CN113481162A - 用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒 - Google Patents

用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及类器官培养领域，具体的，本发明涉及用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒。本发明提供的培养肿瘤类器官的培养基能够大大缩短肿瘤类器官的培养时间。本发明提供的快速培养肿瘤类器官的试剂盒，包括培养肿瘤类器官的培养基、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液，利用该试剂盒进行肿瘤类器官的培养，能够提高肿瘤类器官培养的成功率和存活率，并可在2‑5天快速建立类器官模型，可供后续实验测试应用。

Description

用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒
技术领域
本发明涉及类器官培养领域，具体的，本发明涉及用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒。
背景技术
目前，肿瘤发病率与死亡率逐年上升。2020年中国新发癌症病例457万例，癌症死亡病例300万例，肿瘤所造成的巨大经济、社会负担非常沉重。
手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及内分泌治疗是肿瘤治疗的主要手段。其中约70％的患者需要放化疗，但由于患者个体差异，肿瘤耐药或辐射抵抗是制约肿瘤成功治疗的重要因素。目前临床肿瘤药物整体有效率低(30％左右)，肿瘤不必要的治疗和没有效果的治疗造成巨大浪费。因此，肿瘤个性化治疗迫在眉睫。
类器官是一种在体外环境下培育而成的具备三维结构的微器官，拥有类似真实器官的复杂结构，并能部分模拟来源组织或器官的生理功能。目前，包括结直肠、前列腺、味蕾、食管、输卵管、肝脏、胰腺、胃、唾液腺和乳腺等在内的多个器官均成功在体外获得正常组织或肿瘤的类器官。
传统方法构建肿瘤类器官需从肿瘤组织提取肿瘤细胞，起始培养往往从单个细胞或小于30μm的细胞团开始，经过9-14天培养形成大于100μm符合实验要求的类器官模型。同时培养基生长因子成分及其在基质胶中扩散速率也是影响类器官生长的关键。
虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养为类器官，目前体外构建肿瘤类器官模型并以此模型进行药物或者辐射检测则需耗时1-3月，但是临床需求窗口期也就2-3周时间。这就需要加速体外类器官构建速度以满足临床需求。
因此，开发一种能够高效、快速培养、对多种肿瘤类器官的培养具有普适性的培养基以及试剂盒具有重要的科研和商业价值。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒，本发明提供的培养肿瘤类器官的培养基能够大大缩短肿瘤类器官的培养时间。本发明提供的快速培养肿瘤类器官的试剂盒，包括培养肿瘤类器官的培养基、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液，利用该试剂盒进行肿瘤类器官的培养，能够提高肿瘤类器官培养的成功率和存活率，并可在2-5天快速建立类器官模型，可供后续实验测试应用。
为此，本发明第一方面提供了一种用于培养肿瘤类器官的培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括培养基组分和添加剂组分，其中，所述培养基组分中含有无菌蛋清提取液。
现有的传统方法构建肿瘤类器官需从肿瘤组织提取肿瘤细胞，起始培养往往从单个细胞或小于30μm的细胞团开始，经过9-14天培养形成大于100μm符合实验要求的类器官模型。同时培养基生长因子成分及其在基质胶中扩散速率也是影响类器官生长的关键。虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养为类器官，目前体外构建肿瘤类器官模型并以此模型进行药物或者辐射检测则需耗时1-3月，但是临床需求窗口期也就2-3周时间。这就需要加速体外类器官构建速度以满足临床需求。发明人发现在培养肿瘤类器官的培养基中加入无菌蛋清提取液，有助于促进类器官生长，提高类器官生长速度。利用本发明提供的培养肿瘤类器官的培养基，能够培养来源于消化系统、呼吸系统、泌尿系统和生殖系统等多来样本来源的肿瘤组织。
根据本发明的实施例，在所述培养基中，所述无菌蛋清提取液的浓度为10-30％(v/v)。
根据本发明的实施例，所述无菌蛋清提取液的浓度为20-30％(v/v)。由此，能够进一步提高类器官生长速度。
根据本发明的实施例，所述无菌蛋清提取液是通过下列方式获得的：
(1)分离鸡蛋的蛋清，并将所述蛋清经滤网过滤，以便获得收集液，其中，所述滤网孔径为40-100μm；
(2)将所述收集液进行负压吸引过滤，以便获得所述无菌蛋清提取液。
根据本发明的实施例，在步骤(1)中，对所述蛋清进行至少一次滤网过滤，其中，在所述至少一次滤网过滤中滤网孔径依次减小。
例如，进行所述负压吸引过滤时，可以用0.22μm孔径的过滤器。
根据本发明的实施例，所述添加剂组分进一步包括bFGF、FGF4以及FGF10。
bFGF、FGF4以及FGF10的加入促进了细胞团的分化，由此以便获得所需组织形态的的类器官。
根据本发明的实施例，所述bFGF的浓度为10-500ng/ml，优选为10-100ng/ml。
根据本发明的实施例，所述FGF4的浓度为10-500ng/ml，优选为10-100ng/ml。
根据本发明的实施例，所述FGF10的浓度为10-500ng/ml，优选为10-100ng/ml。
根据本发明的实施例，所述添加剂组分进一步包括HEPES、GlutaMAX、B27、N2、N-乙酰半胱氨酸、EGF、gastrin I、A83-01、Forskolin、Y-27632dihydrochloride，以及任选的Wnt-3a、HGF、R-spondin-1、Noggin、烟酰胺、前列腺素E2、SB202190、CHIR99021。
根据本发明的实施例，所述HEPES的浓度为1-10mM。
根据本发明的实施例，所述GlutaMAX的浓度为1-5mM。
根据本发明的实施例，所述B27的浓度为1％-2％(v/v)。
根据本发明的实施例，所述N2的浓度为1％-2％(v/v)。
根据本发明的实施例，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1-1mM。
根据本发明的实施例，所述R-spondin-1的浓度为100-500ng/ml。
根据本发明的实施例，所述Noggin的浓度为10-500ng/ml，优选10-100ng/ml。
根据本发明的实施例，所述Wnt-3a的浓度为10-500ng/ml，优选10-100ng/ml。
根据本发明的实施例，所述EGF的浓度为10-200ng/ml。
根据本发明的实施例，所述烟酰胺的浓度为1-10mM。
根据本发明的实施例，所述gastrin I的浓度为1-20nM，优选5-10nM。
根据本发明的实施例，所述A83-01的浓度为100-1000nM，优选200-500nM。
根据本发明的实施例，所述前列腺素E2的浓度为1-100nM，优选1-20nM。
根据本发明的实施例，所述SB202190的浓度为1-20μM，优选5-10μM。
根据本发明的实施例，所述CHIR99021的浓度为1-10μM。
根据本发明的实施例，所述Forskolin的浓度为1-50μM，优选1-20μM。
根据本发明的实施例，所述HGF的浓度为10-500ng/ml，优选10-100ng/ml。
根据本发明的实施例，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM，优选5-10μM。
根据本发明的实施例，所述培养基组分进一步包括培养基Advanced DMEM/F12。
利用本发明的用于培养肿瘤类器官的培养基，培养基中各组分能加快类器官生长速度，可以节省类器官模型构建速度。缩短患者体外药物或辐射检测时间。
根据本发明的实施例，所述添加剂组分进一步包括青霉素、链霉素和两性霉素B混合液。
根据本发明的实施例，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
根据本发明的实施例，所述添加剂组分占所述培养基总体积的3％-5％。
根据本发明的实施例，所述肿瘤来源于消化系统、呼吸系统、泌尿系统和生殖系统。
