CN114480289A - 构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤细胞体外培养，具体涉及构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法。本发明要解决的技术问题是为肠道尤文氏肉瘤类器官构建提供一种新选择。本发明的技术方案是构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法，包括如下步骤：样本预处理、清洗、消化、去除杂质、固化和培养。本发明提供了肠道尤文氏肉瘤的类器官构建方法，使用该类器官可以成功预测肿瘤对化疗药物的敏感性，为制定和实施个性化精准治疗方案提供了可能性。

Description

构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法
技术领域
本发明属于肿瘤细胞体外培养，具体涉及构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法。
背景技术
尤文氏肉瘤是一种原发恶性骨肿瘤，起源于骨髓未成熟的间叶细胞或网织细胞，骨外尤文氏肉瘤恶性程度很高，65%可出现血行转移。其治疗方式以手术结合化学治疗为主，且预后与化疗敏感度密切相关，但目前缺乏有效的化疗敏感性预测方式。既往采用细胞系或基因检测的方式预测化疗敏感性具有耗时或灵敏度度的缺点。
类器官是由干细胞在体外经过三维（Three dimensional, 3D）培养分化成多种细胞类型，并自我组织形成器官样结构的细胞群。与癌细胞系和PDTX（人源肿瘤异种移植模型，Patient-Derived tumor Xenograft）相比，类器官具有组织需求量小、培养周期短、培养成功率高、能够保持原始肿瘤组织基因型和表型的稳定性、保留肿瘤间及肿瘤内异质性，并可以进行高通量药物筛选等优势。自2009年Hans Clever首次报道类器官，10余年来，类器官培养及药敏实验已成功在多种肿瘤类型上进行，如结直肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌等。一些研究利用患者来源肿瘤类器官（Patient-derived tumor organoid, PDTO）成功预测了患者的抗肿瘤治疗疗效。借助类器官临床前特异模型，能快速有效地识别对化疗患者，可以避免过度治疗以减少治疗引起的副作用，实施个性化精准治疗方案。因此，PDTO有望成为化疗疗效预判的新方法。但目前尚无肠道尤文氏肉瘤类器官构建及应用报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为肠道尤文氏肉瘤类器官构建提供一种新选择。
本发明的技术方案是构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法，包括如下步骤：
a、样本预处理：将切取的肿瘤组织用聚维酮碘溶液和0.9%氯化钠溶液依次冲洗2～3次后，放入含有5%青霉素/链霉素及2%promocin的RPMI 1640保存液中；
b、清洗：去除RPMI 1640保存液，将组织加入到含有1×Glutamax、10mM HEPES和5%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液中，振荡清洗，静置5min；此步骤应重复2~3次；
c、消化：去除步骤b中培养基，将清洗好的组织用剪刀剪碎至1mm×1mm大小，加入改良的DMEM/F12培养液，置入37℃水浴锅中消化60min，每隔15min剧烈振荡一次；
d、去除杂质：将消化后的组织悬浮液转移至离心管中，加入10mL AdDF+++清洗2～3次后，过滤，收集滤液；向滤液中加入红细胞裂解液，处理完成后加入10mL AdDF+++，清洗，离心，弃掉上清，取沉淀物；
e、固化：在冰上进行，沉淀物用HEPES缓冲液清洗，重悬，加入Matrigel，充分混匀；吸取细胞悬浮液滴入到预热的培养板中，37℃条件下固化5min；
f、培养：将改良的DMEM/F12培养液加入固化后的Matrigel中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱内培养；每2~4天更换培养基，直至类器官大小超过200微米或类器官长满基质胶。
进一步的，所述方法还包括步骤g、传代：去除培养液，PBS清洗，加入TrypLEExpress，用移液枪吹打，将Matrigel打散，每隔10~15min吹打1次，直至类器官被消化成单个细胞；加入 1mL Advanced DMEM/F12培养基与TrypLE Express混合，200g离心5min，去除上清，将细胞沉淀用Advanced DMEM/F12 培养基重悬细胞，再加入Matrigel，充分混匀，进行传代培养，每2~4天更换培养基，每7～14天传代一次。
具体的，所述方法还包括步骤h、冻存：离心收集步骤f培养或步骤g传代获得的类器官，加入类器官冻存液，形成细胞悬液，转移至低温冻存管中，程序性降温，降温完成后将冻存管放入-80℃深低温冰箱中，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
