-
Die
Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Tieftemperaturbiologie.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Kälteschutzverfahren
und neuartige Kälteschutzlösungen sowie
die Prinzipien, die eine Minimierung ihrer Toxizität ermöglichen,
vorzugsweise ohne ihre Verglasungsfähigkeit und Entglasungswiderstandsfähigkeit
im Wesentlichen zu schwächen.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Kryokonservierung
betrifft die Konservierung von Systemen, die bei Temperaturen unter
dem normalen Gefrierpunkt von Wasser (0°C) lebende Zellen enthalten.
Die Geschichte und Literatur der Tieftemperaturbiologie, das Gebiet
der Wissenschaft, das die biologischen Phänomene der Tieftemperatur zu
verstehen und Kryokonservierungsmethoden zu verbessern versucht,
ist groß und
umfangreich, und ihre Erfolge haben in den letzten etwa 40 Jahren
Hunderte von Millionen von Amerikanern und viele andere auf der
ganzen Welt auf die eine oder andere Art berührt. Aber trotz ihrer vielen
eindrucksvollen Erfolge hat die Tieftemperaturbiologie noch keine
Wege zur zeitlich unbegrenzten Kryokonservierung transplantierbarer
Nieren, Herzen und Lebern (trotz des hohen Wertes, den eine solche
Technologie hätte)
oder sogar viel einfacherer Systeme gefunden. In vielen Fällen können Zellen,
wie z. B. menschliches Sperma und Stiersperma und sogar menschliche
Augenhornhäute,
ein Einfrieren überstehen,
aber mit einem unerwünschten
Ausmaß von
Verletzungen. Zum Beispiel frieren bis zu 95 % von menschlichem
Spendersamen nicht gut genug, um klinisch verwendet zu werden, das Überleben
von Stiersperma beträgt
im Wesentlichen weniger als 100 %, und gefrorene/aufgetaute Augenhornhäute verhalten
sich so schlecht, dass Augenbanken allgemein lieber die einfache
kalte Lagerung in OptiSolTM für kurze
Zeitspannen einsetzen als unbegrenzte Konservierung, die die Kosten
erheblich reduzieren und viele Versorgungsprobleme lösen könnte. Es
gibt eindeutig genügend
Gründe,
die Kryokonservierungstechniken zu verbessern, sowohl vom humanitären als
auch geschäftlichen
Standpunkt aus betrachtet, und doch ist dies bis jetzt nicht erreicht
worden.
-
Fahy
schlug 1981–1984
vor, dass eine ausgezeichnete Kryokonservierung sowohl einfacher
als auch hoch komplexer lebender Systeme ohne Eisbildung erreicht
werden könnte,
ein Verfahren, das als Verglasung bezeichnet wird, indem als Kälteschutzmittel
bekannte chemische Mittel in extrem hohen Konzentrationen verwendet
werden (Fahy, Cryobiology 18: 617, 1981; Fahy und Hirsh in: Organ
Preservation, Basic and Applied Aspects, D. E. Pegg, I. A. Jacobsen
und N. A. Halasz, Hrsg., MTP Press, Ltd., 1982, S. 399–404; Fahy
et al., Cryobiology 21: 407–428,
1984). Wie Fahy 1986 ferner erläuterte, "... können alle
vorausgesetzten Probleme in der Tieftemperaturbiologie im Prinzip
durch die Wahl einer ausreichend hohen Konzentration von Kälteschutzmittel
gelöst
werden. ... Im Extremfall könnte
jegliche Eisbildung vollständig
unterdrückt
werden, wenn eine Kälteschutzmittel-Konzentration verwendet
wird, die ausreicht, die Verglasung sicherzustellen." Fahy, Cryobiology
23: 1–13
(1986).
-
Der
potentielle Markt für
Gewebsersatz jeglicher Art, wenn erst einmal alle Versorgungs- und
Abstoßungsprobleme
beseitigt sind, ist von kompetenter Seite auf an die 500 Milliarden
Dollar pro Jahr geschätzt worden.
Dieses Potential kann durch eine Kombination von erheblich verbesserter
Beherrschung der Abstoßung,
verstärkter
Wiederherstellung natürlicher
Gewebe und Organe sowie Entwicklung künstlicher Gewebe und Organe
verwirklicht werden (entweder technisch hergestellte Gewebe und
Organe oder Gewebe und Organe, die einfach im Labor gezüchtet werden
anstatt im menschlichen Körper),
aber nur, wenn es auch möglich wird,
die enorme Anzahl von Geweben und Organen, die zur Abdeckung dieses
immensen Marktes erforderlich sind, mittels Kälte zu konservieren.
-
Der
Wert von Lösungen
mit minimaler Toxizität
zur Kryokonservierung ist eindeutig enorm und stellt ein Problem
dar, das bis jetzt trotz der intensiven Bemühungen von Kryobiologen auf
der ganzen Welt nicht gelöst
wurde, die seit dem Bericht über
die vor Kälteschaden
schützenden
Wirkungen von Glycerol 1949 (Polge, Smith und Parkes, Nature 164:
666, 1949) extensiv an der Kryokonservierung arbeiten. Fahy selbst
hat zahlreiche Bemühungen
zur Verbesserung seiner eigenen Verglasungslösungen für Gewebescheiben und Organe
ohne Fortschritt seit der Übernahme
der VS4-VS41A-Serie um 1986 beschrieben (Fahy, Levy und Ali, Cryobiology
24: 196–213,
1987; Fahy, Lilley, Linsdell, Douglas und Meryman, Cryobiology 27:
247–268,
1990; Fahy, Cryobiology 35: 344–345,
1997).
-
US-A-4,559,298
offenbart ein Verfahren zur Kryokonservierung biologischer Materialien
in einem nicht gefrorenen oder glasigen Zustand. PVP (Polyvinylpyrrolidon)
ist ebenfalls als ein Additiv erwähnt, das helfen kann, eine
Entglasung zu verhindern.
-
Eine
der Studien, auf die in der WO 96/05727 Bezug genommen wurde (vgl.
Seite 7, Zeile 29 bis Seite 8, Zeile 1) war die Verwendung nicht
eindringender Wirksubstanzen, die als Ersatz für einen Anteil des ansonsten
benötigten
Penetriermittels dienen können
und so dem Zellinneren eine zusätzliche
intrazelluläre
Wirksubstanzexposition ersparen.
-
WO
96/30459 bezieht sich auf vorgeschlagene Eiskontrollmoleküle und deren
Anwendungsformen. Es wird vorgeschlagen, dass diese Eiskontrollmoleküle oder
IIDs (Eis-Grenzflächendotanten)
das Wachstum von Eis in verglasbaren Lösungen verlangsamen. Es wird
angedeutet, dass Eiskristalle, die sich dennoch bilden, klein genug
sind, um beim Konservieren unschädlich
für Organe,
Körperflüssigkeiten
oder andere Körpergewebe
zu sein. Zu diesem Zweck wird vorgeschlagen, Kryokonservierungslösungen IIDs
zuzusetzen. Es wird ferner vorgeschlagen, dass synthetische IIDs
produziert oder synthetisch hergestellt werden können, die z. B. Saccharide
oder Polysaccharide umfassen, die mit einem Kohlenstoffpolymer-Rückgrat verbunden
sind, wie es z. B. in PVA (Polyvinylalkohol) zu finden ist (vgl.
Seite 15, Zeile 19 bis Seite 16, Zeile 11). PVA selbst gehört jedoch
nicht zu den vorgeschlagenen IIDs.
-
WESEN DER
ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Anmeldung stellt Kälteschutzlösungen bereit,
die selbst bei höheren
Gesamtkonzentrationen als zuvor betrachtet eine beispiellose Ungiftigkeit
und dabei eine gute Stabilität
beim Erwärmen
aufweisen, und stellt Verfahren zur Gestaltung zusätzlicher
Beispiele davon bereit. Durch Verwenden des Prinzips, das in den
Beispielen vorgestellt und in Anspruch 1 definiert ist, besitzt
der Anwender große
Flexibilität
in der Auswahl von Variationen bei der Feinabstimmung für die besonderen
Bedürfnisse
des Anwenders. Des Weiteren gestattet die Erfindung bei Beschäftigung
mit den hierin offenbarten neuen Gestaltungsprinzipien die Gestaltung
ganz neuer vor Kälteschaden
schützender
Substanzen. Die Erfinder glauben, dass diese neue Kryokonservierungstechnologie
die erfolgreiche Konservierung der meisten Systeme durch Einfrieren
oder Verglasung erlauben wird. Die vorliegende Erfindung führt ferner
neuartige Gefrierschutzmittel ein, die für spezielle Verwendungen basierend
auf den allgemeinen Prinzipien und neuartige Verwendungen zuvor
bekannter Gefrierschutzmittel ausgewiesen sind. Beide sind wertvoll
beim Nachweis von Kryokonservierungslösungen der besten Art.
-
Die
Erfindung stellt einen neuen theoretischen und praktischen Leitfaden
bereit, der zur Herstellung von Verglasungslösungen mit minimaler Toxizität nützlich ist.
Die Erfindung stellt ferner auf diesen neuen theoretischen Einsichten
basierende spezifische Familien von Verglasungslösungen bereit, die minimale
Toxizität aufweisen
und für
unähnliche
biologische Systeme wirksam sind.
-
So
stellt die vorliegende Erfindung verbesserte Lösungen zur Kryokonservierung
von Zellen, Geweben, Organen, künstlichen
Organen, künstlichen
Geweben und unbelebten biologischen Systemen bereit. Die Erfindung
stellt auch auf den neuen Verglasungslösungen basierende spezifische
Familien von Gefrierlösungen
bereit.
-
Die
Erfindung stellt Kälteschutzlösungen und
Verfahren bereit, die ferner bei der Konservierung durch Gefrierpunktserniedrigung,
Unterkühlung
und kalte Lagerung Anwendung finden. Die Erfindung stellt ferner spezifische
Lösungen
bereit, die, wenn sie auf die richtige Art verwendet werden, gänzlich unvorhergesehene vorteilhafte
Wirkungen aufweisen (reduzierte Kälteschutztoxizität, verstärkte Verglasungsneigung
und verstärkte
Widerstandsfähigkeit
gegen Entglasung).
-
Hierin
werden neue Wege und neue Wirksubstanzen zum Hemmen des Wachstums
von Eiskristallen in wässrigen
Lösungen
und in anderen Zusammenhängen
beschrieben. Die Erfindung stellt Verfahren zur Maßstabsvergrößerung der
Verglasung kleiner biologischer Systeme zur Verwendung bei großen biologischen Systemen
mit minimalen oder keinen erforderlichen Erhöhungen der Konzentrationen
von Standard-Kälteschutzmitteln
bereit. Die Erfindung stellt ferner Kälteschutzlösungen bereit, die, sehr überraschend,
keine Lücke
zwischen der Konzentration, die verglast, und der Konzentration
aufweist, die mit mäßigen Geschwindigkeiten
ohne Entglasung erwärmt
werden kann.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt
die Toxizität
(gemessen durch Gewebereduktion im Verhältnis K+/Na+) von 13 Verglasungslösungen für Kaninchen-Nierenrindenscheiben.
-
2 stellt
die Toxizitätsdaten
gemäß 1 mit
Bezug auf den Wassergehalt der Lösung
dar.
-
3 zeigt
eine retrospektive Analyse von Lebensfähigkeitsdaten bezogen auf qv*.
-
4 zeigt
die Lebensfähigkeit
von Kaninchen-Nierenrindenscheiben aufgetragen gegen qv* in Lösungen,
die ein Gemisch aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Formamid und Ethylenglycol
(EG) enthalten.
-
5 zeigt
die Daten aus 3 aufgetragen bezogen auf die
absoluten Konzentrationen von DMSO, Formamid und Ethylenglycol in
den Lösungen
sowie mit Bezug auf den Molprozentgehalt von D(1)F in dem Gemisch.
-
6 zeigt
die Wirkung des Variierens von Veg durch
- a)
Erhöhen
des D(1)F:EG-Molverhältnisses
und
- b) systematisches Ersetzen von EG durch PG.
-
7 zeigt
die Wirkung des Variierens von Veg durch Reduzieren von Formamid
zugunsten von DMSO oder zugunsten von Ethylenglycol oder durch Reduzieren
von DMSO zugunsten von Ethylenglycol.
-
8 beschreibt
die Vielseitigkeit von Formamid, Harnstoff, Formamid/Harnstoff-Gemischen und Hydroxyharnstoff
bezogen auf ihre Wirkungen auf die Zell-Lebensfähigkeit und bezogen auf die
Neutralisierung dieser Wirkungen durch Dimethylsulfoxid.
-
9 stellt
das Verfahren zum Auswählen
von Lösungen
zur Verwendung in Unterkühlungsversuchen an
lebenden Systemen dar.