所述肿瘤例如肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌等常见肿瘤。
本发明第二方面提供第一方面所述的培养基在培养肿瘤类器官中的用途。根据本发明的实施例，所述肿瘤类器官选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤类器官。
本发明第三方面提供一种培养肿瘤类器官的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
1)将肿瘤样本进行消化处理，以便获取肿瘤细胞团；
2)利用第一方面所述的培养基培养所述肿瘤细胞团，以便获取肿瘤类器官。
根据本发明的实施例，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
根据本发明的实施例，所述消化处理包括利用组织消化液对所述肿瘤样本进行消化，以便获取含有肿瘤细胞团的细胞悬液，
其中，所述组织消化液包括透明质酸酶以及Dispace type II。
根据本发明的实施例，所述组织消化液进一步包括胶原蛋白酶IV。
根据本发明的实施例，所述透明质酸酶的浓度为10-100μg/mL。
根据本发明的实施例，所述Dispace type II的浓度为100-2000μg/mL，优选50-200μg/mL。
根据本发明的实施例，所述胶原蛋白酶IV的浓度为100-1000U/mL。
根据本发明的实施例，所述组织消化液进一步包括培养基Advanced DMEM/F12、Y-27632dihydrochloride以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液。
根据本发明的实施例，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM。
根据本发明的实施例，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括在对所述肿瘤样本进行消化处理前，将所述肿瘤样本保存至组织保存液中，其中，所述组织保存液包括B27和Y-27632dihydrochloride。
根据本发明的实施例，所述组织保存液进一步包括HEPES、GlutaMAX、培养基Advanced DMEM/F12以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液。
根据本发明的实施例，所述B27的浓度为1％-2％(v/v)。
根据本发明的实施例，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM。
根据本发明的实施例，所述HEPES的浓度为1-10mM。
根据本发明的实施例，所述GlutaMAX的浓度为1-5mM。
根据本发明的实施例，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括在步骤1)中，获得所述含有肿瘤细胞团的细胞悬液后，将所述细胞悬液利用孔径为40-100μm的收集滤网进行过滤，并利用细胞团收集液反向冲洗所述收集滤网，以便获取所述肿瘤细胞团。
本发明使用细胞滤网过滤，并使用细胞团收集液能得到更大的细胞团，且能够维持细胞活性，可加速肿瘤类器官的构建。
根据本发明的实施例，所述细胞团收集液包括BSA。
根据本发明的实施例，所述细胞团收集液进一步包括Y-27632dihydrochloride、磷酸盐缓冲液以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液。
根据本发明的实施例，所述BSA的浓度为0.1％-1％(v/v)。
根据本发明的实施例，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM。
根据本发明的实施例，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
本发明第四方面提供一种组织消化液。根据本发明的实施例，所述组织消化液包括透明质酸酶以及Dispace type II。
本发明的组织消化液增含有多种消化酶，可减少组织消化时间，提高细胞活性，并增加细胞团得率。
根据本发明的实施例，所述组织消化液进一步包括胶原蛋白酶IV。
根据本发明的实施例，所述透明质酸酶的浓度为10-100μg/mL。
根据本发明的实施例，所述Dispace type II的浓度为100-2000μg/mL，优选50-200μg/mL。
根据本发明的实施例，所述胶原蛋白酶IV的浓度为100-1000U/mL。
根据本发明的实施例，所述组织消化液进一步包括培养基Advanced DMEM/F12、Y-27632dihydrochloride以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液。
根据本发明的实施例，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM。
根据本发明的实施例，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
本发明第五方面提供第四方面所述的组织消化液在消化肿瘤样本中的用途。根据本发明的实施例，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
本发明第六方面提供一种组织保存液。根据本发明的实施例，所述组织保存液包括B27和Y-27632dihydrochloride。
本发明提供的组织保存液含有肿瘤组织基础营养物质，能维持组织离体保存时活性；同时保存液含Y-27632dihydrochloride可抑制凋亡，增加肿瘤组织活率。
根据本发明的实施例，所述组织保存液进一步包括HEPES、GlutaMAX、培养基Advanced DMEM/F12以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液。
根据本发明的实施例，所述B27的浓度为1％-2％(v/v)。
根据本发明的实施例，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM。
根据本发明的实施例，所述HEPES的浓度为1-10mM。
根据本发明的实施例，所述GlutaMAX的浓度为1-5mM。
根据本发明的实施例，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
本发明第七方面提供第六方面所述的组织保存液在保存肿瘤样本中的用途。根据本发明的实施例，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
本发明第八方面提供一种细胞团收集液。根据本发明的实施例，所述细胞团收集液包括BSA。
根据本发明的实施例，所述细胞团收集液进一步包括Y-27632dihydrochloride、磷酸盐缓冲液以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液。
根据本发明的实施例，所述BSA的浓度为0.1％-1％(v/v)。
根据本发明的实施例，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM。
根据本发明的实施例，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
本发明第九方面提供第八方面所述的细胞团收集液在收集利用第四方面所述的组织消化液消化肿瘤样本获得的肿瘤细胞团中的用途。根据本发明的实施例，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
本发明第十方面提供一种培养肿瘤类器官的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第一方面所述的培养基，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括消化液、保存液、收集液中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述消化液为第四方面所述的组织消化液。
根据本发明的实施例，所述保存液为第六方面所述的组织保存液。
根据本发明的实施例，所述收集液为第八方面所述的细胞团收集液。
