CN113106066A - 一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法 - Google Patents

一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法，肉瘤细胞培养基包括：DMEM/F12基础培养基、1.5‑2.5v/v％FBS、0.5‑1.5v/v％ITS、丙酮酸钠0.5‑1.5mM、氢化可的松20‑40nM、3‑6ng/ml FGF2、EGF 40‑60ng/ml和Hippo抑制剂。采用该培养基体外生产Matrigel原液时，将小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架混合，3D生物支架的孔径能够使得小鼠肉瘤细胞维持其三维生长状态，然后对小鼠肉瘤细胞进行培养和扩增，制备Matrigel原液。该制备工艺时间短，所用小鼠量少，可大大降低批次间的差异性。

Description

一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原 液的方法
技术领域
本发明涉及Matrigel的制备技术领域，具体涉及一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法。
背景技术
Matrigel是一种从富含细胞外基质的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等几乎所有的细胞外基质成分。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，广泛应用于干细胞分化、培养、类器官培养等研究中。然而现有的Matrigel制作技术，严重依赖于小鼠动物模型，需要将EHS小鼠肉瘤接种到C57BL6N小鼠皮下，等待大概2-3个月时间，再将接种的肉瘤取出，进行分离、纯化出Matrigel原液。整个过程耗时较长，费用较高，而且需要用到大量的小鼠，导致不同批次的Matrigel存在生物活性差异较大的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种肉瘤细胞培养基以及采用该培养基体外生产Matrigel原液的方法，以解决现有技术存在的制备时间长，不同批次之间差异大的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种肉瘤细胞培养基，包括：DMEM/F12基础培养基、1.5-2.5v/v％FBS、0.5-1.5v/v％ITS、丙酮酸钠0.5-1.5mM、氢化可的松20-40nM、3-6ng/ml FGF2、EGF 40-60ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 8-12μM。
采用上述技术方案的有益效果为：该培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，然后加入FBS，FBS中含有血浆蛋白、多肽，生长因子，激素等，可促进肉瘤细胞生长和存活，并且可提供基础培养基中没有或量很少的营养物；ITS中除了含有胰岛素和转铁蛋白以外，还含有硒，可为基础培养基补充其他微量元素，在肉瘤细胞的增殖中发挥着重要；丙酮酸钠可作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是在培养基中加入丙酮酸钠后，当培养基中没有葡萄糖时，细胞也可以代谢丙酮酸钠，为其生长提供能量；培养基中再加入氢化可的松、生长因子FGF2、EGF，其协同基础培养基、FBS、ITS、丙酮酸钠共同提升肉瘤细胞的增殖效率和活性，此外，Hippo抑制剂I3MT-3可用于扩大肉瘤细胞的体积，使得肉瘤细胞快速扩增变大，缩短收获细胞的时间，进而用于制备Matrigel原液。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，一种肉瘤细胞培养基，包括：DMEM/F12基础培养基、2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM、5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 10μM。
采用上述技术方案的有益效果为：各组分之间相互协同作用，搭配最佳浓度，可更有效加快细胞培养和增殖速率。
采用上述培养基体外生产Matrigel原液的方法，包括以下步骤：
将小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架混合，然后在上述肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，最后收获细胞制备Matrigel原液，具体为：
(1)对小鼠肉瘤细胞进行分离纯化；
(2)将分离纯化后的小鼠肉瘤细胞与3D生物支架混合，得混合液，将混合液滴入CaCl2溶液中，形成肉瘤细胞凝胶微球，再将肉瘤细胞凝胶微球加入上述肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，最后收获细胞；