-
10 fasst
den mit den neuen Lösungen
erreichten Stabilitätsgewinn
und Lebensfähigkeitsgewinn im
Vergleich zur früheren
Standardlösung
VS41A zusammen.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine große Familie
von zweckmäßig zusammengesetzten
und ausgewogenen Kälteschutzmittel-Gemischen,
die Zusammensetzungen mit minimaler Toxizität zur Kryokonservierung von
Proteinen, Organellen, Zellextrakten, Zellen, Geweben, Blutgefäßen, Organen
und künstlichen
oder technisch hergestellten Zellen, Geweben, Blutgefäßen, Organen
oder Organoiden, Organismen oder anderen biologischen Systemen durch
Verglasung, Einfrieren und andere Mittel sowie die zugehörigen Prinzipien
bereitstellen, welche die Strukturformulierung überlegener Kälteschutzlösungen regieren.
Es besteht die Überzeugung,
dass die vorliegende Erfindung dem Praktiker mit normalem Fachwissen
erlauben wird, eine Kryokonservierungslösung zur Verwendung auszuwählen, die
den Wert seiner früheren
Kryokonservierungslösung übertrifft.
Es besteht ferner die Überzeugung,
dass ein Lizenzgeber der vorliegenden Offenbarung, wenn er bei einem
Kryokonservierungsproblem um Beistand gebeten wird, in der Lage
sein wird, die bereitgestellten Beispiele gemäß den hierin enthaltenen Prinzipien
zu modifizieren und bei einfacher Betrachtung der Biologie des zu
konservierenden Systems eine spezifische Version herzustellen, die
speziell auf das interessierende System anwendbar ist.
-
Bis
heute wird die gemäß Fahys
Basisansatz angewendete Verglasung, die unter "Hintergrund der Erfindung" beschrieben ist,
erfolgreich bei einer breiten Vielfalt lebender Systeme verwendet
(z. B. Rall und Fahy, Nature 313: 573–575, 1985; Takahashi et al.,
Cryobiology 23, 103–115,
1986; Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging Applications
and Engineering Contributions, J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg.,
ASME, 1988, S. 113–146).
Jedoch war Verglasung im Allgemeinen außerhalb des Gebiets der Embryo-Kryokonservierung
wegen der Toxizität
der für
das Verfahren benötigten
hohen Kälteschutzmittel-Konzentrationen
nicht weit verbreitet, was die Anwendung des Verfahrens oft unpraktisch,
schwierig oder unmöglich
macht. Insbesondere ist enttäuschend,
dass Fahys Verglasungsansatz in erster Linie durch den Wunsch motiviert
war, komplexe Systeme, wie z. B. Säugerorgane, bei Temperaturen
unter –100°C zu konservieren
und aufzubewahren. Dennoch ist dieses Ziel bis 1998, 17 Jahre nach
dem ersten Vorschlag, noch nicht erreicht worden. Der Grund ist
wohl, dass derzeit verfügbare
Kälteschutzlösungen zu
toxisch bleiben, um ein Überleben
von 100 % der mit solchen Lösungen
behandelten Organe zu gestatten, selbst ohne Kühlung auf kryogene Temperaturen
und Wiedererwärmung.
-
Das
Problem der Verringerung der Kälteschutzmittel-Toxizität betrifft
nicht nur die Kryokonservierung durch Verglasung. Wie Fahy auch
unterstrich (Fahy, Cryobiology 17: 371–388, 1980; Fahy, CryoLetters
4: 309–314,
1983; Fahy, Cryobiology 21: 407–426,
1984; Fahy, Cryobiology 23: 1–13,
1986), produziert Einfrieren wegen des Entfernens von reinem Wasser
aus der Lösung
in Form von Eis hohe Konzentrationen von Kälteschutzmitteln, was augenscheinlich
zu einer ähnlichen
Toxizität
führt,
wie sie zu erleben ist, wenn Zellen verglasungsgeeigneten Lösungen ausgesetzt
werden. Auch aus diesem Grund wären
weniger toxische Lösungen zum
Einfrieren von Zellen und Geweben vorteilhaft, insbesondere vorausgesetzt,
dass die Menge von auf Routinebasis eingefrorenen Zellen für alle Anwendungen
astronomisch ist.
-
Von
anderen entwickelte Verglasungslösungen
(in erster Linie für
Embryos oder Pflanzenzellen) ergeben manchmal Zurückgewinnungen
von 80 % oder mehr, aber dies ist trügerisch. Alle diese Lösungen erfordern
ein rasches Zugeben und Entfernen des Kälteschutzmittels und beinhalten
typischerweise eine Exposition an die verglasbare Lösung für rund zwei
Minuten oder weniger. Die Wirkung dieser Vorgehensweise mit Minimalexposition
besteht darin, die ansonsten starke intrinsische Toxizität dieser
Lösungen
zu maskieren, aber derart kurze Expositionszwänge beschränken die Verwendung solcher
Verglasungslösungen
auf kleine Proben. Bei dem Versuch, Organe zu verglasen, sind dagegen
Kälteschutzlösungen erforderlich,
die für
relative lange Zeitspannen (ca. 40 Minuten) in ihren Spitzenkonzentrationen
mit Zellen in Kontakt bleiben können, und
daher müssen
die Lösungen
intrinsisch weniger toxisch sein. Manchmal sind Zurückgewinnungen
nahe ~90 % oder mehr bei isolierten Zellsystemen
erhalten worden, aber dies geschieht oft oder sogar nur unter Umständen, wo
entweder eine einzigartige Widerstandsfähigkeit des gerade untersuchten
Systems gegen ein bestimmtes Kälteschutzmittel
vorhanden zu sein scheint, was bedeutet, dass dieselbe Lösung auf
andere Systeme angewendet nicht wirksam wäre, oder wieder, wenn nur kurze
Expositionen gestattet sind.
-
Darüber hinaus
können
die meisten Systeme, die eine Verglasung überstehen, mit sehr schnellen
Geschwindigkeiten durch Leitungsmethoden erwärmt werden. Dies ist allgemein
wesentlich, weil Lösungen,
die verglasen, allgemein Erwärmungsgeschwindigkeiten
in der Größenordnung
von ca. 1.000°C/min
erfordern, um der Entglasung (Kristallisierung beim Erwärmen) zu
entgehen (Fahy in: The Biophysics of Organ Cryopreservation, A.
M. Karow jr. und D. E. Pegg, Hrsg., Plenum Press, 1987), eine Geschwindigkeit,
die so hoch ist, dass sie für
viele Systeme und bei vielen Einstellungen unerreichbar ist. Dieses
Problem hat die Anwendung ansonsten erfolgreicher Verglasungsmethoden
beispielsweise auf menschliche Augenhornhäute verhindert (Bourne, 1994).
-
Da
viele Zellen mit den verfügbaren
Kryokonservierungstechniken trotz der vorhandenen Möglichkeiten
zur Verhütung
der Toxizität,
wie soeben festgestellt, nicht gut überleben, finden wahrscheinlich
ausgezeichnete Kryokonservierungslösungen, die von der Arbeit
an der Organ-Kryokonservierung hergeleitet wurden, für die ausgezeichnete
Lösungen
zwingend sind, Anwendung auf viele andere Systeme. Viele Jahre lang
wurde eine Lösung
namens VS41A in Experimenten zur Kaninchennieren-Kryokonservierung
verwendet. Ihr Erfinder (G.M.F.) hält sie für weniger toxisch als die meisten
oder alle anderen verfügbaren
und relevanten Verglasungslösungen,
und sie hat ein Überleben
von ca. 50 % der Kaninchennieren nach Perfusion mit VS41A und Transplantation
mit sofortiger kontralateraler Nierenentfernung erlaubt (Fahy in:
Advances in Anti-Aging Medicine, Vol. 1, R. M. Klatz, Hrsg., Mary
Ann Liebert, Inc., Larchmont, NY, S. 249–255, 1996), aber ein Überleben von
50 % ist nicht genug.
-
Es
gibt derzeit keine Möglichkeit
einer zuverlässigen
Vorhersage, welche Kälteschutzlösungen bei
irgendeinem nicht vertrauten lebenden System wirksam sein werden
und welche unwirksam, und es gibt keine andere Methode als Experimentieren
nach dem Zufallsprinzip und Mutmaßungen, um vielversprechende
Formeln zum Analysieren abzuleiten. Dies hat die Arbeit an der Entwicklung
von Kälteschutzlösungen erheblich beschränkt. Auch
fehlte dem ganzen Gebiet dadurch eine Richtung, und dies führte zu
einem vorherrschenden Verwirrungszustand, der rasche Fortschritte
verhinderte.
-
Die
Anzahl möglicher
Kombinationen von Kälteschutzmitteln
in verschiedenen Anteilen ist nahezu unbegrenzt, so dass die Entdeckung
besonders vorteilhafter Formeln ohne maßloses Experimentieren nicht wahrscheinlich
ist. Es ist klar, dass es bei diesen gegebenen Problemen, dem bereits
erfolglos erschöpften Ausmaß der Bemühungen und
den nicht beanspruchten enormen potentiellen Belohnungen für Erfolg
im Stand der Technik keine offensichtlichen Wege zur Lösung des
Problems der Gestaltung allgemein anwendbarer, annehmbar stabiler,
minimal-toxischer Kälteschutzlösungen geben
kann.
-
Wie
bereits angedeutet, ist ein Grund dafür, dass bis jetzt keine besseren
Lösungen
entwickelt worden sind, das Fehlen eines systematischen Wissens
betreffend die Mechanismen und Modulatoren der Toxizität von Kälteschutzlösungen (Fahy,
Lilley, Linsdell, Douglas und Meryman, Cryobiology 27: 247–268, 1990).
Es werden neue Informationen benötigt,
um das Treffen aufgeklärterer
Auswahlen zur Verringerung der Toxizität von Kälteschutzmittel-Gemischen zu
gestatten.
-
Der
erste Schritt zum Wählen
von Lösungen
mit minimaler Toxizität
für die
Kryokonservierung ist überraschend
das Wählen
von Mitteln, die wässrige
Lösungen "mangelhaft" verglasen, was bedeutet,
dass relativ hohe Konzentrationen von Kälteschutz-Wasser-Bindungsstellen in Bezug auf
Wasser erforderlich sind, um Eisbildung zu verhindern. Dies bedeutet,
dass diese Lösungen
im Vergleich zu stärkeren
Glasbildungslösungen
relativ wenig Wasser enthalten. Gemäß der überlieferten Weisheit auf dem
Gebiet der Tieftemperaturbiologie sollte dies derartige Lösungen toxischer
machen, und ist kontraintuitiv unter der Annahme, dass Zellen zur
Stabilisierung zarter Zellproteine und Membranen Wasser benötigen. Nichtsdestoweniger
wird hierin zum ersten Mal gezeigt, dass das Gegenteil wahr ist,
d. h. dass dies die besten Lösungen
sind, um Toxizität
zu vermeiden, nicht die schlechtesten Lösungen, wie allgemein geglaubt
wird.
-
Ohne
sich an irgendeine Theorie binden zu wollen, wird als selbstverständlich angenommen,
dass dieses Phänomen
durch schwache Kälteschutzmittel-Wasser-Wechselwirkungen
erklärt
wird. Schwache Kälteschutzmittel-Wasser-Wechselwirkungen
lassen darauf schließen,
dass mehr Kälteschutzmittel
benötigt
wird, um Wasser ausreichend zu immobilisieren, um ein wässriges
Glas zu bilden, lassen aber auch darauf schließen, dass das Wasser, das übrig bleibt,
seine Bindungen mit dem Kälteschutzmittel
bereitwilliger brechen kann und daher lebenskritische Moleküle, die
lebende Zellen bilden, besser hydratisieren kann. Mit anderen Worten, obwohl
der Wassergehalt niedriger ist als in Standard-Verglasungslösungen,
ist die Wasserverfügbarkeit
zum Hydratisieren lebender Zellen paradoxerweise größer als
in Standard-Verglasungslösungen,
weil die biologischen Moleküle
erfolgreich mit dem Kälteschutzmittel
um den Zutritt zu Wasser konkurrieren. Diese entscheidende Schlussfolgerung
ist nicht naheliegend und ist zuvor nicht vom Stand der Technik
hergeleitet worden.
-
Wurde
der Wassergehalt der Lösung
durch Verwendung schlechter Glasbildner auf einem Minimum gehalten,
können
optimale Kälteschutzlösungen ggf.
polymere Stoffe mit einer relativen Molekülmasse von ca. 1.000 Dalton
bis 50.000 Dalton anstelle von veränderlichen Mengen von eindringendem
Kälteschutzmittel
einschließen,
um so eine Reduktion der intrazellulären Kälteschutzmittel-Konzentration
und dadurch eine wirksame weitere Steigerung der intrazellulären Wasserverfügbarkeit
zu gestatten. Diese Polymere können
geeignete Polymere zum spezifischen Blockieren von Eiskristallkeimbildung
oder Eiswachstum einschließen
oder auch nicht. Des Weiteren können
die Lösungen
auch niedermolekulare Reaktionsmittel (weniger als 1.000 Dalton
relative Molekülmasse)
enthalten, die imstande sind, die Kristallkeimbildung und/oder das
Wachstum von Eis spezifisch zu hemmen.
