el medio libre de suero en el intervalo de alrededor de 15 ng/ml y alrededor de 25 ng/ml.
Un ejemplo: no limitante incluye una cantidad de EGF en el medio libre de suero de alrededor de 20 ng/ml.
Modalidades del complemento de medio base pueden incluir una cantidad de IGF-1. -Modalidades particulares pueden tener una concentración de IGF-1 en el medio libre de suero en el intervalo de alrededor de 1 ng/ml y alrededor de 10 ng/ml. Un ejemplo no limitante incluye una cantidad1 de IGF-1 en el ¦ medio libre de suero de alrededor de 5 ng/ml.
En cuanto a cada uno de los factores de crecimiento celular descritos anteriormente: PDGF-bb, bFGF, EGF e IGF-1 pueden ser ventajosos a concentraciones en el medio libre de suero seleccionadas del grupo que incluye: alrededor de 2 ng/mL a alrededor de 4 ng/mL, alrededor de 3 ng/mL a alrededor de 5 ng/mL, alrededor de 4 ng/mL a alrededor de 6 ng/mL, alrededor de 5 ng/mL a alrededor de 7 ng/mL, alrededor de 6 ng/mL a alrededor de 8 ng/mL, alrededor de 7 ng/mL a alrededor de 9 ng/mL, alrededor de 8 ng/mL ¡a alrededor de 10 ng/mL, alrededor de 9 ng/mL a alrededor de 11 ng/mL, alrededor de 10 ng/mL a alrededor de 12 ng/mL, alrededor de 11 ng/mL a alrededor de 13 ng/mL, alrededor de 12 ng/mL a alrededor de 14 ng/mL, alrededor de 13 ng/mL a alrededor de 15 ng/mL, alrededor de 14 ng/mL a alrededor de 16 ng/mL, i alrededor de 15 ng/mL a alrededor de 17 ng/mL, alrededor de i 16 ng/mL a alrededor de 18 ng/mL, alrededor de 18 ng/mL a alrededor de 20 ng/mL, and alrededor de 19j ng/mL a alrededor de 20 ng/mL. j Modalidades del complemento de medio base pueden incluir uno o más factores de creciraiendo de fosfolipido, tales como: ácido lisofosfatidico ("LPA") ") (CAS NO. : 22022- 87-5) que puede ser obtenido de Sigma-Aldrijch PN L7260, y 1-fosfato de esfingosina ("S1P") (CAS NO. : 26993-30-6) que puede ser obtenido de Sigma-Aldrich PN S9666. Modalidades I particulares pueden tener una concentración de cada uno de LPA o S1P o ambos, en el medio libre de suero en el intervalo de alrededor de 80 nM y alrededor de 200 j nM . Un ejemplo no limitante incluye una cantidad de LPA en jel medio libre de suero de alrededor de 100 nM combinada cdn una cantidad de I i en el medio libre de suero de alrededor; de 150 nM.
En cuanto cada uno de los factores de crecimiento fosfolipido descritos anteriormente pueden ser ventajosos a concentraciones en el medio libre de suero seleccionada del grupo que incluye: alrededor 80 nM y alrededor de 100 nM, alrededor 90 nM y alrededor de 110 nM, alrededor 100 nM y alrededor de 120 nM, alrededor 110 nM y allrededor de 130 nM, i alrededor 120 nM y alrededor de 140 nM, alrededor 130 nM y alrededor de 150 nM, alrededor 140 nM y allrededor de 160 nM, alrededor 150 nM y alrededor de 170 nM, alrededor 160 nM y alrededor de 180 nM, alrededor 190 nM y alrededor de 200 nM..
Modalidades del complemento del medio base pueden incluir uno o más activadores de ruta de señalización de NT. Los activadores de ruta de señalización de WNT pueden ser seleccionados del grupo no limitante que incluye: una proteina de WNT-3a-humana ("WNT3A") que puede ser obtenida de StemRD Inc., Burlingame, CA PN W3A-H005 y R-spondin-1 ("RSP01") que puede ser obtenida de StemRD Inc., Burlingame, CA PN RSPO-005. Modalidades particulares pueden incluir cada uno de los uno o más activadores de ruta de señalización de WNT en una concentración en el medio libre de suero en el intervalo de 10 ng/ml y alrededor de 50 ng/ml. Un ejemplo no limitante incluye una cantidad de WNT3A en el medio libre de suero de alrededor de 20 ng/ml combinado con una cantidad de RSP01 en el medio libre de suero de alrededor de 40 ng/ml.
Una modalidad no limitante particular del complemento de base para el cultivo de MSC o hMSC pueden comprender, consistir esencialmente de, o consistir de la combinación de los ingredientes cada uno en la concentración final en el medio libre de suero, resumido en la Tabla 2. i TABLA 2 : Factores de crecimiento de medio de MSC definidos químicamente Otra vez, mientras que la Tabla 2 enlista la concentración final de los varios factores de crecimiento celular, factores de crecimiento de lipidos y activadores de ruta de señalización de NT utilizados ¡en una modalidad particular del medio libre de suero de la ' invención para la expansión de MSC en cultivo; la invención no está limitada asi si modalidades adicionales de la invención pueden ser obtenidas para el cultivo de células incluyendo pero no limitado a derivar condrocitos y osteocitós de MSC o hMSC, utilizando uno o más de uno o todos ! los factores de crecimiento enlistadas en la tabla en varias combinaciones y permutaciones con la concentración de cada componente o elemento variada como se describe anteriormente dependiendo de la aplicación.
Modalidades del medio libre de suero pueden incluir • además · una cantidad de factor beta-1 de crecimiento transformante. ("TGFB1") que puede ser obtenido de StemRD Inc., Burlingame, CA PN TGF-b-005. La cantidad de TGFB1 puede ser una cantidad suficiente para derivar condrocitos de células madre mesenquimales cultivadas en el medio de cultivo de celular definido químicamente libre de suero descrito an eriormente. Modalidades particulares del medio libre de suero pueden incluir una concentración de TGFBl en el medio libre de suero en el intervalo de 0.5 ng/ml y alrededor de 5 ng/ml. Un ejemplo no limitante incluye una , cantidad de TGFBl que tiene una concentración en el medio libre de suero de alrededor de 1 ng/ml.
