CH698250B1 - Kryokonservierungsmedium für In-vitro kultivierte Zellen. - Google Patents
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Abstract
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein serumfreies Kryokonservierungsmedium für In-vitro-kultivierte-Zellen, welches ein Gefrierschutzmittel und ein Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymer enthält.
Description
Technisches Gebiet
[0001] Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein serumfreies Kryokonservierungsmedium für In-vitro-kultivierte-Zellen.
Stand der Technik
[0002] Die Langzeitlagerung von lebenden Zellen ist ein zentrales Anliegen in der Zellbiologie und in der Medizin. Eine lebende eukaryontische Zelle ist ein fragiler biologischer Komplex, der spezielle Schutzmassnahmen benötigt, damit er bei sehr tiefen Temperaturen kryokonserviert werden kann. (Aswood-Smith, M. J., 1980. Low Temperature Preservation of Cells, Tissues and Organs, p. 19–44. In Low Temperature Preservation in Medicine and Biology. M. J. Aswood-Smith and J. Farrant, Eds. (Pitman Medical Limited, Kent, England)).
[0003] Schon im Jahr 1949 wurde der positive Effekt von Glycerin auf Zellen bei deren Einfrieren entdeckt. Seither weiss man, dass jedes Kryomedium ein Gefrierschutzmittel enthalten muss, welches die Eiskristallbildung und die damit verbundene Zellschädigung verhindert. (Polge, C, A. U. Smith, and A. S. Parkes, 1949. Revival of Spermatozoa after Vitrification and Dehydration at Low Temperatures. Nature 164:666). Häufig wird Dimethylsulfoxid (DMSO) eingesetzt, denn dieses Reagenz ist, bei tiefen Konzentrationen und tiefen Temperaturen, für die Zellen ungiftig. Dazu kommt, dass DMSO leicht in das Zellinnere penetrieren kann, wo seine Wirkung benötigt wird. Fötales Kälberserum (FKS) wird standardmässig den Gefriermedien beigemischt, welche zur Konservierung von serumabhängigen Zelllinien verwendet werden. FKS mit seinem hohen Proteingehalt (Rinderserumalbumin, viele nicht identifizierte Wachstumsfaktoren, Enzyminhibitoren u.v.a.m.) schützt die Zellen vor Scherkräften und gibt dem Medium die gewünschte Osmolarität sowie eine physiologische Viskosität.
[0004] Es sind unter anderen ethische Gründe, welche den Trend einleiteten von serumhaltigen Kultivierungsmedien wegzukommen. Serum- und proteinfrei kultivierte Zellen sollten jedoch nicht in Kryomedien eingefroren werden, welche Serum enthalten. Zur Zeit sind verschiedene serumfreie Medien, deren Zusammensetzung von den Herstellern nicht bekannt gegeben werden, kommerziell erhältlich. Vom Forscher selbst hergestellte, einfache Mischungen wie konditioniertes Medium + DMSO werden ebenfalls eingesetzt. (Waymouth, C. and Varnum, D., Simple freezing procedure for storage in serum-free media of cultured and tumor cells of mouse. TCA Manual, (1976) 2(1), 311–313). Die Überlebensrate von in diesen Medien eingefrorenen Zellen bewegt sich jedoch nur zwischen 30 und 50% verglichen mit etwa 75%, wenn ein serumhaltiges Medium eingesetzt wurde.
Beschreibung der Erfindung
[0005] Das technische Problem, welches gelöst werden musste, war die Entwicklung eines serum- und proteinfreien Kryokonservierungsmediums mit Zell-Überlebensraten, welche gleich oder besser sind als solche, die mit serumhaltigen Kryomedien erreicht werden. Das Kryomedium sollte für die Konservierung aller eukaryontischen Zellen, im Speziellen Säugerzellen, geeignet sein.
[0006] Das Problem wird durch das Kryomedium gemäss Anspruch 1 gelöst. Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind in den Ansprüchen 2 bis 9 beschrieben. Die Zugabe eines Gefrierschutzmittels und eines Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymers zu irgendeinem kommerziell erhältlichen Basalmedium (z.B. Iscove’s modified Dulbecco’s Medium, RPMI-1640 Medium) oder auch nur zu physiologischer Kochsalzlösung (Phosphate Buffered Saline, PBS) in irgendeiner Konzentration, hat einen hervorragenden Effekt auf die Überlebensrate der eingefrorenen Zellen. Die Lebensfähigkeit und die Überlebensrate der Zellen nach dem Einfrieren und Auftauen sind sogar noch besser als die der Zellen, welche in FKS-haltigen Medien kryokonserviert wurden. Dazu kommt, dass das neue Kryomedium in seiner Herstellung sehr einfach ist; dadurch resultieren im Vergleich zu anderen Kryomedien tiefere Produktionskosten. Ein weiterer wichtiger Punkt ist der, dass mit dem serumfreien Kryomedium auch die ethischen Bedenken hinfällig werden.
