CN109803531B - 用于冷冻保存高粘度生物样本的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，优选地是来自甲壳纲动物或昆虫的精子样本，借助于该方法，能够保持原始样本的物理特性完好，保存精包的活力。

Description

用于冷冻保存高粘度生物样本的方法
技术领域
本发明涉及冷冻保存高粘度生物样本，诸如无脊椎动物的精子样本的方法，并且更具体地涉及能够冷冻保存非常高粘度的精子样本，例如甲壳纲动物的精子样本，完全维持这些样本中包含的精包的活力的新方法。
背景技术
生物组织和流体样本的冷冻保存是生物学中最广泛使用的保存技术之一，用于在长期时间内维持细胞存活并处于良好的状态，甚至不改变它们的外貌或代谢活动，为此目的冷冻保存维持组织和/或流体处于停滞期，其中细胞代谢活动完全停止，从而防止酶促降解过程发生。
为了实现上述目的，生物组织和/或流体的样本必须经过预先处理以减少由于温度骤降而形成晶体的可能性；这通过添加冷冻保护剂物质来实现，冷冻保护剂物质防止在冷冻过程期间形成晶体，这或是由于减少细胞内水的量和/或由于通过修改水分子之间的吸引力(例如通过破坏氢键)而改变它们的行为。
然而，尽管目前在长期时间内冷冻保存不同类型的样本是可能的，但在体外受精领域中存在更多的阻碍，因为考虑到在许多动物物种中损失例如精子的粘合力会阻止受精和产生存活的胚胎，因而不仅维持细胞存活是必要的，而且维持其细胞形态和生理特性完整也是重要的。
为了努力克服所述困难，已经开发出了各种冷冻保存方法，诸如在专利CN101703039 A中提出的方法，其描述了用于甲壳纲动物日本蟳(Charybdis japonica)的精子材料的稀释溶液，其功能是在将组织与为其在液氮罐中的保存而使用的冷冻保护剂接触之前使组织均匀化，旨在使精包与所使用的溶液直接接触。然而，所述冷冻保存方法完全稀释了样本，并导致其物理特性损失，损害了精子的受精能力。此外，在所述方法中仅使用DMSO作为冷冻保护剂，且没有描述其与维持渗透平衡的其它化合物的混合物。
专利EP 2641966 A1描述了用于生物样本的玻璃化过程的组合物，包括对细胞膜有渗透性的冷冻保护剂化合物和对细胞膜非渗透性的冷冻保护剂化合物，对细胞膜有渗透性的冷冻保护剂含量在相对于组合物总体积的30％至50％的范围内。然而，为了能够使用所提出的溶液，需要完全分解细胞样本，并因此损失了处理后样本的原始物理特性。
专利申请WO 2015057641 A1保护了用于冷冻保存组织的系统和进行生物样本的玻璃化的方法。所述应用的意义在于，它将所使用的玻璃化溶液描述为包含渗透性冷冻保护剂(DMSO)和非渗透性冷冻保护剂(海藻糖)。但是，没有提到使用其他溶液，也没有直接指出所使用的冷冻保护剂的浓度。此外，处理后的样本必须完全分解和悬浮以便与冷冻保护剂溶液接触，因此处理后的样本的原始物理特性将全部丧失。
在现有的冷冻保存方法中，没有一种能够处理高粘度生物样本而不需要将其完全分解。此外，在所有情况下都必须将样本完全悬浮并均匀化，以便它们能与所使用的冷冻保护剂紧密接触，因此，当意图保存精包的原始物理特性时，它们将不易被使用。
鉴于该问题，有必要提供一种用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够维持样本的原始物理特性，无需稀释它们以便被冷冻保存，且另外保存精包的活力完好。此外，有必要提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其在包含配子的情况下可保存它们的受精能力。
发明内容
本发明的主要目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的新方法。
本发明的另一目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够保存这些样本的细胞活力。
本发明的又一目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够冷冻保存无脊椎动物的精子样本，特别是甲壳纲动物、蜜蜂、蝴蝶或精子具有高粘度特点的任何其他无脊椎动物的精子样本。
本发明的另一目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够保存无脊椎动物的样本中高细胞活力。
本发明的又一目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够保存原始处理的样本的初始物理特性。
本发明的额外目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够保存无脊椎动物(例如来自甲壳纲动物和昆虫精子)的精子生育能力。
本发明的上述目的以及其他目的和优点，将在以下对所述发明的详细描述的基础上变得显而易见。
附图说明