本发明第十一方面提供一种培养肿瘤类器官的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第四方面所述的组织消化液，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括培养基、保存液、收集液中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述培养基为第一方面所述的培养基。
根据本发明的实施例，所述保存液为第六方面所述的组织保存液。
根据本发明的实施例，所述收集液为第八方面所述的细胞团收集液。
本发明第十二方面提供一种培养肿瘤类器官的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第六方面所述的组织保存液，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括培养基、消化液、收集液中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述培养基为第一方面所述的培养基。
根据本发明的实施例，所述消化液为第四方面所述的组织消化液。
根据本发明的实施例，所述收集液为第八方面所述的细胞团收集液。
本发明第十三方面提供一种培养肿瘤类器官的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第八方面所述的细胞团收集液，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括培养基、消化液、保存液中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述培养基为第一方面所述的培养基。
根据本发明的实施例，所述消化液为第四方面所述的组织消化液。
根据本发明的实施例，所述保存液为第六方面所述的组织保存液。
本发明提供的试剂盒，大大缩短肿瘤类器官培养所需时间，提高肿瘤类器官培养的成功率和存活率，并能快速建立肿瘤类器官模型。本发明提供的快速培养肿瘤类器官的试剂盒，包括培养肿瘤类器官的培养基、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液，利用该试剂盒进行肿瘤类器官的培养，能够提高肿瘤类器官培养的成功率和存活率，并可在2-5天快速建立类器官模型，可供后续实验测试应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明实施例1中肠癌类器官形态结构图；
图2显示了本发明实施例2中肠癌类器官形态结构图；
图3显示了本发明实施例3中肝癌类器官组织形态结构图；
图4显示了本发明实施例4中肺癌类器官组织形态结构图；
图5显示了本发明实施例5中肾癌类器官组织形态结构图；
图6显示了本发明实施例6中乳腺癌类器官组织形态结构图；
图7显示了本发明实施例9中肠癌类器官cdx2免疫组化图；
图8显示了本发明实施例9中肠癌类器官ck20免疫组化图。
具体实施方式
根据本发明的一个具体的实施例，本发明提供的肿瘤类器官的快速建立及快速培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜来源的肿瘤手术切除标本或活检组织放装入预冷4℃的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)用手术刀将肿瘤组织切成5-10mm3大小，放入组织消化液中37℃震荡消化20-60分钟；
3)将步骤2)消化完成后的细胞悬液依次经100μm细胞滤网和40μm细胞滤网，用细胞团收集液反向冲洗40μm细胞滤网，得到直径为40-100μm细胞团后，离心去除上清，细胞团沉淀备用；
4)将快速增殖培养基与基质胶按1:1-1:2比例混合均匀后重悬步骤3)得到的细胞团沉淀，获得混有细胞的凝胶，将该凝胶接种；
5)待步骤4)的接种凝胶充分凝固后加入快速增殖培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养；
6)每隔2-3天更换一次快速增殖培养基，培养2-5天，得到肿瘤类器官。
根据本发明的一个具体的实施例，快速增殖培养基包括无菌蛋清提取液10-30％(v/v)，优选20-30％(v/v)；培养基Advanced DMEM/F12；bFGF，10-500ng/ml，优选为10-100ng/ml；FGF4，10-500ng/ml优选10-100ng/ml；FGF10，10-500ng/ml，优选10-100ng/ml；HEPES，1-10mM；GlutaMAX，1-5mM；B27，1％-2％(v/v)；N2，1％-2％(v/v)；N-乙酰半胱氨酸，0.1-1mM；EGF，10-200ng/ml；gastrin I，1-20nM，优选5-10nM；A83-01，100-1000nM，优选200-500nM；Forskolin，1-50μM，优选1-20μM；Y-27632dihydrochloride，1-20μM，优选5-10μM；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液，青霉素浓度100-200U/mL，链霉素浓度100-200μg/ml，两性霉素B浓度250–500ng/mL，以及任选的Wnt-3a，10-500ng/ml，优选10-100ng/ml；任选的HGF，10-500ng/ml，优选10-100ng/ml；任选的R-spondin-1，100-500ng/ml；任选的Noggin，10-500ng/ml，优选10-100ng/ml；任选的烟酰胺，1-10mM；任选的前列腺素E2，1-100nM，优选1-20nM；任选的SB202190，1-20nM，优选5-10nM；任选的CHIR99021，1-10μM。
根据本发明的一个具体的实施例，组织保存液包括B27，1％-2％(v/v)；Y-27632dihydrochloride，1-20μM；HEPES，1-10mM；GlutaMAX，1-5mM；Advanced DMEM/F12；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液，青霉素浓度100-200U/mL，链霉素浓度100-200μg/ml，两性霉素B浓度250–500ng/mL。
根据本发明的一个具体的实施例，组织消化液包括透明质酸酶，10-100μg/mL；Dispace type II，100-2000μg/mL，优选50-200μg/mL；胶原蛋白酶IV，100-1000U/mL；培养基Advanced DMEM/F12；Y-27632dihydrochloride，1-20μM；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液，青霉素浓度100-200U/mL，链霉素浓度100-200μg/ml，两性霉素B浓度250–500ng/mL。
根据本发明的一个具体的实施例，细胞团收集液包括BSA，0.1％-1％(v/v)；Y-27632dihydrochloride，1-20μM；磷酸盐缓冲液；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液，青霉素浓度100-200U/mL，链霉素浓度100-200μg/ml，两性霉素B浓度250–500ng/mL。
本发明中“任选的”是指其后的组分可以加入也可以不加入。
本发明中因子“bFGF”和“FGF basic”可进行同等替换。
快速增殖培养基、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液的具体组成以及用量可根据所要培养获得的肿瘤类器官类型进行适当调整。
根据本发明的一个具体的实施例，所述无菌蛋清提取液是通过下列方式获得的：
(1)分离鸡蛋的蛋清，并将所述蛋清经滤网过滤，以便获得收集液，其中，所述滤网孔径为40-100μm；
(2)将所述收集液进行负压吸引过滤，以便获得所述无菌蛋清提取液，
其中，在步骤(1)中，对蛋清进行至少一次滤网过滤，在至少一次滤网过滤中滤网孔径依次减小；进行所述负压吸引过滤时，所用的过滤器的孔径为0.2-0.3μm。
根据本发明的一个具体的实施例，所述无菌蛋清提取液是通过下列方式获得的：
取1-3天的新鲜鸡蛋，分离蛋清分别过100μm、70μm、40μm细胞滤网；收集液再经负压吸引过0.22μm滤器制得无菌蛋清提取液。
本发明中制备无菌蛋清提取液时所用的鸡蛋优选新鲜的鸡蛋，即1-3天的鸡蛋。
根据本发明的实施例，分离蛋清所用的滤网优选为孔径40-100μm的细胞滤网，优选将蛋清按照滤网孔径依次减小进行多次过滤，以便去除蛋清中的微生物。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