-
Wie
zuerst von Fahy et al. (Cryobiology, 21: 407–426, 1984) vorgeschlagen und
aufgezeigt, enthalten Zellen die Glasumwandlung verstärkende Proteine,
und daher benötigt
Cytoplasma nicht die volle Menge des eindringenden Kälteschutzmittels,
das zur Verglasung des extrazellulären Raums benötigt werden
mag. Allgemein gesagt, ist es jedoch nicht offensichtlich, dass
dieses Prinzip verwendet werden kann, um eine Lösung, die nicht in der Lage
ist zu verglasen, verglasen zu lassen, indem die Penetriermittelkonzentration
noch weiter reduziert wird. Hierin werden Beispiele bereitgestellt,
worin dieser Ansatz zum ersten Mal aufgezeigt wird. Diese Strategie
ist wirksam beim Reduzieren einer Schädigung der Zelle im Ganzen,
vorausgesetzt, sie wird nicht so weit geführt, dass sie die Entglasung
verschlimmert.
-
Die
Verwendung von npCPAs zur Verstärkung
der Verglasung ist Routine, die vorliegende Erweiterung der Verwendung
von npCPAs in Kombination mit schwach glasbildenden Kälteschutzmittel-Kombinationen
jedoch nicht. Auch die Verwendung von npCPAs mit relativ niedriger
Molekülmasse
wurde hinzugefügt,
wie hier zum ersten Mal gelehrt. Schließlich ist die Kombination von
npCPAs mit relativ niedriger Molekülmasse und schwach glasbildenden
Kälteschutzmittel-Gemischen
neu. Letztendlich ist die Kombination aller Modalitäten (schwache
Glasbildner, npCPAs oder npCPAs mit niedriger Masse (ImnpCPAs) und
Eisblockermittel) noch weiter vom Stand der Technik entfernt.
-
Das
Konzept, dass Konzentrationen lebende Zellen in Mitleidenschaft
ziehen, ist immer durch die Tatsache kompliziert gemacht worden,
dass es nie eine theoretische Basis dafür gab zu bestimmen, welches
Konzentrationsmaß für Toxizität bedeutungsvoll
ist. Dies ist insbesondere in der Tieftemperaturbiologie problematisch,
in welcher der Kryobiologe Termini wie "Lösungseffekt"-Schaden benutzt,
aber ohne imstande zu sein zu bestimmen, welcher Aspekt der Lösungszusammensetzung
die Schädigung
beeinflusst. Biologen und Chemiker mögen denken, dass ein gegebenes
Konzentrationsmaß von
Bedeutung ist, aber die Zellantwort muss nicht proportional zu diesem
Maßstab
sein. Durch Bereitstellen einer deutlich überlegenen Konzentrationsskala
zum Verknüpfen
der Lösungszusammensetzung
mit der Zell-Lebensfähigkeit
auf eine Art und Weise, die nie zuvor möglich gewesen ist, wird der
Praktiker auf diesem Fachgebiet imstande sein, Kälteschaden und Kälteschutz
auf eine nie zuvor möglich
gewesene Art und Weise zu betrachten.
-
Zusammengefasst
sind einige Merkmale der Erfindung, wie folgt. Diese Merkmale werden
später
noch eingehender erläutert.
- A) Die q*-Methode des Nachweises neuer, vorteilhafter
Kälteschutzformeln
(die q*-Skala ist Mol Wasser pro Mol polare Gruppe bei eindringenden
Kälteschutzmitteln
in der Lösung;
der Kehrwert von q*, q*-1, kann ebenfalls verwendet werden). Der
Name q* für
den Parameter "Mol
Wasser pro Mol polare Gruppe" wurde gewählt, um
zwischen ihm und Q zu unterscheiden, welcher Mol Kälteschutzmittel
pro 10 Mol Wasser ist (z. B. Fahy et al., Cryobiology 21: 407–426, 1984),
und q* bei Cv ist qv*.
Die qv*-Methode zur Identifizierung
nützlicher
Kälteschutzlösungen basierend
auf dieser Konzentrationsskala besteht daraus, wenigstens ein Kälteschutzmittel
auszuwählen,
dessen qv* unter 2,0 liegt, dieses in ein Gemisch mit anderen Kälteschutzmitteln
aufzunehmen, Cv des resultierenden Gemischs auf normalem Wege zu
bestimmen (siehe z. B. Fahy et al., Cryobiology 21: 407–426, 1984),
q* bei Cv zu berechnen (qv*) (Anmerkung: die Anzahl von Mol Wasser
kann ohne Weiteres ausgehend vom Gewicht eines gegebenen Lösungsvolumens
minus der Anzahl von Gramm aller gelösten Stoffe, d. h. aus der
Anzahl von Gramm Wasser pro Volumeneinheit oder pro Gewichtseinheit
bestimmt werden), den resultierenden qv*-Wert mit den qv*-Werten
alternativer Kälteschutzlösungen zu
vergleichen und im Allgemeinen lieber Lösungen mit einem niedrigeren
qv*-Wert auszuwählen
als höhere
qv*-Lösungen.
qv*-Werte können
aus veröffentlichten Q-Werten
adäquat
geschätzt
werden, indem bewertet wird, dass die Dichten aller Lösungskomponenten als
Reinsubstanzen unverändert
bleiben, wenn sie mit anderen Substanzen in Lösung sind (die Gültigkeit eines ähnlichen
Ansatzes bei der Ableitung von Q aus %-G/V-Konzentrationen ist bei
Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging Applications and
Engineering Contributions, J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg.,
ASME, 1988, S.113–146
erörtert.)
Eine
Variante dieses Verfahrens ist es, q* in einer Konzentration zu
bestimmen, die akzeptable und gleich bleibende Entglasungsraten
ergibt, und Vergleiche auf diesen q* (qd*) zu stützen.
Zum Verständnis der
Gefrierschädigung
ist es möglich,
q* für
unterschiedliche Lösungen
bei derselben Wasseraktivität
zu berechnen (qa*, der bestimmt werden kann, wenn Zellen auf dieselbe
Temperatur gefroren sind) und die resultierende Gefrierschädigung auf
Basis der qa*-Werte einzuordnen. Dies erlaubt dann die Entwicklung überlegener
Gefrierlösungen.
Darüber
hinaus kann qa* auch dazu verwendet werden, Kandidatenlösungen zur
Konservierung durch Gefrierpunktserniedrigung bei einer gegebenen
Temperatur auszuwählen,
weil Lösungen
mit demselben Gefrierpunkt wieder dieselbe Wasseraktivität aufweisen,
was eine sinnvolle Basis zum Vergleich von q*-Werten zwischen unterschiedlichen
Lösungen
bereitstellt.
Eine andere Variante des Verfahrens besteht darin,
Lösungen
zur Unterkühlung
basierend auf den q*-Werten für
Lösungen
auszuwählen,
die gerade konzentriert genug sind, um den gewünschten Grad der Unterkühlung (qs*)
zu gestatten.
Zusammengefasst erlaubt die q*-Methode überlegene
Konservierung durch Verglasung, Tiefkühlung, Gefrierpunktserniedrigung
und Unterkühlung.
Des Weiteren können
für diese
Anwendungen gefundene Lösungen
auch in niedrigen Konzentrationen (unter ca. 4 Mol) zur Stabilisierung
von Zellen, Geweben und Organen bei Temperaturen über ihren
Gleichgewichts-Gefrier-/Schmelzpunkten (Tm) angewendet werden, um
die Lagerung im flüssigen
Zustand bei diesen Temperaturen (kalte Lagerung) zu verlängern.
- B) Lösungen,
die in erster Linie eine Kombination aus Dimethylsulfoxid und wenigstens
zwei schwach glasbildenden Mitteln einschließen, von denen eines ein Amid
und eines Ethylenglycol sein kann, mit oder ohne eine Auswahl von
anderen Kälteschutzmitteln
mit niedrigem und höherem
Molekulargewicht, um die Verglasung zu erleichtern und die Entglasung
zu hemmen.
- C) Optionales Einschließen
wenigstens einer von mehreren Formen von Polyvinylalkohol (PVA)
als praktische Eisblockermittel in Anwesenheit anderer Kälteschutzmittel.
- D) Optionale Verwendung, innerhalb der polymeren Komponente
der Lösung,
einer oder mehr Formen von Polyvinylalkohol (PVA) als praktische
Eisblockermittel in Anwesenheit anderer Kälteschutzmittel.
- E) Optionales Einschließen,
innerhalb der polymeren Komponente der Lösung, eines oder mehr Polymere mit
einer Molekülmasse
im Bereich von ca. 800 bis ca. 5.000 Dalton zum Verstärken der
Verglasung und Hemmen der Entglasung.
- F) Optionales Einschließen
von Eishemmstoffen mit niedrigem Molekulargewicht.
-
Alle
diese unterschiedlichen, aber wechselwirkenden Elemente einer Kryokonservierungslösungsformulierung
verbinden sich zur Bereitstellung einer wirklich starken Leistungsfähigkeit
zum Vermeiden einer Schädigung
während
und nach der Kryo- oder
Kaltkonservierung mit dem erwarteten breiten praktischen und geschäftlichen
Nutzwert.
-
Definitionen
-
Hierin
zu verwendende spezifische Termini werden verwendet, wie nachstehend
definiert. Nicht speziell definierte Termini sollen die normalen
Bedeutungen haben, die solchen Termini gemäß dem allgemeinen Sprachgebrauch
auf dem Gebiet der Tieftemperaturbiologie zugeschrieben werden.
-
"q*" ist die Anzahl von
Mol Wasser in einer Kälteschutzlösung pro
Mol polarer Gruppen, die bei eindringenden Kälteschutzmitteln in der Lösung vorhanden
sind.
-
"qv*" ist q* für Lösungen bei
ihrer Cv.
-
"qa*" ist q* für Lösungen bei
einer Standard-Wasseraktivität
(allgemein hergestellt durch Gefrieren auf eine Standard-Temperatur).
-
"qd*" ist q* für Lösungen,
die eine Standard-Entglasungsneigung zeigen.
-
"qs*" ist q* für Lösungen,
die eine Standard-Unterkühlungsneigung
in Anwesenheit einer Standardmenge eines Nukleierungsinhibitors
oder Eiskristallwachstum-Inhibitors zeigen, wie z. B. PVA zur Nukleierungshemmung
und Gefrierschutzprotein zur Kristallwachstumshemmung oder thermischen
Hysteresisinduktion.
-
"Cv" ist die benötigte Konzentration
zum Verglasen von 5–10
ml Lösung
bei einer Abkühlungsgeschwindigkeit
von ca. 10°C/min.
-
"Verglasung" ist so definiert,
dass genauer das Erstarren einer flüssigen Lösung als Glas als durch Gefrieren
gemeint ist.
-
"Glas" ist hierin so definiert,
dass eine flüssige
Lösung
gemeint ist, deren Molekularbewegungen durch Abkühlen unter die Glasübergangstemperatur
der Lösung
praktisch zum Stillstand gebracht wurden.
-
"Entglasung" meint die Bildung
von Eis während
des Erwärmens
einer zuvor tiefgekühlten
oder verglasten Lösung
(dies ist nicht die Umkehrung von Verglasung; die Umkehrung von
Verglasung ist "Glasschmelzen" oder einfach "Verflüssigung" genannt worden).
-
"Gefrierschutzmittel" sind Chemikalien,
welche mit Kryokonservierung verbundene Einbußen reduzieren. Als Kälteschutzmittel
anerkannt werden eindringende Kälteschutzmittel
(pCPAs), welche die Zellmembran in einem vernünftigen Zeitrahmen durchqueren
(Sekunden bis einige zehn Minuten). Nicht eindringende Kälteschutzmittel
(npCPAs) bleiben unter den meisten praktischen Bedingungen extrazellulär.
-
"Kryokonservierung" ist die Konservierung
biologischer Systeme durch Gefrieren, Verglasung, Unterkühlung oder
Gefrierpunktserniedrigung.
-
"Unterkühlung" ist das Abkühlen auf
eine Temperatur unter dem Gleichgewichtsschmelzpunkt, aber über der
Glasübergangstemperatur,
ohne die Probe tatsächlich
zu gefrieren.
