CN115104601A - 一种组织保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织保存液及其制备方法。该组织保存液包括:基础培养基、白皮杉醇、小分子抑制剂以及成膜剂。以基础培养基的体积计算,该组织保存液中含有浓度为20~50μmol/L的白皮杉醇、浓度为2~5mmol/L的小分子抑制剂以及浓度为3~6mmol/L的成膜剂。本发明提供了一种成本低廉、成分简单,能很好的维持细胞膜稳定性和渗透压稳定性,保持细胞活力,不引起细胞功能性变异的组织保存液,应用安全可靠有效。
Description
技术领域
本发明属于组织保存液技术领域,具体涉及一种组织保存液及其制备方法。
背景技术
新鲜组织样本从采集到实验室制备检测,往往存在着时间和空间的距离,保证组织样本在规定时间内维持较好的细胞活性及基因表达的稳定性,将有助于保证实验结果的准确有效性。因此,通常在组织样本的采集后会加入保存介质来达到降低细胞新陈代谢、防止细胞凋亡,保持组织细胞活性及基因表达稳定的效果。
传统的组织保存试剂通常加入动物源蛋白,例如牛血清白蛋白等。这会对组织细胞的基因表达造成潜在的影响,且在安全性上,动物源蛋白的引入,可能会使细胞受到各类细菌、病毒和支原体等污染的风险增加。
目前的组织保存液大多借鉴和采用器官/组织低温保护液和灌洗液,例如HTK液、UW液、Collins液等。其主要由乳糖酸和棉子糖或甘露醇这类非渗透性阴离子组成,分子量相对较大,能减轻冷藏时细胞的肿胀,但对于一些对渗透压较为敏感的组织来说,由于缺乏天然细胞外结构和物质,易发生细胞膜膨胀,会受到更多环境压力的影响造成氧化损伤,乳糖酸和棉子糖或甘露醇这类非渗透性阴离子作用就不太明显。因此改善保存液的渗透压、离子浓度尤为重要。
专利CN111066778A公布了一种离体组织保存液,其成分包括:青链霉素双抗、胎牛血清和改进型L-15培养基,能为肿瘤组织提供营养并具有抗菌的作用,且提高肿瘤组织的活性。但是该专利的组织保存液含有胎牛血清,动物源蛋白可能会干扰后续实验,此外,改进型L-15培养基成分较为复杂,制备繁琐,抗生素种类过多且浓度大,也可能会一定程度上影响后续细胞培养的成功率。
发明内容
针对现有技术中的上述不足,本发明提供一种组织保存液及其制备方法,针对现有技术中组织保存液成分复杂,配制步骤繁琐,以及保存时间短,细胞凋亡快,对渗透压较为敏感的组织保存效果不佳的问题,本发明提供一种成本低廉、成分简单,能很好的维持细胞膜稳定性和渗透压稳定性,保持细胞活力,不引起细胞功能性变异的组织保存液,应用安全可靠有效。
为实现上述目的,本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种组织保存液,包括:基础培养基、白皮杉醇、小分子抑制剂以及成膜剂。
进一步地,以基础培养基的体积计算,组织保存液中含有浓度为20~50μmol/L的白皮杉醇、浓度为2~5mmol/L的小分子抑制剂以及浓度为3~6mmol/L的成膜剂。
进一步地,组织保存液中白皮杉醇的终浓度为50μmol/L;小分子抑制剂的终浓度为5mmol/L;成膜剂的终浓度为6mmol/L。
进一步地,基础培养基为Advanced DMEM/F12基础培养基。
进一步地,小分子抑制剂为ROCK小分子抑制剂。
进一步地,小分子抑制剂为SR-3677。
进一步地,成膜剂为普鲁兰多糖。
进一步地,组织为来源于人或动物的离体组织。
进一步地,组织为脾脏组织、肝组织、肺组织、乳腺癌手术组织、肺癌组织、胰腺癌组织或食管癌组织。
一种制备上述组织保存液的方法,将基础培养基、白皮杉醇、小分子抑制剂和成膜剂混合均匀即可。
本发明的有益效果:
1、本发明的改良后的样本组织保存液成分简单明确,制备方便,降低了制备成本。
2、本发明在组织保存液中添加白皮杉醇,能延长组织细胞的活性维持时间(4℃下保持90%以上的活性72小时),使得组织细胞的长途远距离运输成为可能,大大增加了应用范围。
3、SR-3677具有较强的抗氧化作用,也可能在组织保存运输过程中发挥抑制细胞凋亡的积极作用,在抑制细胞凋亡上与白皮杉醇具有协同作用
4、相较于采用传统的青链霉素双抗、胎牛血清作为组织保存液的成分,本发明不需要动物源蛋白的引入,降低了各类细菌、病毒和支原体等污染的风险增加,批次更加稳定,而且白皮杉醇维持细胞活性的同时起着抗菌的作用,繁多的高浓度抗生素加入会影响后续细胞培养成功率,因此,本发明不需要额外添加抗生素。
