DE69929071T2

DE69929071T2 - Verbesserte kälteschutzlösungen

Info

Publication number: DE69929071T2
Application number: DE69929071T
Authority: DE
Inventors: Brian Wowk; M. Gregory FAHY
Original assignee: 21st Century Medicine Inc
Current assignee: 21st Century Medicine Inc
Priority date: 1998-09-21
Filing date: 1999-09-21
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2019-09-22
Also published as: WO2000016618A1; AU1093900A; CA2345009C; WO2000016619A1; US6391224B1; US6395467B1; CA2345018A1; EP1115281B9; EP1115281B1; ATE313259T1; WO2000016618A9; EP1115281A1; CA2345009A1; AU6499299A; DE69929071D1

Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Tieftemperaturbiologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Kälteschutzverfahren und neuartige Kälteschutzlösungen sowie die Prinzipien, die eine Minimierung ihrer Toxizität ermöglichen, vorzugsweise ohne ihre Verglasungsfähigkeit und Entglasungswiderstandsfähigkeit im Wesentlichen zu schwächen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kryokonservierung betrifft die Konservierung von Systemen, die bei Temperaturen unter dem normalen Gefrierpunkt von Wasser (0°C) lebende Zellen enthalten. Die Geschichte und Literatur der Tieftemperaturbiologie, das Gebiet der Wissenschaft, das die biologischen Phänomene der Tieftemperatur zu verstehen und Kryokonservierungsmethoden zu verbessern versucht, ist groß und umfangreich, und ihre Erfolge haben in den letzten etwa 40 Jahren Hunderte von Millionen von Amerikanern und viele andere auf der ganzen Welt auf die eine oder andere Art berührt. Aber trotz ihrer vielen eindrucksvollen Erfolge hat die Tieftemperaturbiologie noch keine Wege zur zeitlich unbegrenzten Kryokonservierung transplantierbarer Nieren, Herzen und Lebern (trotz des hohen Wertes, den eine solche Technologie hätte) oder sogar viel einfacherer Systeme gefunden. In vielen Fällen können Zellen, wie z. B. menschliches Sperma und Stiersperma und sogar menschliche Augenhornhäute, ein Einfrieren überstehen, aber mit einem unerwünschten Ausmaß von Verletzungen. Zum Beispiel frieren bis zu 95 % von menschlichem Spendersamen nicht gut genug, um klinisch verwendet zu werden, das Überleben von Stiersperma beträgt im Wesentlichen weniger als 100 %, und gefrorene/aufgetaute Augenhornhäute verhalten sich so schlecht, dass Augenbanken allgemein lieber die einfache kalte Lagerung in OptiSol^TM für kurze Zeitspannen einsetzen als unbegrenzte Konservierung, die die Kosten erheblich reduzieren und viele Versorgungsprobleme lösen könnte. Es gibt eindeutig genügend Gründe, die Kryokonservierungstechniken zu verbessern, sowohl vom humanitären als auch geschäftlichen Standpunkt aus betrachtet, und doch ist dies bis jetzt nicht erreicht worden.
Fahy schlug 1981–1984 vor, dass eine ausgezeichnete Kryokonservierung sowohl einfacher als auch hoch komplexer lebender Systeme ohne Eisbildung erreicht werden könnte, ein Verfahren, das als Verglasung bezeichnet wird, indem als Kälteschutzmittel bekannte chemische Mittel in extrem hohen Konzentrationen verwendet werden (Fahy, Cryobiology 18: 617, 1981; Fahy und Hirsh in: Organ Preservation, Basic and Applied Aspects, D. E. Pegg, I. A. Jacobsen und N. A. Halasz, Hrsg., MTP Press, Ltd., 1982, S. 399–404; Fahy et al., Cryobiology 21: 407–428, 1984). Wie Fahy 1986 ferner erläuterte, "... können alle vorausgesetzten Probleme in der Tieftemperaturbiologie im Prinzip durch die Wahl einer ausreichend hohen Konzentration von Kälteschutzmittel gelöst werden. ... Im Extremfall könnte jegliche Eisbildung vollständig unterdrückt werden, wenn eine Kälteschutzmittel-Konzentration verwendet wird, die ausreicht, die Verglasung sicherzustellen." Fahy, Cryobiology 23: 1–13 (1986).
Der potentielle Markt für Gewebsersatz jeglicher Art, wenn erst einmal alle Versorgungs- und Abstoßungsprobleme beseitigt sind, ist von kompetenter Seite auf an die 500 Milliarden Dollar pro Jahr geschätzt worden. Dieses Potential kann durch eine Kombination von erheblich verbesserter Beherrschung der Abstoßung, verstärkter Wiederherstellung natürlicher Gewebe und Organe sowie Entwicklung künstlicher Gewebe und Organe verwirklicht werden (entweder technisch hergestellte Gewebe und Organe oder Gewebe und Organe, die einfach im Labor gezüchtet werden anstatt im menschlichen Körper), aber nur, wenn es auch möglich wird, die enorme Anzahl von Geweben und Organen, die zur Abdeckung dieses immensen Marktes erforderlich sind, mittels Kälte zu konservieren.
Der Wert von Lösungen mit minimaler Toxizität zur Kryokonservierung ist eindeutig enorm und stellt ein Problem dar, das bis jetzt trotz der intensiven Bemühungen von Kryobiologen auf der ganzen Welt nicht gelöst wurde, die seit dem Bericht über die vor Kälteschaden schützenden Wirkungen von Glycerol 1949 (Polge, Smith und Parkes, Nature 164: 666, 1949) extensiv an der Kryokonservierung arbeiten. Fahy selbst hat zahlreiche Bemühungen zur Verbesserung seiner eigenen Verglasungslösungen für Gewebescheiben und Organe ohne Fortschritt seit der Übernahme der VS4-VS41A-Serie um 1986 beschrieben (Fahy, Levy und Ali, Cryobiology 24: 196–213, 1987; Fahy, Lilley, Linsdell, Douglas und Meryman, Cryobiology 27: 247–268, 1990; Fahy, Cryobiology 35: 344–345, 1997).
US-A-4,559,298 offenbart ein Verfahren zur Kryokonservierung biologischer Materialien in einem nicht gefrorenen oder glasigen Zustand. PVP (Polyvinylpyrrolidon) ist ebenfalls als ein Additiv erwähnt, das helfen kann, eine Entglasung zu verhindern.
Eine der Studien, auf die in der WO 96/05727 Bezug genommen wurde (vgl. Seite 7, Zeile 29 bis Seite 8, Zeile 1) war die Verwendung nicht eindringender Wirksubstanzen, die als Ersatz für einen Anteil des ansonsten benötigten Penetriermittels dienen können und so dem Zellinneren eine zusätzliche intrazelluläre Wirksubstanzexposition ersparen.
WO 96/30459 bezieht sich auf vorgeschlagene Eiskontrollmoleküle und deren Anwendungsformen. Es wird vorgeschlagen, dass diese Eiskontrollmoleküle oder IIDs (Eis-Grenzflächendotanten) das Wachstum von Eis in verglasbaren Lösungen verlangsamen. Es wird angedeutet, dass Eiskristalle, die sich dennoch bilden, klein genug sind, um beim Konservieren unschädlich für Organe, Körperflüssigkeiten oder andere Körpergewebe zu sein. Zu diesem Zweck wird vorgeschlagen, Kryokonservierungslösungen IIDs zuzusetzen. Es wird ferner vorgeschlagen, dass synthetische IIDs produziert oder synthetisch hergestellt werden können, die z. B. Saccharide oder Polysaccharide umfassen, die mit einem Kohlenstoffpolymer-Rückgrat verbunden sind, wie es z. B. in PVA (Polyvinylalkohol) zu finden ist (vgl. Seite 15, Zeile 19 bis Seite 16, Zeile 11). PVA selbst gehört jedoch nicht zu den vorgeschlagenen IIDs.
WESEN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Anmeldung stellt Kälteschutzlösungen bereit, die selbst bei höheren Gesamtkonzentrationen als zuvor betrachtet eine beispiellose Ungiftigkeit und dabei eine gute Stabilität beim Erwärmen aufweisen, und stellt Verfahren zur Gestaltung zusätzlicher Beispiele davon bereit. Durch Verwenden des Prinzips, das in den Beispielen vorgestellt und in Anspruch 1 definiert ist, besitzt der Anwender große Flexibilität in der Auswahl von Variationen bei der Feinabstimmung für die besonderen Bedürfnisse des Anwenders. Des Weiteren gestattet die Erfindung bei Beschäftigung mit den hierin offenbarten neuen Gestaltungsprinzipien die Gestaltung ganz neuer vor Kälteschaden schützender Substanzen. Die Erfinder glauben, dass diese neue Kryokonservierungstechnologie die erfolgreiche Konservierung der meisten Systeme durch Einfrieren oder Verglasung erlauben wird. Die vorliegende Erfindung führt ferner neuartige Gefrierschutzmittel ein, die für spezielle Verwendungen basierend auf den allgemeinen Prinzipien und neuartige Verwendungen zuvor bekannter Gefrierschutzmittel ausgewiesen sind. Beide sind wertvoll beim Nachweis von Kryokonservierungslösungen der besten Art.
Die Erfindung stellt einen neuen theoretischen und praktischen Leitfaden bereit, der zur Herstellung von Verglasungslösungen mit minimaler Toxizität nützlich ist. Die Erfindung stellt ferner auf diesen neuen theoretischen Einsichten basierende spezifische Familien von Verglasungslösungen bereit, die minimale Toxizität aufweisen und für unähnliche biologische Systeme wirksam sind.
So stellt die vorliegende Erfindung verbesserte Lösungen zur Kryokonservierung von Zellen, Geweben, Organen, künstlichen Organen, künstlichen Geweben und unbelebten biologischen Systemen bereit. Die Erfindung stellt auch auf den neuen Verglasungslösungen basierende spezifische Familien von Gefrierlösungen bereit.
Die Erfindung stellt Kälteschutzlösungen und Verfahren bereit, die ferner bei der Konservierung durch Gefrierpunktserniedrigung, Unterkühlung und kalte Lagerung Anwendung finden. Die Erfindung stellt ferner spezifische Lösungen bereit, die, wenn sie auf die richtige Art verwendet werden, gänzlich unvorhergesehene vorteilhafte Wirkungen aufweisen (reduzierte Kälteschutztoxizität, verstärkte Verglasungsneigung und verstärkte Widerstandsfähigkeit gegen Entglasung).
Hierin werden neue Wege und neue Wirksubstanzen zum Hemmen des Wachstums von Eiskristallen in wässrigen Lösungen und in anderen Zusammenhängen beschrieben. Die Erfindung stellt Verfahren zur Maßstabsvergrößerung der Verglasung kleiner biologischer Systeme zur Verwendung bei großen biologischen Systemen mit minimalen oder keinen erforderlichen Erhöhungen der Konzentrationen von Standard-Kälteschutzmitteln bereit. Die Erfindung stellt ferner Kälteschutzlösungen bereit, die, sehr überraschend, keine Lücke zwischen der Konzentration, die verglast, und der Konzentration aufweist, die mit mäßigen Geschwindigkeiten ohne Entglasung erwärmt werden kann.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Toxizität (gemessen durch Gewebereduktion im Verhältnis K⁺/Na⁺) von 13 Verglasungslösungen für Kaninchen-Nierenrindenscheiben.
2 stellt die Toxizitätsdaten gemäß 1 mit Bezug auf den Wassergehalt der Lösung dar.
3 zeigt eine retrospektive Analyse von Lebensfähigkeitsdaten bezogen auf qv*.
4 zeigt die Lebensfähigkeit von Kaninchen-Nierenrindenscheiben aufgetragen gegen qv* in Lösungen, die ein Gemisch aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Formamid und Ethylenglycol (EG) enthalten.
5 zeigt die Daten aus 3 aufgetragen bezogen auf die absoluten Konzentrationen von DMSO, Formamid und Ethylenglycol in den Lösungen sowie mit Bezug auf den Molprozentgehalt von D(1)F in dem Gemisch.
6 zeigt die Wirkung des Variierens von Veg durch

a) Erhöhen des D(1)F:EG-Molverhältnisses und
b) systematisches Ersetzen von EG durch PG.