-
Konservierung
durch "Gefrierpunktserniedrigung" ist die Verwendung
eines Kälteschutzmittels
zum Herabsetzen des Schmelzpunktes einer wässrigen Lösung auf unter 0°C und Lagern
eines biologischen Systems (z. B. ein Protein oder ein Organ) innerhalb etwa
plus oder minus 3 Grad um diesen Schmelzpunkt, aber unter 0°C.
-
"Kalte Lagerung" bezieht sich auf
die Lagerung über
dem Schmelzpunkt der Lösung,
typischerweise bei 0°C
oder darüber,
aber in Anwesenheit eines zum Stabilisieren des biologischen Systems
verwendeten Kälteschutzmittels
oder Kälteschutzmittel-Gemisches. "Eisblocker" sind Chemikalien,
die Eisbildung während des
Abkühlens,
Erwärmens
oder Isothermhaltens besonders gut reduzieren oder beseitigen, entweder
indem sie direkt an der Eis/Flüssigkeit-Grenzfläche an das
Eis binden oder indem sie Kristallkeimbildung verhindern oder durch
andere Mittel.
-
"Thermische Hysterese" ist oder bezieht
sich auf die Differenz zwischen dem Schmelzpunkt der Lösung und
der Temperatur, bei der Eis während
des Abkühlens
unter diese Temperatur mit nennenswerten Geschwindigkeiten wachsen
kann. Es hat sich gezeigt, dass Eiswachstum trotz des Vorhandenseins
von Eis unter dem Schmelzpunkt verhindert oder erheblich gehemmt
wird, wenn an die A-Achse bindende Eisblocker vorhanden sind, bis
die Tieftemperaturgrenze für
diese Wirkung erreicht wird, welche in diesem Fall die Größenordnung
der thermischen Hysterese definiert.
-
"Gefrierschutzproteine" (oder AFPs, auch "thermische Hysterese-Proteine" oder THPS genannt)
sind in lebenden Systemen hergestellte, natürliche Proteine, die thermische
Hysterese-Wirkungen erzeugen.
-
"VS41A" ist eine auf dem
Fachgebiet bekannte Kälteschutzlösung und
enthält
Dimethylsulfoxid, Formamid und 1,2-Propandiol (Propylenglycol oder
PG), so dass die Gesamtkonzentration dieser drei Kälteschutzmittel
55 % G/V beträgt,
die Stoffmengenkonzentration von Dimethylsulfoxid der Stoffmengenkonzentration
von Formamid gleichkommt und die Konzentration von PG 16,84 % G/V
beträgt.
VS41A wird als die am wenigsten toxische Verglasungslösung angesehen,
die für
Säugerorgane
bekannt ist. "VS4" ist eine verdünnte Version
von VS41A, die 6 % G/V weniger eindringendes Kälteschutzmittel als VS41A enthält und unter
Verwendung eines angelegten Drucks von 1.000 Atmosphären verglast
werden kann.
-
Eine "Träger"- oder "Vehikel"-Lösung ist
der andere Anteil einer Kälteschutzlösung neben
den Gefrierschutzmitteln, die in der Lösung vorhanden sind; die "Träger"- oder "Vehikel"-Lösung
wird allgemein auch in Abwesenheit von Kälteschutzmitteln verwendet,
um die Lebensfähigkeit
von Zellen, Organen oder Geweben außerhalb des Körpers zu
erhalten.
-
Die
Erfindung wird nachstehend in größerer Einzelheit
beschrieben.
-
Kälteschutzlösungen
-
Es
hat sich herausgestellt, dass die besten Kälteschutzlösungen drei Wechselwirkungsteile enthalten:
- 1) eindringendes) Kälteschutzmittel (pCPAs),
- 2) nicht eindringendes) Kälteschutzmittel
(npCPAs), und
- 3) hoch- oder niedermolekulares) gewichtsspezifisches) Eisblocker-Kälteschutzmittel
(ibCPAs).
-
Innerhalb
des Schutzbereiches der vorliegenden Anmeldung können die Eisblockersubstanzen
zur Kryokonservierung oder zum Bilden von Kryokonservierungslösungen allgemein
nicht ohne andere Kälteschutzmittel
erfolgreich verwendet werden, außer dass sie zum kälteschutzmittelfreien
Unterkühlen
auf Temperaturen über
ca. –20°C verwendet
werden können.
Eine detaillierte Beschreibung der neuartigen Eisblockereigenschaften
von PVA ist in WO-A-00 16619 enthalten (veröffentlicht am 30.3.2000). Die
Bezugnahme auf "Polyvinylalkohol" oder "PVA" soll hierin alle
Formen von Polyvinylalkohol repräsentieren,
die in der WO-A-00 16619 als potentiell nützlich identifiziert sind.
Kurz zusammengefasst wurde jedoch herausgefunden, dass Polyvinylalkohol
und verwandte Verbindungen das Gefrieren von Wasser und Wasserlösungen hemmte.
Diese synthetischen Verbindungen binden und hemmen Eisnukleierungsflächen vorzugsweise
auf eine ähnliche
Art und Weise wie natürliche
Gefrierschutzproteine. Die resultierende Inhibition erlaubt die
Unterkühlung
von Wasser und Wasserlösungen
auf Temperaturen unter dem thermodynamischen Gefrierpunkt ohne Eisbildung.
Die Gefrierhemmung tritt bei so kleinen Konzentrationen wie ein
Teil je Million Teile auf, obwohl Konzentrationen bis zu einem Teil
je hundert Teile bevorzugt werden. Diese Polyvinylalkohol-Additive
sind sehr nützlich
zur Steigerung der Leistung von Gefrierschutzformulierungen, biologischen
Kryokonservierungslösungen
und zum Verhindern von Frostschaden an Pflanzen und anderen Industrieprodukten
und -verfahren. Die verwandten Verbindungen schließen alle
Verbindungen mit der Formel [-CR2CROH-]n ein, wo R ein beliebiges Atom oder eine
Gruppe von Atomen ist, ausgenommen eine Hydroxygruppe, und n ≥ 3. Außerdem kann
eine oder mehr der Hydroxygruppen durch chemische Gruppen ersetzt
werden, wie z. B. Methoxy-, Alkoxy- und Aminogruppen. Die Polyvinylalkohol-Verbindungen
haben vorzugsweise eine Molekülmasse
von weniger als 1000 Kilodalton, bevorzugter weniger als 10 Kilodalton
und sogar noch bevorzugter 130–2000
Dalton. Die Polyvinylalkohol-Verbindungen enthalten vorzugsweise
1 bis 25 Mol-% Vinylacetat, bevorzugter 10–20 Mol-% Vinylacetat, und
sie können
ataktisch oder syndiotaktisch sein.
-
Die
pCPA- und npCPA-Gemische sind ohne Eisblockersubstanzen äußerst nützlich,
erfordern aber in vielen Lösungen
der besten Art die Verwendung von Eisblockersubstanzen.
-
Zusammengefasst
beziehen ideale Lösungen
für Kälteschutz
die Verwendung von allen drei Elementen der Erfindung in Kombination
miteinander ein, und weniger optimale, aber immer noch ausgezeichnete
Lösungen
können
durch Verwenden von nur einem oder zwei dieser Prinzipien erhalten
werden. Zum Beispiel werden Augenhornhäute für undurchdringbar für Polymere
wie PVA gehalten und erfordern pCPAs mit oder ohne zusätzliche
Nicht-Eisblocker-npCPAs
oder die Verwendung von Eisblocker-npCPAs in erster Linie als osmotische
Mittel.
-
Involvierte
Theorie
-
Wasser
ist lebensnotwendig, aber die Daten in den nachstehenden Beispielen
zeigen höheres Überleben
bei reduziertem Wasser pro Mol der polaren Gruppe in den Lösungen.
Wie ist dies möglich?
Anders gesagt, man weiß,
dass die Toxizität
eines gegebenen pCPA mit steigender Konzentration ansteigt, wie
können also
höhere
Konzentrationen im Allgemeinen zu einer geringeren Toxizität führen?
-
Ohne
sich an irgendeine Theorie binden zu wollen, ist eine plausible
Erklärung,
dass in einigen Verglasungslösungen
die Anzahl von Wassermolekülen,
die mit polaren Gruppen verbunden sind, viel geringer ist als die
Anzahl von Wassermolekülen,
die in anderen Verglasungslösungen
mit polaren Gruppen verbunden sind. Mit anderen Worten, in den früheren Lösungen sind
die polaren Gruppen weniger stark hydratisiert. Da alles Wasser
in allen Lösungen
beim Abkühlen
verglast, wird alles Wasser in allen Lösungen gestört, aber eine stark störende polare
Gruppe muss daher mehr Wasser pro Mol stören, als es eine schwach störende Gruppe tut,
und diese stärkere
Störung
ist mit größerer Toxizität verbunden.
Die überraschende
Schlussfolgerung ist, dass obwohl weniger Wasser in der schwach
gestörten
Lösung
vorhanden ist, das Wasser, das verbleibt, im Durchschnitt verfügbarer ist,
um die biologische Lebensfähigkeit
zu erhalten als das Wasser, das in den wasserreicheren, aber auch
wassergestörteren
Lösungen
verbleibt.
-
Dies
ist eine gänzlich
beispiellose und unvorhergesehene Beobachtung mit einer praktischen
Schlussfolgerung: für
beste Ergebnisse sollten Kälteschutzmittel
oder Kälteschutzmittel-Gemische gewählt werden, die
schlechte Glasumwandler sind. Dies ist das genaue Gegenteil des
Standard-Ansatzes zum Entwickeln guter Lösungen zur Verglasung lebender
Systeme. Es ist immer noch so, dass für ein gegebenes Kälteschutzmittel
oder Gemisch keine höhere
Konzentration verwendet werden sollte, als zur Verglasung benötigt wird,
da dies die Wasserverfügbarkeit
reduziert, nicht erhöht.
Hat man aber die Wahl zwischen zwei Lösungen, die bei unterschiedlichen
Konzentrationen verglasen, wird die Lösung, die bei einer höheren Konzentration
verglast, zu weniger Toxizität
neigen als die andere Lösung, vorausgesetzt,
es kommen keine anderen Faktoren ins Spiel.
-
Ein
Faktor, der leicht ins Spiel kommt, ist spezifische Toxizität. Zum Beispiel
ist Formamid im Vergleich zu den meisten Kälteschutzmitteln hochtoxisch,
aber seine Toxizität
kann durch die Zugabe von Dimethylsulfoxid vollständig neutralisiert
werden (Fahy, da Mouta, Tsonev, Khirabadi, Mehl und Meryman in:
Cell Biology of Trauma, J. J. Lemasters und C. Oliver, Hrsg., CRC
Press, 1995, S. 333–356).
Die Zugabe von Ethylenglycol zu Formamid hat keine schützende Wirkung,
so dass obgleich ein Gemisch aus Formamid und Ethylenglycol bei
einer hohen Konzentration verglast (Fahy in: Low Temperature Biotechnology:
Emerging Applications und Engineering Contributions, J. J. McGrath
und K. R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S. 113–146), die Lösung extrem toxisch
ist. Ähnliche
Erklärungen
treffen insbesondere auf hydrophobe oder detergensartige Verbindungen
zu, wie kundigen Praktikern auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.
Darüber
hinaus sind einige lebende Systeme insbesondere gegen bestimmte
Kälteschutzmittel
empfindlich, wobei ein Beispiel die Empfindlichkeit der Niere gegen
Glycerol ist, das ein schlechter Glasbildner ist, aber sowohl ziemlich
schlecht eindringend als auch geeignet ist, direkt in biochemische
Stoffwechselwege zu gelangen, um biochemische Störungen zu erzeugen (siehe z.
B. Burch et al., J. Biol. Chem. 245: 2092–2102, 1970 und Jans und Willem,
Eur. J. Biochem. 174: 67–73,
1988).
-
Ein
anderer Faktor, der ins Spiel kommen könnte, ist die Reduktion des
Wassergehaltes unter einen erforderlichen Mindestwert zur adäquaten Hydratation
von Biomelekülen
selbst bei Vorhandensein schwacher Wasser/Gefrierschutzmittel-Wechselwirkungen:
vermutlich gibt es eine Obergrenze, jenseits derer die schwache
Glasbildungsfähigkeit
eher schädlich
als vorteilhaft wird. Die Beispiele zeigen jedoch, dass selbst sehr niedrige
qv*-Lösungen
(qv* < 1,6) geringe
Toxizität
aufweisen.
-
Je
hydrophober ein Molekül
schließlich
ist, desto schwächer
wird es zu einer Wechselwirkung mit Wasser neigen, aber wie auf
dem Fachgebiet bekannt ist, führt übermäßige Hydrophobie
zu Toxizität
und muss vermieden werden.
-
Normale
Praktiker auf dem Fachgebiet sind sich solcher Fallen bewusst und
sind imstande, sie zu vermeiden. Wenn Lösungen zum Testen auf der Basis,
dass sie einen niedrigen qv* haben, irrtümlich gewählt und für toxisch befunden werden,
können
sie auf jeden Fall zugunsten von niedrigen qv*-Lösungen beiseite gelegt werden,
die in der Tat weniger toxisch sind als Lösungen des Standes der Technik.