Modalidades del medio libre de suero pueden incluir además una cantidad de proteína 2 morf'ogenica de hueso ("BMP2") que puede ser obtenido de Sigma-Aldrich PN B3555. La cantidad de BMP2 puede ser una cantidad suficiente para derivar osteocitos de células madre mesenquimales cultivadas en el medio de cultivo de celular definido químicamente libre de suero descrito anteriormente. Modalidades particulares del medio libre de suero pueden incluir una concentración de BMP2 en el medio libre de suero en el intervalo de 0.5 ng/ml y alrededor de 5 ng/ml. Un ejemplo no limitante incluye una cantidad de TGFB1 que · tiene una concentración en el medio libre de suero de alrededor de 1 ng/ml. ¡ Comprensiblemente, las modalidades pueden incluir uno o ambos de TGFB1 o BMP2. suficiente para derivar una población de condrocitos o una población de osteocitos o una población que incluye tanto una población de condrocitos como una población de osteocitos de las MSC o hMSC. Una modalidad particular del medio libre de suero apropiada para derivar condrocitos u osteocitos hMSC puede comprender, consistir esencialmente de o consistir de una combinación de los ingredientes enumerados en la Tabla 1 y : Tabla 2 y luego i mezclar una cantidad ya sea de uno u otro o ambos de TGFB1 y B P2 a la combinación. 1 . Los siguientes ejemplos de trabajo pretenden ser ilustrativos de métodos de fabricación y uso del medio de cultivo celular definido químicamente librje de suero de la invención (incluyendo ciertas modalidades de los medios base de la invención o medios complementados de la invención) suficiente para que la persona de habilidad ordinaria en el arte fabrique y use el amplio intervalo de modalidades abarcadas por la invención. ¡ EJEMPLO 1. RECUPERACION DE CELULAS CRIOPRESERVADAS Células congeladas, incluyendo pero no limitadas a MSC i y en particular hMSC, pueden ser aptas al medio libre de suero de la invención descrito anteriormente, sin consideración del medio antes usado para cultivar o congelar células. El procedimiento gradual incluye deshelar células congeladas, tales como hMSC, en un bañp de agua a. una temperatura de alrededor de 37 °C. Las ¡ hMSC pueden ser I transferidas a un. tubo cónico de 50 mi ¡u otro recipiente apropiado. Por cada 1 mi de suspensión dé hMSC, se agregan gota a gota alrededor de 10 mi del medio libre de suero de la invención pre-calentado a una temperatura de alrededor de 37°C mientras gue se agita suavemente. ] Se transfiere el I í contenido del tubo cónico a un matraz de cjultivo de tejido o múltiples cavidades depositadas de una plJaca de cultivo de tejido. Alternativamente, las hMSC pueden también ser centrifugadas a alrededor de 250 x g ' (-1200 rpm) por alrededor de 10 minutos. Re suspendidas en; el medio libre de suero de la invención (el medio base o el medio complementado dependiendo de la aplicación) y luegp transferidas o depositadas. Las hMSC pueden ser incubadas a alrededor de 36°C a alrededor de 38°C en una atmosfera humidificada gue contiene alrededor de 4% alrededor de 6% de dióxido de carbono. Después de alrededor de 24 horas, se reemplaza el i medio libre de suero de la invención, en el cual las hMSC fueron transferidas o depositadas con medio libre de suero de la invención nuevo. Se mantiene el cultivo celular de hMSC al cambiar el medio libre de suero de la invención cada dos días hasta que la expansión celular requiere el pasaje o división.
EJEMPLO 2. PASAJE DE CELULAS El recubrimiento u otro tratamiento a la superficie de los recipientes de cultivo celular puede no ser necesario cuando se cultivan células, incluyendo pero no limitado a MSC y en particular MSC humanas en modalidades del medio libre de suero de la invención (tal como el "medio base" o "medio complementado") . Una- anexión de célula suficiente y comúnmente óptimo en crecimiento de células incluyendo MSC y hMSC puede ser obtenido utilizando recipientes de cultivo de tejido convencionales sin recubrimiento. Como un ejemplo no limitante, recipientes de poliestireno cargados negativamente, tales como matraz de cultivo de tejido de 35 cm3 disponible de BD Primaria, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, New Jersey (BD Cat# 353808) y BD Primaria, placas de cavidades Falcon 6- (BD Cat# 353046) para , el pasaje celular pueden ser utilizados con modalidades del medio de la invención sin recubrimiento de placa; sin embargo, la invención no está asi limitada y si se desea, la superficie de los recipientes puede ser recubierta : con fibronectina alrededor de 0.5-1.0 microgramos/cm de área superficial por alrededor de 1 hora a alrededor de 37°C, seguido por deposición de células en el medio libre de suero de la invención. Las células, incluyendo MSC y h SC cultivadas en el medio que contiene suero o medio libre de suero pueden ser • rápida y fácilmente adaptadas a modalidades del medio libre de suero de la invención. En la mayoría 'de los casos, una transición de una etapa del medio que : contiene suero a modalidades del medio libre de suero de la invención puede ser suficiente. Si se desea, una adaptación gradual con un incremento gradual de la cantidad del medio libre de suero de la invención (por ejemplo, 25%, 50%, etc.) puede también ser efectuada, como sigue. ; Se inspecciona visualmente el cultivo concentrado de células (ya sea cultivadas en el medio libre de suero de la invención u otro medio)' bajo el microscopio, y se confirma que las células están preparadas para el ; sub-pasaje. Para mantener el potencial de crecimiento de MSC, las células se pueden hacer pasar cuando llegan alrededor de 70% de confluencia. Si el cultivo de MSC o hMSC llega a confluencia de alrededor de 80% o mayor, las células sei pueden detener de proliferar después del pasaje. Por consiguiente, las MSC y hMSC se pueden hacer pasar antes de llegar a confluencia de 80% para evitar este resultado. Se agrega una solución de tripsina/EDTA de alrededor de 0.05% o TrypLE™ Express al recipiente, se inclina el recipiente para cubrir todas las células a temperatura ambiente.
Se observan las MSC o h SC o : células bajo un microscopio.. Cuando las células se empiezan a desprender, se golpea suavemente el lado del recipiente para ayudar a • aflojar las células restantes. El tiempo requerido para que las células se desprendan debe ser de alrededor de 1 minuto a alrededor de 3 minutos, si las MSC o las hMSC han sido cultivadas en modalidades del medio libre de suero de la invención. Interesantemente, las células cultivadas en medio que contiene suero convencional pueden requerir de un tiempo de incubación más largo para desprenderse. , Una vez que las células se han desprendido, se procede a la siguiente etapa. No se dejan las MSC en la enzima de disociación celular, tal como tripsina o 1 TrypleLE™ Express por una cantidad de tiempo prolongado después que las células se han desprendido, ya que esto afectara adversamente el crecimiento de las MSC.
Después del desprendimiento celular, se agregan suficiente solución salina de regulado de fosfato de Dulbecco i ("DPBS") para cubrir el área superficial ¡(un DPBS apropiado para uso en el método de la invención disponible de Sigma- Aldrich, St . Louis, Missouri con No. De producto D4031) . Se recolecta la suspensión celular en un tubo; cónico estéril de 15 mi. Se rompen los cúmulos celulares al ' voltear el matraz firmemente o se pipetea la suspensión si es necesario.
Se centrifugan las células a 1200 rpm (250 x g) por 10 minutos. Se aspira y se descarta sustancialmente todo el sobrenadante. Las células re suspendidas en DPBS o el medio libre de suero de la invención y se centrifuga otra vez. Se aspira el sobrenadante y las células re 'suspendidas en el medio de la invención pre^calentado. Se toma una alicota de la suspensión celular para el conteo celular.
