CN114807039A - 一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法 - Google Patents

一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114807039A
CN114807039A CN202210707805.4A CN202210707805A CN114807039A CN 114807039 A CN114807039 A CN 114807039A CN 202210707805 A CN202210707805 A CN 202210707805A CN 114807039 A CN114807039 A CN 114807039A
Authority
CN
China
Prior art keywords
esophageal cancer
culture
organoid
concentration
cancer tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210707805.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114807039B (zh
Inventor
刘松
邢华杨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd filed Critical Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd
Priority to CN202210707805.4A priority Critical patent/CN114807039B/zh
Publication of CN114807039A publication Critical patent/CN114807039A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114807039B publication Critical patent/CN114807039B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/345—Gastrin; Cholecystokinins [CCK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法。所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，其特征在于，所述特异性添加因子包括使用浓度为10~100μmol/L的RKI‑1447和1~6mmol/L的Zeaxanthin dipalmitate。本发明食管癌原代类器官培养液中添加了RKI‑1447，作为一种ROCK特异性抑制剂，能抑制分离的食管癌原代类器官的凋亡，提高培养的成功率和食管癌类器官的生长速率。本发明培养基中加入Zeaxanthin dipalmitate，作为细胞膜表面脂肪连接蛋白，促进了类器官细胞膜间的信息交流，维持培养过程中微环境的稳定，参与细胞营养代谢，提高食管癌类器官的数量和活率。RKI‑1447和Zeaxanthin dipalmitate相互之间具有协同作用，能够显著提高类器官生成数量和活率。