Das wesentliche Ergebnis ist, dass unter Verwendung der q*-Methode
allgemein überlegene
Lösungen
gefunden werden, die ansonsten nicht gefunden würden, und diese Entdeckung
von guten Lösungen
für den
Dauergebrauch ist ein bedeutenderer Vorteil als der Nachteil bei
flüchtigem
Testen zufälliger toxischer
Versuchslösungen.
-
Die
Erfindung ist durch die obige kurze Beschreibung und eine Reihe
von Beispielen, die spezifische wertvolle Lösungen darstellen, spezifische
Grenzen und spezifische Leitprinzipien, die als Teil der Erfindung angesehen
werden, bestimmt ausreichend beschrieben. Aus diesem Grund wird
der große
Umfang der detaillierten Beschreibung der Erfindung in Form von
mehreren spezifischen Beispielen gelehrt.
-
Beispiel 1: Vorhersage
der Toxizität
unter Verwendung von qv*: Lösungen,
die bei 1000 Atmosphären
in Anwesenheit von 6 % G/V Polymer verglasen
-
1 und 2 zeigen
eine Reanalyse (durchgeführt
Anfang Juli 1998) öffentlicher
Informationen (Fahy, Levy und Ali, Cryobiology 24: 196–213, 1987) über die
Toxizität
mehrerer Verglasungslösungen
bekannter Zusammensetzung. Diese Verglasungslösungen verglasen bei 1.000
Atmosphären
und enthalten entweder 6 % Polyvinylpyrrolidon der relativen Molekülmasse 40
Kilodalton [PVP K30] oder 6 % Polyethylenglycol [PEG 8000]. Die
Datenmenge ist vorteilhaft, weil alle analysierten Lösungen verglasbar
sind, die Datenmenge geringe Standardfehler aufweist und die Toxizität von den
osmotischen Faktoren überzeugend
getrennt war (siehe Fahy, Levy und Ali, 1987, zur Diskussion). In
diesem Beispiel war Lebensfähigkeit
definiert durch das Verhältnis
von primär
intrazellulärem
Kalium zu intrazellulärem
Natrium (K/Na-Verhältnis)
nach der Kälteschutzmittel-Auswaschung
und aktivem Stoffwechsel für
90 min bei der optimalen Temperatur von 25°C. Das Testsystem bestand aus
Kaninchen-Nierenrindenscheiben.
-
Trotz
einer gewissen Korrelation zwischen der Toxizität der Lösungen und sowohl höheren als
auch niedrigeren Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO) in
den Lösungen
enthüllte
die veröffentlichte Schrift,
die die Daten enthielt, keine einzige zufriedenstellende allgemeine
Theorie, die ausreichende Gründe für die beobachteten
Toxizitätsdaten
im Ganzen angab. Ebenso wenig gab es irgendeinen Grund zu glauben, dass
es eine solche Theorie geben sollte oder könnte (siehe Fahy, Lilley, Linsdell,
Douglas und Meryman, Cryobiology 27: 247–268, 1990, zur Diskussion).
-
In 1 sind
die Toxizitäten
auf die Gesamtkonzentrationen der eindringenden, vor Kälteschaden schützenden
Mittel (pCPAs) bezogen, die die Lösungen zum Verglasen benötigen (Cv).
Cv wurde bei 1000 Atmosphären
Druck und in Anwesenheit von 6 % G/V PEG oder PVP gemessen und ist
in % G/V, Molenbruch und molalen Einheiten ausgedrückt. Wenn
diese Daten nicht gegen die DMSO-Konzentration, sondern gegen die
Gesamtkonzentration der Lösung
aufgetragen wurden, wurde ein gewisser Hinweis auf einen neuartigen Trend
wahrgenommen (1): die Lösungen, die höhere Konzentrationen
erforderten, um zu verglasen, schienen sogar seltsamerweise auch
geringere Toxizitäten
bei ihren Cvs zu haben. Ein solcher Trend würde jedoch durch Verändern nur
weniger Punkte von den vielen aufgetragenen zerstört und widerspricht
der vorherrschenden Annahme, dass eine Lösung um so toxischer ist, je
konzentrierter sie ist. Aus diesen Diagrammen ergibt sich auch kein
Anhaltspunkt, dass die Hydratation von Biomelekülen irgendetwas mit der Toxizität der Lösungen zu
tun hat. Normalerweise würde
eher vermutet, dass die Nettowechselwirkung zwischen Wasser und
Kälteschutzmittel
in all diesen Lösungen
dieselbe sein muss, weil die Lösungen
vermutlich alle gleich verglasbar sind. Das Diagramm enthüllt jedoch,
dass die typische Annahme, dass die besten Lösungen zur Verglasung diejenigen
sind, die bei den niedrigsten Konzentrationen verglasen, unbegründet ist,
weil die Erholung stattdessen ungeachtet der Cv ähnlich zu sein scheint.
-
Wie
in 2 gezeigt, ist die Korrelation wenig besser, wenn
die Lebensfähigkeit
entweder gegen den Wassergehalt der Lösung (A) oder die Anzahl von
Mol Wasser pro Mol Kälteschutzmittel
(B) aufgetragen wird. 2 stellt die Toxizitätsdaten
von 1 in Bezug zu dem Wassergehalt der Lösung, der
Anzahl von Mol Wasser in der Lösung
pro Mol pCPA in der Lösung
und der Anzahl von Mol Wasser pro Mol Wasserstoffbrückenbindungs-Gruppen dar, die
an den eindringenden Kälteschutzmitteln
in der Lösung
(qv*) vorhanden sind. Wenn die Anzahl von polaren Gruppen pro Mol
pCPA in jeder Lösung
jedoch summiert und die Lebensfähigkeit gegen
die durchschnittliche Anzahl von Mol Wasser pro Mol polare Gruppen
(OH, C=O, NH2, S=O) an den pCPAs in der Lösung (q*) aufgetragen wird,
besteht eine erstaunliche Konvergenz der Ergebnisse (2C). Zum ersten Mal erbrachte dieses Diagramm
eine gute Korrelation zwischen einer Lösungszusammensetzungsvariablen
und der Toxizität
multipler Verglasungslösungen.
Verblüffenderweise
passte selbst DMSO als Monowirkstoff (offenes Quadrat) eher in das
Gesamtmuster als Ankerpunkt für
die Daten als der größere Ausreißer zu sein,
der es in der Vergangenheit immer gewesen ist.
-
Die
allgemeine Übereinstimmung
zwischen den Daten und qv* lässt
darauf schließen,
dass Amide häufig
in der Hauptsache deshalb vorteilhaft sind, weil sie den qv*-Wert
der Lösung
mehr als die meisten anderen gelösten
Stoffe herabsetzen, eine ganz und gar neuartige Erklärung für ihren
Nutzwert. Jedoch trennen die gestrichelten Linien in 2C die Lebensfähigkeit/q*-Beziehung in amid-dominierte
(leere Kreise) und polyol-dominierte (ausgefüllte Kreise) Lösungen und
zeigen, dass die zwei Datenmengen getrennt sein können, wobei
die Lebensfähigkeit
für einen
gegebenen Wert qv* in Anwesenheit von Amiden immer etwas höher ist als
in ihrer Abwesenheit. Obwohl dieser Trend weitere Prüfung verträgt, ist
das grundlegende Ergebnis, dass alle Lösungen, ob sie Amide enthalten
oder nicht, der allgemeinen qv*-Regel folgen.
-
Es
gibt wenigstens eine Diskrepanz. In dieser Datenmenge waren ganz
auf Ethylenglycol (EG, leeres Dreieck) basierende Lösungen in
der Toxizität
identisch mit ganz auf Propylenglycol (PG, auf den Kopf gestelltes
leeres Dreieck) basierenden Lösungen,
trotz extremer Differenzen in ihren qv*-Werten sowohl bei 1 Atmosphäre als auch
bei 1000 Atmosphären.
Dies könnte
darauf hinweisen, dass diese gelösten
Stoffe der qv*-Regel nicht folgen, oder es könnte darauf hinweisen, dass
diese bestimmten Datenpunkte fehlerhaft sind oder dass der qv*-Wert
für EG
als Monowirkstoff zu niedrig ist. Die nachstehenden Beispiele weisen
jedoch darauf hin, dass EG und PG in Übereinstimmung mit der Lebensfähigkeit/qv*-Phänomenologie
sind und dass die entlegenen Punkte in 2, untere
Tafel, nicht repräsentativ,
sondern stattdessen irreführend
sind. Dies macht die Entdeckung des qv*-Phänomens doppelt verkennbar,
da das Phänomen
aus einer Datenmenge mit wenigstens einem sehr irreführenden
Punkt ermittelt wurde.
-
Beispiel 2: Lebensfähigkeit
korreliert mit qv* in disparaten Lösungen
-
3 zeigt
zwei Kurven, die die Ergebnisse von zwei separaten Experimenten
aufzeigen. Sie zeigt eine retrospektive Analyse von Lebensfähigkeitsdaten
bezogen auf qv* und zeigt:
- a) eine gute Korrelation
zwischen Lebensfähigkeit
und qv* für
Lösungen,
die sehr unterschiedlich zu denen in 2 sind,
und
- b) eine Erhöhung
der Lebensfähigkeit,
wenn qv* unter Verwendung von Polyvinylalkohol erhöht wird,
um die Kristallkeimbildung zu hemmen.
-
Die
Punkte 1–5 wurden
in einer Eurocolline-Vehikellösung
erstellt und bestanden aus einer systematischen Veränderung
des Anteils von EG:3-Methoxy-1,2-propandiol oder 2-Methoxyethanol
im Vergleich zu VS41A, wohingegen die Punkte 6–10 Experimente darstellen,
die in Anwesenheit einer GHP-2 genannten Vehikellösung ausgeführt wurden,
mit (Punkte 8–10)
oder ohne (Punkte 6 und 7) 1 % PVA einer Durchschnittsmolekülmasse von
ca. 7.000 Dalton. In diesem Beispiel sind mehrere Punkte dargestellt.
Zuerst lieferte VS41A, Punkt 1, schlechte Ergebnisse in
diesem Experiment. Reines Ethylenglycol (das eine Cv von 54 % G/V in
Eurocolline-Lösung
aufwies, Punkt 5) lieferte weniger als 50 % Rückgewinnung,
aber als es durch mehr und mehr 3-Methoxy-1,2-propandiol (MG; die
Punkte 4 und 2 sind drei Teile EG auf ein Teil
MG bzw. ein Teil EG auf drei Teile MG bei Cv-Werten von 53 bzw.
52 % G/V) oder durch 2-Methoxyethanol (2-ME; Punkt 3 steht
für drei
Teile EG auf ein Teil 2-ME, Cv = 53 % G/V) ersetzt wurde, wurden
die Ergebnisse schlechter. Dennoch konnten die Daten durch Bezugnahme
auf den qv*-Wert dieser Lösungen
gut angepasst werden, trotz des Fehlens des Einschließens von
entweder MG oder 2-ME in der Analyse der 2C.
Darüber
hinaus fallen Daten, die acht Experimente später gesammelt wurden und sehr
unterschiedliche Lösungen
enthielten (Punkt 6 steht für 58,5 % G/V D(1)UE20 + 6 %
G/V PVP 5000, wobei "E20" bedeutet, dass 20
g/dl EG vorhanden sind und die (1) angibt, dass der Ausgleichsrest
der 58,5 % G/V pCPA sich aus einem 1:1-Molverhältnis von DMSO zu Harnstoff
zusammensetzt; und Punkt 7 steht für 55 % E[D(0,7)F]38,18 + 6
% PVP 5000, was bedeutet, dass 38,18 % G/V der Lösung aus einem Gemisch aus
DMSO und Formamid in einem Verhältnis
von 0,7 Mol DMSO pro Mol Formamid bestehen und EG in einer Konzentration
von 55 – 38,18
= 16,82 % G/V vorhanden ist), auf dieselbe Kurve wie die Punkte 1–5.