7 zeigt die Wirkung des Variierens von Veg durch Reduzieren von Formamid zugunsten von DMSO oder zugunsten von Ethylenglycol oder durch Reduzieren von DMSO zugunsten von Ethylenglycol.
8 beschreibt die Vielseitigkeit von Formamid, Harnstoff, Formamid/Harnstoff-Gemischen und Hydroxyharnstoff bezogen auf ihre Wirkungen auf die Zell-Lebensfähigkeit und bezogen auf die Neutralisierung dieser Wirkungen durch Dimethylsulfoxid.
9 stellt das Verfahren zum Auswählen von Lösungen zur Verwendung in Unterkühlungsversuchen an lebenden Systemen dar.
10 fasst den mit den neuen Lösungen erreichten Stabilitätsgewinn und Lebensfähigkeitsgewinn im Vergleich zur früheren Standardlösung VS41A zusammen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine große Familie von zweckmäßig zusammengesetzten und ausgewogenen Kälteschutzmittel-Gemischen, die Zusammensetzungen mit minimaler Toxizität zur Kryokonservierung von Proteinen, Organellen, Zellextrakten, Zellen, Geweben, Blutgefäßen, Organen und künstlichen oder technisch hergestellten Zellen, Geweben, Blutgefäßen, Organen oder Organoiden, Organismen oder anderen biologischen Systemen durch Verglasung, Einfrieren und andere Mittel sowie die zugehörigen Prinzipien bereitstellen, welche die Strukturformulierung überlegener Kälteschutzlösungen regieren. Es besteht die Überzeugung, dass die vorliegende Erfindung dem Praktiker mit normalem Fachwissen erlauben wird, eine Kryokonservierungslösung zur Verwendung auszuwählen, die den Wert seiner früheren Kryokonservierungslösung übertrifft. Es besteht ferner die Überzeugung, dass ein Lizenzgeber der vorliegenden Offenbarung, wenn er bei einem Kryokonservierungsproblem um Beistand gebeten wird, in der Lage sein wird, die bereitgestellten Beispiele gemäß den hierin enthaltenen Prinzipien zu modifizieren und bei einfacher Betrachtung der Biologie des zu konservierenden Systems eine spezifische Version herzustellen, die speziell auf das interessierende System anwendbar ist.
Bis heute wird die gemäß Fahys Basisansatz angewendete Verglasung, die unter "Hintergrund der Erfindung" beschrieben ist, erfolgreich bei einer breiten Vielfalt lebender Systeme verwendet (z. B. Rall und Fahy, Nature 313: 573–575, 1985; Takahashi et al., Cryobiology 23, 103–115, 1986; Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging Applications and Engineering Contributions, J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S. 113–146). Jedoch war Verglasung im Allgemeinen außerhalb des Gebiets der Embryo-Kryokonservierung wegen der Toxizität der für das Verfahren benötigten hohen Kälteschutzmittel-Konzentrationen nicht weit verbreitet, was die Anwendung des Verfahrens oft unpraktisch, schwierig oder unmöglich macht. Insbesondere ist enttäuschend, dass Fahys Verglasungsansatz in erster Linie durch den Wunsch motiviert war, komplexe Systeme, wie z. B. Säugerorgane, bei Temperaturen unter –100°C zu konservieren und aufzubewahren. Dennoch ist dieses Ziel bis 1998, 17 Jahre nach dem ersten Vorschlag, noch nicht erreicht worden. Der Grund ist wohl, dass derzeit verfügbare Kälteschutzlösungen zu toxisch bleiben, um ein Überleben von 100 % der mit solchen Lösungen behandelten Organe zu gestatten, selbst ohne Kühlung auf kryogene Temperaturen und Wiedererwärmung.
Das Problem der Verringerung der Kälteschutzmittel-Toxizität betrifft nicht nur die Kryokonservierung durch Verglasung. Wie Fahy auch unterstrich (Fahy, Cryobiology 17: 371–388, 1980; Fahy, CryoLetters 4: 309–314, 1983; Fahy, Cryobiology 21: 407–426, 1984; Fahy, Cryobiology 23: 1–13, 1986), produziert Einfrieren wegen des Entfernens von reinem Wasser aus der Lösung in Form von Eis hohe Konzentrationen von Kälteschutzmitteln, was augenscheinlich zu einer ähnlichen Toxizität führt, wie sie zu erleben ist, wenn Zellen verglasungsgeeigneten Lösungen ausgesetzt werden. Auch aus diesem Grund wären weniger toxische Lösungen zum Einfrieren von Zellen und Geweben vorteilhaft, insbesondere vorausgesetzt, dass die Menge von auf Routinebasis eingefrorenen Zellen für alle Anwendungen astronomisch ist.
Von anderen entwickelte Verglasungslösungen (in erster Linie für Embryos oder Pflanzenzellen) ergeben manchmal Zurückgewinnungen von 80 % oder mehr, aber dies ist trügerisch. Alle diese Lösungen erfordern ein rasches Zugeben und Entfernen des Kälteschutzmittels und beinhalten typischerweise eine Exposition an die verglasbare Lösung für rund zwei Minuten oder weniger. Die Wirkung dieser Vorgehensweise mit Minimalexposition besteht darin, die ansonsten starke intrinsische Toxizität dieser Lösungen zu maskieren, aber derart kurze Expositionszwänge beschränken die Verwendung solcher Verglasungslösungen auf kleine Proben. Bei dem Versuch, Organe zu verglasen, sind dagegen Kälteschutzlösungen erforderlich, die für relative lange Zeitspannen (ca. 40 Minuten) in ihren Spitzenkonzentrationen mit Zellen in Kontakt bleiben können, und daher müssen die Lösungen intrinsisch weniger toxisch sein. Manchmal sind Zurückgewinnungen nahe ^~90 % oder mehr bei isolierten Zellsystemen erhalten worden, aber dies geschieht oft oder sogar nur unter Umständen, wo entweder eine einzigartige Widerstandsfähigkeit des gerade untersuchten Systems gegen ein bestimmtes Kälteschutzmittel vorhanden zu sein scheint, was bedeutet, dass dieselbe Lösung auf andere Systeme angewendet nicht wirksam wäre, oder wieder, wenn nur kurze Expositionen gestattet sind.
Darüber hinaus können die meisten Systeme, die eine Verglasung überstehen, mit sehr schnellen Geschwindigkeiten durch Leitungsmethoden erwärmt werden. Dies ist allgemein wesentlich, weil Lösungen, die verglasen, allgemein Erwärmungsgeschwindigkeiten in der Größenordnung von ca. 1.000°C/min erfordern, um der Entglasung (Kristallisierung beim Erwärmen) zu entgehen (Fahy in: The Biophysics of Organ Cryopreservation, A. M. Karow jr. und D. E. Pegg, Hrsg., Plenum Press, 1987), eine Geschwindigkeit, die so hoch ist, dass sie für viele Systeme und bei vielen Einstellungen unerreichbar ist. Dieses Problem hat die Anwendung ansonsten erfolgreicher Verglasungsmethoden beispielsweise auf menschliche Augenhornhäute verhindert (Bourne, 1994).
Da viele Zellen mit den verfügbaren Kryokonservierungstechniken trotz der vorhandenen Möglichkeiten zur Verhütung der Toxizität, wie soeben festgestellt, nicht gut überleben, finden wahrscheinlich ausgezeichnete Kryokonservierungslösungen, die von der Arbeit an der Organ-Kryokonservierung hergeleitet wurden, für die ausgezeichnete Lösungen zwingend sind, Anwendung auf viele andere Systeme. Viele Jahre lang wurde eine Lösung namens VS41A in Experimenten zur Kaninchennieren-Kryokonservierung verwendet. Ihr Erfinder (G.M.F.) hält sie für weniger toxisch als die meisten oder alle anderen verfügbaren und relevanten Verglasungslösungen, und sie hat ein Überleben von ca. 50 % der Kaninchennieren nach Perfusion mit VS41A und Transplantation mit sofortiger kontralateraler Nierenentfernung erlaubt (Fahy in: Advances in Anti-Aging Medicine, Vol. 1, R. M. Klatz, Hrsg., Mary Ann Liebert, Inc., Larchmont, NY, S. 249–255, 1996), aber ein Überleben von 50 % ist nicht genug.
Es gibt derzeit keine Möglichkeit einer zuverlässigen Vorhersage, welche Kälteschutzlösungen bei irgendeinem nicht vertrauten lebenden System wirksam sein werden und welche unwirksam, und es gibt keine andere Methode als Experimentieren nach dem Zufallsprinzip und Mutmaßungen, um vielversprechende Formeln zum Analysieren abzuleiten. Dies hat die Arbeit an der Entwicklung von Kälteschutzlösungen erheblich beschränkt. Auch fehlte dem ganzen Gebiet dadurch eine Richtung, und dies führte zu einem vorherrschenden Verwirrungszustand, der rasche Fortschritte verhinderte.
Die Anzahl möglicher Kombinationen von Kälteschutzmitteln in verschiedenen Anteilen ist nahezu unbegrenzt, so dass die Entdeckung besonders vorteilhafter Formeln ohne maßloses Experimentieren nicht wahrscheinlich ist. Es ist klar, dass es bei diesen gegebenen Problemen, dem bereits erfolglos erschöpften Ausmaß der Bemühungen und den nicht beanspruchten enormen potentiellen Belohnungen für Erfolg im Stand der Technik keine offensichtlichen Wege zur Lösung des Problems der Gestaltung allgemein anwendbarer, annehmbar stabiler, minimal-toxischer Kälteschutzlösungen geben kann.
Wie bereits angedeutet, ist ein Grund dafür, dass bis jetzt keine besseren Lösungen entwickelt worden sind, das Fehlen eines systematischen Wissens betreffend die Mechanismen und Modulatoren der Toxizität von Kälteschutzlösungen (Fahy, Lilley, Linsdell, Douglas und Meryman, Cryobiology 27: 247–268, 1990). Es werden neue Informationen benötigt, um das Treffen aufgeklärterer Auswahlen zur Verringerung der Toxizität von Kälteschutzmittel-Gemischen zu gestatten.
Der erste Schritt zum Wählen von Lösungen mit minimaler Toxizität für die Kryokonservierung ist überraschend das Wählen von Mitteln, die wässrige Lösungen "mangelhaft" verglasen, was bedeutet, dass relativ hohe Konzentrationen von Kälteschutz-Wasser-Bindungsstellen in Bezug auf Wasser erforderlich sind, um Eisbildung zu verhindern. Dies bedeutet, dass diese Lösungen im Vergleich zu stärkeren Glasbildungslösungen relativ wenig Wasser enthalten. Gemäß der überlieferten Weisheit auf dem Gebiet der Tieftemperaturbiologie sollte dies derartige Lösungen toxischer machen, und ist kontraintuitiv unter der Annahme, dass Zellen zur Stabilisierung zarter Zellproteine und Membranen Wasser benötigen. Nichtsdestoweniger wird hierin zum ersten Mal gezeigt, dass das Gegenteil wahr ist, d. h. dass dies die besten Lösungen sind, um Toxizität zu vermeiden, nicht die schlechtesten Lösungen, wie allgemein geglaubt wird.
Ohne sich an irgendeine Theorie binden zu wollen, wird als selbstverständlich angenommen, dass dieses Phänomen durch schwache Kälteschutzmittel-Wasser-Wechselwirkungen erklärt wird. Schwache Kälteschutzmittel-Wasser-Wechselwirkungen lassen darauf schließen, dass mehr Kälteschutzmittel benötigt wird, um Wasser ausreichend zu immobilisieren, um ein wässriges Glas zu bilden, lassen aber auch darauf schließen, dass das Wasser, das übrig bleibt, seine Bindungen mit dem Kälteschutzmittel bereitwilliger brechen kann und daher lebenskritische Moleküle, die lebende Zellen bilden, besser hydratisieren kann. Mit anderen Worten, obwohl der Wassergehalt niedriger ist als in Standard-Verglasungslösungen, ist die Wasserverfügbarkeit zum Hydratisieren lebender Zellen paradoxerweise größer als in Standard-Verglasungslösungen, weil die biologischen Moleküle erfolgreich mit dem Kälteschutzmittel um den Zutritt zu Wasser konkurrieren. Diese entscheidende Schlussfolgerung ist nicht naheliegend und ist zuvor nicht vom Stand der Technik hergeleitet worden.
Wurde der Wassergehalt der Lösung durch Verwendung schlechter Glasbildner auf einem Minimum gehalten, können optimale Kälteschutzlösungen ggf. polymere Stoffe mit einer relativen Molekülmasse von ca. 1.000 Dalton bis 50.000 Dalton anstelle von veränderlichen Mengen von eindringendem Kälteschutzmittel einschließen, um so eine Reduktion der intrazellulären Kälteschutzmittel-Konzentration und dadurch eine wirksame weitere Steigerung der intrazellulären Wasserverfügbarkeit zu gestatten. Diese Polymere können geeignete Polymere zum spezifischen Blockieren von Eiskristallkeimbildung oder Eiswachstum einschließen oder auch nicht. Des Weiteren können die Lösungen auch niedermolekulare Reaktionsmittel (weniger als 1.000 Dalton relative Molekülmasse) enthalten, die imstande sind, die Kristallkeimbildung und/oder das Wachstum von Eis spezifisch zu hemmen.
Wie zuerst von Fahy et al. (Cryobiology, 21: 407–426, 1984) vorgeschlagen und aufgezeigt, enthalten Zellen die Glasumwandlung verstärkende Proteine, und daher benötigt Cytoplasma nicht die volle Menge des eindringenden Kälteschutzmittels, das zur Verglasung des extrazellulären Raums benötigt werden mag. Allgemein gesagt, ist es jedoch nicht offensichtlich, dass dieses Prinzip verwendet werden kann, um eine Lösung, die nicht in der Lage ist zu verglasen, verglasen zu lassen, indem die Penetriermittelkonzentration noch weiter reduziert wird. Hierin werden Beispiele bereitgestellt, worin dieser Ansatz zum ersten Mal aufgezeigt wird. Diese Strategie ist wirksam beim Reduzieren einer Schädigung der Zelle im Ganzen, vorausgesetzt, sie wird nicht so weit geführt, dass sie die Entglasung verschlimmert.
Die Verwendung von npCPAs zur Verstärkung der Verglasung ist Routine, die vorliegende Erweiterung der Verwendung von npCPAs in Kombination mit schwach glasbildenden Kälteschutzmittel-Kombinationen jedoch nicht. Auch die Verwendung von npCPAs mit relativ niedriger Molekülmasse wurde hinzugefügt, wie hier zum ersten Mal gelehrt. Schließlich ist die Kombination von npCPAs mit relativ niedriger Molekülmasse und schwach glasbildenden Kälteschutzmittel-Gemischen neu. Letztendlich ist die Kombination aller Modalitäten (schwache Glasbildner, npCPAs oder npCPAs mit niedriger Masse (ImnpCPAs) und Eisblockermittel) noch weiter vom Stand der Technik entfernt.
Das Konzept, dass Konzentrationen lebende Zellen in Mitleidenschaft ziehen, ist immer durch die Tatsache kompliziert gemacht worden, dass es nie eine theoretische Basis dafür gab zu bestimmen, welches Konzentrationsmaß für Toxizität bedeutungsvoll ist. Dies ist insbesondere in der Tieftemperaturbiologie problematisch, in welcher der Kryobiologe Termini wie "Lösungseffekt"-Schaden benutzt, aber ohne imstande zu sein zu bestimmen, welcher Aspekt der Lösungszusammensetzung die Schädigung beeinflusst. Biologen und Chemiker mögen denken, dass ein gegebenes Konzentrationsmaß von Bedeutung ist, aber die Zellantwort muss nicht proportional zu diesem Maßstab sein. Durch Bereitstellen einer deutlich überlegenen Konzentrationsskala zum Verknüpfen der Lösungszusammensetzung mit der Zell-Lebensfähigkeit auf eine Art und Weise, die nie zuvor möglich gewesen ist, wird der Praktiker auf diesem Fachgebiet imstande sein, Kälteschaden und Kälteschutz auf eine nie zuvor möglich gewesene Art und Weise zu betrachten.
Zusammengefasst sind einige Merkmale der Erfindung, wie folgt. Diese Merkmale werden später noch eingehender erläutert.