5、普鲁兰多糖可替代乳糖酸,棉子糖或甘露醇,成膜性更好,无毒性,渗透性好,渗透至细胞中能结合组织细胞外基质,在细胞外部形成保护膜,同时维持细胞的渗透压稳定,减少组织低温运输时产生的细胞肿胀现象,克服了传统法保存渗透压较为敏感的组织活性差的问题。
附图说明
图1为本申请实施例2和传统法制备的保存液保存不同时间后的细胞活率;
图2为采用本申请实施例2和传统法保存后的细胞接种培养检测图;
图3为不同组织在实施例4制备得到的样本组织保存液中保存不同时间后的细胞活率。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述,以便于本技术领域的技术人员理解本发明,但应该清楚,本发明不限于具体实施方式的范围,对本技术领域的普通技术人员来讲,只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内,这些变化是显而易见的,一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
一种改良后的样本组织保存液,该组织保存液由Advanced DMEM/F12基础培养基,白皮杉醇,SR-3677和普鲁兰多糖混合而成。其中白皮杉醇的终浓度为50μmol/L,SR-3677的终浓度为5mmol/L,普鲁兰多糖的终浓度为6mmol/L。
该改良后的样本组织保存液的应用,包括以下步骤:
取新鲜小鼠脾脏组织,切成0.3×0.3×0.3 cm-0.5×0.5×0.5cm体积大小。置于2mL冻存管,加入2 mL组织保存液,4℃冰箱保存。分别保存24小时,48小时和72小时。待保存后将组织解离为单细胞悬液,利用细胞计数仪检测细胞存活率(AO/PI染色)。
实施例2
一种改良后的样本组织保存液,该组织保存液由Advanced DMEM/F12基础培养基,白皮杉醇、普鲁兰多糖和SR-3677混合而成。其中白皮杉醇的终浓度为20μmol/L,SR-3677的终浓度为2mmol/L,普鲁兰多糖的终浓度为3mmol/L。
该改良后的样本组织保存液的应用,包括以下步骤:
取新鲜人乳腺癌手术组织,切成0.3×0.3×0.3 cm-0.5×0.5×0.5cm体积大小。置于2 mL冻存管,加入2 mL组织保存液,4℃冰箱保存。分别保存24小时,48小时和72小时。待保存后将组织解离为单细胞悬液,利用细胞计数仪检测细胞存活率(AO/PI染色)。将单细胞接种培养后观察类器官生长状态。
实施例3
一种改良后的样本组织保存液,该组织保存液由Advanced DMEM/F12基础培养基,白皮杉醇、普鲁兰多糖和SR-3677混合而成。其中白皮杉醇的终浓度为30μmol/L,SR-3677的终浓度为5mmol/L,普鲁兰多糖的终浓度为4mmol/L。
该改良后的样本组织保存液的应用,包括以下步骤:
取新鲜人乳腺癌手术组织,切成0.3×0.3×0.3 cm-0.5×0.5×0.5cm体积大小。置于2 mL冻存管,加入2 mL样本组织保存液,4℃冰箱保存。分别保存24小时,48小时和72小时。待保存后将组织解离为单细胞悬液,利用细胞计数仪检测细胞存活率(AO/PI染色)。将单细胞接种培养后观察类器官生长状态。
实施例4
一种改良后的样本组织保存液,该组织保存液由Advanced DMEM/F12基础培养基,白皮杉醇,SR-3677和普鲁兰多糖混合而成。其中白皮杉醇的终浓度为50μmol/L,SR-3677的终浓度为5mmol/L,普鲁兰多糖的终浓度为6mmol/L。
该改良后的样本组织保存液的应用,包括以下步骤:
取新鲜小鼠肝组织、肺组织以及人肺癌组织、胰腺癌组织和食管癌组织切成0.3×0.3×0.3 cm-0.5×0.5×0.5cm体积大小。置于2 mL冻存管,加入2 mL组织保存液,4℃冰箱保存。分别保存24小时,48小时和72小时。待保存后将组织解离为单细胞悬液,利用细胞计数仪检测细胞存活率(AO/PI染色),结果如图3所示,细胞活率均达到80%以上。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同,不同之处在于:组织保存液中白皮杉醇和SR-3677的浓度不同,以研究不同浓度的白皮杉醇和SR-3677对小鼠脾脏组织保存后细胞活率的影响;具体如表1所示。
表1 不同浓度白皮杉醇和SR-3677对小鼠脾脏组织保存后细胞活率的影响
从上表1可以看出,白皮杉醇和SR-3677分别按20~50μmol/L和2-5 mmol/L加入时,保存72h,小鼠脾脏组织消化后能维持较高的活率,且在该范围内,白皮杉醇浓度越高,效果越明显。说明上述添加量下白皮杉醇能够抑制细胞的凋亡。当白皮杉醇和SR-3677浓度不在上述范围内时,器官生成数量和活率大大降低。