试剂来源：
本发明实施例采用的HEPES购自上海源培生物科技股份有限公司。
本发明实施例采用的GlutaMAX购自美国thermofisher公司。
本发明实施例采用的B27购自美国thermofisher公司。
本发明实施例采用的Y-27632dihydrochloride购自美国SellecK公司。
本发明实施例采用的Collegenase IV(胶原蛋白酶IV)购自美国thermofisher公司。
本发明实施例采用的Hyaluronidase(透明质酸酶)购自美国thermofisher公司。
本发明实施例采用的Dispace type II购自美国thermofisher公司。
本发明实施例采用的N2购自美国thermofisher公司。
本发明实施例采用的N-acetylcysteine(N-乙酰半胱氨酸)购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的R-spondin-1购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Noggin购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Wnt-3a购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的EGF购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Nicotinamide(烟酰胺)购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的gastrin I购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的A83-01购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的ProstaglandinE2(前列腺素E2)购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的SB202190购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的CHIR99021购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的bFGF(FGF basic)购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Forskolin购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的HGF购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的FGF4购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的FGF10购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的cdx2抗体购自Novus公司。
本发明实施例采用的ck20购自Abcam公司。
实施例1肠癌类器官培养
1、试剂配制
1)肿瘤类器官的快速增殖培养基:由培养基组分Advanced DMEM/F12、20％无菌蛋清提取液和特异性添加因子组成；特异性添加因子的组成：HEPES，10mM；GlutaMAX，2mM；1XB27，1:100(v/v)；1X N2，1:100(v/v)；N-acetylcysteine，1mM；R-spondin-1，500ng/ml；Noggin，100ng/ml；EGF，50ng/ml；Nicotinamide，10mM；gastrin I，10nM；A83-01，500nM；ProstaglandinE2，10nM；SB202190，5μM；FGF basic，50ng/ml；FGF4，50ng/ml；FGF10，10ng/ml；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)，1X；Y-27632dihydrochloride，10μM。添加因子占所述培养基总体积的4％。
2)无菌蛋清提取液
无菌蛋清提取液制备方法为：取1-3天的新鲜鸡蛋，分离蛋清分别过100μm、70μm、40μm细胞滤网；收集液再经负压吸引过0.22μm滤器制得无菌蛋清提取液。
3)组织保存液
组织保存液组成:Advanced DMEM/F12、10mM HEPES；2mM GlutaMAX；1X的B27(1:100(v/v))；10μM Y-27632dihydrochloride；1X青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)。
4)组织消化液
肿瘤组织消化液：包括基础培养基Advanced DMEM/F12、特异性添加因子和消化酶；其中，特异性添加因子包括：10μM Y-27632dihydrochloride；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)，1X；消化酶包括：500U/mL胶原蛋白酶IV；20μg/mL透明质酸酶；100μg/mL Dispace type II。
5)细胞团收集液
细胞团收集液：磷酸盐缓冲液、1％BSA和特异性添加因子。其中，特异性添加因子：10μM Y-27632dihydrochloride；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)。
2、肠癌类器官的培养方法
本实施例提供一种肠癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的肠癌手术切除标本装入预冷4℃的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
7)向细胞团沉淀加入5ml磷酸盐缓冲液重悬细胞团，细胞团悬液经40μm细胞滤网过滤；
8)将40μm细胞滤网倒扣于50ml离心管口，用20ml细胞团收集液从上方冲洗细胞滤网，收集细胞团；
9)将步骤8)收集好细胞团悬液的50ml离心管4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀备用；
10)取适量肿瘤类器官的快速增殖培养基与基质胶1:2混合，然后用混合液重悬步骤9)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到96孔板中，每滴10μl；
11)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置10min使胶凝固；
12)在培养皿内加入肿瘤类器官的快速增殖培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；
13)每隔2-3天更换一次培养基，培养2-5天得到肠癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构呈球形细胞团如图1所示。
实施例2肠癌类器官的培养
1、试剂配制
1)肿瘤类器官的快速增殖培养基：由培养基组分Advanced DMEM/F12、20％无菌蛋清提取液和特异性添加因子组成；特异性添加因子的组成：HEPES，10mM；GlutaMAX，2mM；1XB27，1:100(v/v)；1X N2，1:100(v/v)；N-acetylcysteine，1mM；R-spondin-1，500ng/ml；Noggin，100ng/ml；EGF，50ng/ml；Nicotinamide，10mM；gastrin I，10nM；A83-01，500nM；ProstaglandinE2，10nM；SB202190，5μM；FGF basic，50ng/ml；FGF4，50ng/ml；FGF10，10ng/ml；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)，1X；Y-27632dihydrochloride，10μM。添加因子占所述培养基总体积的4％。
无菌蛋清提取液、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液组成同实施例1。
2、肠癌类器官的培养方法