图1示出了玻璃化之前精子团的组织切片(新鲜样本)，显示出可能来自蛋白质源的嗜酸性结构(黑色箭头)，包括在精子(圆形嗜碱性结构；见白色箭头)之间。放大200倍。
图2示出了来自处理B的解冻的精子团的组织切片(玻璃化之后)，显示出很少的嗜酸性结构(圆圈)。这样的结构在玻璃化过程中损失，可能是由于它们的蛋白质源和冷变性，而精子保持完好(黑色箭头)。放大200倍。
图3示出了冷冻之前或新鲜样本(a)精子团的组织切片与来自处理B的解冻的精子样本(b)的比较，其中观察到了之前在图1和2中显示的完好的精子(箭头)和一些嗜酸性结构(圆圈)。
具体实施方式
本发明提供了用于冷冻保存高粘度生物样本的新方法，其能够保存处理后样本的原始物理特性而不损失精包的活力。本方法特别地可用于实现冷冻保存无脊椎动物(诸如甲壳纲动物和昆虫)的精子样本，并已证明对于虾精子样本尤其有用。
为了实现上述，本发明的方法包括以下步骤：
a)将装载在合适的装置中的高粘度生物材料样本置于包含稀释剂水溶液的试管或冷冻小瓶(冷冻管)中，稀释剂水溶液优选地包括2.125g/kg的NaCl、0.110g/kg的KCl、0.052g/kg的H3BO3、0.019g/kg的NaOH、0.484g/kg的MgSO4·7H2O和对于每100ml稀释剂溶液有20μl来自包含10000IU的青霉素、10mg的链霉素和25μg两性霉素B的溶液，在21℃至25℃的温度下，时间范围为18至22分钟，样本不与溶液接触也不与试管内壁接触，用于达到合适的样本回收装置的目的；
b)将样本浸没在0.25-0.5M海藻糖中，时间范围为18至22分钟；
c)将样本转移到包括0.25-0.5M的海藻糖和10-20％的DMSO在稀释剂溶液中的冷冻保护剂/玻璃化溶液中，仅浸没其2/3，时间范围为从2至4分钟；
d)从冷冻保护剂溶液中移出样本并将它立即置于液氮中；
e)将样本置于冷冻小瓶中并最终存储在-196℃和-200℃之间的液氮中。
样本的解冻进行如下：将样本从液氮中取出并将其浸没在35℃至39℃的温度下的水浴中，时间范围为从4至9分钟，随后将其从冷冻小瓶中取出并放置在包含0.25-0.5M的海藻糖的平衡溶液中，时间范围为从15至25分钟。
使用上述方法能够保持样本的原始一致性而不损失细胞团的活力，同时，已证明其特别可用于冷冻保存无脊椎动物(诸如甲壳纲动物和昆虫)的精子样本，证实其特别可用于冷冻保存虾精荚。
实施例.虾精子样本的冷冻保存。
为了验证本发明的玻璃化方法与其他评估方法进行比较，对虾精荚样本进行处理，虾精荚样本是通过轻微按压位于第五对步足(pereiopod)和雄性交接器之间的生殖孔的基部而手动获得的。通过在食指和拇指之间按压精荚的前部区域，从而分离出所述样本的精子。
用于冷冻保存白虾南美白对虾(P.vannamei)中的精子的评估溶液是海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG)。将前面提到的玻璃化剂(海藻糖、DMSO和PEG)的组合和浓度分配至以下处理：A)PEG为6％，和DMSO为15％；B)海藻糖0.25-0.5M，和DMSO为10-15％；以及C)海藻糖0.25-0.5M和DMSO为16-20％。一旦制备好处理剂，就将它们储存在5℃下直到使用。所有冷冻保护剂浓缩液(浓溶液)均在本发明的方法的步骤a)中提到的稀释剂溶液中制备。
将每个精荚的精子样本置于专用于该类型的样本的装载装置中，并以垂直位置放置在包含100μl的稀释剂溶液的2毫升冷冻小瓶内。在该过程中，谨慎地处理样本以防止与冷冻小瓶的内壁或溶液接触；在环境温度(23℃)下存储样本20分钟。
然后，将装载装置放置在不同的处理剂中，允许仅三分之二的精子样本与冷冻保护剂溶液接触。所述步骤对评定是至关重要的，因为当超过2/3的样本放置在溶液中时会导致样本从装载装置上脱落，而当以较少量放置时则不能允许冷冻保护剂适当地渗透到样本中。
冷冻保存溶液分两步加入：对于处理A，在步骤1中将精子样本浸没在包含冷冻保护剂总浓度的一半的溶液(PEG 3％和7.5％DMSO)中一分钟。步骤2包括将样本投入冷冻保护剂总浓度(PEG6％和DMSO 15％)中20秒；对于处理B和C，步骤1包括将样本浸没在海藻糖中20分钟，并稍后在步骤2中，仅将2/3浸没在玻璃化溶液B(海藻糖0.25-0.5M和DMSO为10-15％)或C(海藻糖0.25-0.5M和DMSO为16-20％)中。在加入冷冻保护剂之后，将包含精子样本的装载装置快速引入液氮中并置于2mL冷冻小瓶中。随后，将冷冻小瓶于从-196℃和-200℃的范围的液氮罐中存储24小时。
为了证明这些方法的有效性，使用来自48只雄性的96个精荚进行了实验。将收集的精荚每天随机分配至不同的处理。一半的样本被分配至使雌性受精，且另一半被转移到下位于Ensenada，Baja California的CICESE公司，在那里会对冷冻保存的精子的质量进行检验。
