CN104145944A - 一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，包括将魁蚶精液与抗冻液混合稀释，预冷后进行分步降温冷冻，保存2周后，进行解冻激活及活力检验；其中所述抗冻液由基础液、抗冻保护剂和添加剂组成；所述基础液为灭菌后的天然海水或浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，所述抗冻保护剂为体积浓度为5%的二甲基亚砜，所述添加剂为海藻糖。本发明的魁蚶精子长期冷冻保存方法对于魁蚶人工繁育、种质保存及可持续养殖等方面有着重要意义。

Description

一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，具体的说是一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法。

背景技术

魁蚶(Scapharca broughtonii Sckrenck)，隶属于软体动物门、双壳纲、蚶目、蚶科、毛蚶属，俗名赤贝、大毛蛤，是一种大型冷水性底栖经济贝类，主要分布在太平洋西北部日本海、黄海、渤海及东海。魁蚶肉质鲜美，营养丰富，深受国内外市场的欢迎，是出口创汇的优良品种。上世纪因为魁蚶的过度开发导致其野生资源急速下降，加上市场和出口的大量需求，人工养殖规模也随之不断扩大，对优质苗种的需求也有增无减。然而近几年来，由于累代养殖、近亲交配产生了种质退化、杂合度降低等一系列问题。种质退化及苗种短缺已经成为魁蚶养殖业发展的首要制约因素，开展魁蚶良种选育及规模化苗种繁育的研究迫在眉睫。魁蚶精子超低温冷冻保存技术对于魁蚶种质保存、贝类品的选育、精液长距离运输等方面有着重要意义。

目前，精子超低温冷冻保存技术在海洋动物种质细胞保存研究的范围主要集中在鱼类和牡蛎等少数几种海洋生物。冷冻保存成功的关键在于在慢速降温过程中使细胞质有效地脱水和收缩，在投入到液氮中去之前，防止或尽量减少细胞内冰晶的形成，以把对细胞的损伤缩小到最低。因为不同种生物精子的渗透压、细胞液离子浓度都不同，所以它们都有各自相应的最佳抗冻液配比、最优冷冻降温速率和最适激活方法，需要大量的实验才可筛选得出。相比鱼类，贝类的精子冷冻技术还不是很成熟。不同种贝类的精子冷冻技术不具有通用性。现有的贝类精子技术中使用的抗冻液组成较为复杂，配比繁琐，且稀释比例较大，保存的精子浓度较低；抗冻程序多采用二步降温法，冷冻程序相对粗糙。经文献检索，未见与本发明魁蚶精子超低温冷冻保存以及激活方法的报道。

发明内容

本发明为了解决魁蚶良种选育中优良种质的保存、选育及长距离运输等技术难题，提供一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法。该发明方法中的精子抗冻液配比简单，冷冻程序相对精细，显著提高了魁蚶冷冻精子的复活率。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：

一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，具体包括将魁蚶精液与抗冻液混合稀释，装入2.0ml的冻存管中，预冷后，进行分步降温冷冻，保存在液氮中，保存2周后，从液氮中取出冻存管进行解冻，在激活液中进行精子激活，最后进行活力检验；其中所述抗冻液由基础液、抗冻保护剂和添加剂组成；所述基础液为灭菌后的天然海水或浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，所述抗冻保护剂为体积浓度为5％的二甲基亚砜(V/V，DMSO体积/抗冻液体积)，所述添加剂为海藻糖。

进一步的，所述氯化钠溶液中氯化钠的加入量为58.4g/L。

进一步的，所述抗冻液中基础液与抗冻保护剂的体积比为95％：5％。

进一步的，所述添加剂海藻糖的加入量为90g/L。

进一步的，所述精液与抗冻液的体积比为1:10。

进一步的，所述预冷是在0℃预冷2-5min。

进一步的，所述分步降温冷冻是在程序降温仪中，在-60℃前降温速率为-12℃/min，降至-60℃时，平衡2-5min，再以-20℃/min快速降温至-180℃，迅速投入液氮中保存。

进一步的，所述解冻是将放有精液与抗冻液的冻存管于37-40℃的水浴中解冻100-110s，然后于室温下放至完全融化。

进一步的，所述激活液为添加了胎牛血清和氯化铵的天然海水，所述胎牛血清的体积浓度为5％(V/V，胎牛血清/激活液)，所述氯化铵的添加量为0.2g/100ml。

进一步的，所述活力检测是采用计算机辅助分析法(CASA)检测魁蚶精子的运动率。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1.本发明冷冻保存魁蚶精子，解冻后精子活力高，精子游动率达到了70％以上，平均曲线速度均大于150μm/s，平均直线速度均大于122μm/s。