本实施例提供一种肠癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的肠癌肠镜活检标本装入预冷4℃的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
7)向细胞团沉淀加入5ml磷酸盐缓冲液重悬细胞团，细胞团悬液经40μm细胞滤网过滤；
8)将40μm细胞滤网倒扣于50ml离心管口，用20ml细胞团收集液从上方冲洗细胞滤网，收集细胞团；
9)将步骤8)收集好细胞团悬液的50ml离心管4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀备用；
10)取适量肿瘤类器官的快速增殖培养基与基质胶1：2混合，然后用混合液重悬步骤9)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到96孔板中，每滴10μl；
11)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置10min使胶凝固；
12)在培养皿内加入肿瘤类器官的快速增殖培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；
13)每隔2-3天更换一次培养基，培养2-5天得到肠癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构呈球形细胞团如图2所示。
实施例3肝癌类器官的培养
1、试剂配制
1)肿瘤类器官的快速增殖培养基：由培养基组分Advanced DMEM/F12、30％无菌蛋清提取液和特异性添加因子组成；特异性添加因子的组成：HEPES，10mM；GlutaMAX，2mM；1XB27，1:100(v/v)；1X N2，1:100(v/v)；N-acetylcysteine，1mM；R-spondin-1，500ng/ml；EGF，50ng/ml；gastrin I，10nM；A83-01，500nM；Forskolin，10μM；FGF basic，50ng/ml；FGF4，50ng/ml；FGF10，100ng/ml；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)，1X；Y-27632dihydrochloride，10μM。添加因子占所述培养基总体积的4％。
无菌蛋清提取液、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液组成同实施例1。
2、肝癌类器官的培养方法
本实施例提供一种肝癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的肝癌手术切除标本装入预冷4℃的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
7)向细胞团沉淀加入5ml磷酸盐缓冲液重悬细胞团，细胞团悬液经40μm细胞滤网过滤；
8)将40μm细胞滤网倒扣于50ml离心管口，用20ml细胞团收集液从上方冲洗细胞滤网，收集细胞团；
9)将步骤8)收集好细胞团悬液的50ml离心管4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀备用；
10)取适量肿瘤类器官的快速增殖培养基与基质胶1：2混合，然后用混合液重悬步骤9)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到96孔板中，每滴10μl；
11)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置10min使胶凝固；
12)在培养皿内加入肿瘤类器官的快速增殖培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；
13)每隔2-3天更换一次培养基，培养2-5天得到肝癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态呈球形细胞团结构如图3所示。
实施例4肺癌类器官的培养
1、试剂配制
1)肿瘤类器官的快速增殖培养基:由培养基组分Advanced DMEM/F12、20％无菌蛋清提取液和特异性添加因子组成；特异性添加因子的组成：HEPES，10mM；GlutaMAX，2mM；1XB27，1:100(v/v)；1X N2，1:100(v/v)；N-acetylcysteine，1mM；EGF，50ng/ml；gastrin I，10nM；A83-01，500nM；CHIR99021 5μM；SB202190，5μM；FGF basic，100ng/ml；FGF4，50ng/ml；FGF10，50ng/ml；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)，1X；Y-27632dihydrochloride，10μM。添加因子占所述培养基总体积的4％。
无菌蛋清提取液、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液组成同实施例1。
2、肺癌类器官的培养方法
本实施例提供一种肺癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的肺癌手术切除标本装入预冷4℃的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
7)向细胞团沉淀加入5ml磷酸盐缓冲液重悬细胞团，细胞团悬液经40μm细胞滤网过滤；
8)将40μm细胞滤网倒扣于50ml离心管口，用20ml细胞团收集液从上方冲洗细胞滤网，收集细胞团；
9)将步骤8)收集好细胞团悬液的50ml离心管4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀备用；
10)取适量肿瘤类器官的快速增殖培养基与基质胶1：2混合，然后用混合液重悬步骤9)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到96孔板中，每滴10μl。
11)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置10min使胶凝固；
12)在培养皿内加入肿瘤类器官的快速增殖培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；
13)每隔2-3天更换一次培养基，培养2-5天得到肺癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态呈球形细胞团结构如图4所示。
实施例5肾癌类器官的培养
1、试剂配制
1)肿瘤类器官的快速增殖培养基：由培养基组分Advanced DMEM/F12、30％无菌蛋清提取液和特异性添加因子组成；特异性添加因子的组成：HEPES，10mM；GlutaMAX，2mM；B27，1X；N2，1X；N-acetylcysteine，1mM；EGF，50ng/ml；gastrin I，10nM；A83-01，500nM；FGFbasic，50ng/ml；FGF4，50ng/ml；FGF10，50ng/ml；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)，1X；Y-27632dihydrochloride，10μM。添加因子占所述培养基总体积的4％。
无菌蛋清提取液、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液组成同实施例1。
2、肾癌类器官的培养方法
本实施例提供一种肾癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的肾癌手术切除标本装入预冷4℃的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
7)向细胞团沉淀加入5ml磷酸盐缓冲液重悬细胞团，细胞团悬液经40μm细胞滤网过滤；
8)将40μm细胞滤网倒扣于50ml离心管口，用20ml细胞团收集液从上方冲洗细胞滤网，收集细胞团；
9)将步骤8)收集好细胞团悬液的50ml离心管4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀备用。
10)取适量肿瘤类器官的快速增殖培养基与基质胶1：2混合，然后用混合液重悬步骤9)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到96孔板中，每滴10μl；