Die Punkte 8–10 stellen
die Tatsache dar, dass biologische Systeme besser überleben,
wenn sie trotz ihrer Verglasbarkeit umfassender hydratisiert werden,
dank der Antinukleierungsfähigkeiten
von PVA, die eine Reduktion der Menge eindringender CPA erlauben,
ohne die Verglasung zu verhindern. Punkt 8 besteht aus
VS4 (siehe unten), das durch das Einschließen von 5 % PVP bei Mr 5000
plus 1 % PVA bei Mr 7000 Dalton verglasbar gemacht wurde. Obwohl
die Lebensfähigkeit
ausgezeichnet ist, ist sie schlechter als die Lebensfähigkeit
einer Lösung
(Punkt 9), die aus Veg – 4 % D(1)F + 5 % PVP 5000
plus 1 % PVA 7000 (Definition von Veg siehe unten) zusammengesetzt
ist. Letztendlich liefert Punkt 10, der die Wirkungen von
53 % E[D(0,7)F]38,18 + 5 % PVP 5000 + 1 % PVA 7000 (gleiche Anmerkung
wie oben) darstellt, noch bessere Ergebnisse. Den beiden Lösungen 9 und 10 fehlt
der starke Glasbildner 1,2-Propandiol, der in VS4 vorhanden ist,
und folglich sind die Punkte 9–10 in Einklang mit
der Analyse auf der Basis von qv*.
-
Beispiel 3: Toxizitäten reiner
CPAs in Bezug auf qv*
-
Tabelle
1 fasst die sechs nominell schwächsten
glasbildenden, gelösten
Stoffe kurz zusammen, die in der von Fahy bereitgestellten, jüngsten veröffentlichten Übersicht
glasbildender Verbindungen beschrieben sind (Fahy in: Low Temperature
Biotechnology: Emerging Applications and Engineering Contributions,
J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S. 113–146). Die
Toxizitätsdaten
für diese
gelösten
Stoffe sind begrenzt, aber wenigstens zwei solche gelöste Stoffe
sind adäquat
beurteilt worden. Acetamid, welches der schwächste Glasbildner in Tabelle
1 basierend auf qv* ist, sollte das am wenigsten toxische Kälteschutzmittel von
diesen sechs sein. In der Tat sind 50 % G/V Acetamid im Wesentlichen
nicht toxisch für
Nierenscheiben (Fahy, da Mouta et al. in: Cell Biology of Trauma,
C. Oliver und J. J. Lemasters, Hrsg., 1995), was wahrscheinlich
ein Rekord ist und in auffälligem
Kontrast zu der Toxizität
von 50 % DMSO oder 50 % 1,2-Propandiol steht. Andere interessierende
schwache Glasbildner sind Acetoin [Cv > ~60 % G/G in
Wasser], Hydroxyaceton, Hexafluoroaceton-Trihydroxid und verwandte
Moleküle.
-
Tabelle
1: Einige schwach glasbildende Kälteschutzmittel
-
Beispiel 4: Lebensfähigkeit
korreliert mit qv* in D(1)F-EG-Lösungen
-
Wässrige Lösungen von
Formamid allein verglasen nicht (Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging
Applications and Engineering Contributions, J. J. McGrath und K.
R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S. 113–146), was nahe legt, dass
Formamidkonzentrationen maximiert werden sollten. Jedoch hat auch
Formamid eine spezifische Toxizität, die durch die gleichzeitige
Anwesenheit von Dimethylsulfoxid neutralisiert werden muss (Fahy,
da Mouta et al. in: Cell Biology of Trauma, C. Oliver und J. J.
Lemasters, Hrsg., 1995), was eingrenzt, wie hoch die Formamidkonzentration
und das Formamid:Dimethylsulfoxid-(F:D-)Verhältnis sein kann.
-
Vorversuche
zeigten, dass
- a) D(1)F bei erheblich niedrigeren
Konzentrationen als erwartet verglaste und daher
- b) Gemische aus D(1)F und dem schwachen Glasbildner Ethylenglycol
in unterschiedlichen Anteilen von EG:D(1)F bis zu 1:1 dieselben
oder nahezu dieselben Cvs aufwiesen.
-
Anfangstoxizitätsversuche
wurden auf Cv-Werten von 57–58
% G/V basiert, die ohne Filtern der Lösungen bestimmt wurden. Wenn ähnliche
Lösungen
durch ein 0,22-Mikron-Filter passiert wurden, tendierte die Cv dazu,
niedriger zu sein (ca. 57 % G/V).
-
4 zeigt
die Lebensfähigkeit
von Kaninchen-Nierenrindenscheiben aufgetragen gegen qv* in Lösungen,
die ein Gemisch aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Formamid und Ethylenglycol
(EG) enthielten, wobei das Molverhältnis von DMSO und Formamid
fest bei 1:1 gehalten wurde, und dieses D(1)F-Gemisch wurde in wechselnden
Anteilen mit EG vermischt (Grammverhältnis von EG:D(1)F = 0, 1:5,
1:4, 1:2 und 1:1). Die Lösungen
waren in jedem Fall auf der zum Verglasen benötigten Gesamtkonzentration;
es war kein Polymer vorhanden. Wie in 4 gezeigt,
war die Toxizität
der EG/D(1)F-Gemische trotz der durch mangelhafte Filtration verursachten
Unwägbarkeiten
der Cv wieder gleich bleibend mit der Einordnung dieser Gemische
gemäß qv*. Dies
traf zu, obgleich die Lösungen
in 2 (nur bei 1.000 Atmosphären verglasbar; alle enthalten
Polymer) sich im Wesentlichen von denjenigen in 4 unterschieden
(alle verglasen bei 1 Atmosphäre,
keine enthält Polymer).
Gemische mit EG:D(1)F-Gewichtsverhältnissen von 1:1 und 1:2 hatten
nahezu äquivalente
qv*-Werte von rund 1,62 (weil die 1:2-Lösung eine gemessene Cv von
58 % G/V aufwies, gegenüber
57 % G/V für
die 1:1-Lösung)
und produzierten bei diesen qv*-Werten identische Scheibentoxizitäten (4)
trotz großer
Unterschiede in den Zusammensetzungen dieser Gemische.
-
5 zeigt
einen interessanten Vergleich zwischen der Toxizität der Lösungen und
den absoluten Konzentrationen von DMSO, Formamid und EG, die in
jedem Fall gleichzeitig anwesend sind. Sie zeigt die Daten von 3,
aufgetragen bezogen auf die absoluten Konzentrationen von DMSO,
Formamid und Ethylenglycol in den Lösungen sowie in Bezug auf den
Molprozentgehalt von D(1)F in dem Gemisch. Bei Verhältnissen
von 0, 1:5 und 1:4 (qv* = 1,85, 1,7 bzw. 1,74) war die Toxizität mit Formamidkonzentrationen
verbunden, die zu hoch waren, um von DMSO richtig neutralisiert
zu werden (Fahy, da Mouta et al. in: Cell Biology of Trauma, C.
Oliver und J. J. Lemasters, Hrsg., 1995), während Konzentrationen von bis
zu nahezu 30 % G/V EG nicht offenkundig schädlich waren. 5 zeigt
an, dass die Grenze für
einen akzeptablen Molenbruch von D(1)F/(D(1)F + EG) für eine Gesamtkonzentration
von 57–58
% G/V D(1)F unter 0,8 und über
0,67 liegt und dass eine Konzentration von ca. 14 % Formamid das
Maximum ist, das mit einer minimalen Schädigung verbunden ist.
-
Beispiel 5: Lebensfähigkeit
korreliert mit q* in modifizierter VS41A
-
VS41A
war die beste zuvor bekannte Lösung;
daher war es von Interesse, sie mit Lösungen mit niedrigerem qv*-Wert
zu vergleichen. VS41A enthält
ca. 38,2 % G/V D(1)F oder fast genau 14 % Formamid, die maximale
Menge, die in Beispiel 4 als kompatibel mit hoher Lebensfähigkeit
ausfindig gemacht wurde. Die andere Komponente von VS41A ist 1,2-Propandiol
(PG), das ein ausgezeichneter Glasbildner ist (qv* ca. 2,6) und
ein weit besserer Glasbildner als D(1)F ist, weswegen es seit ca.
1983 eine Hauptkomponente von VS41A und deren Vorgängerlösungen ist.
Aber gemäß der neuen
Theorie sollte diese Komponente so weit wie möglich durch eine schwächere glasbildende
Komponente ersetzt werden. Deshalb wurde Ethylenglycol als ein bekanntes
schwaches glasbildendes Mittel ausgewählt und das PG in VS41A grammweise
durch EG ersetzt (was eine Lösung
namens Veg bildete), um eine weitere Bewertung der Theorie zu gewinnen.
Obgleich erwartet wurde, dass diese Modifikation die Cv der Lösung verringern
würde,
haben alle versuchten Eins-zu-eins-Ersatz-Experimente
in der Vergangenheit darin versagt, Toxizitätsreduktionen zu erreichen
(siehe z. B. Fahy, Cryobiology 35: 344–345, 1997). In dem aktuellen
Test wurde diese Regel jedoch gebrochen, wie in Tabelle 2 angegeben.
-
Tabelle
2: Vergleich
1 von VS41A mit Veg und VS4
-
- 1Toxizitäten von Verglasungslösungen können am
besten basierend auf q* bei dem zum Verglasen benötigten q*
oder qv* verglichen werden.
-
Die
in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse waren in mehrerlei Hinsicht überraschend
und informativ. Im ersten Sinn erlaubten sie den Nachweis, dass
der spezifische Beitrag des PG in VS41A die Ursache für nahezu drei
Viertel der Toxizität
von VS41A ist. Zweitens zeigten sie, dass eine Lösung, die konzentrierter ist
als VS41A (auf einer molaren Basis) nur etwa ein Viertel der Toxizität von VS41A
haben kann (eine Reduktion des K/Na-Verhältnisses von ca. 10 % gegenüber ca.
60 %). Drittens zeigten sie, dass eine Lösung, die sehr nahe daran ist,
eine Verglasungslösung
zu sein, falls überhaupt,
sogar weniger toxisch ist als VS4, eine Lösung, die 100 % Langzeitüberleben
von autotransplantierten Kaninchennieren nach Herstellung des Gleichgewichtes mit
diesen Nieren durch Perfusion erlaubt hat, und diese geringere Toxizität von Veg
im Vergleich zu VS4 wurde trotz einer enorm höheren Konzentration von Veg
beobachtet. Viertens wurde, wie in Tabelle 3 weiter unten beschrieben,
später
herausgefunden, dass Veg imstande war, modifiziert zu werden, um
es ohne nennenswerte Erhöhung
seiner Toxizität
verglasen zu lassen.
-
Beispiel 6: Akzeptable
Grenzen von PG in Veg-artigen Lösungen
-
6 stellt
eine Karte davon dar, wie die Balance zwischen EG, D(1)F und PG
die Lebensfähigkeit von
Kaninchen-Nierenrindenscheiben beeinflusst, wenn die Gesamtkonzentration
fest bei 55 % G/V gehalten wird. Sie zeigt die Wirkung dessen, wenn
Veg a) durch Erhöhen
des D(1)F:EG-Molverhältnisses
und b) durch systematisches Ersetzen von EG durch PG verändert wird.
Die Zahlen innerhalb der Punkte geben die Prozente eines unbehandelten
Kontroll-K/Na-Verhältnisses
an, das nach Exposition an die durch das ternäre Zusammensetzungsdreieck
definierte Zusammensetzung erreicht wurde (Kontrollprozentberechnung
ohne Korrektur für
Hintergrund K/Na > 0).
Wie aus zwei separaten Experimenten ersichtlich ist (Kreise bzw.
Sechsecke), reduziert das fortschreitende Ersetzen des EG von Veg
(Punkt bei 70 Mol-% D(1)F, 30 Mol-% EG, 0 Mol-% PG) durch PG zum
Bilden VS41A-ähnlicherer
Lösungen
(Punkt bei ca. 73 Mol-% D(1)F, 27 Mol-% PG und 0 Mol-% EG) die Lebensfähigkeit
von den 78 %, wie für
Veg in GHP-2 gesehen, auf die 55 % Lebensfähigkeit, wie für VS41A
gesehen, gleichförmig.
Der Abfall erfolgt jedoch nur auf 70–76 % Lebensfähigkeit,
wenn 3–4
% G/V EG durch 3,4 % G/V PG ersetzt werden (Punkte nahe 4 Mol-%
und 6 Mol-% PG), was unter gewissen Umständen ein akzeptabler Handel
zur Annahme im Austausch für
verstärkte
Lösungswiderstandsfähigkeit
gegen Entglasung und verstärkte
Verglasungsneigung sein kann. Selbst das Ersetzen von 8 % G/V EG
durch 8 % G/V PG (Punkt nahe 12 Mol-% PG) stimmt noch mit einer
Lebensfähigkeit
von 70 % einer unbehandelten Kontrollscheibe K/Na überein,
was wieder darauf hindeutet, dass die Mehrheit einer mit der Verwendung
von PG verbundenen Schädigung
passiert, wenn mehr als 8 % PG anwesend sind.
-
6 zeigt
auch, dass ein D(1)F:EG-Mol-% von bis zu 77 ohne einen Verlust von
Lebensfähigkeit machbar
ist. Dies stimmt mit dem in 5B bereitgestellten
Ergebnis überein,
aber definiert es weiter.
