DE102012021900A1

DE102012021900A1 - Verfahren und Konservierungslösung zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma

Info

Publication number: DE102012021900A1
Application number: DE201210021900
Authority: DE
Inventors: Jakob Wegener; Tanja May; Günter Kamp; Kaspar Bienefeld
Original assignee: fur Angewandte Molekulare Physiologie Lab GmbH; Labor fur Angewandte Molekulare Physiologie GmbH
Current assignee: fur Angewandte Molekulare Physiologie Lab GmbH; Labor fur Angewandte Molekulare Physiologie GmbH
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2014-05-15

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma sowie eine Konservierungslösung zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Dialyse gegen eine Konservierungslösung durchgeführt. Das Sperma wird also nicht mit einer Verdünnungs- und/oder Konservierungslösung durch Rühren vermischt, sondern es wird direkt gegen die Konservierungslösung dialysiert. Durch dieses Dialyseverfahren bleiben die nativen Spermien-Cluster, welche bei vielen Insektenarten vorliegen, u. a. bei der Biene, erhalten. Die erfindungsgemäße Konservierungslösung umfasst als Kryoprotektivum mindestens einen nicht-reduzierenden Zucker. Ein gut geeigneter, nicht-reduzierender Zucker ist die Trehalose.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma sowie eine Konservierungslösung zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma.
Insekten sind wichtige Bestandteile in fast jedem Ökosystem. Darüber hinaus sind Bienen sehr wichtige Nutztiere, da sie neben der Honigproduktion wesentlich zur Bestäubung von Nutzpflanzen beitragen bzw. dafür notwendig sind, z. B. bei Lupinen, Obst und Raps. In den letzten Jahren sind der Bestand an Bienenvölkern und die Artenvielfalt bei Insekten insgesamt erheblich zurückgegangen. Dies ist weltweit zu beobachten. Ursache hierfür dürften Belastungen durch Parasiten, Insektizide, Monokulturen bzw. bei Honigbienen auch Inzucht von Zuchtlinien sein.
Unter Kryokonservierung versteht man das Einfrieren und die Aufbewahrung von Zellen und Geweben bei tiefen Temperaturen, wobei dies oft in flüssigem Stickstoff geschieht. Dies kann grundsätzlich bei Pflanzen- und Tierzellen angewandt werden. Die Kryokonservierung basiert auf der Fähigkeit von kleinen Molekülen, in Zellen einzudringen und eine Dehydration sowie die Bildung von intrazellulären Eiskristallen weitgehend zu verhindern. Diese würden sonst zur Zerstörung von Zellorganellen und zum Zelltod während des Einfrier- und/oder Auftauprozesses führen.
Kryokonservierung von Insekten-Sperma ist eine Möglichkeit zur ex situ-Lagerung von genetischen Ressourcen bei Insekten. Außerdem könnte die Inzucht z. B. bei Bienen durch Anpaarung zeitlich und räumlich getrennter Partner deutlich verringert werden.
Verfahren zur Kryokonservierung von Bienensperma sind bereits bekannt (vgl. etwa Hopkins et al. (2012), Reproduction, Fertility and Development 24 (8): 1079–1083; Kaftanoglu und Peng (1984), Journal of Apicultural Research 23 (3): 157–163). Beim erstgenannten Verfahren wird das von erwachsenen Drohnen gewonnene Sperma mit einer Lösung verdünnt, die verschiedene Antibiotika, Puffer, Zucker, Aminosäuren, BSA und mehrere Salze enthält. Die verdünnte Spermalösung wird dann bis zur Verwendung aufbewahrt. Für die Kryokonservierung wird die verdünnte Spermalösung mit einer Konservierungslösung gemischt, bevor zunächst eine langsame Abkühlung und dann eine Lagerung bei –40°C erfolgen. Die Konservierungs-lösung enthält DMSO als Kryoprotektivum, Natriumphosphat-Puffer sowie als dritte Komponente einen hohen Anteil an Eidotter von Hühnereiern oder das mit Cholesterin und BSA angereicherte Insektenmedium nach Schneider.
Bei dem Verfahren nach Kaftanoglu und Peng (1984) wird Bienensperma in flüssigem Stickstoff bei –196°C gelagert. Dem Sperma wurde zuvor DMSO in verschiedenen Konzentrationen und insgesamt 11 verschiedene Verdünnungslösungen zugesetzt. Nach Einfrieren und Auftauen wurde die Spermaqualität der verschiedenen Proben getestet. Die getesteten Verdünnungslösungen (Tabelle 1) enthielten unterschiedliche Salze, Puffer und Glucose in verschiedenen Konzentrationen.
Bei diesen bekannten Verfahren wird das Insekten-Sperma jeweils mit Lösungen verdünnt, die DMSO als Kryoprotektivum enthalten. DMSO kann auch separat von der Verdünnungslösung zugesetzt werden. Nachteilig bei diesen Verfahren sind das Auftreten von starken Inhomogenitäten bei der Zugabe der Verdünnungs- und/oder Konservierungslösungen sowie das Auftreten von Scherkräften, die durch das Rühren bei der Vermischung von Sperma und Lösung verursacht werden. Dies führt zu einer Beeinträchtigung der Sperma-Qualität. Kryoprotokolle mit der geschilderten Verdünnung der Spermien bewirken ferner vermutlich eine nicht-gewollte, vorzeitige Aktivierung der Spermien (Kaftanoglu und Peng, 1984).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma anzugeben, welches die oben dargestellten Nachteile vermeidet und insbesondere die Zahl der in die Samenblase der Königin einwandernden vitalen Spermien nach Auftauen der eingefrorenen Spermaproben und die Zahl der entstehenden Nachkommenschaft erhöht. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Konservierungslösung anzugeben, welche zu sehr hohen Befruchtungserfolgen nach Einfrieren und Auftauen der Spermaproben führt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma wird eine Dialyse gegen eine Konservierungslösung durchgeführt. Das gewonnene Sperma wird also nicht mit einer Verdünnungs- und/oder Konservierungslösung durch Rühren vermischt, sondern das gewonnene Sperma wird gegen die Konservierungslösung dialysiert. Durch dieses Dialyseverfahren bleiben die nativen Spermien-Cluster, welche bei vielen Insektenarten vorliegen, u. a. bei der Biene (Lensky und Schindler (1967), Annales de l'Abeille 10 (1): 5–16) erhalten. Eine Verdünnung von gewonnenem Sperma löst diese Spermien-Cluster in nachteiliger Weise auf und führt zur Vereinzelung der Spermien, was vermutlich mit einer vorzeitigen Aktivierung der Spermien einhergeht (Kaftanoglu und Peng, 1984). Dieser Effekt der vorzeitigen Aktivierung wird durch den Erhalt der Cluster zumindest deutlich verringert. Das lässt sich anhand der sehr viel später einsetzenden Motilität in aktivierenden Medien zeigen lässt. Sperma, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einfriertauglich gemacht wurde, enthält nach dem Auftauen noch die nativen Spermien-Cluster. Dies konnte an aufgetauten Spermaproben klar gezeigt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von Verfahren gemäß dem Stand der Technik (vgl. Kaftanoglu und Peng, 1984; Hopkins et al., 2012) somit dadurch, dass der Zusatz des Kryoprotektivums nicht durch Verdünnung mit einer entsprechenden Lösung erfolgt, sondern durch eine relativ kurzzeitige Dialyse gegen ein Konservierungsmittel, dem ein Kryoprotektivum zugesetzt wurde. Durch die Dialyse werden ferner starke Inhomogenitäten bei der Zugabe des Konservierungsmediums und Scherkräfte durch Rühren vermieden, die bei direkter Vermischung von Sperma und Konservierungsmedium in nachteiliger Weise auftreten. Nach Cobey, SW (Apidologie 38: 390–410, 2007) sind Rühren und die Verdünnung von Bienensperma nachteilig für den Besamungserfolg.
Mit dem Verfahren nach der Erfindung konnten nach Insemination von kryokonserviertem Sperma circa eine Million Spermien in der Samenblase (Spermatheka) der Königinnen nachgewiesen werden. Diese Konzentration ermöglicht eine längerfristige Produktion von weiblichen Nachkommen, die für die Aufzucht neuer Königinnen mit den konservierten Erbanlagen notwendig sind. Die gegenüber bekannten Verfahren (z. B. Kaftanoglu und Peng, 1984; Harbo, JR (1983): „Annals of the Entomological Society of America 76: 890–891.) deutlich nonere Anzahl von Spermien in der Spermatheka nach Insemination von dialysierten und kryokonserviertem Sperma zeigt, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren eine deutliche Verbesserung der Lagerfähigkeit erzielt werden kann und die Königinnen auch über längere Zeit in der Lage sein sollten, weibliche Nachkommen zu produzieren.
Die Dialyse wird nach einer Ausgestaltung der Erfindung bei 20–25°C, vorzugsweise bei 22,5°C, über einen Zeitraum von ca. 15–45 Minuten durchgeführt. Eine Dialyse über ca. 30 Minuten wird in den meisten Fällen ausreichend sein. Aufgrund der geringen Volumina wird die Dialyse vorteilhafterweise in einer Mini-Dialysekammer durchgeführt. Die Kammer wird in ein Rollrandglas (z. B. 20 ml, innerer Durchmesser 2,5 cm) gehängt.
Die Probenkammern von solchen Mini-Dialysekammern können mit 30–70 μl unverdünntem Insekten-Sperma gefüllt werden. Das dialysierte Sperma kann nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung in Einfrier-Schläuche gefüllt, in Goblets verpackt und anschließend mit einem Einfriergerät einem Abkühlungsprozess unterworfen werden. Die so gekühlten Goblets können dann unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.
Das Verfahren nach der Erfindung ist insbesondere für Bienen-Sperma geeignet.
Die erfindungsgemäße Konservierungslösung umfasst als Kryoprotektivum mindestens einen nicht-reduzierenden Zucker. Nicht-reduzierende Zucker zeigen in überraschender Weise einen positiven kryoprotektiven Effekt. Solche Zucker liegen als Blutzucker bei Insekten vor und können in die Zellen aufgenommen werden. Ein gut geeigneter, nicht-reduzierender Zucker ist die Trehalose (1-α-Glucopyranosyl-1-α-glucopyranosid). Sie kann in einer Menge von 0,5 bis 5,0 g/100 ml Konservierungslösung vorliegen. Trehalose kommt in verschiedenen Pflanzen und Tieren sowie in der Hämolymphe vieler Insekten vor.
Die erfindungsgemäße Konservierungslösung führt zu einem hohen Anteil vitaler Spermien in den Spermatheken von Königinnen nach Auftauen und Insemination und führt mit zu den höchsten Befruchtungserfolgen, die in der Literatur beschrieben sind (Kaftanoglu und Peng, 1984; Hopkins et al., 2012). Nahezu sämtliche (> 95%) der erzeugten weiblichen Puppen schlüpften. Aufgezogene weibliche Nachkommen aus Befruchtungen mit dem kryokonservierten Sperma zeigten einen normalen Phänotyp. Gegenüber der von Hopkins et al. (2012) vorgeschlagenen Verdünnungslösung hat die Konservierungslösung nach der Erfindung den Vorteil, dass keine Zusätze biologischer Herkunft genutzt werden. Die Reproduzierbarkeit wird dadurch erhöht und die Gefahr bakterieller/viraler Kontamination deutlich verringert.
Ein geeigneter Puffer ist ferner in der Konservierungslösung enthalten, um die Konservierungslösung auf einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,2, z. B. 8,2, einzustellen. Es kann HEPES-Puffer verwendet werden. Andere geeignete Puffer sind HEPPS, TRIS oder MES. Die Menge an Puffer kann 0,2 bis 0,8 g/100 ml betragen.
Die Konservierungslösung umfasst nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung Kalium- und Natriumsalze, z. B. KCl, NaHCO₃ und/oder Natriumcitrat. Geeignete Mengen liegen in der Größenordnung von 0,3–0,5 g für KCl, 0,1–0,4 für NaHCO₃ und 0,15–4,0 g für Natriumcitrat × H₂O, jeweils bezogen auf 100 ml Konservierunglösung.
Vorteilhaft für die Dialyse des Spermas sind relativ hohe Werte für die Osmolalität der Lösung. Bevorzugt sind Werte von mehr als 300, insbesondere mehr als 400 mosmol/L.
Eine weitere Ausführungsform der Konservierungslösung enthält neben einem reduzierenden Zucker auch DSMO (Dimethylsulfoxid) als weiteres Kryoprotektivum. Eine gut geeignete Konservierungslösung enthält 79 ml einer Lösung, die 1,145 g Trehalose, 0,41 g KCl, 0,21 g NaHCO₃, 2,43 g Natriumcitrat × 2H₂O und 0,475 g HEPES pro 100 ml umfasst, und 21 ml DMSO. Diese erfindungsgemäße Konservierungslösung wird hergestellt durch Lösen der Substanzen in 90 ml bidest. Wasser. Der der pH-Wert wird durch Zugabe von 4 Mol/L NaOH auf pH 8,2 eingestellt und die Lösung wird anschließend auf 100 ml aufgefüllt. 79 ml davon werden mit 21 ml DMSO vermischt und steril filtriert. Die Konservierungslösung ist damit gebrauchsfertig.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass die erfindungsgemäße Konservierungslösung bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendet wird, wodurch die oben für das Verfahren und die Konservierungslösung geschilderten Vorteile kombiniert werden.
Weitere Einzelheiten der Erfindung und die daraus sich ergebenden Vorteile werden im Folgenden anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen beschrieben und erläutert. Es zeigen:
: Spermien-Cluster in einem nativen Drohnen-Ejakulat.
: Verpackung der Kryoproben in Kryokonservierhülsen („Goblets”).

a) Kunststoff-Goblet (ID 17 mm; MiniTüb No. 16913/5133), der vor Gebrauch mit jeweils 3 Schlitzen (5 × 20 mm) perforiert wird, um den Einstrom von flüssigem Stickstoff zu erleichtern;
b) Zellstoffhülse zur Verhinderung des Herausfallens der Proben;
c) 3,5 cm langes PE-Schlauchstück (ID 1 mm; CD 1,8 mm; Roth No. 9583.1), dass mit der Probe befüllt und in den Goblet eingeführt wird
d) Zellstoffstopfen zum Verschluss des Goblets.

: Erhaltungsgrad von Spermien-Clustern in aufgetautem Sperma. Für die Mikroskopie wurde das aufgetaute Sperma kurz vor der Aufnahme mit der Konservierungslösung nach Beispiel 1 verdünnt.

A: intakter Kernbereich eines Spermienclusters mit dichter Zellpackung
B: im Randbereich des Clusters intensiver synchroner Geißelschlag
C: Reste von Spermienaggregaten mit weitgehend ungeordneten Geißeln

: Spermienvitalität bzw. Befruchtungserfolg nach Kryokonservierung von Bienensperma. Vergleich des Verfahrens nach der Erfindung der Kryokonservierung mit einem Verfahren ohne Dialyse (Zugabe der Konservierungslösung erfolgte nicht über Dialyse sondern durch Verdünnung mit der Konservierungslösung im Verhältnis 1:1,25 (Sperma: Gesamtvolumen), z. B. 10 μl Sperma und 2,5 μl Konservierungslösung, und Rühren.
: Bienenspermien aus Spermatheken besamter Königinnen. A: Spermien aus der Theka einer Königin, die mit nicht-kryokonserviertem Sperma besamt wurde. B: Spermien aus der Theka einer Königin nach Besamung mit Sperma, das nach dem Verfahren nach der Erfindung kryokonserviert wurde. Zusammensetzung der für die Aufnahmen verwendeten Suspensionslösung: 24,3 g/L Na-Citrat·2H₂O, 21,0 g/L NaHCO₃, 0,4 g/L KCl, 3,0 g/L Sulfanilamid, 31 g/L Saccharose, 3,0 g/L Glucose, 0,13 g/L Polyvinylpyrrolidon; pH 8,4.
Beispiel 1: Zusammensetzung der Konservierungslösung, die für die folgenden Beispiele jeweils verwendet wurde.

100 ml Konservierungslösung: 1,145 g Trehalose, 0,41 g KCl, 0,21 g NaHCO₃, 2,43 g Natriumcitrat × 2H₂O und 0,475 g HEPES pro 100 ml.

Nach Lösung der Substanzen in 90 ml bidestilliertem Wasser wurde der pH-Wert durch Zugabe von 4 Mol/L NaOH auf pH 8,2 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt. Neunundsiebzig ml dieser Lösung wurden mit 21 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) vermischt und sterilfiltriert.
Beispiel 2: Verfahren zur Kryokonservierung von Bienen-Sperma
2.1 Verwendete Geräte und Ausrüstung für die Kryokonservierung:
Binokular, Mikrokapillaren, Mikropeläus, Mini-Dialysekammer mit 20 ml Rollrandglas, Schüttler, Wasserbad, Dewar, Einfriergerät, Direktverdrängungs-Pipette, Einfrierschläuche, Goblets, flüssig-N₂-Tank, temperierbares Paraffinbad.
2.2 Gewinnung des Ejakulates:
Von ca. 20-tägigen Drohnen wurden nach einer Standardmethode (Ruttner (1975): 2. Auflage, Apimondia, Bukarest) Sperma in Kapillaren aufgenommen. Bis zu 47 μl wurden in einer Kapillare gesammelt. Unter Luftabschluss wurden die Spermaproben bis zu 2 Tage bei 12–15°C im Dunkeln gelagert.
2.3 Dialyse gegen die Konservierungslösung gemäß Beispiel 1:
Die Mini-Dialysekammer wurde in H₂O bidest. mindestens 10 Minuten vorinkubiert. Ein Rollrand-Glas (ID 2,5 cm) wurde mit 20 ml Konservierungslösung gefüllt und auf 22,5°C temperiert. Die Dialyse-Kammer wurde in das Rollrand-Glas gehängt. Auch die Probentaschen der Kammer wurden mit der Konservierungslösung luftblasenfrei gefüllt. Nach mindestens 5 Minuten wurde die Dialysekammer herausgenommen, die Probentaschen geleert und das gesammelte Sperma mit Hilfe eines Mikro-Peläus direkt aus den Sammelkapillaren in die Probentaschen gedrückt. Die Probentaschen wurden mit 30 μl bis 70 μl Sperma blasenfrei gefüllt. Die Dialysekammer wurde in das mit Konservierungslösung gefüllte Rollrandgefäß zurückgegeben, auf einen Laborschüttler gestellt und bei mittlerer Schüttelgeschwindigkeit für 32 Minuten bei 22,5°C inkubiert.
2.4 Kryokonservierung und Auftauen
Das Einfriergerät wurde auf eine Starttemperatur von 20°C sowie eine Abkühlrate von 3°/Minute programmiert und dann auf Starttemperatur gebracht. In einem Dewar wurde ca. 1L flüssiger Stickstoff bereitgestellt. Mit einer Direktverdrängungs-Pipette wurde das dialysierte Sperma aus den Dialysekammern in Einfrier-Schläuche umgefüllt (7,2 μl/Schlauch). Danach erfolgte der Schlauchverschluss durch Zuschweißen der Enden. Die Spermasäule sollte durch ausreichend lange Schlauchstücke vor Hitze geschützt sein. Mit dialysiertem Sperma gefüllte Schläuche wurden in Goblets (siehe ) verpackt, die dann in das Einfriergerät gehängt und ca. 5 Minuten auf die Starttemperatur von 20°C akklimatisiert wurden. Danach wurde der Abkühlungsprozess gestartet, der exakt nach 20 Minuten durch Herausnahme der Globlets beendet wurde. Die Globlets wurden sofort in den Dewar mit flüssigem Stickstoff getaucht und im N₂-Lagertank aufbewahrt. Zum Auftauen der Spermaproben wurden die gefrorenen Schläuche unter Flüssig-N₂ aus den Globlets herausgezogen und für 15 Sekunden in ein Paraffinölbad (35°C) gehalten.
Beispiel 3: Testung des Befruchtungserfolges mit aufgetautem Bienensperma
3.1 Vorbereitung der Königinnen und Mini-Völker
Königinnen wurden nach Standardmethoden (Ruttner, 1975) im weisellosen Volk erzeugt und zum Schlupf in Käfigen mit einem Tropfen Honig vereinzelt. Spätestens 2 Tage nach dem Schlupf wurden die Königinnen in Zusetz-Käfige („Iltisse”) überführt. Diese wurden danach mit Futterteig (ca. 5 Teile Invenzucker + 1 Teil Honig) verschlossen und in Kirchhainer Begattungskästchen („KBK”, Fa. Wienold, Best.-No. 3008) gehängt. Die Fluglöcher der KBKs wurden mit Absperrgittern versehen, um eine natürliche Begattung der Königinnen zu vermeiden. Die KBKs wurden dann mit je ca. 200 g Jungbienen aus weisellosen Völkern oder Brutnestern versorgt und danach 2 Tage kühl und dunkel aufbewahrt. Dann wurden sie auf einem Bienenstand aufgestellt und das Flugloch geöffnet. Die künstliche Besamung der Königinnen erfolgte, wenn sie 11–12 Tage alt waren. 24 Stunden vor der künstlichen Besamung wurden die Tiere kurz aus den KBKs entnommen und für 7 Minuten in einem geschlossenen Behälter mit CO₂-Gas narkotisiert, um das Einsetzen der Fruchtbarkeit zu beschleunigen. Nach dem Erwachen der Königinnen wurden sie wieder in die KBKs zurückgesetzt. Am folgenden Tag erfolgte die Insemination mit gleich großen Spermaportionen im Standardverfahren (Ruttner, 1975).
3.2 Bewertung von Brutnestern
Besamte Königinnen wurden mit Opalith-Plättchen markiert und in Iltisse gegeben, die danach mit Futterteig verschlossen und in die KBKs zurückgehängt wurden. Die Eiablage wurde alle 2–5 Tage kontrolliert. Siebzehn bis zwanzig Tage nach der Ablage der ersten Eier wurden alle Brutwaben mit verdeckelter Brut aus den Völkern genommen und von beiden Seiten fotografiert (Dokumentation des Brutbildes). Die flach-verdeckelten (Arbeiterinnen-) und bucklig-verdeckelten (Drohnen-)Zellen wurden gezählt. Die Brutwaben wurden bei 35°C und ca. 60% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Geschlüpfte Tiere wurden nach Geschlechtern getrennt gezählt. Nach Abschluss des Bienenschlupfes aus den Waben wurde die Gesamtzahl der geschlüpften Tiere pro Brutnest ermittelt. Aus den 3 erfolgreichsten Brutnestern (höchster Anteil verdeckelter weiblicher Brut) wurden die Königinnen zur Überwinterung in dafür entweiselte Bienenvölker gesetzt (auf je 11 Normalmaß-Waben).
3.3 Bewertung der Spermien-gefüllten Samenblase (Spermatheka)
Achtunddreißig Tage nach der Besamung wurden die verbliebenen Königinnen, d. h. alle außer den 3 erfolgreichsten, die zur Überwinterung in entweiselte Bienenvölker gesetzt wurden, dekapitiert und die Spermatheka entnommen. Die Anzahl der Spermien/Spermatheka, deren Motilität und der Anteil an Propidiumjodid-negativen (= ”vitalen”) Zellen wurden gemäß Wegener et al., 2012 (Cryobiology 65 (2): 126–131) bestimmt. Abweichend vom dort angegebenen Protokoll wurden die Zählung sowie die Motilitäts- und Vitalitäts-Analyse in einer annähernd isotonen Lösung durchgeführt.
3.4 Ergebnisse
zeigt Spermien-Cluster in einem nativen Drohnen-Ejakulat. Sperma, das nach dem obigen Verfahren nach der Erfindung einfriertauglich gemacht wurde, enthält nach dem Auftauen ebenfalls noch die nativen Spermien-Cluster ( ). Dies konnte in diesen Versuchen erstmalig an aufgetauten Spermaproben gezeigt werden. Ersetzt man das obige Dialyseverfahren durch ein Verfahren nach dem Stand der Technik, wobei die Konservierungslösung im Verhältnis 1:1,25 zugegeben und mit dem Sperma verrührt wurde, verursacht dies bereits die Auflösung der Cluster ( ).
Die Ansätze gemäß (Verfahren nach Beispiel 2) und (Verfahren gemäß dem Stand der Technik) wurden auf ihre Eignung zur Besamung von Königinnen getestet. Das Ergebnis ist in dargestellt. Die Auswertungen wurden 40 Tage nach Insemination durchgeführt.

A: Prozentualer Anteil vitaler Spermien in der Spermatheka (= Zellen, deren Plasmamembran intakt ist und deren Kern deshalb nicht durch Propidiumjodid angefärbt wurde).
B: Prozentualer Anteil weiblicher Brut.
C: Anzahl verdeckelter Arbeiterinnen-Zellen.
D: Gesamtzahl der Spermien in der Samenblase (Spermatheka).
a, b: Balken mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (t-Test; P < 0,01).

Beide Verfahren zeigen gleich hohe Anteile vitaler Spermien in den Spermatheken ( ). Auch der Anteil weiblicher Brut ist nahezu gleich groß ( ) und zählt zu den höchsten Befruchtungserfolgen, die in der Literatur beschrieben sind (Kaftanoglu und Peng, 1984; Hopkins et al., 2012). Im Falle des Dialyse-Verfahrens ist dies auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Konservierungslösung zurückzuführen. Nahezu sämtliche (> 95%) erzeugten, weiblichen Puppen schlüpften. Aufgezogene weibliche Nachkommen aus Befruchtungen mit dem kryokonservierten Sperma zeigten einen normalen Phänotyp.
Die Anzahl erzeugter Brutzellen mit weiblichen Puppen ( ) war tendenziell höher, wenn dialysiertes Sperma eingesetzt wurde. Noch deutlicher war der Unterschied hinsichtlich der Anzahl der Spermien in der Spermatheka (t-Test; df = 18; t = 3,8; P < 0.001). Gegenüber dem erfolgreichsten veröffentlichten Protokoll (Kaftanoglu und Peng, 1984) liegt dieser Wert ca. 2,8-fach höher. Auch der visuelle Zustand der Spermien in höherer Verdünnung ( ) entspricht dem typischen Bild intakter Bienenspermien.
Die gegenüber früheren Verfahren (Harbo, 1983; Kaftanoglu und Peng, 1984) deutlich höhere Anzahl von Spermien in der Spermatheka nach Insemination von dialysiertem und kryokonserviertem Sperma (Beispiel 2) zeigt, dass durch das Dialyseverfahren eine deutliche Verbesserung der Lagerfähigkeit erzielt werden kann und die Königinnen auch über längere Zeit in der Lage sein sollten, weibliche Nachkommen zu produzieren. Die Konservierungslösung nach Beispiel 1 hat gegenüber dem von Hopkins et al. (2012) vorgeschlagenen Verdünnungs-Medium zudem den großen Vorteil, dass keine Zusätze biologischer Herkunft genutzt werden. Die Reproduzierbarkeit wird dadurch erhöht und die Gefahr bakterieller/viraler Kontamination deutlich verringert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Hopkins et al. (2012), Reproduction, Fertility and Development 24 (8): 1079–1083 [0005]
Kaftanoglu und Peng (1984), Journal of Apicultural Research 23 (3): 157–163 [0005]
Kaftanoglu und Peng (1984) [0006]
Kaftanoglu und Peng, 1984 [0007]
Lensky und Schindler (1967), Annales de l'Abeille 10 (1): 5–16 [0009]
Kaftanoglu und Peng, 1984 [0009]
Kaftanoglu und Peng, 1984 [0010]
Hopkins et al., 2012 [0010]
Apidologie 38: 390–410, 2007 [0010]
Kaftanoglu und Peng, 1984; Harbo, JR (1983): „Annals of the Entomological Society of America 76: 890–891 [0011]
Kaftanoglu und Peng, 1984 [0016]
Hopkins et al., 2012 [0016]
Hopkins et al. (2012) [0016]
Ruttner (1975): 2. Auflage, Apimondia, Bukarest [0030]
Ruttner, 1975 [0033]
Wegener et al., 2012 (Cryobiology 65 (2): 126–131) [0035]
Kaftanoglu und Peng, 1984; Hopkins et al., 2012 [0038]
Kaftanoglu und Peng, 1984 [0039]
Harbo, 1983; Kaftanoglu und Peng, 1984 [0040]
Hopkins et al. (2012) [0040]

Claims

Verfahren zur Kryokonservierung von Insekten-Sperma, dadurch gekennzeichnet, dass eine Dialyse mit dem Sperma gegen eine Konservierungslösung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dialyse bei 20–25°C über einen Zeitraum von 15 bis 45 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dialyse in einer Mini-Dialysekammer mit einem 20 ml Rollrandglas durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probentaschen der Mini-Dialysekammer mit 30 μl bis 70 μl unverdünntem Sperma gefüllt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das dialysierte Sperma in Einfrier-Schläuche gefüllt wird, die anschließend in Goblets verpackt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Goblets mit einem Einfriergerät einem Abkühlungsprozess unterworden werden und die Goblets anschließend in flüssigen Stickstoff getaucht und in einem N₂-Lagertank aufbewahrt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Insekten-Sperma Bienensperma ist.
Konservierungslösung, enthaltend einen Puffer, Salze und mindestens ein Kryoprotektivum, dadurch gekennzeichnet, dass das Kryoprotektivum mindestens einen nicht-reduzierenden Zucker darstellt.
Konservierungslösung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht-reduzierende Zucker Trehalose ist.
Konservierungslösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Trehalose in einer Menge von 0,5 bis 5,0 g/100 ml Konservierungslösung vorliegt.
Konservierungslösung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer aus der Gruppe ausgewählt wird, die HEPES, HEPPS, Tris und MES umfasst.
Konservierungslösung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer HEPES ist und in einer Menge von 0,2 bis 0,8 g/100 ml Konservierungsmittel vorliegt.
Konservierungslösung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Salze Kalium- und Natriumsalze sind.
Konservierungslösung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Kaliumsatz KCl ist und in einer Menge von 0,3 bis 0,5 g/100 ml Konservierungslösung vorliegt.
Konservierungslösung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumsalz NaHCO₃ und/oder Natriumcitrat ist und in einer Menge von 0,1 bis 0,4 g NaHCO₃/100 ml Konservierungslösung und von 0,15 bis 4,0 g Natriumcitrat/100 ml Konservierungsmittel vorliegen.
Konservierungslösung nach einem der Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie 1,145 g Trehalose, 0,41 g KCl, 0,21 g NaHCO₃, 2,43 g Natriumcitrat × 2H₂O und 0,475 g HEPES pro 100 ml umfasst.
Konservierungslösung nach einem der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 7,5 und 8,8 liegt.
Konservierungslösung nach einem der Ansprüche 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Osmolalität der Konservierungslösung größer als 300 mosmol/L und insbesondere größer als 400 mosmol/L beträgt.
Konservierungslösung nach einem der Ansprüche 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie DMSO als weiteres Kryoprotektivum umfasst.
Konservierungslösung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie pro 100 ml 79 ml der Konservierungslösung nach Anspruch 16 und 21 ml DMSO umfasst.
Verwendung der Konservierungslösung nach einem der Ansprüche 8 bis 20 bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.