A) Die q*-Methode des Nachweises neuer, vorteilhafter Kälteschutzformeln (die q*-Skala ist Mol Wasser pro Mol polare Gruppe bei eindringenden Kälteschutzmitteln in der Lösung; der Kehrwert von q*, q*-1, kann ebenfalls verwendet werden). Der Name q* für den Parameter "Mol Wasser pro Mol polare Gruppe" wurde gewählt, um zwischen ihm und Q zu unterscheiden, welcher Mol Kälteschutzmittel pro 10 Mol Wasser ist (z. B. Fahy et al., Cryobiology 21: 407–426, 1984), und q* bei Cv ist qv*. Die qv*-Methode zur Identifizierung nützlicher Kälteschutzlösungen basierend auf dieser Konzentrationsskala besteht daraus, wenigstens ein Kälteschutzmittel auszuwählen, dessen qv* unter 2,0 liegt, dieses in ein Gemisch mit anderen Kälteschutzmitteln aufzunehmen, Cv des resultierenden Gemischs auf normalem Wege zu bestimmen (siehe z. B. Fahy et al., Cryobiology 21: 407–426, 1984), q* bei Cv zu berechnen (qv*) (Anmerkung: die Anzahl von Mol Wasser kann ohne Weiteres ausgehend vom Gewicht eines gegebenen Lösungsvolumens minus der Anzahl von Gramm aller gelösten Stoffe, d. h. aus der Anzahl von Gramm Wasser pro Volumeneinheit oder pro Gewichtseinheit bestimmt werden), den resultierenden qv*-Wert mit den qv*-Werten alternativer Kälteschutzlösungen zu vergleichen und im Allgemeinen lieber Lösungen mit einem niedrigeren qv*-Wert auszuwählen als höhere qv*-Lösungen. qv*-Werte können aus veröffentlichten Q-Werten adäquat geschätzt werden, indem bewertet wird, dass die Dichten aller Lösungskomponenten als Reinsubstanzen unverändert bleiben, wenn sie mit anderen Substanzen in Lösung sind (die Gültigkeit eines ähnlichen Ansatzes bei der Ableitung von Q aus %-G/V-Konzentrationen ist bei Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging Applications and Engineering Contributions, J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S.113–146 erörtert.) Eine Variante dieses Verfahrens ist es, q* in einer Konzentration zu bestimmen, die akzeptable und gleich bleibende Entglasungsraten ergibt, und Vergleiche auf diesen q* (qd*) zu stützen. Zum Verständnis der Gefrierschädigung ist es möglich, q* für unterschiedliche Lösungen bei derselben Wasseraktivität zu berechnen (qa*, der bestimmt werden kann, wenn Zellen auf dieselbe Temperatur gefroren sind) und die resultierende Gefrierschädigung auf Basis der qa*-Werte einzuordnen. Dies erlaubt dann die Entwicklung überlegener Gefrierlösungen. Darüber hinaus kann qa* auch dazu verwendet werden, Kandidatenlösungen zur Konservierung durch Gefrierpunktserniedrigung bei einer gegebenen Temperatur auszuwählen, weil Lösungen mit demselben Gefrierpunkt wieder dieselbe Wasseraktivität aufweisen, was eine sinnvolle Basis zum Vergleich von q*-Werten zwischen unterschiedlichen Lösungen bereitstellt. Eine andere Variante des Verfahrens besteht darin, Lösungen zur Unterkühlung basierend auf den q*-Werten für Lösungen auszuwählen, die gerade konzentriert genug sind, um den gewünschten Grad der Unterkühlung (qs*) zu gestatten. Zusammengefasst erlaubt die q*-Methode überlegene Konservierung durch Verglasung, Tiefkühlung, Gefrierpunktserniedrigung und Unterkühlung. Des Weiteren können für diese Anwendungen gefundene Lösungen auch in niedrigen Konzentrationen (unter ca. 4 Mol) zur Stabilisierung von Zellen, Geweben und Organen bei Temperaturen über ihren Gleichgewichts-Gefrier-/Schmelzpunkten (Tm) angewendet werden, um die Lagerung im flüssigen Zustand bei diesen Temperaturen (kalte Lagerung) zu verlängern.
B) Lösungen, die in erster Linie eine Kombination aus Dimethylsulfoxid und wenigstens zwei schwach glasbildenden Mitteln einschließen, von denen eines ein Amid und eines Ethylenglycol sein kann, mit oder ohne eine Auswahl von anderen Kälteschutzmitteln mit niedrigem und höherem Molekulargewicht, um die Verglasung zu erleichtern und die Entglasung zu hemmen.
C) Optionales Einschließen wenigstens einer von mehreren Formen von Polyvinylalkohol (PVA) als praktische Eisblockermittel in Anwesenheit anderer Kälteschutzmittel.
D) Optionale Verwendung, innerhalb der polymeren Komponente der Lösung, einer oder mehr Formen von Polyvinylalkohol (PVA) als praktische Eisblockermittel in Anwesenheit anderer Kälteschutzmittel.
E) Optionales Einschließen, innerhalb der polymeren Komponente der Lösung, eines oder mehr Polymere mit einer Molekülmasse im Bereich von ca. 800 bis ca. 5.000 Dalton zum Verstärken der Verglasung und Hemmen der Entglasung.
F) Optionales Einschließen von Eishemmstoffen mit niedrigem Molekulargewicht.

Alle diese unterschiedlichen, aber wechselwirkenden Elemente einer Kryokonservierungslösungsformulierung verbinden sich zur Bereitstellung einer wirklich starken Leistungsfähigkeit zum Vermeiden einer Schädigung während und nach der Kryo- oder Kaltkonservierung mit dem erwarteten breiten praktischen und geschäftlichen Nutzwert.
Definitionen
Hierin zu verwendende spezifische Termini werden verwendet, wie nachstehend definiert. Nicht speziell definierte Termini sollen die normalen Bedeutungen haben, die solchen Termini gemäß dem allgemeinen Sprachgebrauch auf dem Gebiet der Tieftemperaturbiologie zugeschrieben werden.
"q*" ist die Anzahl von Mol Wasser in einer Kälteschutzlösung pro Mol polarer Gruppen, die bei eindringenden Kälteschutzmitteln in der Lösung vorhanden sind.
"qv*" ist q* für Lösungen bei ihrer Cv.
"qa*" ist q* für Lösungen bei einer Standard-Wasseraktivität (allgemein hergestellt durch Gefrieren auf eine Standard-Temperatur).
"qd*" ist q* für Lösungen, die eine Standard-Entglasungsneigung zeigen.
"qs*" ist q* für Lösungen, die eine Standard-Unterkühlungsneigung in Anwesenheit einer Standardmenge eines Nukleierungsinhibitors oder Eiskristallwachstum-Inhibitors zeigen, wie z. B. PVA zur Nukleierungshemmung und Gefrierschutzprotein zur Kristallwachstumshemmung oder thermischen Hysteresisinduktion.
"Cv" ist die benötigte Konzentration zum Verglasen von 5–10 ml Lösung bei einer Abkühlungsgeschwindigkeit von ca. 10°C/min.
"Verglasung" ist so definiert, dass genauer das Erstarren einer flüssigen Lösung als Glas als durch Gefrieren gemeint ist.
"Glas" ist hierin so definiert, dass eine flüssige Lösung gemeint ist, deren Molekularbewegungen durch Abkühlen unter die Glasübergangstemperatur der Lösung praktisch zum Stillstand gebracht wurden.
"Entglasung" meint die Bildung von Eis während des Erwärmens einer zuvor tiefgekühlten oder verglasten Lösung (dies ist nicht die Umkehrung von Verglasung; die Umkehrung von Verglasung ist "Glasschmelzen" oder einfach "Verflüssigung" genannt worden).
"Gefrierschutzmittel" sind Chemikalien, welche mit Kryokonservierung verbundene Einbußen reduzieren. Als Kälteschutzmittel anerkannt werden eindringende Kälteschutzmittel (pCPAs), welche die Zellmembran in einem vernünftigen Zeitrahmen durchqueren (Sekunden bis einige zehn Minuten). Nicht eindringende Kälteschutzmittel (npCPAs) bleiben unter den meisten praktischen Bedingungen extrazellulär.
"Kryokonservierung" ist die Konservierung biologischer Systeme durch Gefrieren, Verglasung, Unterkühlung oder Gefrierpunktserniedrigung.
"Unterkühlung" ist das Abkühlen auf eine Temperatur unter dem Gleichgewichtsschmelzpunkt, aber über der Glasübergangstemperatur, ohne die Probe tatsächlich zu gefrieren.
Konservierung durch "Gefrierpunktserniedrigung" ist die Verwendung eines Kälteschutzmittels zum Herabsetzen des Schmelzpunktes einer wässrigen Lösung auf unter 0°C und Lagern eines biologischen Systems (z. B. ein Protein oder ein Organ) innerhalb etwa plus oder minus 3 Grad um diesen Schmelzpunkt, aber unter 0°C.
"Kalte Lagerung" bezieht sich auf die Lagerung über dem Schmelzpunkt der Lösung, typischerweise bei 0°C oder darüber, aber in Anwesenheit eines zum Stabilisieren des biologischen Systems verwendeten Kälteschutzmittels oder Kälteschutzmittel-Gemisches. "Eisblocker" sind Chemikalien, die Eisbildung während des Abkühlens, Erwärmens oder Isothermhaltens besonders gut reduzieren oder beseitigen, entweder indem sie direkt an der Eis/Flüssigkeit-Grenzfläche an das Eis binden oder indem sie Kristallkeimbildung verhindern oder durch andere Mittel.
"Thermische Hysterese" ist oder bezieht sich auf die Differenz zwischen dem Schmelzpunkt der Lösung und der Temperatur, bei der Eis während des Abkühlens unter diese Temperatur mit nennenswerten Geschwindigkeiten wachsen kann. Es hat sich gezeigt, dass Eiswachstum trotz des Vorhandenseins von Eis unter dem Schmelzpunkt verhindert oder erheblich gehemmt wird, wenn an die A-Achse bindende Eisblocker vorhanden sind, bis die Tieftemperaturgrenze für diese Wirkung erreicht wird, welche in diesem Fall die Größenordnung der thermischen Hysterese definiert.
"Gefrierschutzproteine" (oder AFPs, auch "thermische Hysterese-Proteine" oder THPS genannt) sind in lebenden Systemen hergestellte, natürliche Proteine, die thermische Hysterese-Wirkungen erzeugen.
"VS41A" ist eine auf dem Fachgebiet bekannte Kälteschutzlösung und enthält Dimethylsulfoxid, Formamid und 1,2-Propandiol (Propylenglycol oder PG), so dass die Gesamtkonzentration dieser drei Kälteschutzmittel 55 % G/V beträgt, die Stoffmengenkonzentration von Dimethylsulfoxid der Stoffmengenkonzentration von Formamid gleichkommt und die Konzentration von PG 16,84 % G/V beträgt. VS41A wird als die am wenigsten toxische Verglasungslösung angesehen, die für Säugerorgane bekannt ist. "VS4" ist eine verdünnte Version von VS41A, die 6 % G/V weniger eindringendes Kälteschutzmittel als VS41A enthält und unter Verwendung eines angelegten Drucks von 1.000 Atmosphären verglast werden kann.
Eine "Träger"- oder "Vehikel"-Lösung ist der andere Anteil einer Kälteschutzlösung neben den Gefrierschutzmitteln, die in der Lösung vorhanden sind; die "Träger"- oder "Vehikel"-Lösung wird allgemein auch in Abwesenheit von Kälteschutzmitteln verwendet, um die Lebensfähigkeit von Zellen, Organen oder Geweben außerhalb des Körpers zu erhalten.
Die Erfindung wird nachstehend in größerer Einzelheit beschrieben.
Kälteschutzlösungen
Es hat sich herausgestellt, dass die besten Kälteschutzlösungen drei Wechselwirkungsteile enthalten:

1) eindringendes) Kälteschutzmittel (pCPAs),
2) nicht eindringendes) Kälteschutzmittel (npCPAs), und
3) hoch- oder niedermolekulares) gewichtsspezifisches) Eisblocker-Kälteschutzmittel (ibCPAs).

Innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Anmeldung können die Eisblockersubstanzen zur Kryokonservierung oder zum Bilden von Kryokonservierungslösungen allgemein nicht ohne andere Kälteschutzmittel erfolgreich verwendet werden, außer dass sie zum kälteschutzmittelfreien Unterkühlen auf Temperaturen über ca. –20°C verwendet werden können. Eine detaillierte Beschreibung der neuartigen Eisblockereigenschaften von PVA ist in WO-A-00 16619 enthalten (veröffentlicht am 30.3.2000). Die Bezugnahme auf "Polyvinylalkohol" oder "PVA" soll hierin alle Formen von Polyvinylalkohol repräsentieren, die in der WO-A-00 16619 als potentiell nützlich identifiziert sind. Kurz zusammengefasst wurde jedoch herausgefunden, dass Polyvinylalkohol und verwandte Verbindungen das Gefrieren von Wasser und Wasserlösungen hemmte. Diese synthetischen Verbindungen binden und hemmen Eisnukleierungsflächen vorzugsweise auf eine ähnliche Art und Weise wie natürliche Gefrierschutzproteine. Die resultierende Inhibition erlaubt die Unterkühlung von Wasser und Wasserlösungen auf Temperaturen unter dem thermodynamischen Gefrierpunkt ohne Eisbildung. Die Gefrierhemmung tritt bei so kleinen Konzentrationen wie ein Teil je Million Teile auf, obwohl Konzentrationen bis zu einem Teil je hundert Teile bevorzugt werden. Diese Polyvinylalkohol-Additive sind sehr nützlich zur Steigerung der Leistung von Gefrierschutzformulierungen, biologischen Kryokonservierungslösungen und zum Verhindern von Frostschaden an Pflanzen und anderen Industrieprodukten und -verfahren. Die verwandten Verbindungen schließen alle Verbindungen mit der Formel [-CR₂CROH-]_n ein, wo R ein beliebiges Atom oder eine Gruppe von Atomen ist, ausgenommen eine Hydroxygruppe, und n ≥ 3. Außerdem kann eine oder mehr der Hydroxygruppen durch chemische Gruppen ersetzt werden, wie z. B. Methoxy-, Alkoxy- und Aminogruppen. Die Polyvinylalkohol-Verbindungen haben vorzugsweise eine Molekülmasse von weniger als 1000 Kilodalton, bevorzugter weniger als 10 Kilodalton und sogar noch bevorzugter 130–2000 Dalton. Die Polyvinylalkohol-Verbindungen enthalten vorzugsweise 1 bis 25 Mol-% Vinylacetat, bevorzugter 10–20 Mol-% Vinylacetat, und sie können ataktisch oder syndiotaktisch sein.
Die pCPA- und npCPA-Gemische sind ohne Eisblockersubstanzen äußerst nützlich, erfordern aber in vielen Lösungen der besten Art die Verwendung von Eisblockersubstanzen.
Zusammengefasst beziehen ideale Lösungen für Kälteschutz die Verwendung von allen drei Elementen der Erfindung in Kombination miteinander ein, und weniger optimale, aber immer noch ausgezeichnete Lösungen können durch Verwenden von nur einem oder zwei dieser Prinzipien erhalten werden. Zum Beispiel werden Augenhornhäute für undurchdringbar für Polymere wie PVA gehalten und erfordern pCPAs mit oder ohne zusätzliche Nicht-Eisblocker-npCPAs oder die Verwendung von Eisblocker-npCPAs in erster Linie als osmotische Mittel.
Involvierte Theorie
Wasser ist lebensnotwendig, aber die Daten in den nachstehenden Beispielen zeigen höheres Überleben bei reduziertem Wasser pro Mol der polaren Gruppe in den Lösungen. Wie ist dies möglich? Anders gesagt, man weiß, dass die Toxizität eines gegebenen pCPA mit steigender Konzentration ansteigt, wie können also höhere Konzentrationen im Allgemeinen zu einer geringeren Toxizität führen?
Ohne sich an irgendeine Theorie binden zu wollen, ist eine plausible Erklärung, dass in einigen Verglasungslösungen die Anzahl von Wassermolekülen, die mit polaren Gruppen verbunden sind, viel geringer ist als die Anzahl von Wassermolekülen, die in anderen Verglasungslösungen mit polaren Gruppen verbunden sind. Mit anderen Worten, in den früheren Lösungen sind die polaren Gruppen weniger stark hydratisiert. Da alles Wasser in allen Lösungen beim Abkühlen verglast, wird alles Wasser in allen Lösungen gestört, aber eine stark störende polare Gruppe muss daher mehr Wasser pro Mol stören, als es eine schwach störende Gruppe tut, und diese stärkere Störung ist mit größerer Toxizität verbunden. Die überraschende Schlussfolgerung ist, dass obwohl weniger Wasser in der schwach gestörten Lösung vorhanden ist, das Wasser, das verbleibt, im Durchschnitt verfügbarer ist, um die biologische Lebensfähigkeit zu erhalten als das Wasser, das in den wasserreicheren, aber auch wassergestörteren Lösungen verbleibt.
Dies ist eine gänzlich beispiellose und unvorhergesehene Beobachtung mit einer praktischen Schlussfolgerung: für beste Ergebnisse sollten Kälteschutzmittel oder Kälteschutzmittel-Gemische gewählt werden, die schlechte Glasumwandler sind. Dies ist das genaue Gegenteil des Standard-Ansatzes zum Entwickeln guter Lösungen zur Verglasung lebender Systeme. Es ist immer noch so, dass für ein gegebenes Kälteschutzmittel oder Gemisch keine höhere Konzentration verwendet werden sollte, als zur Verglasung benötigt wird, da dies die Wasserverfügbarkeit reduziert, nicht erhöht. Hat man aber die Wahl zwischen zwei Lösungen, die bei unterschiedlichen Konzentrationen verglasen, wird die Lösung, die bei einer höheren Konzentration verglast, zu weniger Toxizität neigen als die andere Lösung, vorausgesetzt, es kommen keine anderen Faktoren ins Spiel.
Ein Faktor, der leicht ins Spiel kommt, ist spezifische Toxizität. Zum Beispiel ist Formamid im Vergleich zu den meisten Kälteschutzmitteln hochtoxisch, aber seine Toxizität kann durch die Zugabe von Dimethylsulfoxid vollständig neutralisiert werden (Fahy, da Mouta, Tsonev, Khirabadi, Mehl und Meryman in: Cell Biology of Trauma, J. J. Lemasters und C. Oliver, Hrsg., CRC Press, 1995, S. 333–356). Die Zugabe von Ethylenglycol zu Formamid hat keine schützende Wirkung, so dass obgleich ein Gemisch aus Formamid und Ethylenglycol bei einer hohen Konzentration verglast (Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging Applications und Engineering Contributions, J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S. 113–146), die Lösung extrem toxisch ist. Ähnliche Erklärungen treffen insbesondere auf hydrophobe oder detergensartige Verbindungen zu, wie kundigen Praktikern auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Darüber hinaus sind einige lebende Systeme insbesondere gegen bestimmte Kälteschutzmittel empfindlich, wobei ein Beispiel die Empfindlichkeit der Niere gegen Glycerol ist, das ein schlechter Glasbildner ist, aber sowohl ziemlich schlecht eindringend als auch geeignet ist, direkt in biochemische Stoffwechselwege zu gelangen, um biochemische Störungen zu erzeugen (siehe z. B. Burch et al., J. Biol. Chem. 245: 2092–2102, 1970 und Jans und Willem, Eur. J. Biochem. 174: 67–73, 1988).
Ein anderer Faktor, der ins Spiel kommen könnte, ist die Reduktion des Wassergehaltes unter einen erforderlichen Mindestwert zur adäquaten Hydratation von Biomelekülen selbst bei Vorhandensein schwacher Wasser/Gefrierschutzmittel-Wechselwirkungen: vermutlich gibt es eine Obergrenze, jenseits derer die schwache Glasbildungsfähigkeit eher schädlich als vorteilhaft wird. Die Beispiele zeigen jedoch, dass selbst sehr niedrige qv*-Lösungen (qv* < 1,6) geringe Toxizität aufweisen.
Je hydrophober ein Molekül schließlich ist, desto schwächer wird es zu einer Wechselwirkung mit Wasser neigen, aber wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, führt übermäßige Hydrophobie zu Toxizität und muss vermieden werden.
Normale Praktiker auf dem Fachgebiet sind sich solcher Fallen bewusst und sind imstande, sie zu vermeiden. Wenn Lösungen zum Testen auf der Basis, dass sie einen niedrigen qv* haben, irrtümlich gewählt und für toxisch befunden werden, können sie auf jeden Fall zugunsten von niedrigen qv*-Lösungen beiseite gelegt werden, die in der Tat weniger toxisch sind als Lösungen des Standes der Technik. Das wesentliche Ergebnis ist, dass unter Verwendung der q*-Methode allgemein überlegene Lösungen gefunden werden, die ansonsten nicht gefunden würden, und diese Entdeckung von guten Lösungen für den Dauergebrauch ist ein bedeutenderer Vorteil als der Nachteil bei flüchtigem Testen zufälliger toxischer Versuchslösungen.
Die Erfindung ist durch die obige kurze Beschreibung und eine Reihe von Beispielen, die spezifische wertvolle Lösungen darstellen, spezifische Grenzen und spezifische Leitprinzipien, die als Teil der Erfindung angesehen werden, bestimmt ausreichend beschrieben. Aus diesem Grund wird der große Umfang der detaillierten Beschreibung der Erfindung in Form von mehreren spezifischen Beispielen gelehrt.
Beispiel 1: Vorhersage der Toxizität unter Verwendung von qv*: Lösungen, die bei 1000 Atmosphären in Anwesenheit von 6 % G/V Polymer verglasen
1 und 2 zeigen eine Reanalyse (durchgeführt Anfang Juli 1998) öffentlicher Informationen (Fahy, Levy und Ali, Cryobiology 24: 196–213, 1987) über die Toxizität mehrerer Verglasungslösungen bekannter Zusammensetzung. Diese Verglasungslösungen verglasen bei 1.000 Atmosphären und enthalten entweder 6 % Polyvinylpyrrolidon der relativen Molekülmasse 40 Kilodalton [PVP K30] oder 6 % Polyethylenglycol [PEG 8000]. Die Datenmenge ist vorteilhaft, weil alle analysierten Lösungen verglasbar sind, die Datenmenge geringe Standardfehler aufweist und die Toxizität von den osmotischen Faktoren überzeugend getrennt war (siehe Fahy, Levy und Ali, 1987, zur Diskussion). In diesem Beispiel war Lebensfähigkeit definiert durch das Verhältnis von primär intrazellulärem Kalium zu intrazellulärem Natrium (K/Na-Verhältnis) nach der Kälteschutzmittel-Auswaschung und aktivem Stoffwechsel für 90 min bei der optimalen Temperatur von 25°C. Das Testsystem bestand aus Kaninchen-Nierenrindenscheiben.
Trotz einer gewissen Korrelation zwischen der Toxizität der Lösungen und sowohl höheren als auch niedrigeren Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO) in den Lösungen enthüllte die veröffentlichte Schrift, die die Daten enthielt, keine einzige zufriedenstellende allgemeine Theorie, die ausreichende Gründe für die beobachteten Toxizitätsdaten im Ganzen angab. Ebenso wenig gab es irgendeinen Grund zu glauben, dass es eine solche Theorie geben sollte oder könnte (siehe Fahy, Lilley, Linsdell, Douglas und Meryman, Cryobiology 27: 247–268, 1990, zur Diskussion).
In 1 sind die Toxizitäten auf die Gesamtkonzentrationen der eindringenden, vor Kälteschaden schützenden Mittel (pCPAs) bezogen, die die Lösungen zum Verglasen benötigen (Cv). Cv wurde bei 1000 Atmosphären Druck und in Anwesenheit von 6 % G/V PEG oder PVP gemessen und ist in % G/V, Molenbruch und molalen Einheiten ausgedrückt. Wenn diese Daten nicht gegen die DMSO-Konzentration, sondern gegen die Gesamtkonzentration der Lösung aufgetragen wurden, wurde ein gewisser Hinweis auf einen neuartigen Trend wahrgenommen (1): die Lösungen, die höhere Konzentrationen erforderten, um zu verglasen, schienen sogar seltsamerweise auch geringere Toxizitäten bei ihren Cvs zu haben. Ein solcher Trend würde jedoch durch Verändern nur weniger Punkte von den vielen aufgetragenen zerstört und widerspricht der vorherrschenden Annahme, dass eine Lösung um so toxischer ist, je konzentrierter sie ist. Aus diesen Diagrammen ergibt sich auch kein Anhaltspunkt, dass die Hydratation von Biomelekülen irgendetwas mit der Toxizität der Lösungen zu tun hat. Normalerweise würde eher vermutet, dass die Nettowechselwirkung zwischen Wasser und Kälteschutzmittel in all diesen Lösungen dieselbe sein muss, weil die Lösungen vermutlich alle gleich verglasbar sind. Das Diagramm enthüllt jedoch, dass die typische Annahme, dass die besten Lösungen zur Verglasung diejenigen sind, die bei den niedrigsten Konzentrationen verglasen, unbegründet ist, weil die Erholung stattdessen ungeachtet der Cv ähnlich zu sein scheint.
Wie in 2 gezeigt, ist die Korrelation wenig besser, wenn die Lebensfähigkeit entweder gegen den Wassergehalt der Lösung (A) oder die Anzahl von Mol Wasser pro Mol Kälteschutzmittel (B) aufgetragen wird. 2 stellt die Toxizitätsdaten von 1 in Bezug zu dem Wassergehalt der Lösung, der Anzahl von Mol Wasser in der Lösung pro Mol pCPA in der Lösung und der Anzahl von Mol Wasser pro Mol Wasserstoffbrückenbindungs-Gruppen dar, die an den eindringenden Kälteschutzmitteln in der Lösung (qv*) vorhanden sind. Wenn die Anzahl von polaren Gruppen pro Mol pCPA in jeder Lösung jedoch summiert und die Lebensfähigkeit gegen die durchschnittliche Anzahl von Mol Wasser pro Mol polare Gruppen (OH, C=O, NH2, S=O) an den pCPAs in der Lösung (q*) aufgetragen wird, besteht eine erstaunliche Konvergenz der Ergebnisse (2C). Zum ersten Mal erbrachte dieses Diagramm eine gute Korrelation zwischen einer Lösungszusammensetzungsvariablen und der Toxizität multipler Verglasungslösungen. Verblüffenderweise passte selbst DMSO als Monowirkstoff (offenes Quadrat) eher in das Gesamtmuster als Ankerpunkt für die Daten als der größere Ausreißer zu sein, der es in der Vergangenheit immer gewesen ist.
Die allgemeine Übereinstimmung zwischen den Daten und qv* lässt darauf schließen, dass Amide häufig in der Hauptsache deshalb vorteilhaft sind, weil sie den qv*-Wert der Lösung mehr als die meisten anderen gelösten Stoffe herabsetzen, eine ganz und gar neuartige Erklärung für ihren Nutzwert. Jedoch trennen die gestrichelten Linien in 2C die Lebensfähigkeit/q*-Beziehung in amid-dominierte (leere Kreise) und polyol-dominierte (ausgefüllte Kreise) Lösungen und zeigen, dass die zwei Datenmengen getrennt sein können, wobei die Lebensfähigkeit für einen gegebenen Wert qv* in Anwesenheit von Amiden immer etwas höher ist als in ihrer Abwesenheit. Obwohl dieser Trend weitere Prüfung verträgt, ist das grundlegende Ergebnis, dass alle Lösungen, ob sie Amide enthalten oder nicht, der allgemeinen qv*-Regel folgen.
Es gibt wenigstens eine Diskrepanz. In dieser Datenmenge waren ganz auf Ethylenglycol (EG, leeres Dreieck) basierende Lösungen in der Toxizität identisch mit ganz auf Propylenglycol (PG, auf den Kopf gestelltes leeres Dreieck) basierenden Lösungen, trotz extremer Differenzen in ihren qv*-Werten sowohl bei 1 Atmosphäre als auch bei 1000 Atmosphären. Dies könnte darauf hinweisen, dass diese gelösten Stoffe der qv*-Regel nicht folgen, oder es könnte darauf hinweisen, dass diese bestimmten Datenpunkte fehlerhaft sind oder dass der qv*-Wert für EG als Monowirkstoff zu niedrig ist. Die nachstehenden Beispiele weisen jedoch darauf hin, dass EG und PG in Übereinstimmung mit der Lebensfähigkeit/qv*-Phänomenologie sind und dass die entlegenen Punkte in 2, untere Tafel, nicht repräsentativ, sondern stattdessen irreführend sind. Dies macht die Entdeckung des qv*-Phänomens doppelt verkennbar, da das Phänomen aus einer Datenmenge mit wenigstens einem sehr irreführenden Punkt ermittelt wurde.
Beispiel 2: Lebensfähigkeit korreliert mit qv* in disparaten Lösungen
3 zeigt zwei Kurven, die die Ergebnisse von zwei separaten Experimenten aufzeigen. Sie zeigt eine retrospektive Analyse von Lebensfähigkeitsdaten bezogen auf qv* und zeigt:

a) eine gute Korrelation zwischen Lebensfähigkeit und qv* für Lösungen, die sehr unterschiedlich zu denen in 2 sind, und
b) eine Erhöhung der Lebensfähigkeit, wenn qv* unter Verwendung von Polyvinylalkohol erhöht wird, um die Kristallkeimbildung zu hemmen.

Die Punkte 1–5 wurden in einer Eurocolline-Vehikellösung erstellt und bestanden aus einer systematischen Veränderung des Anteils von EG:3-Methoxy-1,2-propandiol oder 2-Methoxyethanol im Vergleich zu VS41A, wohingegen die Punkte 6–10 Experimente darstellen, die in Anwesenheit einer GHP-2 genannten Vehikellösung ausgeführt wurden, mit (Punkte 8–10) oder ohne (Punkte 6 und 7) 1 % PVA einer Durchschnittsmolekülmasse von ca. 7.000 Dalton. In diesem Beispiel sind mehrere Punkte dargestellt. Zuerst lieferte VS41A, Punkt 1, schlechte Ergebnisse in diesem Experiment. Reines Ethylenglycol (das eine Cv von 54 % G/V in Eurocolline-Lösung aufwies, Punkt 5) lieferte weniger als 50 % Rückgewinnung, aber als es durch mehr und mehr 3-Methoxy-1,2-propandiol (MG; die Punkte 4 und 2 sind drei Teile EG auf ein Teil MG bzw. ein Teil EG auf drei Teile MG bei Cv-Werten von 53 bzw. 52 % G/V) oder durch 2-Methoxyethanol (2-ME; Punkt 3 steht für drei Teile EG auf ein Teil 2-ME, Cv = 53 % G/V) ersetzt wurde, wurden die Ergebnisse schlechter. Dennoch konnten die Daten durch Bezugnahme auf den qv*-Wert dieser Lösungen gut angepasst werden, trotz des Fehlens des Einschließens von entweder MG oder 2-ME in der Analyse der 2C. Darüber hinaus fallen Daten, die acht Experimente später gesammelt wurden und sehr unterschiedliche Lösungen enthielten (Punkt 6 steht für 58,5 % G/V D(1)UE20 + 6 % G/V PVP 5000, wobei "E20" bedeutet, dass 20 g/dl EG vorhanden sind und die (1) angibt, dass der Ausgleichsrest der 58,5 % G/V pCPA sich aus einem 1:1-Molverhältnis von DMSO zu Harnstoff zusammensetzt; und Punkt 7 steht für 55 % E[D(0,7)F]38,18 + 6 % PVP 5000, was bedeutet, dass 38,18 % G/V der Lösung aus einem Gemisch aus DMSO und Formamid in einem Verhältnis von 0,7 Mol DMSO pro Mol Formamid bestehen und EG in einer Konzentration von 55 – 38,18 = 16,82 % G/V vorhanden ist), auf dieselbe Kurve wie die Punkte 1–5. Die Punkte 8–10 stellen die Tatsache dar, dass biologische Systeme besser überleben, wenn sie trotz ihrer Verglasbarkeit umfassender hydratisiert werden, dank der Antinukleierungsfähigkeiten von PVA, die eine Reduktion der Menge eindringender CPA erlauben, ohne die Verglasung zu verhindern. Punkt 8 besteht aus VS4 (siehe unten), das durch das Einschließen von 5 % PVP bei Mr 5000 plus 1 % PVA bei Mr 7000 Dalton verglasbar gemacht wurde. Obwohl die Lebensfähigkeit ausgezeichnet ist, ist sie schlechter als die Lebensfähigkeit einer Lösung (Punkt 9), die aus Veg – 4 % D(1)F + 5 % PVP 5000 plus 1 % PVA 7000 (Definition von Veg siehe unten) zusammengesetzt ist. Letztendlich liefert Punkt 10, der die Wirkungen von 53 % E[D(0,7)F]38,18 + 5 % PVP 5000 + 1 % PVA 7000 (gleiche Anmerkung wie oben) darstellt, noch bessere Ergebnisse. Den beiden Lösungen 9 und 10 fehlt der starke Glasbildner 1,2-Propandiol, der in VS4 vorhanden ist, und folglich sind die Punkte 9–10 in Einklang mit der Analyse auf der Basis von qv*.
Beispiel 3: Toxizitäten reiner CPAs in Bezug auf qv*
Tabelle 1 fasst die sechs nominell schwächsten glasbildenden, gelösten Stoffe kurz zusammen, die in der von Fahy bereitgestellten, jüngsten veröffentlichten Übersicht glasbildender Verbindungen beschrieben sind (Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging Applications and Engineering Contributions, J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S. 113–146). Die Toxizitätsdaten für diese gelösten Stoffe sind begrenzt, aber wenigstens zwei solche gelöste Stoffe sind adäquat beurteilt worden. Acetamid, welches der schwächste Glasbildner in Tabelle 1 basierend auf qv* ist, sollte das am wenigsten toxische Kälteschutzmittel von diesen sechs sein. In der Tat sind 50 % G/V Acetamid im Wesentlichen nicht toxisch für Nierenscheiben (Fahy, da Mouta et al. in: Cell Biology of Trauma, C. Oliver und J. J. Lemasters, Hrsg., 1995), was wahrscheinlich ein Rekord ist und in auffälligem Kontrast zu der Toxizität von 50 % DMSO oder 50 % 1,2-Propandiol steht. Andere interessierende schwache Glasbildner sind Acetoin [Cv > ^~60 % G/G in Wasser], Hydroxyaceton, Hexafluoroaceton-Trihydroxid und verwandte Moleküle.
Tabelle 1: Einige schwach glasbildende Kälteschutzmittel
Beispiel 4: Lebensfähigkeit korreliert mit qv* in D(1)F-EG-Lösungen
Wässrige Lösungen von Formamid allein verglasen nicht (Fahy in: Low Temperature Biotechnology: Emerging Applications and Engineering Contributions, J. J. McGrath und K. R. Diller, Hrsg., ASME, 1988, S. 113–146), was nahe legt, dass Formamidkonzentrationen maximiert werden sollten. Jedoch hat auch Formamid eine spezifische Toxizität, die durch die gleichzeitige Anwesenheit von Dimethylsulfoxid neutralisiert werden muss (Fahy, da Mouta et al. in: Cell Biology of Trauma, C. Oliver und J. J. Lemasters, Hrsg., 1995), was eingrenzt, wie hoch die Formamidkonzentration und das Formamid:Dimethylsulfoxid-(F:D-)Verhältnis sein kann.
Vorversuche zeigten, dass