Se transfieren las células a recipientes de cultivo de tejido a una densidad de alrededor de 3.6 x 103 células/cm2. Se inclina el recipiente unos pocos minutos para asegurar la distribución uniforme de la suspensión celular. Se incuba a una temperatura de 36°C a 38°C en una atmosfera humidificada de 4 a 6% de C02. Se reemplaza el medio de cultivo cada dos días con medio de invención pre-calentado nuevo. Se hace pasar a · las células cuando la confluencia celular llega alrededor de 70% (comúnmente a intervalos de tres dias) .
EJEMPLO 3. CRIOCONSERVACION DE CELULAS Se prepara la solución de crio conservación al mezclar el medio base con alrededor de 10% de medio complementado y sulfoxido de dimetil al 10% (DMSO) . Se aglomeran las I células, tales como MSC mediante centrifugación, se re suspenden suavemente las células en solución de crio conservación a alrededor de 1.0 x 106 ;células/ml y se transfiere a crio frascos. Se colocan los prio frascos en un recipiente de congelación (tal como un recipiente de congelación crio Nalgene, 5100 No de prodúcto 5100-0001)) y se coloca en un congelador a -70°C de la noche a la mañana.' Se transfieren los crio frascos a nitrógeno liquido para almacenamiento a largo plazo. ; EJEMPLO 4. CONDROGE ESIS DE CELULAS El potencial de diferenciación de células tales como MSC o hMSC expandidas en el medio libre de suero de la invención pueden ser probado in vitro. Las células ;expandidas pueden ser inducidas para formar condrocitos bajo las condiciones experimentales descritas.
Las MSC expandidas pueden ser ' transferidas en condiciones afianzamiento-independiente y mantenidos como un cultivo de pelotilla por alrededor de 1 a alrededor de 4 semanas en medio libre de suero de la invención de otra manera utilizando el método descrito j previamente por Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998) para inducir la condrogenesis de MSC expandidas en el medio libre de suero de la invención. ; Los resultados indican que las MSC expandidas en las modalidades del medio base libre de suero¡ de la invención formaron una estructura cartilaginosa, que ' puede ser teñida positiva para azul de alcian y colágeno tipo II y se puede teñir en su mayoría negativo para colágeno tipo I. la extensión de condrogenesis puede ser mejorada por la adición de TGFB1 e inhibidores de ruta de NT al medio base de la invención o el uso del medio complementado, descrito anteriormente.
Los resultados evidencian que ciertas modalidades del medio base de la invención, el medio base de la invención que incluye además TGFB1 e inhibidores de ' WNT o el medio complementado, pueden inducir condrogenesis a la misma o mayor proporción de extensión o eficiencia que el medio convencional que contiene FBS .
EJEMPLO 5. OSTEOGENESIS DE CELULAS MADRE MESENQUIMALES El potencial de diferenciación de células tales como MSC o h SC expandidas en el medio de la invención puede ser probado in vitro. Las células expandidas pueden ser inducidas a formar osteocitos bajo las condiciones experimentales descritas.
Los resultados evidencian que las células MSC expandidas en el medio base de la invención formaron - una estructura de hueso, que puede teñir positivo rojo de' Alizarina S. la extensión de osteogenesis puede ser mejorada mediante la adición de BMP2 y activadores de ruta de WNT a modalidades del medio base de la invención o mediante el uso del medio complementado, como se describe anteriormente.
Los resultados pueden evidenciar que los métodos que utilizan el medio base de la invención, el medio base o el medio complementado, pueden inducir osteogenesis a la misma o mayor proporción de extensión o eficieneia que el medio convencional que contiene FBS .
EJEMPLO 6. RESULTADOS Refiriéndose ahora principalmente a 'la Figura 1, que provee imágenes que comparan cultivos celulares de hMSC cultivadas en medio convencional que contiene FBS al 10% y cultivos celulares de hMSC cultivados en él medio libre de suero de la invención (también denominada eh las Figuras como "MesenGro") a cada uno de 40% de confluéncia y a 80% de confluencia. La comparación de las imágenes1 evidencia que los cultivos de hMSC en el medio libre de suero de la invención no parecen sustantivamente diferentes de los cultivos de hMSC en el medio convencional que contiene FBS , al 10%. El medio libre de suero de la invención provee la ventaja de no tener que utilizar FBS que puede variar a un mayor grado en composición y ho puede ser rastreado de regreso al animal donador y puede inhibir o impedir la diferenciación de MSC o-hMSC. El medio libre de suero de la invención puede proveer otras ventajas como se describe además posteriormente en la presente.
Refiriéndose ahora principalmente a la Figura 2, una ¦ gráfica del número de células con respecto' al tiempo en días compara el crecimiento celular de hMSC en >medio convencional que contiene FBS al 10% al crecimiento celular en el medio libre de suero de la invención ("MesenGro")- Los. números de células por cavidad (placa de 24 cavidades.) en cada punto en el tiempo fueron contados con un cambio del medio' cada dos días. Sorprendentemente, la gráfica evidencia que la velocidad de crecimiento celular de hMSC en el medio libre de suero de la invención puede ser mayor que el medio convencional que contiene FBS al 10%. En ciertas aplicaciones, esto provee la ventaja de tener el pasaje a un punto en el tiempo más temprano o proveer l'a ventaja de tener un número deseado de células en una cantidad de tiempo menor.
Refiriéndose ahora principalmente a la Figura 3, una gráfica del número de hMSC totales con respecto al número de pasajes compara el crecimiento celular de hMSC en medio convencional que contiene FBS al 10% al crecimiento celular en el medio libre de suero de la invención (denominado como "MesenGro") . Los números de células totales por cavidad (placa de 6 cavidades) en cada división (cada 3 días) fueron contados. El número de pasaje de partida¦ es 4 (del medio convencional que contiene FBS al 10% ya sea' al medio libre de suero de la invención o al medio convenci'onal que contiene FBS al 10%) con una densidad celular inicial de alrededor de 20 , 000/cavidad . La gráfica evidencia 1 una expansión exponencial similar de hMSC en el medio libre de suero de la invención como en el medio convencional.
Refiriéndose ahora principalmente a la Figura 4 que provee imágenes de la habilidad de información de colonia de hMSC cultivadas en medio convencional que contiene FBS al 10% ¦ en comparación con la habilidad de formación de colonia de hMSC cultivadas en el medio libre de suero de la invención (denominada como "MesenGRo") . Las imágenes evidencian que no hay ninguna diferencia sustantiva en la habilidad de formación de colonia de aquellas hMSC cultivadas en el medio libre de suero de la invención en comparación con aquellas hMSC cultivadas en medio convencional que contiene FBS al 10%. : Refiriéndose ahora principalmente a la Figura 5 que provee imágenes que comparan el potencial1 de diferenciación de multilinaje de hMSC después de cultivo a largo plazo en el medio libre de suero de la invención (denominado como "MesenGro") a hMSC después de cultivo a largo plazo en medio convencional que contiene FBS al 10%-. En' el pasaje 9, las células fueron depositadas en la placa de 6 cavidades y la diferenciación obtenida en el medio libré de suero de la invención fue comparada con la diferenciación obtenida en el medio convencional que contiene FBS al 10% después de 18-24 dias. Los resultados evidencian que las hMSC cultivadas en el medio libre.de suero de la invención retienen un potencial de diferenciación de multilinaje comparable' y que puede ser mayor que las hMSC cultivadas en el medio convencional que contiene FBS al 10%.