Description

一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，特别是涉及一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法。
背景技术
食管癌是一种高度恶性的癌症，研究食管癌最常用的模型是细胞系和患者衍生异种移植（PDX）。这两个模型系统均有相当大的缺点。肿瘤细胞系在培养过程中发生突变，无法很好的模拟肿瘤的原始特征。此外，细胞培养无法模拟肿瘤细胞和其他基质细胞在体内的相互作用，因为培养的细胞是单一的，缺乏不同细胞类型的层次结构。PDX具有广泛的应用，然而不能充分反映人类肿瘤的遗传特征和异质性。PDX耗时、费力、培养周期长、低效和高通量药物筛选工作困难。
类器官具有传代稳定、操作相对简单、培养周期短等优点。同时能够长期保持细胞的基因组稳定性，保留原肿瘤的许多关键特征，因此作为研究食管癌的发生机制是一个很好的要体外研究模型。
比如，公开号为CN113943755A的发明申请公开了一种原位原发的食管癌肿瘤模型制备方法，通过将小鼠食管细胞以特定培养基培养成类器官，再将类器官进行基因编辑，注射回小鼠食管，使其发展成肿瘤。其中将小鼠食管细胞以特定培养基培养成类器官的步骤包括如下步骤：将小鼠食管原代细胞与蛋白浓度为8-12mg/ml的Matrigel混合，待Matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；所述培养基是DMEM/F12，加如下细胞因子中的12~13种得到：B27、EGF、R-spondin1、FGF-10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、Wnt-3a、N2，其中Gastrin、N2和Y-27632不可缺少。
然而，目前食管癌类器官的研究较少，培养条件尚未统一。食管癌类器官在培养过程中的通常容易发生凋亡，导致培养失败。
小分子化合物RKI-1447（CAS No.：1342278-01-6；分子式：C16H14N4O2S；分子量：326.37296），作为高效的ROCK1和ROCK2的小分子抑制剂，不但具有较强的抗氧化作用，而且能抑制分离的食管癌原代类器官的凋亡，提高培养的成功率和食管癌类器官的生长速率。
公开号为CN106190980A的发明申请公开了一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法。所述专用培养基包括受体酪氨酸激酶配体、Rho相关的卷曲蛋白激酶（ROCK1和ROCK2）抑制剂、维生素和激素、抗氧化剂和抑制细胞分化的通路的激动剂。其中，所述Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂包括Fasudil、Y-27632、RKI-1447和GSK429286A中的一种或多种。
另外，Zeaxanthin dipalmitate（CAS No.：144-67-2）作为脂联素受体，是一种枸杞衍生的类胡萝卜素，具有抗氧化应激作用，在抑制细胞凋亡方面发挥着积极作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中食管癌类器官在培养过程中的通常容易发生凋亡，培养成功率低，原有方法培养周期长，类器官生长缓慢的问题，本发明提供一种能够提高食管癌类器官培养成功率和类器官形成数量，缩短培养周期的食管癌类器官培养基和培养方法。
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法。
一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括使用浓度为10~110μmol/L的RKI-1447和1~6mmol/L的Zeaxanthindipalmitate。
优选的，RKI-1447的使用浓度为40~100μmol/L；Zeaxanthin dipalmitate的使用浓度为2~5mmol/L。更优选的，RKI-1447的使用浓度为60~100μmol/L；Zeaxanthindipalmitate的使用浓度为2~5mmol/L。进一步优选的，RKI-1447的使用浓度为80~100μmol/L；Zeaxanthin dipalmitate的使用浓度为3~5mmol/L。最优选的，RKI-1447的使用浓度为100μmol/L；Zeaxanthin dipalmitate的使用浓度为5mmol/L。
优选的，所述特异性添加因子还包括：
2mmol/L Glutamax，10mmol/L HEPES，1mmol/L N-acetylcysteine，10mmol/LNicotinamide，0.1mg/mL Penicillin-Streptomycin，1×B27，10mmol/L SB202190，500nmol/L A8301，100μmol/L Gastrin，100ng/mL R-spondin1，100ng/mL Noggin，50ng/mLEGF。
优选的，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。
本发明又提供了一种食管癌肿瘤类器官的培养方法，使用所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，具体包括以下步骤：
（1）取新鲜的食管癌组织，清洗；
（2）将步骤（1）所得食管癌组织剪碎、消化处理，过滤获得分离的细胞；
（3）将步骤（2）分离的细胞使用Matrigel胶重悬，接种到培养孔中，待Matrigel胶凝固后，加入所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，培养获得食管癌肿瘤类器官。
其中，步骤（3）中培养时2~3天换液一次，培养10~12天后传代。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
在肿瘤类器官培养过程中，肿瘤代谢旺盛，会产生氧自由基并对细胞造成伤害，降低细胞活力，引起分化、凋亡。本发明食管癌原代类器官培养液中添加了RKI-1447，作为一种ROCK特异性抑制剂，能抑制分离的食管癌原代类器官的凋亡，提高培养的成功率和食管癌类器官的生长速率。本发明培养基中加入Zeaxanthin dipalmitate，作为细胞膜表面脂肪连接蛋白，促进了类器官细胞膜间的信息交流，维持培养过程中微环境的稳定，参与细胞营养代谢，提高食管癌类器官的数量和活率。RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate相互之间具有协同作用，能够显著提高类器官生成数量和活率。
附图说明
图1为实施例1中培养后的食管癌类器官形态图。
图2为对比例1中培养后的食管癌类器官形态图。
图3为对比例2中培养后的食管癌类器官形态图。
图4为对比例3中培养后的食管癌类器官形态图。
具体实施方式
试剂购买信息：
Advanced DMEM/F12基础培养基（购自Gibco，货号：12634-010）；
RKI-1447（购自上海碧云天生物技术有限公司，货号：SC6664）；
Zeaxanthin dipalmitate（购自上海甄准生物科技有限公司，货号：04177121）；
100×Glutamax（母液浓度200mM，购自Life Technologies，货号：35050-061）；
100×HEPES（母液浓度1M，购自Gibco，货号：15630-106）；