a) D(1)F bei erheblich niedrigeren Konzentrationen als erwartet verglaste und daher
b) Gemische aus D(1)F und dem schwachen Glasbildner Ethylenglycol in unterschiedlichen Anteilen von EG:D(1)F bis zu 1:1 dieselben oder nahezu dieselben Cvs aufwiesen.

Anfangstoxizitätsversuche wurden auf Cv-Werten von 57–58 % G/V basiert, die ohne Filtern der Lösungen bestimmt wurden. Wenn ähnliche Lösungen durch ein 0,22-Mikron-Filter passiert wurden, tendierte die Cv dazu, niedriger zu sein (ca. 57 % G/V).
4 zeigt die Lebensfähigkeit von Kaninchen-Nierenrindenscheiben aufgetragen gegen qv* in Lösungen, die ein Gemisch aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Formamid und Ethylenglycol (EG) enthielten, wobei das Molverhältnis von DMSO und Formamid fest bei 1:1 gehalten wurde, und dieses D(1)F-Gemisch wurde in wechselnden Anteilen mit EG vermischt (Grammverhältnis von EG:D(1)F = 0, 1:5, 1:4, 1:2 und 1:1). Die Lösungen waren in jedem Fall auf der zum Verglasen benötigten Gesamtkonzentration; es war kein Polymer vorhanden. Wie in 4 gezeigt, war die Toxizität der EG/D(1)F-Gemische trotz der durch mangelhafte Filtration verursachten Unwägbarkeiten der Cv wieder gleich bleibend mit der Einordnung dieser Gemische gemäß qv*. Dies traf zu, obgleich die Lösungen in 2 (nur bei 1.000 Atmosphären verglasbar; alle enthalten Polymer) sich im Wesentlichen von denjenigen in 4 unterschieden (alle verglasen bei 1 Atmosphäre, keine enthält Polymer). Gemische mit EG:D(1)F-Gewichtsverhältnissen von 1:1 und 1:2 hatten nahezu äquivalente qv*-Werte von rund 1,62 (weil die 1:2-Lösung eine gemessene Cv von 58 % G/V aufwies, gegenüber 57 % G/V für die 1:1-Lösung) und produzierten bei diesen qv*-Werten identische Scheibentoxizitäten (4) trotz großer Unterschiede in den Zusammensetzungen dieser Gemische.
5 zeigt einen interessanten Vergleich zwischen der Toxizität der Lösungen und den absoluten Konzentrationen von DMSO, Formamid und EG, die in jedem Fall gleichzeitig anwesend sind. Sie zeigt die Daten von 3, aufgetragen bezogen auf die absoluten Konzentrationen von DMSO, Formamid und Ethylenglycol in den Lösungen sowie in Bezug auf den Molprozentgehalt von D(1)F in dem Gemisch. Bei Verhältnissen von 0, 1:5 und 1:4 (qv* = 1,85, 1,7 bzw. 1,74) war die Toxizität mit Formamidkonzentrationen verbunden, die zu hoch waren, um von DMSO richtig neutralisiert zu werden (Fahy, da Mouta et al. in: Cell Biology of Trauma, C. Oliver und J. J. Lemasters, Hrsg., 1995), während Konzentrationen von bis zu nahezu 30 % G/V EG nicht offenkundig schädlich waren. 5 zeigt an, dass die Grenze für einen akzeptablen Molenbruch von D(1)F/(D(1)F + EG) für eine Gesamtkonzentration von 57–58 % G/V D(1)F unter 0,8 und über 0,67 liegt und dass eine Konzentration von ca. 14 % Formamid das Maximum ist, das mit einer minimalen Schädigung verbunden ist.
Beispiel 5: Lebensfähigkeit korreliert mit q* in modifizierter VS41A
VS41A war die beste zuvor bekannte Lösung; daher war es von Interesse, sie mit Lösungen mit niedrigerem qv*-Wert zu vergleichen. VS41A enthält ca. 38,2 % G/V D(1)F oder fast genau 14 % Formamid, die maximale Menge, die in Beispiel 4 als kompatibel mit hoher Lebensfähigkeit ausfindig gemacht wurde. Die andere Komponente von VS41A ist 1,2-Propandiol (PG), das ein ausgezeichneter Glasbildner ist (qv* ca. 2,6) und ein weit besserer Glasbildner als D(1)F ist, weswegen es seit ca. 1983 eine Hauptkomponente von VS41A und deren Vorgängerlösungen ist. Aber gemäß der neuen Theorie sollte diese Komponente so weit wie möglich durch eine schwächere glasbildende Komponente ersetzt werden. Deshalb wurde Ethylenglycol als ein bekanntes schwaches glasbildendes Mittel ausgewählt und das PG in VS41A grammweise durch EG ersetzt (was eine Lösung namens Veg bildete), um eine weitere Bewertung der Theorie zu gewinnen. Obgleich erwartet wurde, dass diese Modifikation die Cv der Lösung verringern würde, haben alle versuchten Eins-zu-eins-Ersatz-Experimente in der Vergangenheit darin versagt, Toxizitätsreduktionen zu erreichen (siehe z. B. Fahy, Cryobiology 35: 344–345, 1997). In dem aktuellen Test wurde diese Regel jedoch gebrochen, wie in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2: Vergleich¹ von VS41A mit Veg und VS4

¹Toxizitäten von Verglasungslösungen können am besten basierend auf q* bei dem zum Verglasen benötigten q* oder qv* verglichen werden.

Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse waren in mehrerlei Hinsicht überraschend und informativ. Im ersten Sinn erlaubten sie den Nachweis, dass der spezifische Beitrag des PG in VS41A die Ursache für nahezu drei Viertel der Toxizität von VS41A ist. Zweitens zeigten sie, dass eine Lösung, die konzentrierter ist als VS41A (auf einer molaren Basis) nur etwa ein Viertel der Toxizität von VS41A haben kann (eine Reduktion des K/Na-Verhältnisses von ca. 10 % gegenüber ca. 60 %). Drittens zeigten sie, dass eine Lösung, die sehr nahe daran ist, eine Verglasungslösung zu sein, falls überhaupt, sogar weniger toxisch ist als VS4, eine Lösung, die 100 % Langzeitüberleben von autotransplantierten Kaninchennieren nach Herstellung des Gleichgewichtes mit diesen Nieren durch Perfusion erlaubt hat, und diese geringere Toxizität von Veg im Vergleich zu VS4 wurde trotz einer enorm höheren Konzentration von Veg beobachtet. Viertens wurde, wie in Tabelle 3 weiter unten beschrieben, später herausgefunden, dass Veg imstande war, modifiziert zu werden, um es ohne nennenswerte Erhöhung seiner Toxizität verglasen zu lassen.
Beispiel 6: Akzeptable Grenzen von PG in Veg-artigen Lösungen
6 stellt eine Karte davon dar, wie die Balance zwischen EG, D(1)F und PG die Lebensfähigkeit von Kaninchen-Nierenrindenscheiben beeinflusst, wenn die Gesamtkonzentration fest bei 55 % G/V gehalten wird. Sie zeigt die Wirkung dessen, wenn Veg a) durch Erhöhen des D(1)F:EG-Molverhältnisses und b) durch systematisches Ersetzen von EG durch PG verändert wird. Die Zahlen innerhalb der Punkte geben die Prozente eines unbehandelten Kontroll-K/Na-Verhältnisses an, das nach Exposition an die durch das ternäre Zusammensetzungsdreieck definierte Zusammensetzung erreicht wurde (Kontrollprozentberechnung ohne Korrektur für Hintergrund K/Na > 0). Wie aus zwei separaten Experimenten ersichtlich ist (Kreise bzw. Sechsecke), reduziert das fortschreitende Ersetzen des EG von Veg (Punkt bei 70 Mol-% D(1)F, 30 Mol-% EG, 0 Mol-% PG) durch PG zum Bilden VS41A-ähnlicherer Lösungen (Punkt bei ca. 73 Mol-% D(1)F, 27 Mol-% PG und 0 Mol-% EG) die Lebensfähigkeit von den 78 %, wie für Veg in GHP-2 gesehen, auf die 55 % Lebensfähigkeit, wie für VS41A gesehen, gleichförmig. Der Abfall erfolgt jedoch nur auf 70–76 % Lebensfähigkeit, wenn 3–4 % G/V EG durch 3,4 % G/V PG ersetzt werden (Punkte nahe 4 Mol-% und 6 Mol-% PG), was unter gewissen Umständen ein akzeptabler Handel zur Annahme im Austausch für verstärkte Lösungswiderstandsfähigkeit gegen Entglasung und verstärkte Verglasungsneigung sein kann. Selbst das Ersetzen von 8 % G/V EG durch 8 % G/V PG (Punkt nahe 12 Mol-% PG) stimmt noch mit einer Lebensfähigkeit von 70 % einer unbehandelten Kontrollscheibe K/Na überein, was wieder darauf hindeutet, dass die Mehrheit einer mit der Verwendung von PG verbundenen Schädigung passiert, wenn mehr als 8 % PG anwesend sind.
6 zeigt auch, dass ein D(1)F:EG-Mol-% von bis zu 77 ohne einen Verlust von Lebensfähigkeit machbar ist. Dies stimmt mit dem in 5B bereitgestellten Ergebnis überein, aber definiert es weiter.
Beispiel 7: Akzeptable Variationen von Veg
7 zeigt die Wirkung des Veränderns von Veg durch Verringern des Formamids zugunsten von DMSO oder zugunsten von Ethylenglycol oder durch Verringern von DMSO zugunsten von Ethylenglycol, was darauf hinweist, dass Variationen innerhalb dieser Grenzen Veg in einem Bereich hoher Lebensfähigkeit halten. 7 ist in demselben Format wie 6, außer dass kein PG involviert ist und Variationen im Verhältnis D:F enthalten sind. Der Punkt, der 90,6–103 % Kontrollfunktion ergibt, stellt Veg dar. Veg wurde in drei Richtungen verändert: Formamid wurde fortschreitend durch DMSO ersetzt (nach rechts abfallende Linie), Formamid wurde fortschreitend durch EG ersetzt (nach links abfallende Linie), und DMSO wurde zugunsten von EG abgesenkt (waagerecht nach links verlaufende Linie). Wie in der FIGUR angedeutet, neigten alle drei Variationen dazu, das K/Na-Verhältnis zu verschlechtern, was darauf schließen ließ, dass die Formel für Veg nahezu optimal ist, aber alle der varianten Datenpunkte bleiben VS41A weit überlegen, und daher liegen alle akzeptablen Varianten innerhalb des Schutzbereiches der Erfindung. Wie oben festgestellt, wird erwartet, dass ein Anheben des Formamids zu erhöhter Schädigung führt, so dass die einzige andere Möglichkeit zur Verbesserung der Formel für Veg (anders als durch Einschließen anderer Mittel) darin besteht, die Menge von DMSO in der Lösung zu Lasten von Ethylenglycol zu erhöhen. Auf diese Frage eingehende Informationen werden nachstehend gegeben.
Beispiel 8: Vielseitigkeit und überlegener Entglasungswiderstand von Amid
8 sammelt Daten über die toxische Wirkung von Amiden und Amidgemischen auf Kaninchennierenrinde und die Umkehrung dieser toxischen Wirkungen durch DMSO. Sie beschreibt die Vielseitigkeit von Formamid, Harnstoff, Formamid/Harnstoff-Gemischen und Hydroxyharnstoff bezogen auf ihre Wirkungen auf die Zell-Lebensfähigkeit und bezogen auf die Neutralisierung dieser Wirkungen durch Dimethylsulfoxid. Diese Daten erweitern frühere Daten (Fahy, da Mouta, Tsonev, Khirabadi, Mehl und Meryman in: Cell Biology of Trauma, J. J. Lemasters und C. Oliver, Hrsg., CRC Press, 1995, S. 333–356) auf einen überraschenden Grad, wie folgt. Zuerst scheinen Hydroxyharnstoff, Harnstoff und gleiche Gewichte von Harnstoff und Formamid (Kreise, Rhomben bzw. Sechsecke auf der abfallenden Kurve) auf einer Prozentgewicht/Volumen-Basis dieselbe toxische Wirkung zu haben wie Formamid allein. Dies trifft trotz Veränderungen der Molekülmasse zwischen diesen Amiden zu, trotz der Tatsache, dass Harnstoff und Hydroxyharnstoff zwei Aminogruppen gegen die eine Aminogruppe von Formamid aufweisen, und trotz der Tatsache, dass eine der Aminogruppen von Hydroxyharnstoff mit einer Hydroxygruppe modifiziert wird. Zweitens scheint die Neutralisation der Toxizität all dieser Mittel und Mittelkombinationen durch die Zugabe von DMSO (nach rechts ansteigende Kurven) ebenfalls denselben quantitativen Trends bezogen auf %-G/V-Konzentrationen zu folgen, wie sie zuvor für die Neutralisierung der Fomamid-Toxizität allein dokumentiert wurden (umgekehrtes Dreieck; und Fahy, da Mouta, Tsonev, Khirabadi, Mehl und Meryman in: Cell Biology of Trauma, J. J. Lemasters und C. Oliver, Hrsg., CRC Press, 1995, S. 333–356), wieder trotz der gerade festgestellten Unterschiede.
Wie Formamid kann es eine Obergrenze der Menge von Harnstoff oder anderem Amid geben, deren Toxizität durch DMSO umgekehrt werden kann. Eine Harnstoffkonzentration in der Nähe von 15 % sollte jedoch im Wesentlichen vollständig entgiftbar sein und Vorteile haben, weil Harnstoff noch schlechtere Glasbildungslösungen bildet als Formamid (Punkt 6 gemäß 3). Wenn diese harnstoffreichen Lösungen verglasen, vermögen sie es darüber hinaus nicht, beim Erwärmen zu entglasen, eine bemerkenswerte und unerwartete Eigenschaft, vermutlich wegen der Verarmung von Wasser aus der Lösung in einem derartigen Ausmaß, dass ungenügend Wasser zum Gefrieren übrig bleibt. Vorteilhafte harnstoffhaltige Zusammensetzungen sind in der Haupt-Verglasungslösungstabelle angegeben und darin einbezogen (siehe unten).
Die durch 8 bereitgestellte Flexibilität sollte es Forschern erlauben, ihre Amidmischung gemäß Besonderheiten der Zellmembrandurchlässigkeit und biochemischen Toxizität maßzuschneidern, die zwischen diesen Amiden und Amidmischungen variieren. Hydroxyharnstoff, der als Inhibitor der Zellteilung bekannt ist, hatte in den in 8 veranschaulichten Experimenten keine nachteilige Wirkung und wird beispielsweise vorteilhaft sein, wenn Zellteilung unerwünscht ist.
Beispiel 9: Formeln zur Konservierung durch Unterkühlung
9 stellt das Verfahren zum Auswählen von Lösungen zur Verwendung in Unterkühlungsversuchen an lebenden Systemen dar. 9 veranschaulicht die Konzentrationen von benötigtem Veg-Gelöstem in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,1–1,0 % PVA mit ~ 1.000 Dalton Molekülmasse graphisch (ein bereitstehendes Handelsprodukt, das "X-1000" genannt wird), um eine stabile Unterkühlung für wenigstens 48 Std. in einem Haushaltskühlschrank-Gefrierfach nachzuweisen, der am meisten praktisch verfügbaren Temperatur für unterkühlte Lagerung. Die Kreise stellen Lösungen dar, welche die physiologische Lösung RPS-2 enthalten, die in der Literatur beschrieben ist, und die Quadrate stellen Lösungen basierend auf einem RPS-T genannten Vehikel dar, worin 175 mM Trehalose plus 5 mM Glucose die in RPS-2 gefundene 180-mM-Glucosekonzentration ersetzen.
Tabelle 3: In diesen Studien verwendete Träger-(Vehikel-)Lösungen
Wie gezeigt, bleibt Veg-Gelöstes unter solchen Bedingungen (Temperatur ca. –20°C±3°) bei einer Gesamtkonzentration von 33 % G/V und 30 % G/V in jeder Vehikellösung flüssig, aber Lösungen mit einer Konzentration von 27,5 % gefrieren spontan, so dass die sichere Konzentration zur Unterkühlung ca. 28–30 % G/V oder vielleicht 29 % ist. Die erforderliche Gleichgewichtskonzentration von Veg-Gelöstem zum Erniedrigen des Gefrierpunktes auf die Durchschnittstemperatur in dem vorher erwähnten Tiefkühler beträgt ungefähr 33–34 % G/V, was bedeutet, dass Veg-Gelöstes in jeder Vehikellösung unterkühlt, wenn seine Konzentrationen um ca. 5–6 % G/V reduziert werden, aber nicht weiter. Die Zugabe von 0,1 % X-1000 zu 27,5 % Veg-Gelöstes-Lösungen eliminiert das Gefrieren von 27,5%-Lösungen, aber nicht von 25 % G/V Veg-Lösungen. Jedoch erniedrigt die Zugabe von 1 % X-1000 die benötigte Konzentration zum Unterkühlen bis auf 23 % G/V, obwohl noch bei einer Veg-Gelöstes-Konzentration von 22 % G/V ein Gefrieren stattfindet. Somit erweitert 1 % X-1000 die Spanne zugänglicher Konzentrationen zur kurzfristigen Lagerung (z. B. für 48 Std.) in schwach toxischen Medien von den anfänglichen 5–6°C auf eine Gesamtkonzentrationserniedrigung von 10°C oder etwa das Doppelte des normalen Grenzwertes. Daher besteht ein Verfahren zum Lagern von Systemen in schwach toxischen Medien unter Unterkühlungsbedingungen darin,

a) die gewünschte Speichertemperatur zu bestimmen,
b) die Kälteschutzmittel-Konzentration zu bestimmen, die diese Temperatur als ihren Gleichgewichtsschmelzpunkt aufweist,
c) ca. 8–10 % G/V von dieser Gleichgewichtskonzentration abzuziehen, und
d) das interessierende System bei der interessierenden Lagertemperatur in der auf diese Weise berechneten, interessierenden Lösung zu lagern.

Auf Wunsch können höhere Konzentrationen von PVA für noch größeren Unterkühlungsschutz verwendet werden.
Eine Vorsichtsmaßnahme ist, dass es wesentlich ist, vor dem Kühlen eine vollständige Permeation des PVA in die Probe sicherzustellen, und die Probe sollte während der Lagerung möglichst wenig geschüttelt werden. In Vorversuchen gefroren einige Testgewebescheiben wegen der unvollständigen Penetration von PVA in die unzureichend exponierten Scheiben.
Beispiel 10: Veg-Gelöstes bildet überlegene Gefrierlösungen
Ein jüngeres Gefrierexperiment verglich das Gefrieren von Kaninchennierenscheiben auf –130°C in Anwesenheit von entweder 30 % G/V DMSO oder 30 % G/V Veg-Gelöstem. Das K/Na-Verhältnis nach Einfrieren und Auftauen betrug in DMSO 2,46 ± 0,30, wohingegen das K/Na-Verhältnis nach Einfrieren und Auftauen in 30 % G/V Veg-Gelöstem 3,10 ± 0,07 betrug (p < 0,05).
Ein jüngeres Gefrierexperiment verglich das Gefrieren von Rattenhepatozyten in Suspension auf –140°C in Anwesenheit von entweder 10 % V/V DMSO oder 10 % V/V Veg-Gelöstem. In Bezug auf die anfängliche Lebensfähigkeit waren 98 % der Veg-behandelten, nicht gefrorenen Hepatozyten imstande, Trypanblau-Farbstoff auszuschließen, wohingegen nur 70 % der DMSO-behandelten, nicht gefrorenen Hepatozyten ihre Farbstoffausschlussfähigkeit nach Zugabe und Entfernen von DMSO allein behielten. Nach dem Einfrieren und Auftauen blieben 65 % der anfänglichen Anzahl frisch isolierter Hepatozyten geeignet, Trypanblau-Farbstoff auszuschließen, wohingegen nur 60 % der gefrorenen/aufgetauten Hepatozyten diese Fähigkeit behielten, wenn sie mit DMSO gefroren waren.
Menschliches Sperma wurde 2 M Veg-Gelöstem oder 2 M Glycerol nahe 0°C unter Verwendung von schrittweisen Zugabeverfahren ausgesetzt, dann gefroren, aufgetaut und auf Videoband aufgenommen, ohne das Kälteschutzmittel zu entfernen. Das in 2 M Veg gefrorene menschliche Sperma erlangte wieder eine Motilität ähnlich der vor der Zugabe von Veg beobachteten, wohingegen in 2 M Glycerol gefrorenes Sperma beim Auftauen größtenteils bewegungslos war.
Beispiel 11: Verglasungslösungen des Veg-Typs erlauben überlegene Erholung nach Verglasung und Wiedererwärmung
Kaninchen-Nierenrindenscheiben wurden mit einer von drei Verglasungslösungen äquilibriert, dann verglast, wieder erwärmt und nach 90 min Erholung bei 25°C in Bezug auf ihr K/Na-Verhältnis beurteilt. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4: K/Na-Verhältnis von Kaninchen-Nierenrindenscheiben

*0,31 ist das K/Na-Verhältnis ganz toter Scheiben und ist gleich dem K/Na-Verhältnis des Bademediums.

Beispiel 12: Verglasungslösungen des Veg-Typs sind weniger toxisch für die menschliche Augenhornhaut als VS41A
Menschliche Augenhornhäute wurden VS41A oder Veg + 3 % EG für 25 min bei 0°C ausgesetzt und die Kälteschutzmittel dann ausgewaschen. Unter Verwendung eines Lebend/Tot-Vitalfärbungstests und der Rasterelektronenmikroskopie wurde festgestellt, dass 20 % der Korneaendothelzellen mit VS41A abgetötet oder schwer beschädigt waren, wohingegen nur 10 % der Endothelzellen mit Veg + 3 % EG abgetötet oder beschädigt waren.
Beispiel 13: VS41A ist Verglasungslösungen des Standes der Technik überlegen, aber Veg ist VS41A überlegen
Die Annahme, dass keine Lösung des Standes der Technik besser ist als VS41A, wurde durch Herstellen von drei in der Literatur beschriebenen Lösungen bestätigt, für die

a) das Erreichen hoher Überlebensraten in den Systemen beansprucht wurde, für die sie verwendet wurden, und
b) basierend auf ihrer Ähnlichkeit mit Veg eine geringe Toxizität wahrscheinlicher erschien als bei anderen Lösungen in der Literatur.