[0007] Um die Eiskristallbildung zu verhindern, müssen dem Kryomedium irgendwelche Gefrierschutzmittel beigemischt werden. Solche Gefrierschutzmittel verhindern das Gefrieren von Flüssigkeiten und verhindern damit die Bildung von Eiskristallen, welche die Zellmembranen und somit die Zellen zerstören würden. Bevorzugte Gefrierschutzmittel werden ausgewählt aus der Gruppe von Methanol [CH30H], Ethanol [C2H50H], Ethylenglykol [C2H4(OH)2], 1–2 Isopropandiol [C3H6(OH)2], Glycerin [C3H5(OH)3], Dimethylsulfoxid [(CH3)SO], Polyvinylpyrrolidon (PVP), Methylcellulose oder Hydroxyethyl Stärke oder Gemischen davon. Das bevorzugteste Gefrierschutzmittel ist Dimethylsulfoxid (DMSO). Konzentrationen von 0.5 bis 10% (Volumen-%), vorzugsweise von 5 bis 10%, zeigen eine gute Schutzwirkung.
[0008] Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymere sind Blockcopolymere mit der allgemeinen Formel EO(n1)-PO(n2)-EO(n1), wobei EO für «Ethylenoxid» und PO für «Propylenoxid» stehen. n1, n2 bezeichnen die durchschnittliche Anzahl an Ethylenoxid-und Propylenoxid-Molekülen.
[0009] Bevorzugte Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymere haben die Formel EO(50 to 200)-PO(10 to 80)-EO(50 to 200), noch bevorzugter sind solche mit der Formel EO(70 to 140)-PO(25 to 55)-EO(70 to 140).
[0010] Noch mehr bevorzugt werden die Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymere, ausgewählt aus der Gruppe EO(76)-PO(30)-EO(76) (Pluronic F68); EO(104)-PO(39)-E(104) (Pluronic F88); EO(123)-PO(47)-EO(123) (Pluronic F98); oder EO(132)-PO(50)-EO(132) (Pluronic F108) oder Gemische davon.
[0011] Das am meisten bevorzugte Blockcopolymer ist EO(76)-PO(30)-EO(76) (Pluronic F68). Das synthetische Pluronic F68 ist ein oberflächenaktives bifunktionales Blockcopolymer mit primären Hydroxylgruppen, ein nicht-ionisches Tensid, das bekannt dafür ist, die Zellmembranen eukaryontischer Zellen zu stabilisieren. In Kombination mit einem Gefrierschutzmittel, bevorzugt DMSO, zeigt dieses eine optimale Wirkung in Gefriermedien für Kryokonservierung bei tiefen Temperaturen.
[0012] Der optimale Konzentrationsbereich des Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymers liegt zwischen 0.1 und 10% (Gewichts-%). Bevorzugte Konzentrationen liegen zwischen 0.1 und 1%, die bevorzugteste Konzentration liegt bei ungefähr 1%. Die besten Resultate wurden mit einem Kryomedium mit folgender Zusammensetzung erzielt: ungefähr 89% Basal Medium, ungefähr 10% DMSO und ungefähr 1% Pluronic F68. Bei dieser Konzentration an Pluronic F68 war die Ausbeute an überlebenden Zellen am grössten und die Viskosität erlaubte einen optimalen Umgang mit dem Kryomedium.
[0013] Das Kryomedium kann als Konzentrat oder als gebrauchsfertige Lösung hergestellt werden. Die angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das gebrauchsfertige Medium; Konzentrationen für Konzentrate müssen entsprechend angepasst werden. Mit dem in dieser Erfindung beschriebenen Kryokonservierungsmedium wurden Säugerzellen eingefroren und aufgetaut; dabei wurden hervorragende Resultate erzielt.