解冻时，从液氮罐中取出冷冻小瓶，并在将每个样本快速浸没在大约37℃下的水浴中6秒。稍后，将它们置于平衡溶液(0.25-0.5M的海藻糖)中15-25分钟，并存储在环境温度下直到用于人工受精或活力评定。光学显微镜下的受精和活力评定均在Mariculturadel Pacífico,S.A.de C.V的设备上进行。使用荧光探针和组织学的活力评定在位于CICESE的Subsistema de Recursos Genéticos Acuáticos(SUBNARGENA，西班牙语首字母)的设施中进行。
为了进行受精，将解冻的样本悬浮于本发明方法的步骤a)中所述的稀释剂溶液中，并对其活力进行评估。将十个精子样本分配给用于10只准备排卵的雌性的人工授精的处理。人工授精之后产生甲壳纲动物幼虫的唯一处理是处理B(海藻糖0.25-0.5M和DMSO为10-15％)。
此外，转移到CICESE的七个样本被用于评定其活力。将解冻的样本置于包含1mL稀释剂溶液的试管中，以便在30秒期间被组织匀浆器分解。一旦制成悬浮液，按以下方式将细胞用
Figure GDA0003019316680000071
精子活力试剂盒(Life Technologies，Eugene，OR，USA)染色：将5μL的SYBR 14染色剂添加到毫升的细胞悬浮液(最终浓度100nM)，并在环境温度(23℃)下在黑暗中温育10分钟；然后，加入5μL的碘化丙啶染色剂(PI，最终浓度12μM)在环境温度下在黑暗中再温育10分钟。一旦染色过程结束，将20μL的小份置于玻片上，且细胞在具有用于绿色荧光的蓝色激发荧光滤光片的荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)下可视化。被SYBR 14染色剂(绿色)染色的细胞被认为是细胞膜完好的细胞，而被PI(红色)染色的细胞被认为是细胞膜受损的细胞。根据其组织学，对玻片的总共100个细胞进行评估，并最终确定细胞膜完好的细胞的百分比，呈现出处理后的样本100％的百分比的细胞有完好的细胞膜。
将解冻且平衡的精子的三个样本各自小心翼翼地包裹在米纸中，并放入组织学盒中，以在改良的戴维森溶液中固定约48小时。稍后，将样本在一系列醇中脱水，包裹石蜡，切片(8微米厚)并用苏木精-伊红染色。在光学显微镜下检查玻片，并评估精子的形态特征。在其组织学分析之后，未发现处理B、C中的解冻样本与未处理的新鲜样本之间精子结构存在差异(图1至图3)。其余处理未显示存在精子。
为了通过用光学显微镜观察来评估精子的活力，将平衡溶液(海藻糖0.25-0.5M进行15至20分钟)中的精子样本用1.5mL的稀释剂溶液均匀化。在用10％尼格罗黑(nigrosin)将小份染色之后，用400X的放大检查20μL的小份，并对存在形态学变化进行评估和记录。保持形态特征完好(球体和完整的棘突)的精子被认为是存活的，而那些具有不规则细胞体或畸形或缺失棘突的精子则被认为是非存活的。为了确定存活百分比，在每个检验玻片至少五个视野内，一式三份对100个精子进行计数，发现在所有情况下存活百分比都是100％。
上述结果表明，使用本发明的方法能够在不影响其原始形态特性的前提下维持高粘度生物样本的细胞团的活力；同样，本发明的方法能够保存冷冻保存的细胞的功能。
已经根据优选的方法描述了本发明；然而，对于在本领域具有一般专业知识的技术人员来说，显然可以在不偏离其精神和范围的情况下对本发明进行修改。

Claims (2)

1.一种用于冷冻保存虾精荚或精子团的方法，其特征在于包括以下步骤：
a)将虾精荚或精子团的样本置于包含稀释剂水溶液的试管或冷冻小瓶中，在21℃至25℃的温度下，时间范围为18至22分钟，防止所述样本与所述溶液或所述试管的内壁接触，所述稀释剂水溶液包括2.125g/kg的NaCl、0.110g/kg的KCl、0.052g/kg的H3BO3、0.019g/kg的NaOH、0.484g/kg的MgSO4·7H2O和包含10000IU的青霉素、10mg的链霉素和25μg两性霉素B的20μl溶液；
b)将所述样本浸没在0.25-0.5M海藻糖中，时间范围为18至22分钟；
c)将所述样本转移到包括0.25-0.5M的海藻糖和10-15％的DMSO在稀释剂水溶液中的冷冻保护剂/玻璃化溶液中，仅浸没所述样本的2/3，时间范围为从2至4分钟；
d)从所述冷冻保护剂溶液中移出所述样本并立即将其浸没在液氮中；以及
e)将所述样本置于冷冻小瓶中并将其最终存储在-196℃至-200℃的温度范围下的液氮中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括通过以下解冻所述样本：将其从液氮中移出并浸没在从35℃至39℃的温度下的水浴中，时间范围为从4至9分钟，随后将其从冷冻小瓶中移出并置于包含0.25M海藻糖的平衡溶液中15-25分钟的时间。
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