N-acetylcysteine（购自Sigma，货号：A7250）；
Nicotinamide（购自Sigma，货号：N0636）；
100×Penicillin-Streptomycin（母液浓度10mg/mL，购自BiologicalIndustries，货号：03-31-1BCS）；
50×B27（购自invitrogen，货号：12587-010）；
SB202190（购自Peprotech，货号：1523072）；
A8301（购自MedChemExpress，货号：909910-43-6）；
Gastrin（购自Sigma，货号：G9145）；
R-spondin1（购自Peprotech，货号：120-38）；
Noggin（购自Peprotech，货号：120-10C）；
EGF（购自Peprotech，货号：AF-100-15）；
Y-27632（购自Sigma，货号：Y0503）；
Chroman 1（购自北京白奥莱博科技有限公司，货号：M01033）；
Belumosudil（购自MedChemExpress，货号：S7936）；
LX7101（购自北京白奥莱博科技有限公司，货号：M07024）；
AT13148（购自上海源叶生物科技有限公司，货号：S80059）。
实施例1
一种食管癌类器官的培养基，所述培养基由Advanced DMEM/F12基础培养基和特异性添加因子1×Glutamax（2mmol/L），1×HEPES（10mmol/L），1mmol/L N-acetylcysteine，10mmol/L Nicotinamide，1×Penicillin-Streptomycin（0.1mg/mL），1×B27，10mmol/LSB202190，500nmol/L A8301，100μmol/L Gastrin，100ng/mL R-spondin1，100ng/mLNoggin，50ng/mL EGF，以及RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate组成，其中RKI-144的浓度为100μmol/L，Zeaxanthin dipalmitate的浓度为5mmol/L。
一种食管癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1）取得新鲜的食管癌组织（来源于杭州市肿瘤医院，伦理委员会：杭州市肿瘤医院伦理委员会，审批号：HZCH-2022），在预冷的PBS中反复漂洗，去除组织上明显的血污。
2）用剪刀剪碎，移至1.5mL Eppendorf管中加入已预热的消化液中，在37℃下置于摇床上孵育1~2h，期间在显微镜下观察细胞漏出情况。
3）加PBS终止消化后，将组织悬液通过70μm的滤网，1300rpm，离心3min。
4）用食管癌类器官培养基将上一阶段获取的细胞沉淀重悬，加入1.5~2倍体积的未稀释的Matrigel胶混合，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡。
5）吸取50μL悬液，加入到提前预热的24孔板每个孔中的中心部位，样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出。
6）将接种后的培养皿放入CO2培养箱内37℃静置5min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固25min。
7）加入800μL食管癌类器官覆盖于表面，接着于37℃，二氧化碳培养箱中培养，2~3天换液，通常培养10~12天后传代。
培养后的食管癌类器官形态如图1所示，类器官生长数量多，且活率高。
实施例2
不同RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate浓度对食管癌类器官培养效果的影响。
本实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：食管癌类器官培养基中RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate的浓度不同；具体如下表1所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
从上表1可以看出，不同浓度RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate对食管癌类器官培养后类器官数量和活率具有很大影响，RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate分别按60~100μmol/L和2~5mmol/L加入时，培养6天后，能够显著提高类器官生成数量和活率，且在该范围内，RKI-1447浓度越高，效果越明显。说明上述添加量下RKI-1447能够促抑制食管癌类器官的凋亡。当Zeaxanthin dipalmitate浓度不在上述范围内时，类器官生成数量和活率大大降低。
对比例1
本对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：培养基中去掉RKI-1447。
对比例1的方法培养后的食管癌类器官形态如图2所示，类器官个数和活率如表2所示。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
结果显示：与实施例1相比，对比例1中减去RKI-1447后，类器官生长缓慢，类器官数量少于实施例1，且活性较差。
对比例2
本对比例2与实施例1基本相同，不同之处在于：培养基中去掉Zeaxanthindipalmitate。
对比例2的方法培养后的食管癌类器官形态如图3所示，类器官个数和活率如表3所示。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE006
结果显示：与实施例1相比，对比例2中减去Zeaxanthin dipalmitate后，类器官细胞团连接松散，数量少于实施例1，且活性较差。
对比例3
本对比例3与实施例1基本相同，不同之处在于：培养基中去掉RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate。
对比例3的方法培养后的食管癌类器官形态如图4所示，类器官个数和活率如表4所示。
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE008
结果显示：与实施例1相比，对比例3中减去RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate后，培养过程中细胞生长缓慢且有较多无法形成有球形结构的、多细胞成份的类器官，活性较差。
对比例4
本对比例4与实施例1基本相同，不同之处在于：培养基中RKI-1447分别替换为同为ROCK抑制剂的10μM Y-27632、20μM Chroman 1、1μM Belumosudil、100nM LX7101或100nMAT13148。
实施例1的培养后的食管癌类器官与对比例4的方法培养后的食管癌类器官个数和活率如表5所示。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE010
结果显示：将RKI-1447替换为其他ROCK抑制剂后效果不佳，类器官数量降低，活性变差。RKI-1447和Zeaxanthin dipalmitate具有协同作用。