2.本发明采用灭菌后的天然海水或0.5mol/L的氯化钠溶液作为基础液，相比其他稀释液，更为简单，更容易操作。因其具有较为合适的渗透压，冷冻效果更好。

3.本发明采用5％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)为抗冻保护剂，并加入了0.2M海藻糖作为添加剂，保持较好渗透性的同时又降低了保护剂毒性。二甲基亚砜为渗透性抗冻剂，可缓解冷冻时细胞过冷引起的脱水皱缩和复活时细胞渗透性肿胀引起的损伤；而海藻糖为非渗透型抗冻剂，具有不同于其他糖类的生物学特性，其可以稳定生物分子，对细胞抗脱水保护和抗高渗保护有着独特的作用。

4.本发明使用添加了胎牛血清和氯化铵的天然海水来激活经冷冻复苏的精子，取得了较好的激活效果，精子易被激活，且游动速度相对较快。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合实施例，对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

1)精子的采集：2014年7月23日，正值魁蚶的生殖期，从日照东港养殖场取回45只魁蚶亲贝。经解剖镜检，选取性腺发育良好，显微镜检测活力在85％以上的魁蚶雄性个体进行精子冷冻保存试验。

2)精子激活液的筛选：分别使用天然海水、添加了胎牛血清和氯化铵的天然海水、添加了胎牛血清和乙酸铵的天然海水、添加了胎牛血清和氢氧化钠的天然海水来激活魁蚶鲜精，经镜检观察，添加了胎牛血清和氯化铵的天然海水的激活精子效果较好，精子平均曲线速度为185.1μm/s，平均直线速度为143.4μm/s。数据对比见下表。

3)精子抗冻液的筛选：抗冻液由基础液、抗冻保护剂和添加剂组成。本次试验配置了14种抗冻液，其中基础液、抗冻保护剂和添加剂组合不同，具体见下表，其中所述5％二甲基亚砜是指体积浓度为5％的二甲基亚砜，所述抗冻液中基础液与抗冻保护剂的体积比为95％：5％，配好后置于0-4℃冰箱预冷，待用，每组抗冻液做3个平行实验。

4)将上述鲜精与预先配置的14种抗冻液以体积比1:10的比例混合稀释，分装至2ml冻存管中，放置于4℃冰箱中预冷20-30分钟，同时程序降温仪(Planner kyro)开启，预冷至0℃；本发明采用2ml冻存管装魁蚶精子，温度控制更加精密，且采用了1:10的稀释比例，相对其他贝类精子冷冻的稀释比例较低，保持了较高的精子密度，约为4.6×10⁸/ml。

5)将冻存管置于程序降温仪中0℃平衡2-5min，而后以分步降温处理，即以-12℃/min降温至-60℃，平衡2-5min，然后以-20℃/min快速降温至-180℃。精液从0℃至-60℃是冰晶形成的区域，采用适当的降温速度可以有效地减少冰晶的对精子的损伤；-60℃平衡后以-20℃/min的速度降温至-180℃，使魁蚶精液彻底玻璃化，避免了冻存管从程序降温仪移至液氮罐中温度骤升引起的重结晶损伤。

6)将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后按顺序逐一放入冻存盒，然后放入液氮容器中长期贮存(-196℃)；

7)将上述冷冻保存的冻精在2014在8月6日从液氮中拿出，将42管冻存管解冻，放入37-40℃水浴解冻100-110s，然后室温放至完全融化，可使精子快速度过重结晶区，减少了局部温度过高导致的损伤。

8)在载玻片上滴加100μL加了胎牛血清和氯化铵的天然海水，所述胎牛血清的体积浓度为5％(V/V，胎牛血清/激活液)，所述氯化铵的添加量为0.2g/100mL，用牙签蘸取解冻的精液涂抹在激活液中，使解冻后的精子恢复运动能力，在显微镜下10倍物镜观察精子活力，并采用计算机辅助分析法(CASA)检测魁蚶精子的运动率。激活效果见下表。

由表可以看出组合2和6的冷冻液解冻后的效果最好，精子游动率都达到了70％以上，平均曲线速度也均大于150μm/s，即抗冻液的优选组合为灭菌后的天然海水、5％二甲基亚砜、90g/L的海藻糖，另一优选组合为58.4g/LNaCl、蒸馏水、5％二甲基亚砜、90g/L的海藻糖。