Diese drei Lösungen wurden mit VS41A und Veg verglichen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Vergleich früher verwendeter Kälteschutzlösungen mit VS41A und Veg
Abkürzungen:

EFS = 40 % V/V EG + 1 g % Ficol (70 kD) + 0,3 M Sucrose
EGP = 8,5 M EG + 10 % PVP
EPT = 40 % V/V EG + 20 % PVP + 11,3 % Trehalose

Verfahren zum Einbringen und Entfernen der Verglasungslösungen:
¹/₈ der vollen Verglasungslösungsstärke, ¼ der vollen Verglasungslösungsstärke, die Hälfte der vollen Verglasungslösungsstärke, die volle Verglasungslösungsstärke (1X), ½X + 300 mM Mannitol, ³/₈X + 300 mM Mannitol, ¼X + 300 mM Mannitol, 0X + 300 mM Mannitol, gewöhnliches Vehikel (MHP-2). Jeder Schritt dauert 20 min außer dem Schritt 1X, der 40 min dauert. Alle Schritte werden bei 0°C vorgenommen.
Beispiel 14: Viele Variationen von Veg sind VS41A überlegen
Tabelle 6 im Anschluss listet Lösungen auf, die sich in der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft herausgestellt haben. Die Auflistung schließt die Identität der Lösung, das mit der Lösung verbundene Lebensfähigkeitsresultat in Bezug auf Exposition an andere Lösungen oder in Bezug auf unbehandelte Kontrollen und Informationen betreffend die Verglasungsneigung und Entglasungsneigung der Lösung ein. Weitere Variationen werden für den Fachmann auf diesem Gebiet bei Betrachtung der aufgelisteten Musterlösungen ersichtlich sein.
Ein weiterer Ausblick auf den Wert der in Tabelle 6 aufgeführten Lösungen kann durch Betrachten eines frühen Beispiels erhalten werden, Veg + 3 % EG (Lösung # 15-1). Diese Lösung hat eine ähnliche Toxizität wie eine Lösung, die als V52 bekannt ist, aber anders als V52 ist Veg + 3 % EG sehr wahrscheinlich ausreichend stabil zur Verglasung von Kaninchennieren. V52 ist eine Zusammensetzung auf halbem Wege zwischen VS4 und VS41A und ist verwendet worden, um Kaninchennieren auf den Punkt der osmotischen Herstellung des Gleichgewichtes zu perfundieren, auf –35°C abzukühlen, wieder aufzuwärmen und nach der Transplantation mit sofortiger kontralateraler Nierenentfernung wiederzugewinnen, mit Erlangung einer 100%igen Überlebensrate und einer 100%igen Rückkehr der Empfängerkaninchen in einen dauerhaft normalen klinischen Zustand (Khirabadi et al., 1995). Wenn Veg + 3 % EG bezogen auf Toxizität dasselbe Ergebnis erzielen kann, ist es wohl auch ausreichend stabil, um als Nächstes diese Nieren durch Verglasung bei kryogenen Temperaturen erfolgreich zu konservieren und aufzubewahren. Dabei ist Veg + 3 % EG weit von der am meisten überlegenen oder vorteilhaften Lösung entfernt, die in Tabelle 5 aufgeführt ist. Aus dieser Perspektive heraus sollte deutlich sein, dass selbst augenscheinlich kleine Toxizitätszunahmen für den Erfolg eines Kryokonservierungsprozesses entscheidend sein können und dass zumindest so weit unten eingeordnete Lösungen wie die Lösung 15-1 von großem Wert sein könnten.
Eine weitere Perspektive ist in 10 bereitgestellt, in der die Daten der Tabelle 6 in eine grobe Schätzung der Lebensfähigkeit gegen die kritische Erwärmungsgeschwindigkeitskurve umgesetzt sind, um eine schwerwiegende Entglasung beim Erwärmen zu verhindern. VS41A (leere Kästchen) erfordert in diesen Experimenten schätzungsweise eine Erwärmung bei ca. 150–160°C/min, abhängig von der verwendeten Vehikel- oder Trägerlösung. Lösungen der Erfindung stellen bei derselben geschätzten kritischen Erwärmungsgeschwindigkeit ungefähr die doppelte Lebensfähigkeit bereit, wie sie VS41A gestattet (senkrechter Pfeil nahe der Beschriftung "VS41A"). Anders gesehen, wenn die von VS41A bereitgestellte Lebensfähigkeit als zufriedenstellend angesehen wird, können die Lösungen der Erfindung dieselbe Lebensfähigkeit bereitstellen, aber bei einer kritischen Erwärmungsgeschwindigkeit, die ca. 100 Mal niedriger ist als die kritische Geschwindigkeit, die für VS41A benötigt wird. Die experimentelle Variabilität der Daten ist durch die Rhomben angedeutet, die zwei unabhängige Tests (34-4 und 36-1) derselben Lösung veranschaulichen.
Bis zur Vorlage dieser Anmeldung war nicht genügend Zeit, die Daten der Tabelle 6 bezogen auf qv* zu analysieren. Jedoch ist offensichtlich, dass Ausnahmen zur qv*-Regel zu finden sein werden. Augenscheinlich haben geringe Konzentrationserhöhungen (ca. 3 % G/V) allgemein ähnliche Wirkungen auf die Lebensfähigkeit in einem Veg-Hintergrund. Dies gestattet die Verstärkung der Stabilität der Lösung durch gute glasbildende Mittel wie Methoxyglycerol ohne Folgen, vorausgesetzt, die anderen Lösungsherstellungsregeln werden befolgt. Dies ist eine bedeutende Ausweitung der Verwendung der qv*-Methode.
Aus dem gleichen Grund sind Mittel wie Acetol, 1,3-Propandiol, Dihydroxyaceton und Acetoin nicht imstande, Ethylenglycol ganz in Veg zu ersetzen, vielleicht weil diese Mittel zu hydrophob sind. Eine Verwendung in Maßen kann jedoch vorteilhaft sein.
Die in Tabelle 6 aufgezeichneten Verglasungsdaten wurden erhalten, wie folgt. Proben wurden untersucht, indem wenigstens ein Reagenzglas, das 5 ml einer Probe plus 1 ml Isopentan als Oberflächenschicht enthielt, auf einem starren Träger befestigt und dieser Träger in einem festen Abstand über der Oberfläche von flüssigem Stickstoff in einem Dewar-Gefäß mit mittlerer Halsöffnung angebracht wurde, wobei zeitgleich eine Parallelprobe derselben Lösung laufen gelassen wurde, um die Wärmeentwicklung der Probe zu dokumentieren, und basierend auf ihrem Erscheinungsbild nach dem Abkühlen oder basierend auf ihrer Löslichkeit eingestuft. Die Einstufungen wurden nur für die Proben als verlässlich angesehen, die keine Thermopaarsonden enthielten. Alle Proben enthielten eine biologisch kompatible Vehikel- bzw. Trägerlösung. Wo anwendbar, wurden die Proben nach Abschluss des Abkühl- und Einstufungsvorgangs ferner auf ihre Stabilität beim Erwärmen geprüft. Dies wurde bewerkstelligt durch Übertragen der Proben- und Vergleichsröhrchen in entweder

a) ein Bad von ungefähr 100 ml Methanol bei ungefähr Raumtemperatur (geschätzte Erwärmungsgeschwindigkeit: 60–100°/min) oder
b) ein kochendes oder beinahe kochendes Wasserbad (geschätzte Erwärmungsgeschwindigkeit: 100–200°/min oder mehr) oder in einigen Fällen auf andere Arten.

Zum Beispiel wurden Proben in einigen Fällen zu einem auf 0°C gehaltenen Methanolbad transferiert, und in anderen Fällen in einem Tiefkühlgerät mit geregelter Geschwindigkeit gekühlt und erwärmt, um das Gefrieren beim Abkühlen oder Erwärmen mit relativ langsamen Temperaturwechselraten erkennen zu lassen. Die Abkühlungskurven und damit die berechneten Durchschnittsabkühlungsgeschwindigkeiten (9–11 °C/min) waren sehr einheitlich. Die so berechneten Erwärmungsgeschwindigkeiten stellten sich als etwas uneinheitlich heraus. Dies kann auf das hohe Erwärmungstempo im Vergleich zum Abkühlungstempo, die Unkontrollierbarkeit der genauen Anordnung der Temperatursonde zwischen der Wand und dem Zentrum der Probe, die unvollkommene Übereinstimmung der Rührgeschwindigkeit oder manuellen Schüttelgeschwindigkeit im Wärmebad und die unvollkommene Übereinstimmung der Wärmebadtemperatur und der Probentemperatur zu dem Zeitpunkt, wo die Probe zum Wärmebad transferiert wurde (gewöhnlich –105 bis –95°C, manchmal hinunter bis zu rund –110°C) sowie die von Probe zu Probe unterschiedlichen Wärmeeigenschaften der Proben selbst zurückzuführen sein.
Tabelle 6: Muster-Kälteschutzlösungen mit niedriger Toxizität
Tabelle 6: Teil 2
Tabelle 6: Teil 3
Abkürzungen:

E oder EG = Ethylenglycol; D = DMSO; F = Formamid; U = Harnstoff; D(n)Y = DMSO in einem n:1-Molverhältnis von D zu Y, wobei Y ein anderes Kälteschutzmittel ist; tiefgestellte Zahlen wie E20 oder [D(0,7)F]40 beziehen sich auf absolute Zahlen in Gramm pro Deziliter der Substanz, die der Tiefstellung vorangeht, wie z. B. Ethylenglycol bzw. D(0,7)F; MG = 3-Methoxy-1,2-propandiol; PVP = Polyvinylpyrrolidon; PEG = Polyethylenglycol; PVA = Polyvinylalkohol, 80 % hydrolysiert aus Polyvinylacetat; NDV = keine Entglasung; Fr = gefroren; T = nur transparentes Eis; pDV = Teilentglasung; sDV = nur Oberflächenentglasung (Entglasung nur an der zurückweichenden Flüssig/Gummiphasengrenze); wsDV = schwache Oberflächenentglasung; ^~ = ungefähr; nt = nicht untersucht; e = geschätzt; % K⁺/Na⁺ stellt einen Vergleich zwischen zwei Gruppen von Kaninchen-Nierenrindenscheiben dar, die gewöhnlich jeweils 8–12 Scheiben enthalten.
*Ungefähr erforderliche Abkühlungsgeschwindigkeit für vollständige visuelle Verglasung. RPS-2-Daten mit niedriger Referenznummer mögen die Stabilität beim Abkühlen und Erwärmen der CPA-Lösung in RPS-2 zu hoch bewerten. Standard-Verfahren zum Einbringen und Entfernen von CPA und Untersuchen der K⁺/Na⁺-Verhältnisse sind durch Subtrahieren von 0,309 von den Originalverhältnissen korrigiert, um von Null abweichende Hintergründe auszugleichen.

Andere Variationen sowohl der Lösungen als auch der feineren Aspekte zur Berechnung von qv* werden für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein.

Claims

Kälteschutzlösung, die Dimethylsulfoxid und wenigstens zwei schwache Glasbildner umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Formamid, Harnstoff, N-Methylformamid, Hydroxyharnstoff, 1,3-Dihydroxyaceton, Hydroxyaceton, 1,3-Propandiol, Acetol, Hexafluoroaceton-Trihydroxid und Ethylenglycol ausgewählt sind.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 1, die ferner Propylenglycol in einer Konzentration von nicht mehr als 8 % G/V umfasst.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 1 oder 2, die ferner einen polymeren Stoff umfasst, der aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol ausgewählt ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 3, worin der polymere Stoff Polyvinylalkohol ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 4, worin der Polyvinylalkohol entweder ataktisch oder syndiotaktisch ist.
Lösung nach Anspruch 4, worin der Polyvinylalkohol zu ca. 80 % hydrolysiert ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 3, worin das Polymer Polyvinylpyrrolidon ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 7, worin das Polyvinylpyrrolidon Polyvinylpyrrolidon 5000 ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 3, worin das Polyethylenglycol Polyethylenglycol 1000 ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 1, die Dimethylsulfoxid, ein Amid und Ethylenglycol umfasst.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 1 oder 10, die ferner wenigstens einen anderen schwachen Glasbildner umfasst, der aus der Gruppe bestehend aus 1,3-Dihydroxyaceton, Acetol, Glycerol, 1,3-Propandiol, Hexafluoroaceton, Formamid, N-Methylformamid, Harnstoff, Acetamid und Hydroxyharnstoff ausgewählt ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 1, 10 oder 11, worin das Amid Formamid ist.
Kälteschutzlösung nach Anspruch 1, 10 oder 11, die ferner 3-Methoxy-1,2-propandiol umfasst.
Verfahren zur Konservierung biologischer Proben, das umfasst: – Kontaktieren des biologischen Materials mit der Kälteschutzlösung nach Anspruch 1 und – Abkühlen des biologischen Materials in Kontakt mit der Kälteschutzlösung, bis es verglast, gefroren oder unterkühlt ist.
Verfahren nach Anspruch 14, das ferner Abkühlen des biologischen Materials in Kontakt mit der Kälteschutzlösung auf unter die Glasübergangstemperatur der Kälteschutzlösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, das ferner Lagern des gekühlten biologischen Materials in Kontakt mit der Kälteschutzlösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, das ferner umfasst: – ausreichendes Erwärmen des gekühlten biologischen Materials in Kontakt mit der Kälteschutzlösung, um ein Entfernen der Kälteschutzlösung zu gestatten, und – Entfernen der Kälteschutzlösung aus dem biologischen Material.