Abbildungen
[0014] Abbildung 1 zeigt eine Auswahl an getesteten Standard Kryokonservierungsmedien im Vergleich zu Kryomedien, die Pluronic F68 enthalten. Das Überleben von Zellen 24 Stunden nach dem Auftauen in Medien, welche Pluronic F68 enthalten, war signifikant höher als in den entsprechenden Medien ohne Pluronic F68 oder in serumhaltigen Standard-Medien. Überlebensraten, die höher als 100% liegen, deuten darauf hin, dass die Zellen bereits in den ersten 24 Stunden proliferieren. Solche Werte wurden in Medien ohne Pluronic F68 nie beobachtet.
[0015] In der Legende zu Abbildung1sind die Zusammensetzungen der getesteten Medien beschrieben:
<tb>1.<sep>FKS 10% DMSO
<tb>2.<sep>Kommerzielles Medium
<tb>3.<sep>45% frisches Medium/45% konditioniertes Medium/10% DMSO
<tb>4.<sep>48.7% frisches Medium/48.7% konditioniertes Medium/2.5% DMSO
<tb>5.<sep>47.5% frisches Medium/47.5% konditioniertes Medium/5% DMSO
<tb>6.<sep>Hypothermosol 1.5% DMSO
<tb>7.<sep>Hypothermosol 2.5% DMSO
<tb>8.<sep>Hypothermosol 5% DMSO
<tb>9.<sep>Hypothermosol 10% DMSO
<tb>10.<sep>Hypothermosol 2.5% DMSO+0.1% Methylcellulose
<tb>11.<sep>Hypothermosol 2.5% DMSO+3% Polyvinylpyrrolidon
<tb>12.<sep>Hypothermosol 10% DMSO+0.1% Methylcellulose
<tb>13.<sep>Hypothermosol 10% DMSO+3% Polyvinylpyrrolidon
<tb>14.<sep>Hypothermosol 2.5% DMSO+0.1% Pluronic F68
<tb>15.<sep>Hypothermosol 2.5% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>16.<sep>Hypothermosol 10% DMSO+0.1% Pluronic F68
<tb>17.<sep>Hypothermosol 10% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>18.<sep>47.5% frisches Medium/47.5% konditioniertes Medium/5% DMSO+0.1% Pluronic
<tb><sep>F68
<tb>19.<sep>47.5% frisches Medium/47.5% konditioniertes Medium/5% DMSO+1% Pluronic
<tb><sep>F68
<tb>20.<sep>45% frisches Medium/45% konditioniertes Medium/10% DMSO+0.01% Pluronic F68
<tb>21.<sep>45% frisches Medium/45% konditioniertes Medium/10% DMSO+0.1% Pluronic F68
<tb>22.<sep>45% frisches Medium /45% konditioniertes Medium/10% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>23.<sep>45% frisches Medium/45% konditioniertes Medium/10% DMSO+10% Pluronic F68
<tb>24.<sep>PBS 10% DMSO+0.1% Pluronic F68
<tb>25.<sep>PBS 10% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>26.<sep>PBS 10% DMSO+5% Pluronic F68
<tb>27.<sep>Frisches Medium 10% DMSO+0.01% Pluronic F68
<tb>28.<sep>Frisches Medium 10% DMSO+0.1% Pluronic F68
<tb>29.<sep>Frisches Medium 10% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>30.<sep>Frisches Medium 10% DMSO+5% Pluronic F68
<tb>31.<sep>Frisches Medium 10% DMSO+10% Pluronic F68
<tb>32.<sep>Konditioniertes Medium 10% DMSO+0.01% Pluronic F68
<tb>33.<sep>Konditioniertes Medium 10% DMSO+0.1% Pluronic F68
<tb>34.<sep>Konditioniertes Medium 10% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>35.<sep>Konditioniertes Medium 10% DMSO+5% Pluronic F68
<tb>36.<sep>Konditioniertes Medium 10% DMSO+10% Pluronic F68
<tb>37.<sep>Frisches Medium 0.5% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>38.<sep>Frisches Medium 1.5% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>39.<sep>Frisches Medium 2.5% DMSO+1% Pluronic F68
<tb>40.<sep>Frisches Medium 5% DMSO+1% Pluronic F68
Beispiele
Beispiel 1
[0016] Folgende Basalmedien wurden entweder einzeln oder in Kombination eingesetzt:
PBS (Phosphate buffered saline);
HTS (Hypothermosol nach: Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Fedorow, C. A. and Taylor, M. J. (2001). Cell Transplantation 10, 583-589.);
Frisches, chemisch voll definiertes Medium, (HEKTOR, In-Vitrus, Turbodoma Messi Cell Culture Technologies, Gravesano, Schweiz);
[0017] Konditioniertes Medium (ein konditioniertes Medium ist ein ursprünglich chemisch voll definiertes Medium, in welchem Zellen kultiviert wurden und deshalb verschiedene Zellprodukte wie Zytokine, Wachstumsfaktoren u. a. enthalten sind);
Verschiedene Standard-Zellkulturmedien wie z.B. Iscove’s modified Dulbeccos medium.