进一步的，所述方法还包括步骤i、复苏：将冻存管至于37℃，间歇摇动冻存管令其尽快融化，融化后加入advanced DMEM/F12培养基，混匀后200g离心5min，弃去上清液，保留细胞沉淀；加入advanced DMEM/F12重悬细胞沉淀，再加入Matrigel，混匀，吸取混合液至37℃条件下预热30min的培养板中， 5%CO2的37℃细胞培养箱内培养，冻存类器官复苏完成。
具体的，步骤b中，所述DMEM/F12培养液中含有Advanced DMEM/F12和AdDF+++。
其中，步骤c中，所述改良的DMEM/F12培养液含0.5～1.0mg/mL 的II型Collagenase、500U/mL的IV 型Collagenase和10µM的RHO/ROCK pathway inhibitor 。
优选的，经步骤c处理后仍未成功消化的组织可用TrypLE Express在37℃水浴锅中继续消化20min。
进一步的，步骤d中，过滤参数为70µm；离心参数为300g×5min。
其中，步骤e中，加入Matrigel充分混匀后，使细胞浓度为1×106/mL。
具体的，步骤f中，所述改良的DMEM/F12培养液以DMEM/F12培养液为基础，加入N-Acetylcysteine、EGF、FGF-10、FGF-basic、Y-27632、A-83-01、SB202190、Nicotinamide、PGE2、Noggin、 R-Spondin、HEPES、GlutaMAX、B27、N2、青霉素和链霉素。
肿瘤药敏有人源肿瘤异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDTX)和基因检测两种模式，PDTX即将病人的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠而建立，与PDTX相比，类器官具有组织需求量小、培养周期短、培养成功率高、能够保持原始肿瘤组织基因型和表型的稳定性、保留肿瘤间及肿瘤内异质性，并可以进行高通量药物筛选等优势。 而基因检测根据基因突变预测药物敏感性，是一种间接的预测方式，其灵敏度不足。
本发明的有益效果：本发明提供了肠道尤文氏肉瘤的类器官构建方法，使用该类器官可以成功预测肿瘤对化疗药物的敏感性，为制定和实施个性化精准治疗方案提供了可能性。该方法流程简单，制备过程易于标准化，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为A-D分别对应培养0天、5天、10天、15天的肠道尤文氏肉瘤类器官在显微镜下的明场图；
图2为肠道尤文氏瘤培养及药敏检测流程；
图3为以药物浓度的对数值（log(µM)）作为X轴,细胞活力值作为Y轴绘制得到散点图。
具体实施方式
实施例1 类器官的构建
在标本离体30min内切取肠道尤文氏肉瘤组织（注意避开明显坏死组织及正常癌旁组织），切取的肿瘤组织大小应为0.5cm×0.5cm。将切取的肿瘤组织用聚维酮碘溶液和0.9%氯化钠溶液依次冲洗2～3次后，放入含有5%青霉素/链霉素及2%promocin的RPMI 1640保存液中，放入冰盒内，应在不超过10h内转运至实验室处理。
去除RPMI 1640保存液，将组织加入含有1×Glutamax、10mM HEPES和5%青霉素/链霉素的改良DMEM/F12培养液（Advanced DMEM/F12, AdDF+++），振荡清洗，静置5min。此步骤应重复至少2~3次。
去除AdDF+++，将清洗好的组织用剪刀剪碎至1mm×1mm大小，加入到含0.5～1.0mg/mL 的II型Collagenase、500U/mL的IV 型Collagenase和10µM的RHO/ROCK pathwayinhibitor (Y-27632)的改良DMEM/F12培养液，置入37℃水浴锅中缓慢消化60min，每隔15min剧烈振荡一次。仍未成功消化的组织可用TrypLE Express在37℃水浴锅中继续消化20min。
将消化后的组织悬浮液转移至离心管中，加入10mL AdDF+++吹打清洗2～3次后，置于70µm过滤器上过滤，去除消化后的残渣后，将过滤液转移至新离心管。
为去除红细胞，将上述过滤液用2mL红细胞裂解液裂解，并用10mL AdDF+++清洗后置于离心机中离心（300g×5min），弃掉上清，取沉淀物。
沉淀物用HEPES缓冲液清洗，重悬计数后加入Matrigel，充分混匀，使细胞量为1×106/mL，吸取混有Matrigel的细胞悬浮液30µL（应在冰上进行，避免Matrigel和细胞悬浮液混合体在接种上6孔板之前发生凝固，一旦发生凝固即实验失败），滴入预热的6孔板中，37℃条件下固化5min。
在改良的DMEM/F12中加入N-Acetylcysteine、EGF、FGF-10、FGF-basic、Y-27632、A-83-01、SB202190、Nicotinamide、PGE2、Noggin、 R-Spondin、HEPES、GlutaMAX、B27、N2等成分制备类器官生长所需培养基。将制备好的培养基加入固化后的Matrigel中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱内培养。
类器官培养过程中，使用全自动细胞成像系统每天观察、拍照一次，每2~4天更换培养基（图1）。类器官生长大小超过200微米或类器官长满基质胶，可进行传代冻存或石蜡包埋、基因测序及药敏实验等。类器官在生长过程中可能出现支原体污染，支原体在培养基上也呈团装或球状生长，易与类器官混淆，镜下难以发现，为检测所培养的类器官有无支原体污染，用MycoAlert Mycoplasma Detection Kit进行了支原体检测实验。支原体检测实验步骤如下：取2mL含有类器官的培养基置于离心机中离心（200g×5min），吸取100µL上清液样本至新离心管中；将检测试剂盒中的反应物和底物分别加入buffer中，于摇床上混匀15min；取100µL反应物加入样本中，5min后发光仪下读数，记为Reading A；再取100µl底物加到样本中去，10min后读数，记为Reading B; Reading B与Reading A的比值我们定义为MycoAlert比值（MycoAlert ratio）。MycpAlert比值若小于0.9说明样本没有支原体污染，比值大于1.2则说明样本存在支原体污染。
类器官培养到成功后进行传代和冻存。首先将6孔板中的培养基吸出，加入 1mLPBS清洗。去除PBS后，加入1mL TrypLE Express，用移液枪吹打，将Matrigel打散，并使TrypLE Express与类器官充分接触从而促进消化。每隔10~15min吹打1次，同时在倒置显微镜下观察，直至类器官被消化成单个细胞（一般消化时间为 1~2 小时不等）。消化成单个细胞后，加入 1mL Advanced DMEM/F12培养基与TrypLE Express混合，移至15mL离心管中离心(200g×5min)，去除上清，将细胞沉淀中的 1/3细胞进行传代培养：用80µL AdvancedDMEM/F12 培养基重悬细胞，再加入80µLMatrigel，充分混匀（切忌吹打过程中产生大量气泡，以免影响后续种板），吸取80µL的混合液移至6孔板中，做2副孔培养。细胞沉淀中的剩余2/3 细胞进行低温冻存，向准备冻存的细胞中加入1mL类器官冻存液，形成细胞悬液，然后各取500µL细胞悬液分别移至2个低温冻存管中，程序性降温，降温完成后将冻存管放入-80℃深低温冰箱中，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。冻存类器官的复苏：提前打开水浴锅调至37℃，取出冻存管快速放入水浴锅内，不时摇动冻存管令其尽快融化，融化后吸取1mL液体至离心管内，加入10mL advanced DMEM/F12培养基，混匀后200g离心5min，弃去上清液，保留细胞沉淀；加入80µL advanced DMEM/F12重悬细胞沉淀，再加入80µL Matrigel，混匀，吸取80µL混合液至37℃条件下预热30min的6孔板中，设置1个副孔，将6孔板放入5%CO2的37℃细胞培养箱内培养，冻存类器官复苏完成。
实施例2类器官药敏实验
按照1:2的比例将AdDF+++和Matrigel混合制备混合胶，放入培养箱备用。将准备进行药敏实验的类器官用TrypLE Express消化5至10min后，12000rpm×5min离心，弃去上清，细胞沉淀用Dispase II分散酶孵育15min以去除Matrigel。获取类器官后，加入培养基重悬，使类器官数目达到20个/µL。用电动移液枪将重悬液（5µL/孔）铺入384孔板中，铺板时设置1个主孔2个副孔，并设置不含类器官的Matrigel铺板作为空白对照。铺板完成后培养48h，根据细胞状态决定是否加药。设置按5倍稀释含6个浓度的药物浓度梯度（50 µmol/L至0.016 µmol/L），同时设置加入等浓度的二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）作为阴性对照组。加药后第4天，检测细胞活力值（Cell viability），根据空白对照及阴性对照组检测结果进行标准化（图2）。以药物浓度的对数值（log(µM)）作为X轴,细胞活力值作为Y轴绘制得到散点图后（图3），使用GraphPad Prism 7.0软件根据非线性回归中的‘log(inhibitor) vs normalized response’方程进行曲线拟合，得出药物的半抑制浓度（Halfmaximal inhibition concentration, IC50）。
实施例3具体病例应用
患者A以“腹痛、肠梗阻入院”，入院完善相关检查，病理提示“肠道尤文氏肉瘤”，术前诊断为“肠道尤文氏肉瘤伴腹腔转移、肠梗阻”完善术前准备后予手术切除，术中切下肿瘤后由负责医师取材，按上述流程培养类器官，根据尤文氏肉瘤的既往化疗经验选择两组药物组合进行优化。两种药物组合分别为环磷酰胺+依托泊苷（浓度比1:1）、长春新碱+环磷酰胺+阿霉素（浓度比1:1）。两种组合进行药敏测试，测试结果提示类器官对“长春新碱+环磷酰胺+阿霉素”敏感，依据药敏结果选用化疗方案“长春新碱+环磷酰胺+阿霉素”，患者使用该方案化疗2个月后复查，腹腔转移灶部分消失，评估为：肿瘤部分缓解（PR）。