Claims (9)

1.一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，其特征在于，所述特异性添加因子包括使用浓度为10~110μmol/L的RKI-1447和1~6mmol/L的Zeaxanthin dipalmitate。
2.根据权利要求1所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，其特征在于，RKI-1447的使用浓度为40~100μmol/L；Zeaxanthin dipalmitate的使用浓度为2~5mmol/L。
3.根据权利要求2所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，其特征在于，RKI-1447的使用浓度为60~100μmol/L；Zeaxanthin dipalmitate的使用浓度为2~5mmol/L。
4.根据权利要求3所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，其特征在于，RKI-1447的使用浓度为80~100μmol/L；Zeaxanthin dipalmitate的使用浓度为3~5mmol/L。
5.根据权利要求4所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，其特征在于，RKI-1447的使用浓度为100μmol/L；Zeaxanthin dipalmitate的使用浓度为5mmol/L。
6.根据权利要求1所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子还包括：
2mmol/L Glutamax，10mmol/L HEPES，1mmol/L N-acetylcysteine，10mmol/LNicotinamide，0.1mg/mL Penicillin-Streptomycin，1×B27，10mmol/L SB202190，500nmol/L A8301，100μmol/L Gastrin，100ng/mL R-spondin1，100ng/mL Noggin，50ng/mLEGF。
7.根据权利要求1所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，其特征在于，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。
8.一种食管癌肿瘤类器官的培养方法，其特征在于，使用权利要求1~7任一所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，具体包括以下步骤：
（1）取新鲜的食管癌组织，清洗；
（2）将步骤（1）所得食管癌组织剪碎、消化处理，过滤获得分离的细胞；
（3）将步骤（2）分离的细胞使用Matrigel胶重悬，接种到培养孔中，待Matrigel胶凝固后，加入所述食管癌肿瘤类器官培养用的培养基，培养获得食管癌肿瘤类器官。
9.根据权利要求8所述食管癌肿瘤类器官的培养方法，其特征在于，步骤（3）中培养时2~3天换液一次，培养10~12天后传代。
CN202210707805.4A 2022-06-22 2022-06-22 一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法 Active CN114807039B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210707805.4A CN114807039B (zh) 2022-06-22 2022-06-22 一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210707805.4A CN114807039B (zh) 2022-06-22 2022-06-22 一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114807039A true CN114807039A (zh) 2022-07-29
CN114807039B CN114807039B (zh) 2022-10-04

Family

ID=82521796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210707805.4A Active CN114807039B (zh) 2022-06-22 2022-06-22 一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114807039B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115104601A (zh) * 2022-08-25 2022-09-27 杭州艾名医学科技有限公司 一种组织保存液及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1241133A (zh) * 1997-10-07 2000-01-12 株式会社资生堂 细胞外基质产生促进剂
US20060182826A1 (en) * 2005-02-11 2006-08-17 Kalamazoo Holdings, Inc. Extracts of Asteraceae containing reduced levels of phototoxic thiophene derivatives and methods for preparing same
CN106190980A (zh) * 2016-07-12 2016-12-07 张云霞 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法
CN109481589A (zh) * 2018-11-02 2019-03-19 吴保喜 一种治疗肺癌的排毒抗癌胶囊及食疗抗癌的制备方法
CN113481162A (zh) * 2021-07-01 2021-10-08 丹望医疗科技(上海)有限公司 用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒
CN113943755A (zh) * 2020-07-15 2022-01-18 四川大学华西医院 构建原位原发食管癌动物模型的方法
WO2022065854A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 Ts Bio Co., Ltd. A novel composition for stem cell culture

