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Diese
Erfindung betrifft ein langsames Gefrierverfahren zum Gefrierkonservieren
von menschlichen Oozyten.
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Hintergrund der Erfindung
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In
US 5,985,538 wird der Einfluss
von 0,1 M und 0,2 M Saccharose auf die Oozyten-Gefrierkonservierung
offenbart. Dieses Dokument offenbart jedoch kein Verfahren zum Gefrierkonservieren
von Oozyten, worin das nicht-penetrierende Gefrierschutzmittel Saccharose
mit einer Konzentration von 0,3 M ist.
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Palasz
und Mapletoft, „Cryopreservation
of mammalian embryos and oocytes: recent advances", Biotechnology Advances,
Elsevier Publishing, Barking, GB, Vol. 14, No. 2, 1996, Seiten 127–149, offenbaren
zur Benutzung als nicht-penetrierendes Gefrierschutzmittel geeignete
Lösungen
umfassend 0,25 M bis 0,5 M Saccharose, Trehalose, Lactose oder Galactose.
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Otoi
Takeshige et al., „The
development of immature bovine oocytes cryopreserved by 1,2-propanediol", Journal of Reproduction
and Development, 1995, Vol. 41, Seiten 361–366, offenbaren ein Verfahren
zum Gefrierkonservieren von Rinderoozyten umfassend die Schritte
des Äquilibrierens
besagter Oozyten mit einer Mischung aus 0,16 M 1,2-Propandiol und
verschiedenen Saccharosekonzentrationen, darunter 0,3 M, mittels
des Drei-Schritt-Verfahrens. Die Oozyten werden dann gekühlt und
in flüssigem
Stickstoff eingefroren. Nach dem Auf tauen und Verdünnen ihrer
Gefrierschutzmittel mittels des Drei-Schritt-Verfahrens wurde die
Oozyten-Überlebensrate
angegangen.
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Otoi
T et al., „Cryopreservation
of mature bovine oocytes by vitrification in straws", Cryobiology, 1998,
Vol. 37, Seiten 77–85,
offenbaren Versuche, die durchgeführt worden sind, um die optimalen
Bedingungen zur Vitrifikation von in vitro gereiften Rinderoozyten
in Strohhalmen zu ermitteln. Eine schrittweise Zugabe von Oozyten
zu einer Vitrifikationslösung
bestehend aus 30% Ethylenglykol, 0,35 M Saccharose wurde vor dem
Vitrifizieren durch das Drei-Schritt-Zugabe-Verfahren durchgeführt. Der Einfluss
der Dauer des Aussetzens der Oozyten einer 0,5 M Saccharose im ersten
Schritt während
der Drei-Schritt-Verdünnung
wurde des Weiteren untersucht.
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Es
ist bekannt, dass die Gefrierkonservierung von unbefruchteten menschlichen
Oozyten eine Methode ist, die verschiedene Vorteile bietet, besonders
wenn Oozyten konserviert werden müssen von Patienten, die bezüglich einer
ovarialen Hyperstimulation gefährdet
sind und keine Embryonen während der
in vitro Fertilisationsbehandlung transferieren können. Jedoch
ist die Gefrierkonservierung von Oozyten, besonders von frischen
menschlichen Oozyten aufgrund der zytologischen Eigenart von Oozyten in
größere technische
Schwierigkeiten geraten als die Konservierung von männlichen
Keimzellen oder Embryonen.
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Renard
et al. (J. Reprod. Fert., 1984, 71, Seiten 573–580) beschreiben ein Verfahren
zum Gefrierkonservieren von Kaninchenembryonen, worin die Embryonen
mit verschiedenen Gefrierschutzmittel enthaltenden Lösungen,
wie etwa Lösungen
enthaltend Saccharose in Konzentrationen von 0 bis 1,0 M behandelt
worden sind. Das Erhöhen
der Konzentration an Saccharose auf 1,0 M beeinflusste die Entwicklung
der Embryonen negativ. Diese Veröffentlichung
sieht nicht vor, dass das Verfahren für andere Zelltypen als embryonale
Zellen verwendet werden kann.
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Die
geringe Anzahl an Geburten aus menschlichen gefrierkonservierten
Oozyten, die in der Literatur berichtet werden, zeigt die technischen Schwierigkeiten
des Gefrierkonservierens von Oozyten. Bisher liefern die über die
Gefrierkonservierung von Oozyten durchgeführten Untersuchungen gegensätzliche
Ergebnisse bezüglich
geeigneterer und weniger schädlicher Verfahren
zur Aufrechterhaltung der zellulären
Unversehrtheit und zum Erhalt eines höheren Anteils an brauchbaren
Oozyten.
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Bisher
ist kein maßgebliches
Protokoll zum Gefrierkonservieren menschlicher Oozyten festgelegt
worden und die Anzahl an bisher verwendeten Oozyten ist noch zu
niedrig, um eine maßgeblich
anzuwendende Methodik zu ermitteln.
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Die
menschliche Oozyten-Überlebensrate bei
der Gefrierkonservierung hängt
sowohl von der Oozyten-Größe als auch
vom verwendeten Gefrierschutzmittel (Zusammensetzung, Konzentration
und Aussetzungsdauer) und von der Einfrier-/Auftau-Geschwindigkeit
ab.
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In
dem Gefrierkonservierungsverfahren ist die Oozytengröße ein sehr
wichtiger Parameter, der die Überlebensrate
beeinflusst, da die große
Wassermenge im Ooplasma intrazelluläre Eisbildung während des
Gefrierprozesses verursacht: intrazelluläres Eis ist einer der hauptverantwortlichen
Faktoren für die
intrazellulären
Strukturschädigungen.
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Die
Oozytengefrierkonservierungsprotokolle umfassen üblicherweise die folgenden
Schritte:
a) zunächst
das Aussetzen der Oozyten einer Lösung umfassend ein penetrierendes
Gefrierschutzmittel (z.B. 1,2-Propandiol (PROH)), dessen Zweck es
ist, die durch Wasserkristallisation hervorgerufenen intrazellulären Strukturschädigungen
auf ein. Minimum zu reduzieren, b) anschließend das Aussetzen der Oozyten
für eine
Dauer von 2–5
Minuten einer sogenannten Ladelösung
enthaltend eine Mischung aus einem penetrierenden Gefrierschutzmittel
und einem nicht-penetrierenden Gefrierschutzmittel (z.B. Saccharose),
um die Oozyten-Dehydratisierung zu erhöhen, c) langsames Abkühlen auf –150°C, d) Aufbewahren
in flüssigem
Stickstoff (–196°C), e) Auftauen,
f) Verdünnen
und Entfernen der Gefrierschutzmittel durch Aussetzen von sogenannten
Auftaulösungen
und Rückführen auf
die physiologische Umgebung für
weitere Handhabungen.
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Die
Vorteile der Gefrierschutzmittel beziehen sich auf I) ihre Konzentration,
II) Aussetzungsdauer, III) die Temperatur, bei der sie zu den Oozyten
hinzugefügt
werden.
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Offenbarung
der Erfindung
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In
einem erfindungsgemäßen Verfahren
zum Gefrierkonservieren menschlicher Oozyten ist es vorgesehen,
Lade-/Auftaulösungen
enthaltend Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M oder größer zu verwenden.
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In
der Tat ist überraschenderweise
festgestellt worden, dass die Gegenwart von Saccharose mit einer
Konzentration von 0,3 M oder größer außerhalb
der Zellmembran die Zell-Dehydratisierung/Rehydratation mit einer
Verbesserung der Überlebensrate
der gefrierkonservierten Oozyten stark erhöht.
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Des
Weiteren sieht das vorliegende Verfahren in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
vor, menschliche Oozyten einer Ladelösung enthaltend mindestens
0,3 M Saccharose für
eine Dauer von 15 min auszusetzen, bevor das Gefrierverfahren begonnen
wird.
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In
diesem letzten Fall hat eine durch ein invertiertes Mikroskop erfolgte
morphologische Analyse eine zytoplasmatische Volumenreduktion der
Oozyten von etwa 30% mit weiterer Dehydratisierung gezeigt; dies
reduziert auch die Möglichkeit
der intrazellulären
Eisbildung.
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Detaillierte
Beschreibung einer Ausführungsform
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Die
wesentlichen Stadien eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Gefrierkonservieren
frischer menschlicher Oozyten werden nachstehend beschrieben.
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Die
folgenden Lösungen
werden in dem Gefrierverfahren verwendet:
- – eine PBS-Lösung (Dulbecco's Phosphat-gepufferte
Salzlösung
w/o Natriumbicarbonat)
- – eine Äquilibrierlösung (1,5
M PROH),
- – eine
Ladelösung
(1,5 M PROH + 0,3 M Saccharose),
- – eine
SSS-Lösung
(Synthetisches Serum-Substitut)
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Die
Zusammensetzung der obigen Lösungen
ist wie folgt:
PBS-Lösung
8 ml PBS
Äquilibrierlösung (1,5
M PROH) 6,79 ml PBS 1,21 ml PROH (1,2-Propandiol)
Ladelösung (1,5
M PROH + 0,3 M Saccharose) 6,79 ml PBS 1,21 ml PROH 1,128 gr Saccharose.
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Diese
Lösungen
werden in einem langsamen Gefrierprogramm verwendet. Die Lösungen werden
hergestellt, gemischt, gefiltert und bei +4°C aufbewahrt. Es ist besser,
die Lösungen
vor dem Verwenden für
15 min bei Raumtemperatur aufzubewahren.
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Wenn
die oben beschriebenen Lösungen
fertig sind, wird eine Petri-Schale mit 2,1 ml PBS-Lösung + 0,9 ml SSS (Synthetisches
Serum-Substitut) hergestellt. In dieser Lösung werden alle Oozyten von
ihrem Nährmedium
ausgewaschen, bevor sie in die Äquilibrierlösung überführt werden.
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Dann
wird eine geeignete Schale mit einer Mehrzahl an Kammern hergestellt:
Einige
dieser Kammern enthalten 0,350 ml Äquilibrierlösung (1,5 M PROH) + 0,150 ml
SSS (Synthetisches Serum-Substitut). In diese Lösung werden ein oder zwei Oozyten/Kammer überführt und
für 10
min aufbewahrt, bevor sie in die Ladelösung überführt werden.
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Die
anderen Kammern enthalten 0,350 ml Ladelösung (1,5 M PROH + 0,3 M Saccharose)
+ 0,150 ml SSS (Synthetisches Serum-Substitut). Die (aus der Äquilibrierlösung genommenen)
Oozyten werden in die Ladelösung überführt und
schnell in Plastik-Strohhalme geladen.
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Danach
werden die Strohhalme in einen progammierbaren Gefrierschrank, z.B.
ein Kryo 10 series III (Planer Kryo 10/1,7 GB) gestellt.
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Gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens werden die Oozyten vor dem Beginn des
Gefrierprogramms der Ladelösung
(enthaltend Saccharose mit einer Konzentration von mindestens 0,3
M) für
13–15
min und vorzugsweise für
etwa 15 min ausgesetzt.
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Dann
wird ein langsames Gefrierverfahren auf die Oozyten wie folgt angewandt.
Die Anfangskammertemperatur ist 20°C. Dann wird die Temperatur
langsam (2°C/min)
auf –7°C erniedrigt,
bei der die Eiskeimbildung manuell induziert wird. Nach einer Haltezeit
von 10 min bei –7°C werden
die Strohhalme langsam (0,3°C/min)
auf –30°C runtergekühlt und dann
schnell (50°C/min)
auf –150°C.
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Nach
10–12
min Stabilitätstemperatur
werden die Strohhalme in Flüssig-Stickstofftanks überführt und
bis zum Auftauen aufbewahrt.
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Die
folgenden Lösungen
werden in dem Auftauverfahren verwendet:
- – eine Stammlösung 1,0
M PROH zusammengesetzt aus 14,35 ml PBS 1,65 ml PROH und verwendet,
um
- – A)
1,0 M PROH-Lösung
+ 0,3 M Saccharose, zusammengesetzt aus 8 ml Stammlösung (1,0
M PROH) 1,128 gr Saccharose
- – B)
0,5 M PROH-Lösung
+ 0,3 M Saccharose, zusammengesetzt aus 4 ml Stammlösung (1,0
M PROH) 4 ml PBS 1,128 gr Saccharose herzustellen.
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Die
folgenden Lösungen
werden auch verwendet:
- – C) 0,3 M Saccharose-Lösung, zusammengesetzt
aus: 8 ml PBS 1,128 gr Saccharose
- – D)
PBS-Lösung,
zusammengesetzt aus: 8 ml PBS
- – E)
SSS-Lösung
(Synthetisches Serum-Substitut).
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Diese
Lösungen
werden in einem schnellen Auftauprogramm verwendet. Die Lösungen werden hergestellt,
gemischt, gefiltert und bei +4°C
aufbewahrt. Es ist besser, die Lösungen
vor dem Verwenden für
15 min bei Raumtemperatur aufzubewahren.
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Zum
Auftauen werden die Strohhalme zunächst für 30 s Luft erwärmt und
dann in ein 30°C-Wasserbad für 40 s eingetaucht,
bis alle Eisspuren verschwunden sind.
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Dann
wird für
jeden Strohhalm eine Vier-Kammer-Schale zum Entfernen des Gefrierschutzmittels
durch schrittweises Verdünnen
von PROH in den Auftaulösungen
hergestellt.
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Besonders
bevorzugt enthält
die erste Kammer 0,350 ml Lösung
A (1,0 M PROH-Lösung
+ 0,3 M Saccharose) + 0,150 ml Lösung
E SSS (Synthetisches Serum-Substitut). Der Inhalt des Strohhalms wird
in diese Lösung
ausgestoßen
und die Oozyten werden für
5 min bei Raumtemperatur äquilibriert.
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Die
zweite Kammer enthält
0,350 ml Lösung B
(0,5 M PROH-Lösung
+ 0,3 M Saccharose) + 0,150 ml SSS (Synthetisches Serum-Substitut).
Die aus der ersten Kammer genommenen Oozyten werden in diese Lösung überführt und
für zusätzliche
5 min bei Raumtemperatur aufbewahrt.
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Die
dritte Kammer enthält
0,350 ml Lösung
C (0,3 M Saccharose-Lösung)
+ 0,150 ml SSS-Lösung (Synthetisches
Serum-Substitut). Die aus der zweiten Kammer genommenen Oozyten
werden in diese Lösung überführt und
für 10
min bei Raumtemperatur aufbewahrt.
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Die
vierte Kammer enthält
0,350 ml Lösung D
(PBS-Lösung)
+ 0,150 ml SSS-Lösung
(Synthetisches Serum-Substitut). Die aus der dritten Kammer genommenen
Oozyten werden in diese Lösung überführt und
für 10
min bei Raumtemperatur und für
zusätzliche
10 min bei 37°C
aufbewahrt.
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Schließlich können die
Oozyten vor der Befruchtung in ein herkömmliches Nährmedium überführt werden.
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Experimentelle
Daten haben eine sehr hohe Überlebensrate
(82%) von frischen menschlichen Oozyten, die mit einer Lade-/Auftaulösung enthaltend
Saccharose mit einer Konzentration von 0,3 M gefrierkonserviert
wurden, gezeigt. Eine höhere Überlebensrate
wird auch beobachtet, wenn die Oozyten der Ladelösung für 13–15 min anstelle von 2–5 min ausgesetzt
werden.