Claims (9)

1.构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、样本预处理：将切取的肿瘤组织用聚维酮碘溶液和0.9%氯化钠溶液依次冲洗2～3次后，放入含有5%青霉素/链霉素及2%promocin的RPMI 1640保存液中；
b、清洗：去除RPMI 1640保存液，将组织加入到含有1×Glutamax、10mM HEPES和5%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液中，振荡清洗，静置5min；此步骤应重复2~3次；
c、消化：去除步骤b中培养基，将清洗好的组织用剪刀剪碎至1mm×1mm大小，加入改良的DMEM/F12培养液，置入37℃水浴锅中消化60min，每隔15min剧烈振荡一次；
d、去除杂质：将消化后的组织悬浮液转移至离心管中，加入10mL AdDF+++清洗2～3次后，过滤，收集滤液；向滤液中加入红细胞裂解液，处理完成后加入AdDF+++，清洗，离心，弃掉上清，取沉淀物；
e、固化：在冰上进行，沉淀物用HEPES缓冲液清洗，重悬，加入Matrigel，充分混匀；吸取细胞悬浮液滴入到预热的培养板中，37℃条件下固化5min；
f、培养：将改良的DMEM/F12培养液加入固化后的Matrigel中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱内培养；每2~4天更换培养基，直至类器官大小超过200微米或类器官长满基质胶；
步骤f中，所述改良的DMEM/F12培养液以DMEM/F12培养液为基础，加入N-Acetylcysteine、EGF、FGF-10、FGF-basic、Y-27632、A-83-01、SB202190、Nicotinamide、PGE2、Noggin、 R-Spondin、HEPES、GlutaMAX、B27、N2、青霉素和链霉素。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤g、传代：去除培养液，PBS清洗，加入TrypLE Express，用移液枪吹打，将Matrigel打散，每隔10~15min吹打1次，直至类器官被消化成单个细胞；加入 1mL Advanced DMEM/F12培养基与TrypLE Express混合，200g离心5min，去除上清，将细胞沉淀用Advanced DMEM/F12 培养基重悬细胞，再加入Matrigel，充分混匀，进行传代培养，每2~4天更换培养基，每7～14天传代一次。
3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤h、冻存：离心收集步骤f培养或步骤g传代获得的类器官，加入类器官冻存液，形成细胞悬液，转移至低温冻存管中，程序性降温，降温完成后将冻存管放入-80℃深低温冰箱中，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤i、复苏：将冻存管至于37℃，间歇摇动冻存管令其尽快融化，融化后加入advanced DMEM/F12培养基，混匀后200g离心5min，弃去上清液，保留细胞沉淀；加入advanced DMEM/F12重悬细胞沉淀，再加入Matrigel，混匀，吸取混合液至37℃条件下预热30min的培养板中， 5%CO2的37℃细胞培养箱内培养，冻存类器官复苏完成。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤b中，所述DMEM/F12培养液中含有AdvancedDMEM/F12和AdDF+++。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤c中，所述改良的DMEM/F12培养液含0.5～1.0mg/mL 的II型Collagenase、500U/mL的IV 型Collagenase和10µM的RHO/ROCK pathwayinhibitor。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，经步骤c处理后仍未成功消化的组织可用TrypLE Express在37℃水浴锅中继续消化20min。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤d中，过滤参数为70µm；离心参数为300g×5min。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤e中，加入Matrigel充分混匀后，使细胞浓度为1×106/mL。
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