CN104904707A - 组合物及其应用、胎盘的玻璃化冻存剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学领域，特别涉及组合物及其应用、胎盘的玻璃化冻存剂及制备方法。为了提高玻璃化冻存的胎盘组织复苏后的活率，本发明对玻璃化的冻存方法进行了优化，主要是对其配方进行改良。本发明的玻璃化冻存液冻存的胎盘组织，复苏后细胞分离培养效率更高，细胞增殖更为迅速，细胞收获量更大。

Description

组合物及其应用、胎盘的玻璃化冻存剂及制备方法

技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及组合物及其应用、胎盘的玻璃化冻存剂及制备方法。

背景技术

在生命科学研究和医疗实践过程中，所研究的对象是有生命的细胞、组织或器官。因为科研或治疗的需要，经常需要保存这些细胞、组织或器官的生物活性，这就要求采用合适的方法对它们进行保存。深低温保存时最常见的方法。细胞、组织或器官虽然能在低温下长期保存，但是低温冻存中冷冻损伤是必然的，低温保存的目的就是将低温损伤减到最小，使保存后细胞、组织或器官的结构、遗传性能和功能不发生改变。随着对细胞以及组织低温损伤机制认识的逐步加深,发现对其低温冻存时极容易在降温和复温过程中受到溶液冻存、融化以及溶液渗透压变化的因素的影响而遭到损伤。因此为了实现细胞、组织或器官的深低温保存，一般均需要在溶液中加入一定种类和浓度的低温保护剂。并针对不同的对象设计特定降温程序和复温程序。

目前在低温生物学研究领域中已经有很多低温保存的方法，通常分为两类：一类是传统的保存方法(冻存保护液+细胞/组织)；另一类是玻璃化的保存方法(玻璃化溶液+细胞/组织)。在众多的保存方法中，玻璃化技术有许多其固有的优点，而被广泛用于各种活性细胞、组织和器官的保存。

现有的玻璃化冻存方法，冻存细胞可取得较好的效果，但对于组织，则效果有限，比如玻璃化冻存的胎盘组织复苏后分离出胎盘来源贴壁细胞的效果并不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种组合物及其应用、胎盘的玻璃化冻存剂及制备方法。本发明的玻璃化冻存液冻存的胎盘组织，复苏后细胞分离培养效率更高，细胞增殖更为迅速，细胞收获量更大。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种组合物，包括甘油、乙二醇、聚乙二醇、DMSO和蔗糖溶液。

在本发明的一些具体实施方案中，以体积份计，所述组合物包括：

在本发明的一些具体实施方案中，以体积份计，所述组合物包括：

在本发明的一些具体实施方案中，以体积份计，所述组合物包括：

在本发明的一些具体实施方案中，所述蔗糖溶液的浓度为0.1～1mol/L。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蔗糖溶液的浓度为0.4～0.5mol/L。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蔗糖溶液的浓度为0.4mol/L。

本发明还提供了所述的组合物在制备胎盘玻璃化冻存剂中的应用。

本发明还提供了一种胎盘玻璃化冻存剂，包括所述组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，胎盘玻璃化冻存剂为胎盘玻璃化冻存液。

本发明还提供了一种所述胎盘玻璃化冻存剂的制备方法，取所述甘油、所述乙二醇、所述聚乙二醇、所述DMSO溶于所述蔗糖溶液。

本发明还提供了一种胎盘的玻璃化冻存方法，采用所述胎盘玻璃化冻存剂保存所述胎盘。

在本发明的一些具体实施方案中，胎盘的玻璃化冻存方法具体为取胎盘与培养基混合、离心，弃上清，与所述胎盘玻璃化冻存剂混合，液氮保存。

在本发明的一些具体实施方案中，胎盘的玻璃化冻存方法中所述取胎盘与培养基混合具体为采用不同浓度的DMEM培养基分5步进行预平衡。

在本发明的一些具体实施方案中，胎盘的玻璃化冻存方法后复苏采用10％FBS的MSC专用培养基。

为了提高玻璃化冻存的胎盘组织复苏后的活率，本发明对玻璃化的冻存方法进行了优化，主要是对其配方进行改良。本发明的玻璃化冻存液冻存的胎盘组织，复苏后细胞分离培养效率更高，细胞增殖更为迅速，细胞收获量更大。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示细胞增殖曲线；其中冻存液1为本发明实施例1的冻存液；冻存液2为30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4M蔗糖；