组合	1	2	3	4	5	6	7
								精子游动率(％)	46	74	42	43	49	76	58
平均曲线速度	82	150	77	80	83	154	84

组合	8	9	10	11	12	13	14
								精子游动率(％)	54	48	32	53	57	46	53
平均曲线速度	75	67	54	74	67	60	67

实施例2：

1)2014年8月7日，正值魁蚶的生殖期，从日照欣慧水产有限公司的养殖车间取回20只魁蚶亲贝。经解剖镜检，选取性腺发育良好，显微镜检测活力在85％以上的魁蚶雄性个体进行精子冷冻保存试验。

2)抗冻液的配置：稀释液由基础液、抗冻保护剂、添加剂组成，配置后置于0-4℃冰箱预冷，待用；共配置两种抗冻液。其中一种标记为HS，其基础液为灭菌后的天然海水；抗冻保护剂为体积5％的二甲基亚砜(DMSO)；添加剂为海藻糖，添加量为90g/L。另一种标记为NACL，其基础液为浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液；抗冻保护剂为体积5％的二甲基亚砜(DMSO)；添加剂为海藻糖，添加量为90g/L。

3)将上述鲜精一分为二，与预先配置的2种抗冻液以体积比1:10的比例混合，各分装至22个2ml冻存管中。在4℃冰箱中预冷20分钟，同时程序降温仪开启，预冷至0℃。

4)将分装好的冻存管置于降温仪中，在0℃平衡2-5min，后以分步降温处理；即以-12℃/min降温至-60℃，平衡2-5min，然后以-20℃/min快速降温至-180℃。

5)将所有的冻存管移入盛有液氮的泡沫盒中，然后按顺序逐一放入冻存盒，全部放入液氮容器中长期贮存(-196℃)。

6)在液氮容器中冷冻2小时后，每一种抗冻液任意选取5个冻存管，放入37-40℃水浴解冻100-110s，然后室温放至完全融化。

7)在载玻片上滴加50μL加了胎牛血清和氯化铵的天然海水，所述胎牛血清的体积浓度为5％(V/V，胎牛血清/激活液)，所述氯化铵的添加量为0.2g/100mL，用牙签蘸取解冻的精液涂抹在激活液中，使解冻后的精子恢复运动能力，在显微镜下10倍物镜观察精子活力，并采用计算机辅助分析法(CASA)检测魁蚶精子的运动率。激活效果见下表。由表可知，检测复活后冻精的活力均高于70％。

HS冻存管编号	1	2	3	4	5
						精子游动率(％)	70	74	76	78	72
平均曲线速度	152	157	162	150	159

NACL冻存管编号	1	2	3	4	5
						精子游动率(％)	72	74	70	79	80
平均曲线速度	155	151	157	153	160

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：包括将魁蚶精液与抗冻液混合稀释，装入2.0ml的冻存管中，预冷后，进行分步降温冷冻，保存在液氮中，保存2周后，从液氮中取出冻存管进行解冻，然后在激活液中进行精子激活，最后进行活力检验；其中所述抗冻液由基础液、抗冻保护剂和添加剂组成；所述基础液为灭菌后的天然海水或浓度为0.5 mol/L的氯化钠溶液，所述抗冻保护剂为体积浓度为5%的二甲基亚砜，所述添加剂为海藻糖。

2. 根据权利要求1所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述氯化钠溶液中氯化钠的加入量为58.4g/L。

3. 根据权利要求1或2所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述抗冻液中基础液与抗冻保护剂的体积比为95%：5%。

4. 根据权利要求3所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述添加剂海藻糖的加入量为90g/L。

5. 根据权利要求1或4所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述精液与抗冻液的体积比为1:10。

6. 根据权利要求1所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述预冷是在0℃预冷2-5min。

7. 根据权利要求1或6所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述分步降温冷冻是在程序降温仪中，在-60℃前降温速率为-12℃/ min，降至-60℃时，平衡2-5min，再以-20℃/min 降温至-180℃，迅速投入液氮中保存。

8. 根据权利要求1或6所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述解冻是将放有精液与抗冻液的冻存管于37-40℃的水浴中解冻100-110s，然后于室温下放至完全融化。

9. 根据权利要求1或6所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述激活液为添加了胎牛血清和氯化铵的天然海水，所述胎牛血清的体积浓度为5%，所述氯化铵的添加量为0.2g/100ml。

10. 根据权利要求1或6所述的一种魁蚶精子超低温冷冻保存与激活方法，其特征在于：所述活力检测是采用计算机辅助分析法检测魁蚶精子的运动率。