11)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置10min使胶凝固；
12)在培养皿内加入肿瘤类器官的快速增殖培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；
13)每隔2-3天更换一次培养基，培养2-5天得到肾癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构呈球形细胞团如图5所示。
实施例6乳腺癌类器官的培养
1、试剂配制
1)肿瘤类器官的快速增殖培养基：由培养基组分Advanced DMEM/F12、30％无菌蛋清提取液和特异性添加因子组成；特异性添加因子的组成：HEPES，10mM；GlutaMAX，2mM；1XB27，1:100(v/v)；1X N2，1:100(v/v)；N-acetylcysteine，1mM；R-spondin-1，500ng/ml；Noggin，10ng/ml；EGF，50ng/ml；Nicotinamide，10mM；gastrin I，10nM；A83-01，500nM；ProstaglandinE2，10nM；+，10μM；FGF basic，10ng/ml；FGF4，50ng/ml；FGF10，100ng/ml；青霉素、链霉素和两性霉素B混合液(100U/mL青霉素，100μg/ml链霉素，250ng/mL两性霉素B)，1X；Y-27632dihydrochloride，10μM。添加因子占所述培养基总体积的4％。
无菌蛋清提取液、组织保存液、组织消化液、细胞团收集液组成同实施例1。
2、乳腺癌类器官的培养方法
本实施例提供一种乳腺癌类器官的培养方法，包括：
1)将新鲜的乳腺癌手术切除标本装入预冷4℃的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
7)向细胞团沉淀加入5ml磷酸盐缓冲液重悬细胞团，细胞团悬液经40μm细胞滤网过滤；
8)将40μm细胞滤网倒扣于50ml离心管口，用20ml细胞团收集液从上方冲洗细胞滤网，收集细胞团；
9)将步骤8)收集好细胞团悬液的50ml离心管4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀备用；
10)取适量肿瘤类器官的快速增殖培养基与基质胶1：2混合，然后用混合液重悬步骤9)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到96孔板中，每滴10μl；
11)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置10min使胶凝固；
12)在培养皿内加入肿瘤类器官的快速增殖培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；
13)每隔2-3天更换一次培养基，培养2-5天得到乳腺癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构呈球形细胞团如图6所示。
实施例7肠癌组织消化后细胞活性检测
肠癌组织消化后细胞活性检测方法如下：
1)将新鲜的肠癌手术切除标本装入预冷4℃的实施例1的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml实施例1的组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀。
7)将细胞团用1ml磷酸盐缓冲液重悬，取20μL细胞团悬液加入20μL等体积含5μM钙黄绿素和5μM碘化丙啶，混合液经荧光细胞计数仪检测。
实施例8肠癌组织消化后细胞团大小检测：
肠癌组织消化后细胞团大小检测方法如下：
1)将新鲜的肠癌手术切除标本装入预冷4℃的实施例1的组织保存液中保存，24小时内送入实验室预处理；
2)样本清洗：将组织转入50ml离心管中，然后用20ml含1％青霉素、链霉素和两性霉素B混合液的磷酸盐缓冲液震荡清洗5分钟去除组织表面的杂质；
3)样本切碎：在生物安全柜中，将样本转移至10cm培养皿，用手术刀在冰上操作将组织剪碎至5-10mm3大小；
4)将切碎后的组织转移至15ml离心管，加入10ml实施例1的组织消化液在37℃震荡消化30分钟；
5)消化结束后，加入5ml磷酸盐缓冲液终止消化，然后经100μm细胞滤网过滤至50ml离心管中；
6)过滤后的细胞液4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
7)向细胞团沉淀加入5ml磷酸盐缓冲液重悬细胞团，细胞团悬液经40μm细胞滤网过滤；
8)将40μm细胞滤网倒扣于50ml离心管口，用20ml实施例1的细胞团收集液从上方冲洗细胞滤网，收集细胞团；
9)将步骤8)收集好细胞团悬液的50ml离心管4℃600rpm离心5分钟，去除上清得到细胞团沉淀；
10)将步骤9)得到的细胞团用1ml磷酸盐缓冲液重悬，得到细胞悬液。
11)取3次10μL细胞悬液滴于载玻片上放于光学显微镜下拍照，使用Image J软件进行图像分析，记录单个细胞和细胞团大小及数量。
实施例9肠癌类器官鉴定
将实施例2获得肠癌类器官进行石蜡包埋切片制备。将包埋好的类器官进行切片，然后进行免疫组化染色观察。
1)固定：投入预先配好的固定液中(4％的甲醛固定)固定0.5小时。培养孔中吸去4％的甲醛固定液，加入500ul 70％酒精浸泡10分钟；
2)脱水：吸去70％酒精溶液，用眼科镊将含有肠癌类器官的基质胶挑出，放入包埋固定盒内。包埋固定盒放入自动脱水机内依次：70％酒精30分钟2次、95％酒精30分钟2次、100％酒精30分钟2次、二甲苯30分钟2次、60℃石蜡溶液2小时2次；
3)包埋：用包埋模具包类器官，然后切片机切成3-5μm的切片贴于防脱载玻片；
4)烤片：将载玻片放置于烤片机上，42℃，8小时，56℃，1小时；
5)脱蜡：载玻片分别经二甲苯5分钟2次、100％酒精2次、95％酒精2次、70％酒精2次脱蜡；
6)抗原修复：载玻片脱蜡后在清水中冲洗2分钟，加入3％H2O2中浸泡10分钟，清水中洗2分钟2次，加入柠檬酸缓冲液，放入蒸锅蒸煮20分钟，冷却至室温；
7)封闭：柠檬酸缓冲液倒掉，将载玻片置于PBS中5分钟洗2次，擦干组织周围的PBS液，加驴血清；
8)加一抗：吸去驴血清、加入一抗(cdx2，1:100；ck20，1:100)4℃冰箱中孵育过夜；
9)加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5分钟，擦干组织周围的PBS后加上二抗室温孵育30分钟；
10)显色：将载玻片放入PBS中洗3次，每次5分钟擦干组织周围的PBS后加上显色剂。待显色后及时放入PBS中洗5分钟；
11)复染：载玻片浸泡于苏木精中染色5分钟；
12)脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精2分钟2次、95％酒精2分钟2次、100％酒精2分钟2次、二甲苯2分钟2次；
13)封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，放于37℃烤片机上2小时晾干；
14)拍照：载玻片于显微镜下观察并拍照，如图7、图8所示，组织标志物cdx2阳性，ck20阳性，说明采用本发明的培养方法成功获得了肠癌类器官。
对比例1组织保存液组成探究
本对比例提供的组织保存液中去掉B27，其他组成同实施例1。
按照实施例7方法进行肠癌细胞消化后活性检测，比较实施例1和对比例1的组成保存液中保存的肠癌组织中细胞活性。表1结果显示，实施例1中组织保存液的活细胞率显著优于对比例1，这说明在组织保存液中添加B27有助于提高细胞活性。
表1
对比项 细胞总数 活细胞数量 活细胞比例
实施例1 5.2×10<sup>5</sup>个 4.5×10<sup>5</sup>个 86.54％
对比例1 5.1×10<sup>5</sup>个 3.7×10<sup>5</sup>个 72.55％
对比例2组织保存液组成探究
本对比例提供的组织保存液中去掉Y-27632dihydrochloride，其他组成同实施例1。
按照实施例7方法进行肠癌细胞消化后活性检测，比较实施例1和对比例2的组成保存液中保存的肠癌组织中细胞活性。表2结果显示，实施例1的活细胞率显著优于对比例2，这说明在组织保存液中添加Y-27632dihydrochloride有助于提高细胞活性。
表2
对比项 细胞总数 活细胞数量 活细胞比例
实施例1 5.2×10<sup>5</sup>个 4.5×10<sup>5</sup>个 86.54％