对比例2
本对比例2与实施例1基本相同,不同之处在于:组织保存液中去掉白皮杉醇。
检测细胞在实施例1与本对比例制备得到的保存液中保存不同时间后的细胞活率,结果见表2。
表2 细胞活率
如表2所示,在减去白皮杉醇后,保存不同时间后的细胞活率明显低于实施例1。
对比例3
本对比例3与实施例1基本相同,不同之处在于:组织保存液中去掉SR-3677。
检测细胞在实施例1与本对比例制备得到的保存液中保存不同时间后的细胞活率,结果见表3。
表3 细胞活率
如表3所示,在减去SR-3677后,保存不同时间后的细胞活率明显低于实施例1。
对比例4
本对比例4与实施例1基本相同,不同之处在于:组织保存液中去掉白皮杉醇和SR-3677。
检测细胞在实施例1与本对比例制备得到的保存液中保存不同时间后的细胞活率,结果见表4。
表4 细胞活率
如表4所示,在减去白皮杉醇和SR-3677后,保存不同时间后的细胞活率明显低于实施例1。
对比例5
本对比例5与实施例1基本相同,不同之处在于:组织保存液中SR-3677分别替换为同为ROCK抑制剂的Y-27632、Chroman 1、Belumosudil、LX7101、AT13148。
检测细胞在实施例1与本对比例制备得到的保存液中保存不同时间后的细胞活率,结果见表5。
表5 细胞活率
如表5所示,将SR-3677替换为其他ROCK抑制剂后效果不佳,保存后细胞活率降低,说明白皮杉醇和SR-3677在改善细胞活率效果方面具有协同作用。
对比例6
本对比例6采用传统的青链霉素双抗、胎牛血清作为组织保存液的成分对组织进行保存。
传统方法:组织保存液配方为Advanced DMEM/F12基础培养基,30%胎牛血清,2%青链霉素双抗,胎牛血清先进行56℃灭活30min,然后进行1300rpm离心10min, 最后按比例添加混合均匀即可。
实施例2的保存液保存不同时间后细胞活率与对比例6的保存液保存不同时间后细胞活率如图1所示,保存后的细胞接种培养后结果如图2所示
结果显示:与对比例6的传统组织保存液相比,本发明改良后的样本组织保存液不使用胎牛血清和额外的高浓度抗生素,对细胞活率及生长影响较小,且无需进行灭活离心步骤,操作更加的方便。
对比例7
本对比例7与实施例1基本相同,不同之处在于:组织保存液中普鲁兰多糖分别替换为乳糖酸,棉子糖或甘露醇。
检测细胞在实施例1与本对比例制备得到的保存液中保存不同时间后的细胞活率,结果见表6。
表6 细胞活率
如表6所示,将普鲁兰多糖替换为乳糖酸,棉子糖或甘露醇后效果不佳,保存后的细胞活率显著降低。
结合上述表1~6的检测结果可知,本申请构建的组织保存液在各组分的协同配合下,在对离体组织保存72h后,细胞活率能够达到93.4%以上,最高可达98.2%,表明本申请制备的保存液对细胞活性具有优异的保持效果。
Claims (10)
1.一种组织保存液,其特征在于,包括:基础培养基、白皮杉醇、小分子抑制剂以及成膜剂。
2.根据权利要求1所述的组织保存液,其特征在于,以基础培养基的体积计算,所述组织保存液中含有浓度为20~50μmol/L的白皮杉醇、浓度为2~5mmol/L的小分子抑制剂以及浓度为3~6mmol/L的成膜剂。
3.根据权利要求2所述的组织保存液,其特征在于,所述组织保存液中白皮杉醇的终浓度为50μmol/L;小分子抑制剂的终浓度为5mmol/L;成膜剂的终浓度为6mmol/L。
4.根据权利要求1或2所述的组织保存液,其特征在于,所述基础培养基为AdvancedDMEM/F12基础培养基。
5.根据权利要求1或2所述的组织保存液,其特征在于,所述小分子抑制剂为ROCK小分子抑制剂。
6.根据权利要求5所述的组织保存液,其特征在于,所述小分子抑制剂为SR-3677。
7.根据权利要求1或2所述的组织保存液,其特征在于,所述成膜剂为普鲁兰多糖。
8.根据权利要求1或2所述的组织保存液,其特征在于,所述组织为来源于人或动物的离体组织。
9.根据权利要求8所述的组织保存液,其特征在于,所述组织为脾脏组织、肝组织、肺组织、乳腺癌手术组织、肺癌组织、胰腺癌组织或食管癌组织。
10.一种组织保存液的制备方法,其特征在于,按权利要求1~9任一项所述的配方,将基础培养基、白皮杉醇、小分子抑制剂和成膜剂混合均匀即可。
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