(3)将收获的细胞进行离心、裂解、除上清，最后重悬，制得Matrigel原液。
采用上述技术方案的有益效果为：将小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架混合，3D生物支架的孔径能够使得小鼠肉瘤细胞维持其三维生长状态，即为小鼠肉瘤细胞提供3D生长环境，模拟肉瘤细胞体内的状态，还可以促进肉瘤细胞产生大量的细胞外基质，进而提高最终产物Matrigel的产量。当向混合液中滴入CaCl2溶液后，CaCl2可以使得3D生物支架交联固化，形成细胞凝胶微球。然后通过培养基对小鼠肉瘤细胞凝胶微球进行培养和扩增，如培养基中的Hippo抑制剂I3MT-3可用于扩大小鼠肉瘤细胞球的体积，经过悬浮培养的小鼠肉瘤细胞球快速扩增变大，进而收获细胞制备Matrigel原液。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，步骤(1)具体过程为：将小鼠肉瘤细胞用胰酶消化，然后对其吹打，终止消化，将消化后的细胞离心，收集沉淀，并对沉淀进行重悬，再离心，收集沉淀，得分离纯化后的小鼠肉瘤细胞。更为具体的过程如下：将小鼠肉瘤细胞用0.25％胰酶消化1-3min，然后对其吹打，并用无血清培养基终止消化，将消化后的细胞以150-250g的速度离心5-10min，收集细胞用磷酸盐缓冲液重悬后，再以150-250g的速度离心5-10min，收集细胞，得分离纯化后的小鼠肉瘤细胞。
进一步，步骤(2)中的3D生物支架为海藻酸钠。
采用上述技术方案的有益效果为：海藻酸钠遇钙离子能迅速结合形成稳定的凝胶，该凝胶三维网状结构，孔径大小适合肉瘤细胞生长，生物相容性良好没有任何免疫原性，其孔径特别适合肉瘤细胞产生的细胞外基质蛋白堆积，起到一个类似蜂巢的效果。
进一步，步骤(2)具体过程为：将分离纯化后的小鼠肉瘤细胞与0.5-1.5wt％的海藻酸钠混合，得混合液，将混合液滴入0.05-0.15mol/L的CaCl2溶液中，形成肉瘤细胞凝胶微球，再将肉瘤细胞凝胶微球加入肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，培养温度为35-40℃，CO2浓度为5％，培养12-16天，收获细胞；其中，培养过程中每3-4天换一次培养液，每次更换一半培养液。
进一步，步骤(2)中海藻酸钠的浓度为1wt％。
进一步，步骤(2)中CaCl2溶液的浓度为0.1mol/L。
进一步，步骤(3)具体过程为：将收获的细胞于150-250g的速度离心8-15min，然后加入3-4.5mol/L NaCl裂解缓冲液，混匀后，以6000-8000g的速度离心10-20min，去除上清，并重复1-2次，再采用TBS缓冲液重悬，制得Matrigel原液。
本发明具有以下有益效果：
当将肉瘤细胞由体内培养转变为体外培养后，若利用2D平面培养EHS小鼠肉瘤细胞，由于没有3D立体结构，肉瘤细胞分泌合成的细胞外基质蛋白严重不足，因此不能用来提取Matrigel。而单纯的3D立体培养虽然可以解决细胞外基质蛋白分泌不足的问题，但是由于细胞团内部缺乏养分，以及缺乏合适的细胞生长因子导致细胞团生长缓慢，体积较小，因此也不能用来提取Matrigel。经过发明人摸索后提供的肉瘤细胞培养基可有效提升肉瘤细胞的增殖效率和活性，利用该培养基体外生产Matrigel原液时，先将EHS小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架如海藻酸钠混合，一方面海藻酸钠的孔径非常适合EHS小鼠肉瘤细胞维持其三维生长状态，另一方面，EHS小鼠肉瘤细胞高表达FGF2受体，因此培养基中加入了FGF2生长因子，同时还加入了Hippo抑制剂I3MT-3，用于扩大EHS小鼠肉瘤细胞球的体积，经过一定时间的悬浮培养后，EHS小鼠肉瘤细胞球快速扩增变大，进而收获细胞制备Matrigel原液。该制备方法简单快速，制备时间短，大约14天就可以完成一个批次的Matrigel原液制备工艺，因为整个过程时间短，所用小鼠量少，就会大大降低了批次间的差异性，降低了Matrigel产品的价格，提高了Matrigel产品的质量。
附图说明
图1为实施例4中细胞生长状况图。
图2为EHS小鼠肉瘤细胞球和EHS小鼠肉瘤组织的胞外基质蛋白表达mRNA含量结果。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基1)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：1.5v/v％FBS、0.5v/v％ITS、丙酮酸钠0.5mM、氢化可的松20nM、3ng/ml FGF2、EGF 40ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 8μM。
实施例2：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基2)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：2.5v/v％FBS、1.5v/v％ITS、丙酮酸钠1.5mM、氢化可的松40nM、6ng/ml FGF2、EGF 60ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 12μM。