对比例2 4.9×10<sup>5</sup>个 2.8×10<sup>5</sup>个 57.14％
对比例3组织消化液组成探究
本对比例提供的组织消化液中去掉透明质酸酶，其他组成同实施例1。
按照实施例8方法进行肠癌组织消化后细胞团大小检测。比较实施例1和对比例3的组织保存液中保存的细胞团大小。表3结果显示，实施例1的细胞团数量显著优于对比例3，这说明在组织消化液中添加透明质酸酶有助于提高细胞团得率。
表3
对比项 细胞团数量 平均大小
实施例1 84个 65μm
对比例3 27个 52μm
对比例4组织消化液组成探究
本对比例提供的组织消化液中去掉Dispace type II，其他组成同实施例1。
按照实施例8方法进行肠癌组织消化后细胞团大小检测。比较实施例1和对比例4的组织保存液中保存的细胞团大小。表4结果显示，实施例1的细胞团数量显著优于对比例4，这说明在组织保存液中添加Dispace type II有助于提高细胞团得率。
表4
对比项 细胞团数量 平均大小
实施例1 84个 65μm
对比例4 19个 48μm
对比例5细胞团收集液组成探究
本对比例提供的细胞团收集液中去掉BSA，其他组成同实施例1。
按照实施例8方法进行肠癌组织消化后细胞团大小检测。比较实施例1和对比例5的细胞团大小。表5结果显示，实施例1的细胞团数量显著优于对比例5，这说明在细胞团收集液中添加BSA有助于提高细胞团得率。
表5
对比项 细胞团数量 平均大小
实施例1 75个 72μm
对比例5 59个 55μm
对比例6肿瘤类器官快速增殖培养基组成探究
本对比例提供的肿瘤类器官快速增殖培养基中去掉无菌蛋清提取液、bFGF、FGF4、FGF10，其他组成同实施例1中肿瘤类器官快速增殖培养基。
对比例7肿瘤类器官快速增殖培养基组成探究
本对比例提供的肿瘤类器官快速增殖培养基中去掉bFGF、FGF4、FGF10，其他组成同实施例1中肿瘤类器官快速增殖培养基。
对比例8肿瘤类器官快速增殖培养基组成探究
本对比例提供的肿瘤类器官快速增殖培养基中去掉无菌蛋清提取液，其他组成同实施例1中肿瘤类器官快速增殖培养基。
使用实施例1以及对比例6-8肿瘤类器官快速增殖培养基按照实施例1方法进行肠癌类器官培养。培养3天后3个复孔在光学显微镜下拍照，用Image J软件进行类器官数量及大小测量。
结果显示，对比例6为传统肠癌培养基配方，在此基础上添加无菌蛋清提取液获得对比例7中培养基，对比例7类器官大小显著优于对比例6，这说明在培养基中添加无菌蛋清提取液有助于提高类器官生长速度。
对比例7中类器官形态为去分化型，生长迅速，与对比例6和体内肿瘤组织形态不同，在此基础上添加分化因子bFGF(FGF basic)、FGF4、FGF10获得实施例1中培养基，培养类器官与对比例6和体内组织形态相似。
对比例8在传统肠癌培养基中添加bFGF、FGF4、FGF10则表现为抑制肠癌类器官生长。
表6
对比项 类器官平均数量 平均大小
实施例1 66个 102μm
对比例6 57个 84μm
对比例7 68 105μm
对比例8 45个 77μm
综上，本发明的肿瘤类器官快速培养试剂盒适用广泛，能够培养来源于消化系统、呼吸系统、泌尿系统和生殖系统等多来样本源的肿瘤组织。试剂盒中各组分能提高肿瘤细胞团得率，并加快类器官生长速度。可以节省类器官模型构建速度。缩短患者体外药物或辐射检测时间。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (30)

1.一种用于培养肿瘤类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括培养基组分和添加剂组分，其中，所述培养基组分中含有无菌蛋清提取液。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述无菌蛋清提取液的浓度为10-30％(v/v)；
任选地，所述无菌蛋清提取液的浓度为20-30％(v/v)。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述无菌蛋清提取液是通过下列方式获得的：
(1)分离鸡蛋的蛋清，并将所述蛋清经滤网过滤，以便获得收集液，其中，所述滤网孔径为40-100μm；
(2)将所述收集液进行负压吸引过滤，以便获得所述无菌蛋清提取液；
任选地，在步骤(1)中，对所述蛋清进行至少一次滤网过滤，其中，在所述至少一次滤网过滤中滤网孔径依次减小。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加剂组分进一步包括bFGF、FGF4以及FGF10；
任选地，所述bFGF的浓度为10-500ng/ml，优选为10-100ng/ml；
任选地，所述FGF4的浓度为10-500ng/ml，优选为10-100ng/ml；
任选地，所述FGF10的浓度为10-500ng/ml，优选为10-100ng/ml。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述添加剂组分进一步包括HEPES、GlutaMAX、B27、N2、N-乙酰半胱氨酸、EGF、gastrin I、A83-01、Forskolin、Y-27632dihydrochloride，以及任选的Wnt-3a、HGF、R-spondin-1、Noggin、烟酰胺、前列腺素E2、SB202190、CHIR99021；
任选地，所述HEPES的浓度为1-10mM；
任选地，所述GlutaMAX的浓度为1-5mM；
任选地，所述B27的浓度为1％-2％(v/v)；
任选地，所述N2的浓度为1％-2％(v/v)；
任选地，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1-1mM；
任选地，所述R-spondin-1的浓度为100-500ng/ml；
任选地，所述Noggin的浓度为10-500ng/ml，优选10-100ng/ml；
任选地，所述Wnt-3a的浓度为10-500ng/ml，优选10-100ng/ml；
任选地，所述EGF的浓度为10-200ng/ml；
任选地，所述烟酰胺的浓度为1-10mM；
任选地，所述gastrin I的浓度为1-20nM，优选5-10nM；
任选地，所述A83-01的浓度为100-1000nM，优选200-500nM；
任选地，所述前列腺素E2的浓度为1-100nM，优选1-20nM；
任选地，所述SB202190的浓度为1-20μM，优选5-10μM；
任选地，所述CHIR99021的浓度为1-10μM；
任选地，所述Forskolin的浓度为1-50μM，优选1-20μM；
任选地，所述HGF的浓度为10-500ng/ml，优选10-100ng/ml；
任选地，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM，优选5-10μM。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基组分进一步包括培养基Advanced DMEM/F12；
任选地，所述添加剂组分进一步包括青霉素、链霉素和两性霉素B混合液；
任选地，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
7.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述添加剂组分占所述培养基总体积的3％-5％；
任选地，所述肿瘤来源于消化系统、呼吸系统、泌尿系统和生殖系统。
8.权利要求1-7中任一项所述的培养基在培养肿瘤类器官中的用途，其特征在于，所述肿瘤类器官选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤类器官。
9.一种培养肿瘤类器官的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)将肿瘤样本进行消化处理，以便获取肿瘤细胞团；
2)利用权利要求1-7中任一项所述的培养基培养所述肿瘤细胞团，以便获取肿瘤类器官；
任选地，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述消化处理包括利用组织消化液对所述肿瘤样本进行消化，以便获取含有肿瘤细胞团的细胞悬液，
其中，所述组织消化液包括透明质酸酶以及Dispace type II；
任选地，所述组织消化液进一步包括胶原蛋白酶IV；
任选地，所述透明质酸酶的浓度为10-100μg/mL；