图2示冻存组织所分离的细胞，其中A为冻存液2冻存组织所分离的细胞，B为冻存液1冻存组织所分离的细胞。

具体实施方式

本发明公开了一种组合物及其应用、胎盘的玻璃化冻存剂及制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的组合物及其应用、胎盘的玻璃化冻存剂及制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1胎盘组织玻璃化冻存液的制备

将甘油、乙二醇、聚乙二醇、DMSO溶于蔗糖溶液中，混合即得。

实施例2胎盘组织玻璃化冻存液的制备

将甘油、乙二醇、聚乙二醇、DMSO溶于蔗糖溶液中，混合即得。

实施例3胎盘组织玻璃化冻存液的制备

将甘油、乙二醇、聚乙二醇、DMSO溶于蔗糖溶液中，混合即得。

实施例4胎盘组织的冻存与复苏

1取3mm×3mm大小的胎盘组织块，按照1：1体积比的比例加入保护剂，保护剂为含乙酰胺的DMEM培养基溶液，用不同体积分数乙酰胺(5％、10％、20％、40％、60％)的DMEM培养基于4℃处理30分钟；然后4℃，2,500转离心5分钟，

2弃上清液，加入体积分数100％的实施例1制备的玻璃化冻存液1mL，然后直接投入液氮罐中保存。

3胎盘组织在深低温冻存3个月后，从液氮中取出胎盘组织块放入40℃的恒温水浴箱快速解冻，在1min内使胎盘组织块迅速解冻，去除冷冻保护剂然后用含10％FBS的MSC专用培养基5mL洗脱，2,500转离心5分钟去除上清。

实施例5胎盘来源贴壁细胞的分离、培养和分离效率检测

1组织块(实施例4中的冻存、复苏后的组织块)用PBS洗脱三次，1,200rpm离心10min；弃去上清液，加0.25％胰酶-0.53mM EDTA在37℃作用15min；反复消化二次，收集消化液，加入培养基终止消化；

2过150目的网筛，用碾棒搅动，边搅边用PBS冲洗；收集冲洗液，1,200rpm离心10min，弃去上清液；

3加入培养基，置5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养；2天后培养的细胞处于刚贴壁未增殖的状态，去掉细胞培养液除去未贴壁细胞，用0.25％胰酶-0.53mM EDTA 37℃消化2min，加入4至5倍体积的MSC专用培养基终止反应，取20μL细胞液计数得出每克组织分离获得的细胞数。

实施例6胎盘来源贴壁细胞的分离、培养和增殖曲线检测

1.组织块(实施例4中的冻存、复苏后的组织块)用PBS洗脱三次，1,200rpm离心10min；弃去上清液，加0.25％胰酶-0.53mM EDTA在37℃作用15min；反复消化二次，收集消化液，加入培养基终止消化；

2过150目的网筛，用碾棒搅动，边搅边用PBS冲洗；收集冲洗液，1,200rpm离心10min，弃去上清液；

3加入培养基，置5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养；4天后进行全量换液以除去未贴壁细胞，以后每3天换液一次；

4长至80％左右汇合度时，用0.25％胰酶-0.53mM EDTA 37℃消化2min；加入4至5倍体积的MSC专用培养基终止反应，取20μL细胞液计数算出该细胞代数收获的细胞；1,200rpm离心10min，弃上清；沉淀用培养基重悬，得出以1：3比例传代，每3天换液一次。