Refiriéndose ahora principalmente a la Figura 6 que es una gráfica de números de células con respecto al número de pasajes. Las velocidades de crecimiento de hMSC derivadas de i medula ósea. (Cellular Engmeering Technologies) en el medio libre de suero de la invención son similares en placas de 6 cavidades BD Primari Falcon (BD Cat# 353046)' con o sin el uso de un recubrimiento de fibronectina como se describe anteriormente. Esto provee una ventaja con respecto a varios otros medios libres de suero disponibles comercialmente, tales como StemPro MSC SFM de Invitrogen1 (PN A10332-01) y MesenCult-XF de StemCell Technologies (PN 05420), que requiere la etapa de recubrimiento de placa para obtener número de células similares con respectó al resultado de número de células de pasaje. : Refiriéndose ahora principalmente a lá Figura 7, que es una gráfica del número de células con respecto al número de pasajes compara la velocidad de crecimiento de MSC derivadas de sangre de cordón umbilical (Celíular Engineering Technologies) cultivadas en una modalidad del medio base complementado con FBS al 10%, L-glutam'ina y penicilina estreptomicina a MSC derivadas de sangre umbilical cultivadas en una modalidad del medio libre de sueró de la invención (denominada como " esenGro") .
Las MCS derivadas de sangre de cordón umbilical fueron cultivadas por dos a seis pasajes en medio que contiene FBS al 10%. Las MSC cultivadas fueron luego divididas en dos grupos y cada uno de los dos grupos cultivados ya sea en uno u otro de: el medio base complementado con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina estreptomicina o el medio libre de suero de la. invención (denominado como "MesenGro") .
Ambos grupos fueron cultivados en matraces DB Primaria T25 y se hicieron cada tres a 4 días. La densidad de siembra fue de 1.25 x 105 células por matraz en cada pasaje. Las velocidades de cultivo en los números de células totales de MSC derivadas de sangre de cordón umbilical* en el medio libre de suero de la invención (denominado como "MesenGro") fue sustancialmente mayor que en el medio base complementado con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina estreptomicina.
Refiriéndose ahora principalmente a la, Figura 8, que es una gráfica del número de célula con respecto al número de pasajes compara la velocidad de crecimiento de MSC derivadas de tejido adiposo (Cellular Engineering Technologies) cultivadas en una modalidad del medio base complementado con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina estreptomicina a MSC derivadas de tejido adiposo cultivadas en una modalidad del medio libre de suero de la invención (denominada como "MesenGro") .
Las MSC derivadas de tejido adiposo; fueron cultivadas por dos a seis pasajes en medio que contiene FBS al 10%. Las MSC cultivadas fueron luego divididas en dos grupos y cada uno de los dos grupos cultivados ya sea en uno u otro de: el medio base complementado con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina estreptomicina o el medio libre de suero de la invención (denominado, como "MesenGro") . i Ambos grupos fueron cultivados en matraces DB Primaria T25 y se hicieron pasar cada tres a 4 días. La densidad de siembra fue de 1.25 x 105 células por matrjaz en cada pasaje. Las velocidades de crecimiento en los húmeros de células totales de MSC derivadas de tejido adiposo! en el medio libre de suero de la invención (denominado como "MesenGro") fue sustancialmente mayor que en el medio base1 complementado con FBS al 10%, L-glutamina y penicilina estreptomicina.
Refiriéndose ahora principalmente a ,1a Figura 9, que provee una gráfica de barras de los números de células totales con respecto al tipo de matraz de cultivo utilizado ' en el cultivo de hMSC. MSC derivadas; de medula ósea congeladas (Cellular Engineering Technologies) fueron desheladas de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1. Las MSC derivadas de medula ósea que se habían echar pasar por seis pasajes en el medio libre de suero de la invención ("MesenGro") sobre matraces Primaria T25 sin recubrir fueron luego sembradas a 0.09 x 106 por matraz en dos clases diferentes de matraces: BD Primari T25 y ;CellBIND T25. Cada clase diferente de matraz estaba sin recubrir y las células fueron todas cultivadas en el medio libre de suero de la invención ("MesenGro") . Después de 4 días, los números de células de cada matraz fueron contados. Ya que entre diferentes clases de matraces de cultivo sin recubrir no hubo diferencia sustancial en el número total de MSC. Esto evidencia que el medio libre de suero de Ja invención puede ser usado para el cultivo de MSC en una variedad de diferentes matraces de cultivo sin recubrir, cada matraz de cultivo manufacturado de acuerdo con una especificación del fabricante correspondientemente diferente. 1 i VENTAJAS DE CULTIVA MSC EN EL MEDIO LIBRE DE SUERO El medio libre de suero de la invención confiere una variedad de ventajas con respecto al cultivo de MSC o hMSC en un medio complementado con suero bovino fetal o con suero autologo humano u otro medio que contiene suero.
En primer lugar, las modalidades del medio libre de suero de la invención no contienen suero bovino, suero humano u otro suero animal. Asi, las modalidades del medio libre de suero de la invención no pueden contener ningún patógeno nacido en sangre correspondiente, tales como virus y priones de vaca loca, encefalopatía espongiforme bovina ("BSE") o los semejantes. ! En segundo lugar, las modalidades del medio libre de suero de la invención no invocan generación de anticuerpo a proteína xenobioticas lo que puede invocar respuestas inmunes en pacientes a los cuales poblaciones expandidas ex vivo de MSC pueden ser transferidas en tratamientos de alteraciones de cartílago y hueso.
En tercer lugar, las modalidades del medio libre de suero de la invención tienen una variación de lote a lote sustancialmente menor en composición y mediante esto desempeño de lote de lote del medio libre de suero de la invención puede ser utilizado con una mayor consistencia.
En cuarto lugar, las modalidades del medio libre de suero de la invención pueden ser utilizadas con matraces de cultivo sin recubrir manufacturados por una variedad de diferentes fabricantes. En comparación, otros medios libres de suero disponibles comercialmente tales; como StemPro MSC SFM de Invitrogen o StemCell Techonologies MesenCult-XF, requieren pre-recubrimiento del matraz : de cultivo con material de anexión.
En quinto lugar, las modalidades del medio libre de suero de la invención exhiben resultados inesperadamente buenos en apoyar la expansión de MSC derivadas de una variedad de fuentes de MSC tales como matriz de cordón umbilical, sangre de cordón umbilical, MSC derivadas de medula . ósea y derivadas de tejido adiposo en comparación con i el medio convencional complementado con suero bovino fetal como se evidencia por la Figura 7 y Figura^ y la descripción anterior. ; USOS DE MSC CULTIVADAS EN MODALIDADES DEL MEDIO LIBRE DE SUERO ! Un primer uso no limitante de modalidades de medio libre de suero de la invención puede ser la provisión de un kit de cultivo celular que incluye una porción de - o todos los I componentes del medio libre de suero de la invención ya sea combinado o combinable en varias , combinaciones o permutaciones para preparar varias modalidades del medio libre de suero de la invención por el propósito de expansión ex-vivo de células, poblaciones de MSC o hM¡SC.
Adicionalmente, a la luz de obtener la expansión ex-vivo de poblaciones de MSC en general y en particular poblaciones de hMSC que pueden ser diferenciadas adicionalmente para producir condrocitos y osteocitos en modalidades del medio libre de suero de la invención con resultados inesperadamente buenos como se describe anteriormente, ;el uso de tales poblaciones expandidas o diferenciadas de MSC para tratar alteraciones que pueden ser beneficiadas por la transferencia de una o más de tales poblaciones expandidas de MSC, ya sea diferenciadas o no, es evidente. Como un ejemplo no limitante, una población de células madre mesenquimales i i i expandidas in vivo utilizando el medio libre de suero de la invención puede ser obtenida como se describe anteriormente. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la población de células madre mesenquimales expandidas como se describe anteriormente puede ser administrada a un individuo.
En ciertas instancias, el individuo puede estar sufriendo de una alteración del tejido del cartílago y una población de osteocitos derivados de una población de células madre mesenquimales expandidas ex-vivo utilizando el medio libre de suero de la invención puede ser obtenida y una cantidad terapéuticamente efectiva o suficiente de tal población de osteocitos puede ser administrada al individuo para beneficiar, para ayudar a reconstituir o reconstituir el tejido del cartílago.
En ciertas instancias, el individuo puede estar sufriendo de una alteración del hueso y una población de condrocitos derivados de una población ' de células madre mesenquimales expandidas ex-vivo utilizando el medio libre de suero de la invención puede ser obtenida y una cantidad terapéuticamente efectiva o suficiente de tal población de condrocitos puede ser administrada al individuo para beneficiar, para ayudar a reconstituir o reconstituir el hueso .
Como se puede entender fácilmente de lo anterior, los conceptos básicos de la presente invención pueden ser implementados en una variedad de maneras. La invención involucra numerosas y variadas modalidades de un medio libre de suero que incluye el mejor modo útil en la expansión y diferenciación ex-vivo de células MSC y hMSC y tratamiento de alteraciones beneficiadas por la administración de población de MSC o poblaciones diferenciadas derivadas de tales MSC.
Como tal, las modalidades o elementos ' particulares de la invención revelados por la descripción o, mostradas en las Figuras o tablas adjuntas a esta solicitud no pretenden ser limitantes, sino más bien ejemplares de las numerosas y variadas modalidades abarcadas genéricamente por la invención o equivalentes abarcadas con respecto a 'cualquier elemento particular de la misma. Además, la descripción especifica de una sola modalidad o elemento de la invención puede no describir explícitamente todas las modalidades o elementos posibles; muchas alternativas son reveladas implícitamente por la descripción y figuras. i Se debe entender que cada elemento de' un aparato o cada etapa de un método pueden ser descrito por un término de aparato o termino de método. Tales términos pueden ser sustituidos en donde se desee para hacer explícita la cobertura implícitamente amplia a la cual esta invención tiene derecho. Como solo un ejemplo, se ¡debe entender que todas las etapas de un método pueden ser reveladas como una acción, un medio para tomar aquella acción ó como un elemento que causa aquella acción. Similarmente, cada elemento de un aparato puede ser revelado como el elemento físico o la acción que el elemento físico facilita. Como solo un ejemplo, la revelación de un "cultivo celular" .debe¦ ser entendido para .abarcar la revelación del acto de "cultivar células"-ya sea discutido explícitamente o no e inversamente, en donde efectivamente la revelación del acto de "cultivar células" tal revelación se debe entender que abarca la revelación de un "cultivo celular" y aun "medios para cultivar células". Tales, términos alternativos para cada elemento o etapa se entiende que" están incluidos explícitamente en la descripción. ¡ Además, en cuanto a cada término usado se debe entender que a no ser que su uso en esta solicitud| sea inconsistente con tal interpretación, definiciones de diccionario comunes se debe entender que están incluidas en la descripción para cada termino como está contenido en el Random House Webster' s Unabridged Dictionary, segunda edición, : cada definición incorporada en la presente por referencia.
Todos los valores numéricos en la presente se supone que están modificados por el término "alrededor", ya sea indicado explícitamente o no. Por propósitos de la presente invención, los intervalos pueden ser expresados como ¡de "alrededor" de un valor particular a "alrededor" de otro . alor particular. ' Cuando tal intervalo es expresado, otra ¡modalidad incluye desde el valor particular al otro valor particular. La cita de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los valores numéricos contenidos dentro de aquel intervalo. Un intervalo numérico de 1 a .5 incluye por ejemplo los valores numéricos 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80;, 4, 5, y asi sucesivamente. Se debe entender además que' los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final e independientemente del otro punto final. Cuando un valor es expresado como una aproximación por el uso del antecedentes "alrededor" se entenderá que el valor particular forma otra modalidad.
Asi, se debe entender que la solicitante reivindica por lo menos: i) un medió de cultivo celular libre de suero como se revela y describe en la presente, ii) métodos relacionados revelados y descritos, iii) variaciones similares, equivalentes y aun implícitas de cada uno de estos dispositivo y métodos, iv) aquellas modalidades alternativas que llevan a cabo cada una de las funciones mostradas, reveladas o descritas, v) aquellos diseños y métodos ¦ alternativos que llevan a cabo cada una , de las funciones mostradas como están implícitas para llevar a cabo lo que se revela y describe, vi) cada elemento, componente y etapa como invenciones separadas e independientes, vii¡) las aplicaciones mejoradas por los varios sistemas o componentes revelados, viii) los productos resultantes producidos por tales sistemas o componentes, ix) métodos y aparatos sustancialmente como se describe anteriormente en la presente y con referencia a cualquiera de los ejemplos adjuntos,1 x) las varias combinaciones y permutaciones de cada uno de los elementos previos revelados. .
La sección de antecedentes de la .invención de esta solicitud de patente provee una afirmación del campo de alcance al cual la invención pertenece. Esta sección también puede incorporar o contener parafraseo de ciertas patentes, solicitud de patente, publicaciones o materia de patentes de los Estados Unidos de América de la invención reivindicada i útiles en relacionar información, problemas o preocupaciones acerca del estado de la tecnología al cual la invención es dirigida. No se pretende que alguna patente, solicitud de patente, publicación de patente, afirmación de patente estadounidense citada o incorporada en la presente sea I interpretada, construida o considerada o 'admitida como arte previo con respecto a la invención. i Las reivindicaciones resumidas en esta especificación de patente PCT internacional son incorporadas en la presente por referencia como parte de esta descripción de la invención y la solicitante se reserva expresamente el derecho de usar todo o una porción de tal contenido incorporado de tales reivindicaciones como descripción adicional para soportar cualquiera de o todas las reivindicaciones o cualquier elemento o componente de las mismas y la solicitante se reserva además expresamente el derecho de mover cualquier porción de o todo el contenido incorporado de tales reivindicaciones o cualquier elemento o componentes de las mismas de la descripción a las reivindicaciones o viceversa como sea necesario para definir la materia para la cual se busca protección para esta solicitud o por cualquier solicitud subsecuente o solicitud de continuación, división o continuación de parte de la misma o para obtener cualquier beneficio de , reducción de derechos de acuerdo con o para cumplir con las leyes de patentes, reglas o regulaciones de cualquier país o tratado y tal contenido incorporado por referencia sobrevivirá durante toda la vigencia de esta solicitud incluyendo cualquier solicitud de continuación, división o continuación de parte subsecuente de la misma o cualquier remisión o extensión de la misma.
Las reivindicaciones resumidas en esta especificación de patente de PCT internacional- pretenden además describir las metas y limites de un número limitado de las modalidades preferidas de la invención y no serán interpretadas como la modalidad más amplia de la invención o un listado completo de modalidades de la invención que pueden ser reivindicadas. La solicitante no renuncia a cualquier derecho por desarrollar reivindicaciones adicionales en base a la descripción resumida anteriormente como parte de una solicitud de continuación, división o continuación de parte o similar.

Claims (73)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero, caracterizado porque comprende: a) un medio base en donde dicho medio base está libre de suero y i b) un . complemento del medio base, que incluye: i) uno o más factores de crecimiento celular; i ii) uno o más factores de crecimiento de fosfolipidos y iii) uno o más activadores de ruta de señalización de WNT.
2. El medio de cultivo celular definido químicamente • libre de suero de la reivindicación 1, caracterizado porque el medio base comprende una . cantidad de DMEM y una cantidad de MCDB que tiene una proporción de DMEM a MCDB en un intervalo de alrededor de 0.75:1.25 v/v a alrededor de 1.25:0.75 v/v. ¦
3. El medio de cultivo celular definido químicamente libre 'de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque I la proporción de DMEM a MCDB es seleccionada del grupo que consiste de: alrededor 0.75:1.25 y alrededor de 0.85:1.15, alrededor 0.80:1.20 y alrededor de 0.90:1.10, alrededor 0.85:1.15 y alrededor de 0.95:1.05, alrededor 90:110 y i alrededor de 1.05:0.95, alrededor 1.00:1.00 y alrededor de 1.10:0.90, alrededor 1.05:0.95 y alrededor de 1.15:0.85, i I alrededor 1.10: 0.90 y alrededor de 1.20:0.80, y alrededor de 1.15:0.85 y alrededor de 125:0.75.
4. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque i el uno o más factores de crecimiento celular son I seleccionados del grupo que. consiste de: insulina, bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-betal y IGF-1.
5. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 4, caracterizado porque la insulina tiene una. concentración en el medio de cultivo i celular definido químicamente libre de suero en un intervalo i de alrededor de 4 mg/ml y alrededor de 6 mg/1.
6. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 5, caracterizado porque cada uno de dichos bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-betal y IGF-1 tiene una concentración en el medio dé cultivo celular definido químicamente libre de suero ' en un intervalo alrededor de 1 ng/ml alrededor de 20 ng/ml.'
7. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 6, caracterizado porque cada uno de dichos bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-betal y IGF-1 tiene una concentración en el medio dé cultivo celular definido químicamente libre de suero en un intervalo I seleccionado del grupo que consiste de: alrededor de 1 ng/mL a alrededor de 4 ng/mL, alrededor de 3 ng/mL a alrededor de 5 i i ng/mL, alrededor de 4 ng/mL a alrededor de! 6 ng/mL, alrededor de 5 ' ng/mL a alrededor de 7 ng/mL, alrededor de 6 ng/mL a alrededor de 8 ng/mL, alrededor de 7 ng/mL a alrededor de 9 ng/mL, alrededor de 8 ng/mL a alrededor de 10 ng/mL, alrededor de -9 ng/mL a alrededor de 11 ng/mL, alrededor de 10 ng/mL a alrededor de 12 ng/mL, alrededor de 11 ng/mL a alrededor de 13 ng/mL, alrededor de 12 ng/mL a alrededor de i 14 ng/mL, alrededor de 13 ng/mL a alrededor de 15 ng/mL, alrededor de 14 ng/mL a alrededor de 16 ng/mL, alrededor de i 15 ng/mL a alrededor de 17 ng/mL, alrededor de 16 ng/mL a I alrededor de 18 ng/mL, alrededor de 18 ng/mL a alrededor de 20 ng/mL y alrededor de 19 ng/mL a alrededor de 20 ng/mL.
8. - El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque ¦ el uno o más factores de crecimiento de lípido son seleccionados del grupo que consiste de: LE?A y S1P.
9. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 8, caracterizado porque el uno o más factores de crecimiento de lípidos tienen una concentración en el medio base en el intervalo de alrededor de 100 nM a alrededor de 200 nM.
10. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 9, caracterizado porque el uno o más factores de crecimiento de lípidos tienen una concentración en el medio base seleccionado del grupo que consiste de: alrededor de 100 n y alrjededor de 120 nM, alrededor de 110 nM y alrededor de 130 nM, alrededor de 120 nM y alrededor de 140. nM, alrededor de 130 nM y alrededor de 150nM, alrededor de 140 nM y alrededor de 160 nM, alrededor i de 150nM y alrededor de 170 nM, alrededor de 160 nM y alrededor de 180nM, alrededor de 190. nM alrededor de 200 nM. ;
11. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque^ el uno o más activadores de ruta de señalización de WNT¦ son seleccionados del grupo que consiste de: 1 un WNT3A humano y RSPOl. I
12. El medio de cultivo celular definido químicamente i libre de suero de la reivindicación 11, caracterizado porque el uno o más activadores de ruta de señalización de WNT tiene una concentración en el medio base en> el intervalo de alrededor de 20 ng/ml y alrededor de 200 ng/ml.
13. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 12, caracterizado porque el uno o más activadores de ruta de señalización de WNT comprenden una combinación de un WNT3A humano que tiene una concentración de alrededor de 20 ng/ml y RSPOl que tiene una concentración de alrededor de 40 ng/ml.
14. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además uno o más esteroides.
15. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 14, caracterizado porque el uno o más esteroides son seleccionados .del grupo que consiste de: dexametasona e hidrocortisona .
16. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 14, caracterizado porque el uno o más esteroides comprenden una combinación de dicha dexametasona que tiene una concentración de alrededor de 2.0 ug/ml a alrededor de 5.0 g/ml y la hidrocortisona que tiene una concentración de 0.5 mg/ml y alrededor de 1.5 mg/ml.
17. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además una fuente de hierro regulada.
18. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 17, caracterizado porque la fuente de hierro regulada comprende, una cantidad de transferrina que tiene una concentración de medio base en el intervalo de alrededor de 2 mg/1 y alrededor de 10 mg/1.
19. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 18, caracterizado porque la concentración de transferrina es seleccionada del grupo que consiste de: alrededor de 2 mg/L y alrededor de 4 mg/L, alrededor de 3 mg/L y alrededor de 5 mg/L, alrededor de 4 mg/L y alrededor de 6 mg/L, alrededor de 5 mg/L y alrededor de 7 mg/L, alrededor de 6 mg/L y alrededor de 8 mg/L, alrededor de 7 mg/L y alrededor de 9 mg/L, alrededor de 8 mg/L y alrededor de 10 mg/L.
20. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la ' reivindicación 2, caracterizado porque comprende además un activador de transporté de electrones.
21. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 20, caracterizado porque el activador de transporte de electrones es seleccionado del grupo que consiste de: una cantidad de selenio y una cantidad de ácido selenoso.
22. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además una cantidad de HSA. '
23. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 22, caracterizado porque la cantidad de HSA tiene una concentración en el medio base en intervalo de alrededor de 100 g/ml y alrededor de 50 g/ml. ;
2 . El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 23, caracterizado porque la cantidad de HSA comprende una cantidad de HSA recombinante . ¡
25. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además uno o más antioxidantes.
26. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 25, caracterizado porque los antioxidantes son seleccionados del grupo que consiste de: acetato de -tocoferol y ácido ascórbico 2-fosfato.
27. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, cáracterizado porque comprende además una cantidad de 5-hidroxitriptamina en el intervalo de alrededor de 0.001 g/1 y alrededor de 0.003 g/1.
28.. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, cáracterizado porque comprende además una solución reguladora del pH .
2.9. El medio de cultivo . celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 25, caracterizado porque la solución reguladora del pH comprendé una cantidad de bicarbonato de sodio en el intervalo de 3¡.2 g/1 y alrededor de 4.2 g/1. i
30. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, cáracterizado porque comprende además una cantidad de TGFB1 suficiente para derivar condrocxtos de células madre mesenquimales cultivadas en el medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero.
31. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 2, caracterizado porque I I i comprende además una cantidad de BMP2 suficiente para derivar condrocitos de células madre mesenquimale¡s cultivadas en el medio de cultivo celular, definido químicamente libre de suero. .
32. El .medio de cultivo celular definido químicamente •libre de suero . de la reivindicación 1, caracterizado porque el medio base consiste de: , a) una cantidad de MCDB201 de alrededor de 0.5 L/L; b) una cantidad de aproximadamente dé DMEM de alrededor de 0. i · 5L/L; c) una cantidad de bicarbonato de sodio de alrededor de 3.7 ¦ g/L; d) una cantidad, de albúmina de suero humano recombinante de alrededor de 0.25 g/L; e) una cantidad de transferrina de alrededor de 0.005 g/L; f) una cantidad de insulina de alrededor 0.005 g/L; g) una cantidad de ácido seleniosó de alrededor de 0.0000037 ! g/L; h) una cantidad de ácido ascórbico-2 fosfato de alrededor de 0.32205 g/L; i i) una cantidad de 5-hidroxitriptamina de alrededor de 0.002127 g/L;. j) una cantidad de dexametasona de aproximadamente 0.000003925 g/L; '¦ i k) una cantidad de hidrocortisona -;de aproximadamente 0.001 g/L; , y 1) una cantidad de acetato de a-tocofero! de alrededor de 0.0002 g/L. ,
33. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 32, caracterizado porque el complemento de. medio base consiste de: ' una cantidad de PDGF-BB de alrededor de 10 ng/ml; b) una cantidad de bFGF (155aa) de alrededor 10 ng/ml; c) una cantidad de EGF de alrededor de 20 ng/ml; d) una cantidad de IGF1 de alrededor de 5 ng/ml; e) una cantidad de LPA de alrededor de 100 nM; f) una- cantidad de alrededor de 150 nm de S1P; 1 g) una cantidad de Wnt3a de alrededor de 20 ng/ml; y h) una cantidad de RSPOl de alrededor :de 40 ng/ml.
34. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 33, caracterizado porque el complemento de medio base consiste además de una cantidad de TGFB1. :
35. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 33, cáracterizado porque el complemento de medio base consiste dé una cantidad de BMP2. ;
36. Un método para producir un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero, caracterizado porque comprende las etapas de: a) , proveer un medio base en donde el medio base está libre de suero y b) un complemento del medio base, para incluir además: i) uno o más factores de crecimiento celular; ii) uno o más factores de crecimiento de fosfolípidos y iii) uno o más activadores de ruta de señalización de NT.
37. Un método para producir un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 33, caracterizado porque la etapa de proveer un medio base comprende la etapa de combinar una cantidad de DMEM y una cantidad de MCDB que tiene una proporción, de DMEM a MCDB en el intervalo de . alrededor de 0.75:1.25 v/v a alrededor de 1.25:0.75 v/v.
38. El método para producir un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la ' reivindicación 37, caracterizado porque la etapa de complementar el medio base comprende la etapa de mezclar con el medio base: a) uno o más factores de crecimiento celular son seleccionados del grupo que consiste de: insulina, bFGF, PDGF-bb, EGF, TGF-betal y IGF-1; b) uno o más factores de crecimiento de lípidos seleccionados del grupo que consiste de: LPA y S1P y c) uno o más activadores de ruta de señalización de WNT seleccionados del grupo que consiste de ! proteina de WNT3A humana y RSP01.
39. El método para producir el medio : de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 36, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar al medio base uno o más esteroides seleccionados del grupo que consiste de dexametasona e hidrocortisona .
40. El método para producir el medio ¡ de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 39, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar al medio base una cantidad de transíerrina .
41. El método para producir el medio j de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 40, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar al medio base una cantidad de ácido selenoso.
42. El método para producir el medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la1 reivindicación 41, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar al medio base una cantidad de 5-hidroxitriptamina .
43. El método para producir el medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la ; reivindicación 42, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar al medio base una cantidad de rHSA.
44. El método para producir el medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la¦ reivindicación 43, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar al medio base una cantidad de antioxidante seleccionado del grupo que consiste de: acetato de a-tocoferol y ácido ascórbico-2 fosfato.
45. El método para producir el medio ;de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 44, caracterizado porque comprende además la etapa de mezclar una cantidad de bicarbonato de sodio.
46. El método para producir el medio !de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la .reivindicación 36, caracterizado porque comprende además. la etapa de complementar el medio base con una cantidad: de TGFB1.