任选地，所述Dispace type II的浓度为100-2000μg/mL，优选50-200μg/mL；
任选地，所述胶原蛋白酶IV的浓度为100-1000U/mL。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述组织消化液进一步包括培养基Advanced DMEM/F12、Y-27632dihydrochloride以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液；
任选地，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM；
任选地，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在对所述肿瘤样本进行消化处理前，将所述肿瘤样本保存至组织保存液中，其中，所述组织保存液包括B27和Y-27632dihydrochloride；
任选地，所述组织保存液进一步包括HEPES、GlutaMAX、培养基Advanced DMEM/F12以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液；
任选地，所述B27的浓度为1％-2％(v/v)；
任选地，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM；
任选地，所述HEPES的浓度为1-10mM；
任选地，所述GlutaMAX的浓度为1-5mM；
任选地，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在步骤1)中，获得所述含有肿瘤细胞团的细胞悬液后，将所述细胞悬液利用孔径为40-100μm的收集滤网进行过滤，并利用细胞团收集液反向冲洗所述收集滤网，以便获取所述肿瘤细胞团；
任选地，所述细胞团收集液包括BSA；
任选地，所述细胞团收集液进一步包括Y-27632dihydrochloride、磷酸盐缓冲液以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液；
任选地，所述BSA的浓度为0.1％-1％(v/v)；
任选地，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM；
任选地，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
14.一种组织消化液，其特征在于，所述组织消化液包括透明质酸酶以及Dispace typeII。
15.根据权利要求14所述的组织消化液，其特征在于，所述组织消化液进一步包括胶原蛋白酶IV；
任选地，所述透明质酸酶的浓度为10-100μg/mL；
任选地，所述Dispace type II的浓度为100-2000μg/mL，优选50-200μg/mL；
任选地，所述胶原蛋白酶IV的浓度为100-1000U/mL。
16.根据权利要求14所述的组织消化液，其特征在于，所述组织消化液进一步包括培养基Advanced DMEM/F12、Y-27632dihydrochloride以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液；
任选地，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM；
任选地，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
17.权利要求14-16中任一项所述的组织消化液在消化肿瘤样本中的用途，其特征在于，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
18.一种组织保存液，其特征在于，所述组织保存液包括B27和Y-27632dihydrochloride。
19.根据权利要求18所述的组织保存液，其特征在于，所述组织保存液进一步包括HEPES、GlutaMAX、培养基Advanced DMEM/F12以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液；
任选地，所述B27的浓度为1％-2％(v/v)；
任选地，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM；
任选地，所述HEPES的浓度为1-10mM；
任选地，所述GlutaMAX的浓度为1-5mM；
任选地，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
20.权利要求18或19所述的组织保存液在保存肿瘤样本中的用途，其特征在于，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
21.一种细胞团收集液，其特征在于，所述细胞团收集液包括BSA；
任选地，所述细胞团收集液进一步包括Y-27632dihydrochloride、磷酸盐缓冲液以及任选的青霉素、链霉素和两性霉素B混合液；
任选地，所述BSA的浓度为0.1％-1％(v/v)；
任选地，所述Y-27632dihydrochloride的浓度为1-20μM；
任选地，所述青霉素、链霉素和两性霉素B混合液中所述青霉素浓度为100-200U/mL；所述链霉素浓度为100-200μg/ml；所述两性霉素B的浓度为250–500ng/mL。
22.权利要求21所述的细胞团收集液在收集利用权利要求14-16中任一项所述的组织消化液消化肿瘤样本获得的肿瘤细胞团中的用途，其特征在于，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤。
23.一种培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7中任一项所述的培养基，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤；
任选地，所述试剂盒进一步包括消化液、保存液、收集液中的至少之一。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述消化液为权利要求14-16中任一项所述的组织消化液；
任选地，所述保存液为权利要求18或19所述的组织保存液；
任选地，所述收集液为权利要求21所述的细胞团收集液。
25.一种培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求14-16中任一项所述的组织消化液，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤；
任选地，所述试剂盒进一步包括培养基、保存液、收集液中的至少之一。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，所述培养基为权利要求1-7中任一项所述的培养基，
任选地，所述保存液为权利要求18或19所述的组织保存液；
任选地，所述收集液为权利要求21所述的细胞团收集液。
27.一种培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求18或19所述的组织保存液，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤；
任选地，所述试剂盒进一步包括培养基、消化液、收集液中的至少之一。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其特征在于，所述培养基为权利要求1-7中任一项所述的培养基，
任选地，所述消化液为权利要求14-16中任一项所述的组织消化液；
任选地，所述收集液为权利要求21所述的细胞团收集液。
29.一种培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求21所述的细胞团收集液，所述肿瘤选自与消化系统、呼吸系统、泌尿系统或生殖系统相关的肿瘤；
任选地，所述试剂盒进一步包括培养基、消化液、保存液中的至少之一。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于，所述培养基为权利要求1-7中任一项所述的培养基，
任选地，所述消化液为权利要求14-16中任一项所述的组织消化液；
任选地，所述保存液为权利要求18或19所述的组织保存液。
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