5当细胞长至80％左右汇合度时，重复上述步骤4，得到每细胞代次的细胞数(P1-P5)，得出细胞增殖曲线。

实施例7不同玻璃化冻存方法的比较

冻存液1：本发明实施例1的冻存液

冻存液2：30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4M蔗糖

取6块胎盘组织，3块用冻存液1冻存，另3块用冻存液2冻存，冻存、复苏方法参照实施例2。复苏后比较分离效率、细胞增殖曲线(方法详见实施例4和实施例5)。结果显示，冻存液1的组织分离效率更高(P<0.05，表1)，细胞增殖更迅速(P<0.05，图1)。

表1 不同冻存液冻存后胎盘组织中分离贴壁细胞得效率

从表1可发现，冻存液1组分离效率是冻存液2组的5倍以上，证明以冻存液1冻存的组织分离效率高。从图1的增殖曲线可见，冻存液1冻存后复苏培养的细胞，P4代后增殖速度明显上升；同时图2可见，图2B中的有大量呈平行排列生长的相对均一的梭形细胞，是典型的干细胞生长形态，反观图2A，干细胞呈多角形生长状态不好且数量少。综述所述，冻存液1冻存的组织，分离效率高，增殖曲线快，细胞状态好。

取实施例2、实施例3制备获得的胎盘组织玻璃化冻存液进行上述实验，结果与实施例1制备获得的胎盘组织玻璃化冻存液的实验结果相同或相近，无显著差异(P＞0.05)。

综合上述实验结果表明，胎盘组织玻璃化冻存液冻存的胎盘组织，复苏后细胞分离培养效率更高，细胞增殖更为迅速，细胞收获量更大。

实施例8不同比例的冻存配方的对比

试验组：

冻存液1：10％甘油+50％乙二醇+5％聚乙二醇+15％DMSO+0.4M蔗糖

冻存液2：20％甘油+5％乙二醇+50％聚乙二醇+10％DMSO+0.4M蔗糖

冻存液3：5％甘油+10％乙二醇+10％聚乙二醇50％DMSO+0.4M蔗糖

冻存液4：50％甘油+10％乙二醇+15％聚乙二醇+5％DMSO+0.4M蔗糖

对照组：

冻存液5：60％甘油+3％乙二醇+1％聚乙二醇+4％DMSO+0.4M蔗糖

冻存液6：3％甘油+60％乙二醇+2％聚乙二醇+3％DMSO+0.4M蔗糖

冻存液7：1％甘油+3％乙二醇+60％聚乙二醇+4％DMSO+0.4M蔗糖

冻存液8：3％甘油+2％乙二醇+2％聚乙二醇+60％DMSO+0.4M蔗糖

取24块胎盘组织，随机均分至8组，冻存液1组～8组分别采用冻存液1～8，冻存、复苏方法参照实施例2。复苏后比较分离效率(方法详见实施例4和5)。结果显示(表2)，冻存液1的配方最佳。

表2 不同比例的冻存配方分离贴壁细胞得效率

从表2可知，冻存1～4组冻存方案的分离效率是冻存5～8组的一半以上，证明在本发明保护范围内的冻存方案有优秀的冻存效果，且效果一致。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括甘油、乙二醇、聚乙二醇、DMSO和蔗糖溶液。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以体积份计，所述组合物包括：

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，以体积份计，所述组合物包括：

4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，所述蔗糖溶液的浓度为0.1～1mol/L。

5.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，所述蔗糖溶液的浓度为0.4～0.5mol/L。

6.根据权利要求1至5任一项所述的组合物在制备胎盘玻璃化冻存剂中的应用。

7.一种胎盘玻璃化冻存剂，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的组合物。

8.根据权利要求8所述的胎盘玻璃化冻存剂，其特征在于，其为胎盘玻璃化冻存液。

9.一种如权利要求8所述的胎盘玻璃化冻存剂的制备方法，其特征在于，取所述甘油、所述乙二醇、所述聚乙二醇、所述DMSO溶于所述蔗糖溶液。

10.一种胎盘的玻璃化冻存方法，其特征在于，采用如权利要求7或8所述的胎盘玻璃化冻存剂保存所述胎盘。