-
Beispiel 7: Akzeptable
Variationen von Veg
-
7 zeigt
die Wirkung des Veränderns
von Veg durch Verringern des Formamids zugunsten von DMSO oder zugunsten
von Ethylenglycol oder durch Verringern von DMSO zugunsten von Ethylenglycol,
was darauf hinweist, dass Variationen innerhalb dieser Grenzen Veg
in einem Bereich hoher Lebensfähigkeit
halten. 7 ist in demselben Format wie 6,
außer
dass kein PG involviert ist und Variationen im Verhältnis D:F
enthalten sind. Der Punkt, der 90,6–103 % Kontrollfunktion ergibt,
stellt Veg dar. Veg wurde in drei Richtungen verändert: Formamid wurde fortschreitend
durch DMSO ersetzt (nach rechts abfallende Linie), Formamid wurde
fortschreitend durch EG ersetzt (nach links abfallende Linie), und
DMSO wurde zugunsten von EG abgesenkt (waagerecht nach links verlaufende
Linie). Wie in der FIGUR angedeutet, neigten alle drei Variationen
dazu, das K/Na-Verhältnis
zu verschlechtern, was darauf schließen ließ, dass die Formel für Veg nahezu optimal
ist, aber alle der varianten Datenpunkte bleiben VS41A weit überlegen,
und daher liegen alle akzeptablen Varianten innerhalb des Schutzbereiches
der Erfindung. Wie oben festgestellt, wird erwartet, dass ein Anheben
des Formamids zu erhöhter
Schädigung
führt,
so dass die einzige andere Möglichkeit
zur Verbesserung der Formel für
Veg (anders als durch Einschließen
anderer Mittel) darin besteht, die Menge von DMSO in der Lösung zu
Lasten von Ethylenglycol zu erhöhen.
Auf diese Frage eingehende Informationen werden nachstehend gegeben.
-
Beispiel 8: Vielseitigkeit
und überlegener
Entglasungswiderstand von Amid
-
8 sammelt
Daten über
die toxische Wirkung von Amiden und Amidgemischen auf Kaninchennierenrinde
und die Umkehrung dieser toxischen Wirkungen durch DMSO. Sie beschreibt
die Vielseitigkeit von Formamid, Harnstoff, Formamid/Harnstoff-Gemischen
und Hydroxyharnstoff bezogen auf ihre Wirkungen auf die Zell-Lebensfähigkeit
und bezogen auf die Neutralisierung dieser Wirkungen durch Dimethylsulfoxid.
Diese Daten erweitern frühere
Daten (Fahy, da Mouta, Tsonev, Khirabadi, Mehl und Meryman in: Cell
Biology of Trauma, J. J. Lemasters und C. Oliver, Hrsg., CRC Press,
1995, S. 333–356)
auf einen überraschenden
Grad, wie folgt. Zuerst scheinen Hydroxyharnstoff, Harnstoff und
gleiche Gewichte von Harnstoff und Formamid (Kreise, Rhomben bzw.
Sechsecke auf der abfallenden Kurve) auf einer Prozentgewicht/Volumen-Basis
dieselbe toxische Wirkung zu haben wie Formamid allein. Dies trifft
trotz Veränderungen
der Molekülmasse
zwischen diesen Amiden zu, trotz der Tatsache, dass Harnstoff und
Hydroxyharnstoff zwei Aminogruppen gegen die eine Aminogruppe von
Formamid aufweisen, und trotz der Tatsache, dass eine der Aminogruppen
von Hydroxyharnstoff mit einer Hydroxygruppe modifiziert wird. Zweitens
scheint die Neutralisation der Toxizität all dieser Mittel und Mittelkombinationen
durch die Zugabe von DMSO (nach rechts ansteigende Kurven) ebenfalls
denselben quantitativen Trends bezogen auf %-G/V-Konzentrationen
zu folgen, wie sie zuvor für
die Neutralisierung der Fomamid-Toxizität allein dokumentiert wurden
(umgekehrtes Dreieck; und Fahy, da Mouta, Tsonev, Khirabadi, Mehl
und Meryman in: Cell Biology of Trauma, J. J. Lemasters und C. Oliver,
Hrsg., CRC Press, 1995, S. 333–356),
wieder trotz der gerade festgestellten Unterschiede.
-
Wie
Formamid kann es eine Obergrenze der Menge von Harnstoff oder anderem
Amid geben, deren Toxizität
durch DMSO umgekehrt werden kann. Eine Harnstoffkonzentration in
der Nähe
von 15 % sollte jedoch im Wesentlichen vollständig entgiftbar sein und Vorteile
haben, weil Harnstoff noch schlechtere Glasbildungslösungen bildet
als Formamid (Punkt 6 gemäß 3). Wenn
diese harnstoffreichen Lösungen
verglasen, vermögen
sie es darüber
hinaus nicht, beim Erwärmen
zu entglasen, eine bemerkenswerte und unerwartete Eigenschaft, vermutlich
wegen der Verarmung von Wasser aus der Lösung in einem derartigen Ausmaß, dass
ungenügend
Wasser zum Gefrieren übrig
bleibt. Vorteilhafte harnstoffhaltige Zusammensetzungen sind in
der Haupt-Verglasungslösungstabelle
angegeben und darin einbezogen (siehe unten).
-
Die
durch 8 bereitgestellte Flexibilität sollte es Forschern erlauben,
ihre Amidmischung gemäß Besonderheiten
der Zellmembrandurchlässigkeit
und biochemischen Toxizität
maßzuschneidern,
die zwischen diesen Amiden und Amidmischungen variieren. Hydroxyharnstoff,
der als Inhibitor der Zellteilung bekannt ist, hatte in den in 8 veranschaulichten
Experimenten keine nachteilige Wirkung und wird beispielsweise vorteilhaft
sein, wenn Zellteilung unerwünscht
ist.
-
Beispiel 9: Formeln zur
Konservierung durch Unterkühlung
-
9 stellt
das Verfahren zum Auswählen
von Lösungen
zur Verwendung in Unterkühlungsversuchen an
lebenden Systemen dar. 9 veranschaulicht die Konzentrationen
von benötigtem
Veg-Gelöstem
in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,1–1,0 % PVA mit ~ 1.000 Dalton
Molekülmasse
graphisch (ein bereitstehendes Handelsprodukt, das "X-1000" genannt wird), um
eine stabile Unterkühlung
für wenigstens
48 Std. in einem Haushaltskühlschrank-Gefrierfach
nachzuweisen, der am meisten praktisch verfügbaren Temperatur für unterkühlte Lagerung.
Die Kreise stellen Lösungen
dar, welche die physiologische Lösung
RPS-2 enthalten, die in der Literatur beschrieben ist, und die Quadrate
stellen Lösungen
basierend auf einem RPS-T genannten Vehikel dar, worin 175 mM Trehalose
plus 5 mM Glucose die in RPS-2 gefundene 180-mM-Glucosekonzentration
ersetzen.
-
Tabelle
3: In diesen Studien verwendete Träger-(Vehikel-)Lösungen
-
Wie
gezeigt, bleibt Veg-Gelöstes
unter solchen Bedingungen (Temperatur ca. –20°C±3°) bei einer Gesamtkonzentration
von 33 % G/V und 30 % G/V in jeder Vehikellösung flüssig, aber Lösungen mit
einer Konzentration von 27,5 % gefrieren spontan, so dass die sichere
Konzentration zur Unterkühlung
ca. 28–30
% G/V oder vielleicht 29 % ist. Die erforderliche Gleichgewichtskonzentration
von Veg-Gelöstem
zum Erniedrigen des Gefrierpunktes auf die Durchschnittstemperatur
in dem vorher erwähnten
Tiefkühler
beträgt
ungefähr
33–34
% G/V, was bedeutet, dass Veg-Gelöstes in jeder Vehikellösung unterkühlt, wenn
seine Konzentrationen um ca. 5–6
% G/V reduziert werden, aber nicht weiter. Die Zugabe von 0,1 %
X-1000 zu 27,5 % Veg-Gelöstes-Lösungen eliminiert
das Gefrieren von 27,5%-Lösungen,
aber nicht von 25 % G/V Veg-Lösungen.
Jedoch erniedrigt die Zugabe von 1 % X-1000 die benötigte Konzentration
zum Unterkühlen
bis auf 23 % G/V, obwohl noch bei einer Veg-Gelöstes-Konzentration von 22 %
G/V ein Gefrieren stattfindet. Somit erweitert 1 % X-1000 die Spanne
zugänglicher
Konzentrationen zur kurzfristigen Lagerung (z. B. für 48 Std.)
in schwach toxischen Medien von den anfänglichen 5–6°C auf eine Gesamtkonzentrationserniedrigung
von 10°C
oder etwa das Doppelte des normalen Grenzwertes. Daher besteht ein
Verfahren zum Lagern von Systemen in schwach toxischen Medien unter
Unterkühlungsbedingungen
darin,
- a) die gewünschte Speichertemperatur zu
bestimmen,
- b) die Kälteschutzmittel-Konzentration
zu bestimmen, die diese Temperatur als ihren Gleichgewichtsschmelzpunkt
aufweist,
- c) ca. 8–10
% G/V von dieser Gleichgewichtskonzentration abzuziehen, und
- d) das interessierende System bei der interessierenden Lagertemperatur
in der auf diese Weise berechneten, interessierenden Lösung zu
lagern.
-
Auf
Wunsch können
höhere
Konzentrationen von PVA für
noch größeren Unterkühlungsschutz
verwendet werden.
-
Eine
Vorsichtsmaßnahme
ist, dass es wesentlich ist, vor dem Kühlen eine vollständige Permeation
des PVA in die Probe sicherzustellen, und die Probe sollte während der
Lagerung möglichst
wenig geschüttelt
werden. In Vorversuchen gefroren einige Testgewebescheiben wegen
der unvollständigen
Penetration von PVA in die unzureichend exponierten Scheiben.
-
Beispiel 10: Veg-Gelöstes bildet überlegene
Gefrierlösungen
-
Ein
jüngeres
Gefrierexperiment verglich das Gefrieren von Kaninchennierenscheiben
auf –130°C in Anwesenheit
von entweder 30 % G/V DMSO oder 30 % G/V Veg-Gelöstem. Das K/Na-Verhältnis nach
Einfrieren und Auftauen betrug in DMSO 2,46 ± 0,30, wohingegen das K/Na-Verhältnis nach
Einfrieren und Auftauen in 30 % G/V Veg-Gelöstem 3,10 ± 0,07 betrug (p < 0,05).
-
Ein
jüngeres
Gefrierexperiment verglich das Gefrieren von Rattenhepatozyten in
Suspension auf –140°C in Anwesenheit
von entweder 10 % V/V DMSO oder 10 % V/V Veg-Gelöstem. In Bezug auf die anfängliche
Lebensfähigkeit
waren 98 % der Veg-behandelten, nicht gefrorenen Hepatozyten imstande,
Trypanblau-Farbstoff auszuschließen, wohingegen nur 70 % der
DMSO-behandelten, nicht gefrorenen Hepatozyten ihre Farbstoffausschlussfähigkeit
nach Zugabe und Entfernen von DMSO allein behielten. Nach dem Einfrieren und
Auftauen blieben 65 % der anfänglichen
Anzahl frisch isolierter Hepatozyten geeignet, Trypanblau-Farbstoff
auszuschließen,
wohingegen nur 60 % der gefrorenen/aufgetauten Hepatozyten diese
Fähigkeit
behielten, wenn sie mit DMSO gefroren waren.
-
Menschliches
Sperma wurde 2 M Veg-Gelöstem
oder 2 M Glycerol nahe 0°C
unter Verwendung von schrittweisen Zugabeverfahren ausgesetzt, dann
gefroren, aufgetaut und auf Videoband aufgenommen, ohne das Kälteschutzmittel
zu entfernen. Das in 2 M Veg gefrorene menschliche Sperma erlangte
wieder eine Motilität ähnlich der
vor der Zugabe von Veg beobachteten, wohingegen in 2 M Glycerol
gefrorenes Sperma beim Auftauen größtenteils bewegungslos war.
-
Beispiel 11: Verglasungslösungen des
Veg-Typs erlauben überlegene
Erholung nach Verglasung und Wiedererwärmung
-
Kaninchen-Nierenrindenscheiben
wurden mit einer von drei Verglasungslösungen äquilibriert, dann verglast,
wieder erwärmt
und nach 90 min Erholung bei 25°C
in Bezug auf ihr K/Na-Verhältnis
beurteilt. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 4 gezeigt.
-
Tabelle
4: K/Na-Verhältnis
von Kaninchen-Nierenrindenscheiben
-
- *0,31 ist das K/Na-Verhältnis
ganz toter Scheiben und ist gleich dem K/Na-Verhältnis des Bademediums.
-
Beispiel 12: Verglasungslösungen des
Veg-Typs sind weniger toxisch für
die menschliche Augenhornhaut als VS41A
-
Menschliche
Augenhornhäute
wurden VS41A oder Veg + 3 % EG für
25 min bei 0°C
ausgesetzt und die Kälteschutzmittel
dann ausgewaschen. Unter Verwendung eines Lebend/Tot-Vitalfärbungstests
und der Rasterelektronenmikroskopie wurde festgestellt, dass 20
% der Korneaendothelzellen mit VS41A abgetötet oder schwer beschädigt waren,
wohingegen nur 10 % der Endothelzellen mit Veg + 3 % EG abgetötet oder beschädigt waren.
-
Beispiel 13: VS41A ist
Verglasungslösungen
des Standes der Technik überlegen,
aber Veg ist VS41A überlegen
-
Die
Annahme, dass keine Lösung
des Standes der Technik besser ist als VS41A, wurde durch Herstellen
von drei in der Literatur beschriebenen Lösungen bestätigt, für die
- a)
das Erreichen hoher Überlebensraten
in den Systemen beansprucht wurde, für die sie verwendet wurden,
und
- b) basierend auf ihrer Ähnlichkeit
mit Veg eine geringe Toxizität
wahrscheinlicher erschien als bei anderen Lösungen in der Literatur.
-
Diese
drei Lösungen
wurden mit VS41A und Veg verglichen, und die Ergebnisse sind in
Tabelle 5 gezeigt.
-
Tabelle
5: Vergleich früher
verwendeter Kälteschutzlösungen mit
VS41A und Veg
-
Abkürzungen:
-
- EFS = 40 % V/V EG + 1 g % Ficol (70 kD) + 0,3 M Sucrose
- EGP = 8,5 M EG + 10 % PVP
- EPT = 40 % V/V EG + 20 % PVP + 11,3 % Trehalose
-
Verfahren zum Einbringen
und Entfernen der Verglasungslösungen:
-
1/8 der vollen Verglasungslösungsstärke, ¼ der vollen
Verglasungslösungsstärke, die
Hälfte
der vollen Verglasungslösungsstärke, die
volle Verglasungslösungsstärke (1X), ½X + 300
mM Mannitol, 3/8X
+ 300 mM Mannitol, ¼X
+ 300 mM Mannitol, 0X + 300 mM Mannitol, gewöhnliches Vehikel (MHP-2). Jeder
Schritt dauert 20 min außer
dem Schritt 1X, der 40 min dauert. Alle Schritte werden bei 0°C vorgenommen.
-
Beispiel 14: Viele Variationen
von Veg sind VS41A überlegen
-
Tabelle
6 im Anschluss listet Lösungen
auf, die sich in der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft herausgestellt
haben. Die Auflistung schließt
die Identität
der Lösung,
das mit der Lösung
verbundene Lebensfähigkeitsresultat
in Bezug auf Exposition an andere Lösungen oder in Bezug auf unbehandelte
Kontrollen und Informationen betreffend die Verglasungsneigung und
Entglasungsneigung der Lösung
ein. Weitere Variationen werden für den Fachmann auf diesem Gebiet
bei Betrachtung der aufgelisteten Musterlösungen ersichtlich sein.
-
Ein
weiterer Ausblick auf den Wert der in Tabelle 6 aufgeführten Lösungen kann
durch Betrachten eines frühen
Beispiels erhalten werden, Veg + 3 % EG (Lösung # 15-1). Diese Lösung hat
eine ähnliche
Toxizität wie
eine Lösung,
die als V52 bekannt ist, aber anders als V52 ist Veg + 3 % EG sehr
wahrscheinlich ausreichend stabil zur Verglasung von Kaninchennieren.
V52 ist eine Zusammensetzung auf halbem Wege zwischen VS4 und VS41A
und ist verwendet worden, um Kaninchennieren auf den Punkt der osmotischen
Herstellung des Gleichgewichtes zu perfundieren, auf –35°C abzukühlen, wieder
aufzuwärmen
und nach der Transplantation mit sofortiger kontralateraler Nierenentfernung
wiederzugewinnen, mit Erlangung einer 100%igen Überlebensrate und einer 100%igen
Rückkehr
der Empfängerkaninchen
in einen dauerhaft normalen klinischen Zustand (Khirabadi et al.,
1995). Wenn Veg + 3 % EG bezogen auf Toxizität dasselbe Ergebnis erzielen
kann, ist es wohl auch ausreichend stabil, um als Nächstes diese
Nieren durch Verglasung bei kryogenen Temperaturen erfolgreich zu
konservieren und aufzubewahren. Dabei ist Veg + 3 % EG weit von
der am meisten überlegenen oder
vorteilhaften Lösung
entfernt, die in Tabelle 5 aufgeführt ist. Aus dieser Perspektive
heraus sollte deutlich sein, dass selbst augenscheinlich kleine
Toxizitätszunahmen
für den
Erfolg eines Kryokonservierungsprozesses entscheidend sein können und
dass zumindest so weit unten eingeordnete Lösungen wie die Lösung 15-1 von
großem
Wert sein könnten.
-
Eine
weitere Perspektive ist in 10 bereitgestellt,
in der die Daten der Tabelle 6 in eine grobe Schätzung der Lebensfähigkeit
gegen die kritische Erwärmungsgeschwindigkeitskurve
umgesetzt sind, um eine schwerwiegende Entglasung beim Erwärmen zu
verhindern. VS41A (leere Kästchen)
erfordert in diesen Experimenten schätzungsweise eine Erwärmung bei
ca. 150–160°C/min, abhängig von
der verwendeten Vehikel- oder Trägerlösung. Lösungen der
Erfindung stellen bei derselben geschätzten kritischen Erwärmungsgeschwindigkeit
ungefähr
die doppelte Lebensfähigkeit
bereit, wie sie VS41A gestattet (senkrechter Pfeil nahe der Beschriftung "VS41A"). Anders gesehen,
wenn die von VS41A bereitgestellte Lebensfähigkeit als zufriedenstellend
angesehen wird, können
die Lösungen
der Erfindung dieselbe Lebensfähigkeit
bereitstellen, aber bei einer kritischen Erwärmungsgeschwindigkeit, die
ca. 100 Mal niedriger ist als die kritische Geschwindigkeit, die
für VS41A
benötigt
wird. Die experimentelle Variabilität der Daten ist durch die Rhomben
angedeutet, die zwei unabhängige
Tests (34-4 und 36-1) derselben Lösung veranschaulichen.
-
Bis
zur Vorlage dieser Anmeldung war nicht genügend Zeit, die Daten der Tabelle
6 bezogen auf qv* zu analysieren. Jedoch ist offensichtlich, dass
Ausnahmen zur qv*-Regel zu finden sein werden. Augenscheinlich haben
geringe Konzentrationserhöhungen
(ca. 3 % G/V) allgemein ähnliche
Wirkungen auf die Lebensfähigkeit
in einem Veg-Hintergrund. Dies gestattet die Verstärkung der
Stabilität
der Lösung
durch gute glasbildende Mittel wie Methoxyglycerol ohne Folgen,
vorausgesetzt, die anderen Lösungsherstellungsregeln
werden befolgt. Dies ist eine bedeutende Ausweitung der Verwendung
der qv*-Methode.
-
Aus
dem gleichen Grund sind Mittel wie Acetol, 1,3-Propandiol, Dihydroxyaceton
und Acetoin nicht imstande, Ethylenglycol ganz in Veg zu ersetzen,
vielleicht weil diese Mittel zu hydrophob sind. Eine Verwendung in
Maßen
kann jedoch vorteilhaft sein.
-
Die
in Tabelle 6 aufgezeichneten Verglasungsdaten wurden erhalten, wie
folgt. Proben wurden untersucht, indem wenigstens ein Reagenzglas,
das 5 ml einer Probe plus 1 ml Isopentan als Oberflächenschicht enthielt,
auf einem starren Träger
befestigt und dieser Träger
in einem festen Abstand über
der Oberfläche
von flüssigem
Stickstoff in einem Dewar-Gefäß mit mittlerer
Halsöffnung
angebracht wurde, wobei zeitgleich eine Parallelprobe derselben
Lösung
laufen gelassen wurde, um die Wärmeentwicklung
der Probe zu dokumentieren, und basierend auf ihrem Erscheinungsbild
nach dem Abkühlen
oder basierend auf ihrer Löslichkeit
eingestuft. Die Einstufungen wurden nur für die Proben als verlässlich angesehen,
die keine Thermopaarsonden enthielten. Alle Proben enthielten eine
biologisch kompatible Vehikel- bzw. Trägerlösung. Wo anwendbar, wurden
die Proben nach Abschluss des Abkühl- und Einstufungsvorgangs
ferner auf ihre Stabilität
beim Erwärmen geprüft. Dies
wurde bewerkstelligt durch Übertragen
der Proben- und Vergleichsröhrchen
in entweder
- a) ein Bad von ungefähr 100 ml
Methanol bei ungefähr
Raumtemperatur (geschätzte
Erwärmungsgeschwindigkeit:
60–100°/min) oder
- b) ein kochendes oder beinahe kochendes Wasserbad (geschätzte Erwärmungsgeschwindigkeit: 100–200°/min oder
mehr) oder in einigen Fällen
auf andere Arten.
-
Zum
Beispiel wurden Proben in einigen Fällen zu einem auf 0°C gehaltenen
Methanolbad transferiert, und in anderen Fällen in einem Tiefkühlgerät mit geregelter
Geschwindigkeit gekühlt
und erwärmt,
um das Gefrieren beim Abkühlen
oder Erwärmen
mit relativ langsamen Temperaturwechselraten erkennen zu lassen.
Die Abkühlungskurven
und damit die berechneten Durchschnittsabkühlungsgeschwindigkeiten (9–11 °C/min) waren
sehr einheitlich. Die so berechneten Erwärmungsgeschwindigkeiten stellten
sich als etwas uneinheitlich heraus. Dies kann auf das hohe Erwärmungstempo
im Vergleich zum Abkühlungstempo,
die Unkontrollierbarkeit der genauen Anordnung der Temperatursonde
zwischen der Wand und dem Zentrum der Probe, die unvollkommene Übereinstimmung
der Rührgeschwindigkeit
oder manuellen Schüttelgeschwindigkeit
im Wärmebad
und die unvollkommene Übereinstimmung
der Wärmebadtemperatur
und der Probentemperatur zu dem Zeitpunkt, wo die Probe zum Wärmebad transferiert
wurde (gewöhnlich –105 bis –95°C, manchmal
hinunter bis zu rund –110°C) sowie
die von Probe zu Probe unterschiedlichen Wärmeeigenschaften der Proben
selbst zurückzuführen sein.
-
Tabelle
6: Muster-Kälteschutzlösungen mit
niedriger Toxizität
-
-
-
Abkürzungen:
-
- E oder EG = Ethylenglycol; D = DMSO; F = Formamid; U = Harnstoff;
D(n)Y = DMSO in einem n:1-Molverhältnis von D zu Y, wobei Y ein
anderes Kälteschutzmittel
ist; tiefgestellte Zahlen wie E20 oder [D(0,7)F]40 beziehen sich
auf absolute Zahlen in Gramm pro Deziliter der Substanz, die der
Tiefstellung vorangeht, wie z. B. Ethylenglycol bzw. D(0,7)F; MG
= 3-Methoxy-1,2-propandiol; PVP = Polyvinylpyrrolidon; PEG = Polyethylenglycol;
PVA = Polyvinylalkohol, 80 % hydrolysiert aus Polyvinylacetat; NDV
= keine Entglasung; Fr = gefroren; T = nur transparentes Eis; pDV
= Teilentglasung;
sDV = nur Oberflächenentglasung (Entglasung
nur an der zurückweichenden
Flüssig/Gummiphasengrenze); wsDV
= schwache Oberflächenentglasung; ~ = ungefähr;
nt = nicht untersucht; e = geschätzt;
% K+/Na+ stellt einen
Vergleich zwischen zwei Gruppen von Kaninchen-Nierenrindenscheiben
dar, die gewöhnlich
jeweils 8–12
Scheiben enthalten.
- *Ungefähr
erforderliche Abkühlungsgeschwindigkeit
für vollständige visuelle
Verglasung. RPS-2-Daten mit niedriger Referenznummer mögen die
Stabilität
beim Abkühlen
und Erwärmen
der CPA-Lösung
in RPS-2 zu hoch bewerten. Standard-Verfahren zum Einbringen und
Entfernen von CPA und Untersuchen der K+/Na+-Verhältnisse
sind durch Subtrahieren von 0,309 von den Originalverhältnissen
korrigiert, um von Null abweichende Hintergründe auszugleichen.
-
Andere
Variationen sowohl der Lösungen
als auch der feineren Aspekte zur Berechnung von qv* werden für den Fachmann
auf diesem Gebiet offensichtlich sein.