[0018] Weitere Komponenten im Kryokonservierungsmedium: FKS (Fötales Kälberserum Serum; Sigma, Buchs, Schweiz);
DMSO (Fluka, Buchs, Schweiz) mit einer Konzentration von 0.5 bis 10% (Endkonzentration);
Pluronic F68 (Sigma, Buchs, Schweiz) mit einer Konzentration von 0.01 bis 20% (Endkonzentration);
Methylcellulose (Fluka, Buchs, Schweiz) mit einer Konzentration von etwa 0.1% (Endkonzentration);
PVP (Polyvinylpyrrolidon Fluka, Buchs, Schweiz) mit einer Konzentration von etwa 3%.
[0019] Zelllinien:
[0020] Maus Myelom Zelllinie P3X63Ag8.653 und ein Antikörper sekretierendes Hybridom, HEP-1 sowie VERO-Zellen, HEK-293, COS-1 und COS-7 Zellen.
[0021] 2x10E6 Zellen wurden in 1 ml Kryomedium in einem Nalgene Kryoröhrchen bei kontrollierten Abkühlungsraten von 0.5 bis 5°C/min beginnend bei Raumtemperatur bis zu –80°C eingefroren. Die Proben wurden anschliessend in flüssigen Stickstoff transferiert. Für das Auftauen wurden die Kryoröhrchen exakt 3 Minuten in einem 37°C Wasserbad aufgewärmt. Der Inhalt wurde anschliessend zu 10 ml frischem Zellkulturmedium in einem sterilen 15 ml Reagenzröhrchen (TPP, Schweiz) pipettiert. Nach einer Zentrifugation (5 Min bei 350 g) wurde der Überstand verworfen und die Zellen in 3 ml frischem Medium resuspendiert. Die Überlebensrate wurde 24 Stunden nach dem Auftauen mittels Zellzählung (Casy<®> Cell Counter) bestimmt. Das Wachstumsverhalten der Zellen wurde nach dem Aussäen der Zellen (Zelldichte 5x10E4/ml) durch Zellzählung in 24 Stunden Intervallen beobachtet.
[0022] Die Überlebensraten der verschiedenen Medien sind aus Abbildung1 ersichtlich.
Claims (10)
1. Ein Kryokonservierungsmedium enthaltend ein Gefrierschutzmittel und ein Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymer.
2. Das Kryokonservierungsmedium gemäss Anspruch 1, wobei das Gefrierschutzmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Ethylenglykol, 1–2 Isopropandiol, Glycerin, Dimethylsulfoxid, Polyvinylpyrrolidon, Methylcellulose oder Hydroxyethyl Stärke oder Gemischen davon.
3. Das Kryokonservierungsmedium gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei das Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymer die Formel EO(50 to 200)-PO(10 to 80)-EO(50 to 200) hat, bevorzugt die Formel EO(70 to 140)-PO(25 to 55)-EO(70 to 140).
4. Das Kryokonservierungsmedium gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EO(76)-PO(30)-EO(76), EO(104)-PO(39)-E(104), EO(123)-PO(47)-EO(123) oder EO(132)-PO(50)-EO(132) oder Gemischen davon.
5. Das Kryokonservierungsmedium gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gefrierschutzmittel Dimethylsulfoxid und das Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymer EO(76)-PO(30)-EO(76) ist.
6. Das Kryokonservierungsmedium gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Konzentration des Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymers zwischen 0.1 und 10% liegt, bevorzugt zwischen 0.1 und 1%, noch bevorzugter ungefähr 1% ist.
7. Das Kryokonservierungsmedium gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Konzentration des Gefrierschutzmittels zwischen 0.5 und 10% liegt, bevorzugt zwischen 5 und 10%.
8. Das Kryokonservierungsmedium gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 enthaltend ungefähr 89% Basal Medium, ungefähr 10% Dimethylsulfoxid und ungefähr 1% EO(76)-PO(30)-EO(76).
9. Die Verwendung eines Ethylenoxid/Propylenoxid Blockcopolymers als Bestandteil eines Kryokonservierungsmediums, gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Die Verwendung des Kryokonservierungsmediums gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 für das Einfrieren von Säugerzellen.
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