实施例3：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基3)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM、5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 10μM。
对比例1：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基4)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM、EGF 50ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 10μM。
对比例2：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基5)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM、5ng/ml FGF2和EGF 50ng/ml。
对比例3：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基6)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM。
对比例4：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基7)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM，5ng/ml bFGF和Hippo抑制剂I3MT-3 10μM。
对比例5：
一种肉瘤细胞培养基(记为培养基8)，由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基以及向DMEM/F12基础培养基中加入的如下浓度的组分：2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM，5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和JNK信号抑制剂Isovitexin 10μM。
将实施例1-3和对比例1-5提供的培养基培养EHS小鼠肉瘤细胞，培养方法具体如下：
(1)将EHS小鼠肉瘤细胞按照6000个细胞/cm2的密度种植到5个T25细胞培养瓶中，分别加入培养基1，培养基2，培养基3，培养基4和培养基5，将培养基与EHS小鼠肉瘤细胞悬液充分混匀后，将5个细胞培养瓶放入到37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养，此后每3天按照6000个细胞/cm2的密度进行细胞传代；
(2)在细胞培养的第9天，将细胞培养瓶中的细胞收获，用0.25％的胰酶消化2min，之后将EHS小鼠肉瘤细胞吹打下来并用各对应培养基终止消化；
(3)将步骤(2)得到的EHS小鼠肉瘤细胞以200g的速度离心5min，收集EHS小鼠肉瘤细胞并用10ml的磷酸盐缓存溶液重悬后，再以200g的速度离心5min，继续得到EHS小鼠肉瘤细胞，继续用10ml的磷酸盐缓存溶液混匀；
(4)将步骤(3)得到的EHS小鼠肉瘤细胞用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数和细胞活率检测，每组测3次，结果取平均值如表1所述。
表1EHS小鼠肉瘤细胞的细胞数及活率检测结果
Figure BDA0003064651170000071
由表1可知，本发明提供的肉瘤细胞培养基由于优化加入了FGF2生长因子和Hippo抑制剂I3MT-3，可以更好的维持EHS小鼠肉瘤细胞的活性，使EHS小鼠肉瘤细胞保持更好的生长速度，而替换的加入JNK抑制剂Isovitexin和bFGF均不能维持细胞的生长速度和存活率。
实施例4：
采用实施例3培养基培养的EHS小鼠肉瘤细胞用于体外生产Matrigel原液，具体过程如下：
(1)将EHS小鼠肉瘤细胞用0.25％的胰酶消化2min，之后将EHS小鼠肉瘤细胞吹打并用无血清培养基终止消化；
(2)将步骤(1)得到的EHS小鼠肉瘤细胞以200g的速度离心5分钟，收集细胞用磷酸盐缓冲溶液重悬后，再以200g的速度离心5min；
(3)将步骤(2)得到的EHS小鼠肉瘤细胞按照1×106/ml的浓度与1wt％浓度的海藻酸钠混合，用2ml注射器将混合液滴入到0.1mol/L的CaCl2溶液中，形成肉瘤细胞凝胶微球，再注入到含有肉瘤细胞培养基的透气型悬浮细胞培养瓶中，将培养瓶放入到培养箱中，调节培养箱至CO2浓度为5％，温度为37℃；
(4)每3天半量换液，培养14天后收获细胞，以200g的速度离心10分钟；
(5)向步骤(4)所得物中加入3.4mol/L NaCl裂解缓冲液，混匀，在4℃，以7000g的速度离心15分钟，去除上清，重复该步骤2次；
(6)使用4℃TBS缓冲液重悬步骤(5)所得物，即为Matrigel原液。
使用倒置显微镜观察上述步骤(4)所得细胞的生长状况，结果见图1。由图1可知，3D生物支架海藻酸钠和细胞形成的细胞微球边界较为清晰，EHS小鼠肉瘤细胞在细胞球内生长状况良好。
采用Trizol法提取上述步骤(3)制得的EHS小鼠肉瘤细胞球和EHS小鼠肉瘤组织的总RNA，然后进行RNA反转录：总RNA 4μL，Oligo(dT)1μL，DEPC水8μL，65℃反应10min，冰上冷却后再加入：5×Buffer 4ml，RNA酶抑制剂0.5μL，Mix 2μL，反转录酶0.5μL，总体积20μL。PCR仪50℃反应60min，85℃反应5min，迅速置于冰上停止反应。实时荧光定量PCR：SYBRGreen 10μL，上游引物和下游引物各0.5μL(具体引物序列见表2)，cDNA 2μL，DEPC水7μL，总体积20μL。实验结束后，软件分析并导出记录各样本的ct值。
表2实时荧光定量PCR所用引物序列
Figure BDA0003064651170000091
表2中Laminin为层粘连蛋白，Nestin为巢蛋白，HSPG为硫酸肝素糖蛋白，collagenIV为Ⅳ型胶原，GAPDH为内参。
通过实时荧光定量PCR鉴定EHS小鼠肉瘤细胞球和EHS小鼠肉瘤组织的胞外基质蛋白表达mRNA含量，结果见图2。由图2可知，构成Matrigel胶的主要成分是层粘连蛋白Laminin、Ⅳ型胶原collagen IV、巢蛋白Nestin和硫酸肝素糖蛋白，由图1可以看出，经过3D生物支架悬浮培养的EHS小鼠肉瘤细胞球和EHS小鼠肉瘤组织的主要细胞外蛋白成分组成相似，具有较好的一致性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肉瘤细胞培养基，其特征在于，包括：DMEM/F12基础培养基、1.5-2.5v/v％FBS、0.5-1.5v/v％ITS、丙酮酸钠0.5-1.5mM、氢化可的松20-40nM、3-6ng/ml FGF2、EGF 40-60ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 8-12μM。
2.根据权利要求1所述的肉瘤细胞培养基，其特征在于，包括：DMEM/F12基础培养基、2v/v％FBS、1v/v％ITS、丙酮酸钠1mM、氢化可的松30nM、5ng/ml FGF2、EGF 50ng/ml和Hippo抑制剂I3MT-3 10μM。
3.采用权利要求1或2所述的肉瘤细胞培养基体外生产Matrigel原液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小鼠肉瘤细胞在体外与3D生物支架混合，然后在上述肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，最后收获细胞制备Matrigel原液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体过程如下：
(1)对小鼠肉瘤细胞进行分离纯化；
(2)将分离纯化后的小鼠肉瘤细胞与3D生物支架混合，得混合液，将混合液滴入CaCl2溶液中，形成肉瘤细胞凝胶微球，再将肉瘤细胞凝胶微球加入上述肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，最后收获细胞；
(3)将收获的细胞进行离心、裂解、除上清，最后重悬，制得Matrigel原液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体过程为：将小鼠肉瘤细胞用胰酶消化，然后对其吹打，终止消化，将消化后的细胞离心，收集沉淀，并对沉淀进行重悬，再离心，收集沉淀，得分离纯化后的小鼠肉瘤细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的3D生物支架为海藻酸钠。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体过程为：将分离纯化后的小鼠肉瘤细胞与0.5-1.5wt％的海藻酸钠混合，得混合液，将混合液滴入0.05-0.15mol/L的CaCl2溶液中，形成肉瘤细胞凝胶微球，再将肉瘤细胞凝胶微球加入肉瘤细胞培养基中进行悬浮培养，培养温度为35-40℃，CO2浓度为5％，培养12-16天，收获细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中海藻酸钠的浓度为1wt％。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中CaCl2溶液的浓度为0.1mol/L。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体过程为：将收获的细胞于150-250g的速度离心8-15min，然后加入3-4.5mol/L NaCl裂解缓冲液，混匀后，以6000-8000g的速度离心10-20min，去除上清，并重复1-2次，再采用TBS缓冲液重悬，制得Matrigel原液。
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