47. El método para producir el medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la -reivindicación 36, caracterizado porque comprende además; la etapa de complementar el medio base con una cantidad; de BMP2.
48. El método para producir un medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 36, caracterizado porque el medio base consiste de: a) una cantidad de MCDB201 de alrededor de 0.5 L/L; b) ' una cantidad de DME de alrededor de 0.5 L/L; c) una cantidad de bicarbonato de sodio de alrededor de 3.7 g/L; d) una cantidad de albúmina de suero humano recombinante de alrededor de 0.25 g/L; ! i e) una cantidad de transferrina de alrededor de 0.005 g/L; : f) una cantidad de insulina de alrededor 0.005 g/L; g) una cantidad . de ácido selenioso de alrededor de 0.0000037 g/L; j h) una cantidad de ácido ascórbico-2 fosfato de alrededor de 0.32205 g/L; i i) una cantidad de 5-hidroxitriptamina de alrededor de 0.002127 g/L; i j ) una cantidad de dexametasona de alrededor de 0.000003925 g/L; k) una cantidad de hidrocortisona de alrededor de 0.001 g/L; y 1) una cantidad de acetato de a-toco¡ferol de alrededor de 0.0002 g/L. · !
49. El método para producir el medio ¡de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la¦ reivindicación 48, caracterizado porque el complemento de medio base consiste de: a) una cantidad de PDGF-BB de alrededor de 10 ng/ml; b) una cantidad de bFGF 155aa de alrededor 10 ng/ml; c) una cantidad de EGF de alrededor de 20 ng/ml; d) una cantidad de IGFl de alrededor de 5 ng/ml; e) una cantidad de ácido lisofosfatidíco de alrededor de 100 nM; ¡ I i f) una cantidad de l-fosfato de esfingosina de alrededor de 150 nm; i g) una cantidad de nt-3a de alrededor de 20 ng/ml; y . h) una cantidad de RSpondin de alrededor de 40 ng/ml.
50. El método para producir el medio ' de cultivo celular definido químicamente libre de suero de lai reivindicación 44, caracterizado porque el complemento de medio base consiste además de una cantidad de TGFB1. '
51. El método para producir el medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de la reivindicación 44-, caracterizado porque el complemento de medio base consiste i además de una cantidad de BMP.
52. Un método de cultivo celular caracterizado porque comprende la etapa de expandir una población de células madre mesenquimales utilizando el medio de cultivo celular de la i reivindicación 1.
53. El método de cultivo celular de; la reivindicación 52, caracterizado porque comprende además la etapa de obtener dicha población de células madre mesenquimales de una fuente seleccionada del grupo que consiste de: ¡ sangre de cordón umbilical, medula ósea, matriz de cordón umbilical y tejido adiposo. :
5 . El método de cultivo celular de i la reivindicación 52, caracterizado porque comprende además la etapa de obtener una población de células madre mesenquimales no expuestas I I antes a un suero para expansión ex-vivo.
55. El método de cultivo celular de la reivindicación 52, caracterizado porque comprende además la etapa de generar una población de células madre mesenquimales no expuestas previamente a un suero mediante expansión ex-vivo.
56. El método de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 52 o 55, caracterizado porque comprende además la etapa de derivar una población de condrocitos de la población de células madre mesenquimales.
57. El método de cultivo celular de1 la reivindicación 56, caracterizado porque comprende además la etapa de complementar el medio de cultivo celular con una cantidad de TGFB1 y en donde el uno o más activadores de ruta de señalización de WNT consiste de una WNT3A humana.
58. El método de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 52 o 55, caracterizado porque comprende además la etapa de derivar una población de osteocitos de la población de células madre mesenquimales.
59. El método de cultivo celular de la reivindicación 58, caracterizado porque comprende además la etapa de complementar el medio de cultivo celular con una cantidad de B P2 y en donde el uno o más activadores de ruta de señalización de WNT consiste de una proteina de WNT-3a humana .
60. El método de cultivo celular de cualquiera de las reivindicaciones 52 o 55, caracterizado porque comprende además la etapa de expandir dicha población de células madre mesenquimales en un matraz de cultivo sin recubrir.
61. Un método de .tratamiento, caracterizado porque comprende las etapas de: ' a) obtener una población de células madre mesenquimales expandidas ex-vivo utilizando dicho medio de cultivo celular de la reivindicación 1 y i b) administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente . efectiva de dicha población de células madres mesenquimales.
62. El método de la reivindicación; 61, caracterizado porque la etapa de obtener una población' de células madres I mesenquimales comprende la etapa de obtener una población de condrocitos derivados de una población 'de células madres mesenquimales expandidas ex vivo utilizando el medio de cultivo celular de la reivindicación 1 y en donde la etapa de administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha población de células madres mesenquimales comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha población de condrocitos.
63. El método de tratamiento de la reivindicación 62, I caracterizado porque dicha cantidad terapéuticamente efectiva de la población de condrocitos comprende üna cantidad de la población de condrocitos suficiente para reconstituir el i hueso.
64. El método de tratamiento de la-; reivindicación 61, caracterizado porque la etapa de obtener una población de células madres mesenquimales comprende .la etapa de obtener una población de osteocitos derivados dé una población de células madres mesenquimales expandidas ex' vivo utilizando el medio de cultivo celular de la reivindicación 1 y en donde la etapa de administrar al individuó una cantidad terapéuticamente efectiva de la poblacióni de células madres mesenquimales comprende la etapa de ¡administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente ^efectiva de dicha población de osteocitos. .
65. El método de tratamiento de la 'reivindicación 64, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva de la población de osteocitos comprende una cantidad de la población de osteocitos suficiente para reconstituir el tejido del cartílago. '·
66. Un kit para cultivo celular caracterizado porque comprende un medio de cultivo celular libre de células de cualquiera de las reivindicaciones 1, 32, 33, 34 o 35.
67. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero de cualquiera de las reivindicaciones 1, 32, 33, 34 o 35 para uso en un método de cultivo de células libre de suero de células madre mesenquimales humanas.
68. El medio de cultivo celular definido químicamente I I libre de suero de la reivindicación 1, caracterizado porque es sustancialmente como se describe en la presente con referencia a cualquier modalidad revelada.
69. El medio de cultivo celular definido químicamente libre de suero como se describe en la presente con referencia a- cualquier modalidad mostrada en las figuras adjuntas.
70. un método para producir el medio . de cultivo celular definido químicamente libre de suero caracterizado porque es sustancialmente como se describe en , la presente con referencia a cualquier modalidad revelada. ¦
71. un método para producir el medio , de cultivo celular definido químicamente libre de suero caracterizado porque es como se describe en la presente con referencia a cualquier modalidad mostrada en las figuras adjuntas.,
72. El método de tratamiento de acuerdo con la reivindicación 61, caracterizado porque es como se describe en la presente con referencia a cualquier m'odalidad revelada.
73. Cualquier invención descrita o reivindicada en la presente. :
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