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1241133A (zh) * 1997-10-07 2000-01-12 株式会社资生堂 细胞外基质产生促进剂
US20060182826A1 (en) * 2005-02-11 2006-08-17 Kalamazoo Holdings, Inc. Extracts of Asteraceae containing reduced levels of phototoxic thiophene derivatives and methods for preparing same
CN106190980A (zh) * 2016-07-12 2016-12-07 张云霞 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法
CN109481589A (zh) * 2018-11-02 2019-03-19 吴保喜 一种治疗肺癌的排毒抗癌胶囊及食疗抗癌的制备方法
CN113943755A (zh) * 2020-07-15 2022-01-18 四川大学华西医院 构建原位原发食管癌动物模型的方法
WO2022065854A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 Ts Bio Co., Ltd. A novel composition for stem cell culture
CN113481162A (zh) * 2021-07-01 2021-10-08 丹望医疗科技(上海)有限公司 用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAN C.ABNET ET AL.: ""Prospective study of serum retinol, β-carotene, β-cryptoxanthin, and lutein/zeaxanthin and esophageal and gastric cancers in China"", 《CANCER CAUSES AND CONTROL》 *
宁娜等: ""地骨皮的化学成分与药理作用"", 《现代药物与临床》 *
彭光华: ""类胡萝卜素及其抗乳腺癌机理研究"", 《中国知网电子期刊网》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115104601A (zh) * 2022-08-25 2022-09-27 杭州艾名医学科技有限公司 一种组织保存液及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114807039B (zh) 2022-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106834212B (zh) 一种用于肺组织3d培养的培养基
CN106967672B (zh) 一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法
CN109679915B (zh) 一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法
US20200208101A1 (en) Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof
US20230029554A1 (en) Organoid cultures
CN111197030B (zh) 一种体外培养膀胱癌类器官的方法
Kehoe et al. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells
DK2878664T3 (en) CULTURE MEDIUM COMPOSITION AND PROCEDURE FOR CULTIVATING CELLS OR TISSUE USING THE COMPOSITION
CN107189980B (zh) 人胚胎干细胞的悬浮培养物
Zhau et al. Establishment of a three-dimensional human prostate organoid coculture under microgravity-simulated conditions: evaluation of androgen-induced growth and PSA expression
CN112662627B (zh) 多能干细胞分化为自然杀伤细胞的培养液及分化方法
CN109652376B (zh) 一种用于卵巢癌组织3d培养的培养基
CN112266898A (zh) 结直肠癌类器官的培养方法和培养液
CN114807039B (zh) 一种食管癌肿瘤类器官培养用的培养基及培养方法
CN114790446B (zh) 一种宫颈腺癌类器官培养基及其构建方法
CN116194572A (zh) 用于产生间充质干细胞的培养基和方法
CN114874973B (zh) 获得成熟肝细胞的培养基及培养方法
CN113249310A (zh) 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
CN113943755B (zh) 构建原位原发食管癌动物模型的方法
EP3963050B1 (en) Preparation of human allogeneic liver-derived progenitor cells
CN110951686A (zh) 一种造血干细胞体外扩增培养体系和方法
CN116218777A (zh) 一种甲状腺及甲状腺癌类器官培养基、培养方法和传代方法
CN114214266B (zh) 一种凝胶组合物、生物支架凝胶及其制备方法和应用
CN115851577A (zh) 一种基于单细胞的骨肉瘤类器官模型的构建方法
CN116536264A (zh) 一种结肠癌类器官无血清专用培养基

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant