KR20180109600A - 동결보존효과가 개선된 줄기세포 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동결보존효과가 개선된 줄기세포 동결보존용 조성물에 관한 것으로, 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 유효성분으로 포함하되, 우태아혈청(FBS)를 유효성분으로 포함하지 않는 줄기세포의 동결보존용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 동결보존용 조성물을 줄기세포의 동결보존에 이용하는 경우, 동결보존에도 불구하고 동결 전후의 세포수가 일정하고, 생존율 및 해동 후의 증식성이 우수하며, 세포표면마커의 발현이 유지되어 줄기세포특성이 유지된다. 따라서 본 발명은 줄기세포의 동결보존제로서 유용하게 사용할 수 있으며 특히, 동물 및 이종유래 물질을 전혀 포함하지 않으므로 실제 임상적용가능성이 뛰어나다는 특징을 지닌다.

Description

동결보존효과가 개선된 줄기세포 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 방법{COMPOSITION FOR CRYOPRESERVATION OF STEM CELLS HAVING IMPROVED CRYOPRESERVATION EFFECT AND METHOD USING THE SAME}

본 발명은 동결보존효과가 개선된 줄기세포 동결보존용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 줄기세포의 장기보존을 위한 동결에 있어서 임상적용가능성을 위해 무이종(xeno-free) 및 무동물유래성분(animal component-free)을 유지하면서도 동결보존효과가 개선된 줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 이러한 줄기세포의 불멸성과 다분화성은 인간의 발생과정의 연구를 위한 좋은 실험 모델(in vitro model)을 제공한다. 줄기세포로부터 얻은 균질한 사람의 조직이나, 세포를 대상으로 약물검사, 독성검사를 수행하면 신약개발이 용이해질 수 있다. 나아가 훼손된 조직을 대체할 수 있는 세포나 조직을 다량으로 얻을 수 있게 되어 난치성 질병의 치료에 이용할 수 있다.

세포치료제는 살아있는 자가, 동종, 이종 세포를 체외에서 배양증식하거나 선별하는 등 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품으로서, 줄기세포 치료제는 상술한 줄기세포를 원료로 하여 질환을 가진 환자에 투여하는 의약품으로서 그 유래에 따라서 골수유래, 제대혈유래, 말초혈액유래, 지방유래 등으로 분류된다.

이러한 줄기세포 및 (줄기)세포 치료제는 살아있는 세포를 원료로 하기 때문에 환경에 민감하게 반응하며, 보존기간(shelf life)가 짧은 단점이 있다. 따라서 이들 줄기세포의 특성을 유지하면서도 장기간 보관하기 위해서는 세포의 동결보존 과정이 필수적이다. 일반적으로 세포의 동결보존시에는 세포 내 얼음의 결정화로 인해 세포가 손상되기 때문에 반드시 동결보존제가 사용된다.

기존에 사용되는 줄기세포의 동결보존제에는 우태아혈청(FBS: fetal bovine serum), 인간 혈청(human serum) 등 이종, 또는 동물유래 성분이 포함되어 있기 때문에 이로부터 바이러스, 프리온 등의 감염이나 면역반응을 일으킬 수 있다는 위험성이 존재하며, 더욱이 치료의 목적을 위해 사용되는 세포치료제 등의 보존에는 적합하지 않다는 문제가 있었다.

줄기세포의 동결보존과 관련된 국내특허인 대한민국 공개특허 제10-2012-0117209호는 PBS(phosphate buffered saline) 용액 중 수크로오스(sucrose), 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)을 포함하는 줄기세포 초자화 동결보존액에 관하여 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 배양첨가제로 동물의 혈청 등 동물 및 이종 유래물질이 사용되지 않으면서도 줄기세포의 동결보존 효과가 우수한 동결보존제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명의 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 유효성분으로 포함하는 조성물의 경우, 기존에 상용화된 조성의 동결보존제와 비교하여 줄기세포에 대한 동결보존 효과가 뛰어나다는 것을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 유효성분으로 포함하되, 우태아혈청(FBS)를 유효성분으로 포함하지 않는 줄기세포의 동결보존용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose)를 유효성분으로 포함하되, 우태아혈청(FBS)를 유효성분으로 포함하지 않는 줄기세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “재조합 인간 알부민(rHSA: recombinant human serum albumin)”은 인간의 혈청단백질인 알부민을 유전공학적으로 재조합하여 식물세포, 곤충을 비롯한 동물세포 또는 세균에서 합성한 것을 의미하며, 인간의 혈청으로부터 분리된 알부민이 아니므로 불필요한 면역반응이나 오염의 위험성이 없는 것이 특징이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 재조합 인간 혈청 알부민은 동결보존용 조성물 총 부피에 대하여 0.5-3 (w/v)%의 농도를 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.5-2, 0.5-1.5, 1-1.5 (w/v)%일 수 있으며, 가장 구체적으로는 1 (w/v)%이다.

본 명세서에서 용어 “디메틸설폭사이드(DMSO; dimethyl sulfoxide)”는 세포막 투과성 동결억제제로서 얼음결정의 형성과 세포막의 파열을 방지하는 역할을 한다.

본 명세서에서 용어 “동결보존”이란, 증식성이 있는 세포의 배양시 계대 배양을 계속하게 되면 자연적으로 일정비율의 돌연변이체가 생겨 본래의 세포 집단과는 전혀 다른 세포 집단으로 변할 수 있는데, 이러한 유전적 변이를 최소화하고 노화 및 형질전환을 방지하는 등 세포주를 안정하게 보존하고 오염에 의한 소실을 방지하기 위하여 0℃ 이하의 저온에서 세포를 보존하는 것을 의미한다. 동결보존시에는 세포의 저온 노출에 의한 세포 내의 기관 및 기능에 장애가 발생하며, 얼음결정의 형성에 의한 기계적 및 물리적 손상이 발생한다. 동결보존으로 인한 세포의 장애 및 손상을 방지하기 위해 동결보존제가 반드시 필요한 것이다.

일반적으로 사용되는 동결보존제의 종류에는 상기한 디메틸설폭사이드(DMSO) 외에, 글리세롤, 수크로스, 글루코스, 메탄올, 락토스 등이 있으며, 가장 흔하게는 디메틸설폭사이드와 글리세롤이 사용된다. 동결배지에는 일반적으로 배양배지, 우태아혈청(FBS), 동결보호제를 포함하며, 조성은 대개 세포배양배지에 동결보호제(DMSO, 글리세롤) 10-15 (v/v)%, 우태아혈청 20-25 (v/v)%를 첨가하여 사용한다. 상기 동결보존을 위한 동결은 전자식 자동세포 동결기를 사용하는 것이 가장 이상적이나, 상기 장비가 없는 경우에는 이소프로필 알코올이 들어있는 동결용기 속에 동결바이알을 넣고 70℃ 내지 80℃에서 하룻밤 보관한 후, -196℃의 액체질소 용기에 이동 보관한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 디메틸설폭사이드는 동결보존용 조성물 총 부피에 대하여 1-10 (v/v)%의 농도를 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는 3-7, 5-7 (w/v) %일 수 있으며, 가장 구체적으로는 5 (w/v)%이다. 상기 디메틸설폭사이드는 10 (v/v)%를 초과하는 농도에서는 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 동결보존용 조성물은 무이종(xeno-free) 및 무동물유래성분(animal component-free)을 특징으로 한다. 본 발명에서 ‘무이종’이란 우태아혈청 등 이종동물 유래의 성분이 포함되지 않은 것을 의미하며, 본 발명에서 ‘무동물유래성분’이란 이종동물 뿐만 아니라 동종의 동물 유래의 성분도 포함되지 않은 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함하는 신규한 조성의 동결보존제 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% 메틸셀룰로오스 포함)은 기존의 동물유래 성분을 포함하는 동결보존제(CPA1; 5% DMSO와 20% FBS 포함)와 비교하여 세포독성(cytotoxicity)의 면에서 유의한 차이가 없었다(실시예 2 및 도 2).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 동결보존용 조성물은 유효성분으로서 트레할로스(trehalose)를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “트레할로스(trehalose)”는 미생물부터 식물, 곤충 등 자연계에 넓게 존재하는 당질의 한 종류로서, 이함수의 결정구조를 가진 비환원성 당류이다. 동결보호제로서 널리 사용되며, 독성이 없는 비침투성 동결보호제로서 탈수현상이 일어날 때 세포막을 안정시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 동결보호제로서 사용되는 트레할로스의 농도는 0.1-1.0 M이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 트레할로스는 본 발명의 동결보존용 조성물에 있어서 1-30 mM의 농도일 수 있고, 보다 구체적으로는 1-20, 5-20, 7-15, 7-12, 10-12 mM의 농도일 수 있으며, 가장 구체적으로는 10 mM로 일반적으로 사용되는 트레할로스의 농도에 비해 극히 소량이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 동결보존용 조성물은 유효성분으로서 메틸셀룰로오스(methylcellulose)를 더 포함할 수 있다.

상기 메틸셀룰로오스는 세포 내로 침투하지 않는 비투과성 동결방지제로 알려진 고분자량의 폴리머로서, 세포의 동결 전 세포 내 수분의 유출을 조장하여 세포 내외의 삼투평형을 이룸으로써 세포막의 손상을 방지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Merten et al.(1995, Biologicals 23:185189.)은 Vero 세포와 BHK-21 세포주를 이용한 실험에서 표준동결배지(10% Fetal Calf Serum 포함)와 무혈청배지(메틸셀룰로오스 함유)에서 동결한 세포 간에 차이가 없었다는 결과를 발표한 바 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 메틸셀룰로오스는 동결보존용 조성물 총 부피에 대하여, 0.001-0.5 (w/v)%의 농도를 가질 수 있고, 보다 구체적으로는 0.01-0.3, 0.01-0.2, 0.01-0.1 (w/v)%일 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.01-0.05 (w/v)% 일 수 있고, 가장 구체적으로는 0.05 (w/v)%이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함하되, FBS를 포함하지 않는 신규한 조성의 동결보존제 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 기존의 동물유래 성분을 포함하는 동결보존제(CPA1; 5% DMSO와 20% FBS 포함)와 비교하여 동결 전후 세포의 총세포수(total cell count)의 면에서 유의한 차이가 없었다(실시예 3 및 도 3의 A).

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함하되, FBS를 포함하지 않는 신규한 조성의 동결보존제 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 기존의 동물유래 성분을 포함하는 동결보존제(CPA1; 5% DMSO와 20% FBS 포함)와 비교하여 동결 전후 세포의 생존율의 면에서 모두 양호한 세포생존율을 나타내었다(실시예 3 및 도 3의 B).

특히, 본 발명의 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 유효성분으로 포함하는 동결보존용 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 우태아혈청 및 디메틸설폭사이드를 유효성분으로 포함하는 동결보존용 조성물(CPA1; 5% DMSO와 20% FBS 포함)에 비하여 우수한 세포생존율을 나타내었다. 나아가, 재조합 인간 혈청 알부민, 디메틸설폭사이드 및 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 동결보존용 조성물(CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함)는 가장 우수한 세포생존율을 나타내었다.

따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 신규한 조성의 동결보존제 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 기존의 우태아혈청 등 동물유래 성분을 포함하는 동결보존제 조성물을 대체할 수 있는 우수한 동결보존 효과를 나타냄을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함하되, FBS를 포함하지 않는 신규한 조성의 동결보존제 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 기존의 동물유래 성분을 포함하는 동결보존제(CPA1; 5% DMSO와 20% FBS 포함)와 비교하여 동결 전후 줄기세포의 표면항원 분석 결과, 음성마커(CD34 및 CD45)에 대해서는 모두 기준 이하의 발현율을 나타내었고, 양성마커(CD29, CD44, CD105)에 대해서는 모두 기준 이상의 발현율을 나타내어, 줄기세포의 냉동보존 및 해동 후에도 줄기세포의 특성을 유지함을 확인하였다(실시예 3 및 도 4).

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함하되, FBS를 포함하지 않는 신규한 조성의 동결보존제 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 기존의 동물유래 성분을 포함하는 동결보존제(CPA1; 5% DMSO와 20% FBS 포함)와 비교하여 동결 전후 세포의 회복능의 면에서 유의적인 차이가 없는 결과를 나타내었다( 실시예 4 및 도 5, 도 6).

구체적으로 동물혈청 성분을 포함하는 기존의 동결보존용 조성물(CPA1; 5% DMSO와 20% FBS 포함)과 비교하여 재조합 인간 알부민 및 디메틸설폭사이드를 유효성분으로 포함하는 신규한 조성의 동결보존용 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 CCK-8 어세이(세포증식력 시험), 총세포수 측정, 세포생존율의 면에서 모두 유의적인 차이가 없었다.

결과적으로, 본 발명의 신규한 조성의 동결보존제 조성물(CPA2; 5% DMSO와 5% rHSA 포함, CPA3; 5% DMSO와 1% rHSA, 10mM trehalose 포함, CPA4; 5% DMSO와 1% rHSA, 0.05% methylcellulose 포함)은 기존의 우태아혈청 등 동물유래 성분을 포함하는 동결보존제 조성물을 대체할 수 있을 정도의 우수한 동결보존 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 줄기세포의 동결보존용 조성물이 적용될 수 있는 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(Adult stem cell/Tissue-specific stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 상기 배아줄기세포(ESC: embryonic stem cell)는 배반포의 내세포 집단에서 유래한 다분화능의 줄기세포를 의미한다. 난자와 정자가 결합하여 수정란이 된 후, 하나의 세포로 시작한 수정란은 세포분열을 통해 여러 개의 세포로 이루어진 배반포가 된다. 배반포의 안쪽에는 내세포괴라고 하는 세포들의 덩어리가 있는데, 이 세포들을 배아줄기세포라고 하며, 혈액, 뼈, 피부, 간 등 한 개체에 있는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있으므로 만능세포라고 불리지만, 수정란을 파괴하여야만 얻을 수 있기 때문에 윤리적인 문제가 있다.

본 발명의 상기 성체줄기세포(Adult stem cell/Tissue-specific stem cell)는 신체 각 조직에 극히 소량만이 존재하는 미분화된 세포로서 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포이다. 대표적인 예로 다능성 조혈모세포가 있다. 성체주리세포는 배아줄기세포와는 다르게 수정란의 파괴가 없어 윤리적으로도 문제가 되지 않지만, 얻을 수 있는 줄기세포수가 적고, 배양이 어려우며 특정 세포로만 분화가 가능하다.

본 발명의 상기 중간엽줄기세포(MSC: mesenchymal stem cell)는 생체외에서 섬유아세포 모양으로 부착하여 자라고, 단일세포로부터 세포군락을 형성할 수 있으며, 골, 지방, 연골세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다.

본 발명의 상기 유도만능줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell), 또는 역분화 줄기세포는 다능성이 없는 성인의 피부세포와 같은 체세포에 역분화를 일으키는 4가지 특정 유전자(Sox2, c-Myc, Klf4, Oct-4)를 도입한 후 발현시키거나 역분화를 일으키는 4가지 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 추출하여 이를 다시 체세포에 주입하여 만들어진 배아 줄기세포와 같은 다능성세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 기존 배아줄기세포의 윤리적인 문제가 없으며, 환자의 체세포를 줄기세포로 전환시키므로 면역 거부 반응 문제가 없다는 점에서 활용가치가 높다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 줄기세포 동결보존용 조성물을 줄기세포와 혼합하여 줄기세포 혼합물을 만드는 단계, 및 상기 줄기세포 혼합물을 동결하는 단계를 포함하는 줄기세포의 동결보존 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 줄기세포의 동결보존 방법은 상술한 줄기세포 동결보존용 조성물을 그대로 이용하는 방법이므로, 본 명세서의 복잡성을 방지하기 위하여 상술한 조성물과의 중복되는 범위 내에서의 설명은 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

본 발명은 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin), 트레할로스(trehalose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 유효성분으로 포함하되, 우태아혈청(FBS)를 유효성분으로 포함하지 않는 줄기세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 동결보존용 조성물을 줄기세포의 동결보존에 이용하는 경우, 동결보존에도 불구하고 동결 전·후의 총세포수가 균일하고, 해동 후 세포 생존율 및 해동 후 배양 시 세포 증식력이 우수하며, 줄기세포 특이적 세포표면마커의 발현이 유지된다. 따라서 본 발명의 동결보존용 조성물은 줄기세포의 동결보존제로서 유용하게 사용할 수 있으며, 특히, 이종유래 및 동물유래 물질을 전혀 포함하지 않으므로 실제 임상적용 가능성이 뛰어나다는 특징을 지닌다.

도 1은 본 발명의 동결보존용 조성물의 물리·화학적인 특성(A. 삼투농도, B, pH)을 나타낸 도이다(CPA1은 5% DMSO + 20% FBS, CPA2는 5% DMSO + 5% rHSA, CPA3은 5% DMSO + 1% rHSA + 10 mM trehalose, CPA4는 5% DMSO + 1% rHSA + 0.05% methylcellulose를 조성으로 함).
도 2는 본 발명의 동결보존용 조성물의 조성에 따른 골수유래 중간엽줄기세포에 대한 세포독성 유무를 동결하지 않은 세포(fresh cells)와 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 동결보존용 조성물의 조성에 따른 동결 및 해동 후의 골수유래 중간엽줄기세포의 세포생존율을 동결하지 않은 세포(fresh cells)와 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 동결보존용 조성물의 조성에 따른 동결 및 해동 후의 골수유래 중간엽줄기세포의 세포 표면 마커를 동결하지 않은 세포(fresh cells)와 비교하여 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 동결보존용 조성물의 조성에 따른 동결 및 해동 후의 골수유래 중간엽줄기세포의 세포증식력을 CCK-6 어세이를 사용하여 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 동결보존용 조성물의 조성에 따른 동결 및 해동 후의 골수유래 중간엽줄기세포의 세포증식력을 총세포수의 분석으로 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 %는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

본 발명의 발명자들은 동결보존제의 조성 중 가장 효능이 우수한 3종의 동결보존제 CPA2(5% DMSO + 5% rHSA), CPA3(5% DMSO + 1% rHSA + 10mM trehalose), CP4(5% DMSO + 1% rHSA + 0.05% methylcellulose)를 선정하였으며, 본 실시예에서는 상기 총 3종의 동결보존제 중 최적의 동결보존제를 선정하기 위하여 동결 보존 안정성 확인 및 세포 특성 확인 시험을 수행하였다.

실험방법

세포배양(cell culture)

1. 동결세포 해동(thawing of cryopreserved cells)

1x10⁶ cells의 동결세포(P1)가 담긴 바이알(vial)을 37℃의 항온수조(water bath)에 해동(thawing)시킨 후, 세포배양 배지가 담간 T175 플라스크에 2x10⁵ cells의 세포를 접종한 다음 7일간 배양하였으며, 배양 4일째에 배지를 교환하였다. 세포배양 시 배양환경 조건은 CO₂ 7%, 37℃였으며, CSBM-A06 배양배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(200 mM), Penicillin- streptomycin(10,000 U/mL), 10% FBS (fetal bovine serum)을 첨가하여 사용하였다.

본 발명에 사용된 상기 세포는 인간의 골수유래 중간엽줄기세포이다.

2. 계대배양 (subculture)

세포배양 플라스크가 80~90% 컨플루언시(confluency)한 상태에 이르면, 0.125 % Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 탈착하였다. 세포배양 배지가 담긴 T175 플라스크에 2x10⁵ cells의 탈착한 세포를 접종한 다음 7일간 배양하였고, 배양 4일째에 배지를 교환하였다. 세포배양 시 배양환경 조건은 CO₂ 7%, 37℃였으며, 세포배양 배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(200 mM), Penicillin-streptomycin(10,000 U/mL), 10% FBS (fetal bovine serum)을 첨가하여 사용하였다.

3. 세포수확 (cell harvest)

세포배양 플라스크가 80~90% 컨플루언시(confluency)한 상태에 이르면, 0.125% Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 탈착한 후 CSBM-A06 기본배지(basal medium)로 현탁하였다. 세포배양 배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(200 mM), Penicillin-streptomycin(10,000 U/mL), 10% FBS (fetal bovine serum)을 첨가하여 사용하였다.

세포동결 (cell cryopreservation)

1. 반제품(동결세포)의 제조

1) 총 7일간 배양된 세포배양 플라스크 내 80~90 % 컨플루언시의 세포를 rypsin/EDTA 처리하여 탈착한 후 세포를 수확하였다.

2) 수확한 세포를 세포배양배지로 현탁한 후 동결보존제(CPA) 조성물 1종 당 동결할 세포수에 따라 현탁액을 튜브에 분주한 다음, 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다.

3) 세포 펠렛이 있는 튜브에 각 동결보존제 조성물(2~8℃ 보관) 넣은 후 현탁하여 동결보존제(CPA) 현탁액(세포농도: 1x10⁶ cells/800 uL)을 조제하였다.

4) 상기 동결보존제 현탁액은 각 종별로 동결보존제 조성물명이 라벨링 된 2개의 동결바이알(cryo vial)에 800 uL씩 부드럽게 분주한 다음, 동결바이알 캡을 닫았다.

2. 자동동결시스템 (CRF, Controlled Rate Freezer) 장비를 이용한 보관

상기 1에서 제조한 반제품(동결세포)을 CRF 동결프로토콜 조건으로 셋팅된 CRF 장비 내에 넣은 후 동결프로그램에 따라 동결절차를 수행하였다. 동결 완료 후 LN₂탱크에 3일간 동결보관(< -150℃)하였다.

동결세포의 해동 (thawing of cryopreserved cells)

1) 동결보관 후 3일째에 LN₂탱크에서 동결세포를 꺼내어 37℃온도조건의 항온수조(water bath)에서 신속하게 급속 해동(thawing)시켰다. 해동된 세포 현탁액을 세포배양배지가 담긴 튜브에 천천히 옮긴 후, 추가로 세포배양 배지를 넣어 현탁한 다음 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다.

3) 튜브 바닥의 세포 펠렛을 세포배양 배지로 현탁한 후, 총 세포수 및 세포생존율 확인시험을 수행하여 동결보존제 조성물별 동결세포의 생존율을 확인하였다(실시예 4).

4) 동결세포 회복능 시험항목 중 세포수확량 확인시험을 위해 상기에서 측정한 생세포수를 기준으로 세포배양 배지가 담긴 T175 플라스크에 2 x 10⁵ cells를 접종한 다음 7일간 배양하였다. 또한 CCK-8 세포증식 어세이(CCK-8 cell proliferation assay)를 이용한 세포증식율 시험 또한 생세포수를 기준으로 96 웰에 웰당 5.0x10³ cells 씩 접종하여 0, 4, 7일 마다 CCK-8 세포증식 어세이를 수행하였다(실시예 5).

5) 상기의 세포배양 시 배양환경조건은 CO₂ 7%, 37℃였으며, 세포배양 배지는 CSBM-A06 기본배지(basal medium)에 L-alanyl-L-glutamine(200mM), Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL), 10% FBS을 첨가하여 사용하였다.

총세포수 측정 시험 (Total cell count test)

1) 총 7일간 배양된 세포배양 플라스크 내 80~90 % 컨플루언시(confluency)의 세포를 Trypsin/EDTA로 처리 및 수확하였다.

2) 트립판 블루색소 배제법(Trypan blue dye exclusion method)을 적용하여 수확한 세포를 염색하고 혈구계수기를 사용하여 총 세포수를 확인하였다.

3) 상기 세포수의 측정은 세포현탁액과 동량의 0.4% 트립판 블루 용액을 혼합하여 반응시킨 다음 혈구계수기를 이용하여 측정하였다. 상기 세포수는 5회 반복 측정하였다.

4) 상기 총 세포수의 환산방법은 “(생세포수 + 사멸세포 평균) X 10⁴/mL x (1/측정구획 수) x 세포부유액(mL) x 희석배수“의 식으로 나타낼 수 있으며, 세포배가수준(population doubling level, PDL)은 세포의 성장률을 나타내는 지수로서 세포배가 (population doubling, PD) = log (최종 수확한 세포수/초기 접종 세포수)/log 2의 식으로 나타낼 수 있다.

세포생존율 시험 (Cell viablilty test)

계대배양 중의 세포생존율 변화관찰을 통해 세포사멸상태를 확인하고자 하는 시험이다.

1) 총 7일간 배양된 세포배양플라스크 내 80~90 % 컨플루언시(confluency)의 세포를 Trypsin/EDTA 처리 및 수확하였다.

2) 세포현탁액 과 동량의 0.4% 트립판 블루 용액를 혼합하여 2분간 반응시킨 후 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정하였으며, 5회 반복하였다.

3) 세포생존율은 트립판 블루에 염색된 세포와 염색되지 않은 세포의 수의 비율로 계산한다. 5회 측정 결과 중 상위 값과 하위 값을 제외한 중간의 세 개의 값으로 세포생존율을 계산하였다.

4) 상기 세포생존율의 계산방법은 “세포생존율(%) = 염색되지 않은 세포 수/ 전체 세포 수 x 100%”의 식으로 나타낼 수 있다.

CCK-8 세포증식 어세이 (CCK-8 Cell proliferation assay)

Cell Counting Kit-8 (Dojindo MolecularTechnologies, US)을 이용하여 제조사의 방법으로 실험하였다.

1) 동결보관 3일째에 LN₂탱크에서 동결세포를 꺼내어 37℃의 항온수조(water bath)에서 신속하게 해동(thawing)시킨 후, 세포 현탁액을 빈 튜브에 옮기고 세포배양 배지(CSBM-A06 + 10% FBS)를 넣어 세척하였다.

3) 수확한 세포 중 생세포를 기준으로 5.0×10³ cells/well 의 밀도로 96웰 플레이트에 검체 조건당 3회 반복으로 100 ul 씩 접종한 후 37 ℃, 7 % CO₂ 조건에서 7일간 배양하였으며, 배양 4일째에 배지를 교환하였다. 세포수는 0, 4, 7일 간격으로 측정하였다.

4) 각 웰에 CCK-8 시약을 10 μL씩 첨가한 다음 37 ℃ 조건에서 1시간 반응시킨 후, ELISA 리더기(Bio-rad)를 이용하여 450 nm 조건에서 흡광도를 측정하였다. 분석 결과는 각 동결보존제(CPA) 조성물별 0일차, 4일차, 7일차의 O.D값을 측정하여 기울기값(slope value)을 도출하였다.

세포표면항원 발현분석 (Immunophenotype analysis)

1) 형광 활성화 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting: FACS)을 이용하여 세포의 표면항원 발현특성을 확인하고자 하였다.

2) 세포배양 플라스크 내 70-80% 이상 컨플루언시(confluency)한 세포를 트립신 처리(trypsin-EDTA)하여 수확하였다. 수확한 세포를 FACS 완충액(2% FBS가 첨가된 DPBS)로 세척하고, 시험관에 1x10⁵ cells/100 ㎕ 농도의 세포 현탁액을 넣은 후 5~20 uL의 세포표면 항원에 결합하는 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 이후, 염색된 세포를 500 uL 의 FACS 완충액으로 현탁하여 분석하였다.

3) 상기의 항체는 모두 BD(Becton Dickinson, 미국)사의 제품을 사용하였다. 중간엽 줄기세포 마커를 검출하는 항체로 PE-CD54, PE-CD29, PE-CD44, PE-CD106, PE-Cy^TM7-CD73, FITC-CD105, PerCP-Cy^TM5.5-CD90을 선정하였고, 조혈줄기세포 마커를 검출하는 항체로 APC-CD34, FITC-CD45를 선정하였다. 음성대조군 항체로는 PE-IgG1 κ Isotype Control, APC-IgG1 κ Isotype Control, FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control, PerCP-Cy™5.5 Mouse IgG1 κ Isotype Control, PE-Cy™7 Mouse IgG1 κ Isotype Control를 선정하였다.

통계처리방법(T-test 검증)

실험결과는 평균±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고, 대조군과 실험군 사이의 비교는 Student's T-test로 하였으며, 통계학적 유의수준은 p값이 0.05 이하가 유의하다고 정의하였다.

실시예 1 : 동결보존제의 물리·화학적 특성 분석

본 발명의 동결보존제 조성물의 물리화학적 특성분석을 위해 pH(수소이온농도), 삼투압 농도를 측정하였다.

조제한 총 4종(대조군 1종, 시험군 3종)의 동결보존제 조성물인 CPA1(대조군, 5% DMSO + 20% FBS), 시험군인 CPA2(5% DMSO + 5% rHSA), CPA3(5% DMSO + 1% rHSA + 10mM trehalose), CP4(5% DMSO + 1% rHSA + 0.05% methylcellulose)의 물리·화학적 특성으로 pH(수소이온농도) 및 삼투압을 측정하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물들의 삼투압은 CPA1(대조군), CPA2(5% DMSO + 5% rHSA), CPA3(5% DMSO + 1% rHSA + 10mM trehalose), CP4(5% DMSO + 1% rHSA + 0.05% methylcellulose)조성물은 각각 1113± 4.0, 1120± 0.6, 1050± 1.5, 1124± 1.2 (mOsmol/kg)로 측정되었다. pH (수소이온농도) 측정 결과에서는 각각 9.15±0.02, 7.96± 0.04, 8.22± 0.03, 8.31± 0.01을 나타내었다(도 1).

실시예 2 : 동결보존제의 세포독성 시험(Cell toxicity test)

본 발명의 동결보존제 조성물의 세포독성 유무를 확인하기 위하여, 수확한 세포를 각각의 동결보존제 조성물을 이용, 1x10⁶ cells/0.8 mL 의 세포농도로 현탁한 후 저온(2~8℃)상태 세포의 세포성상, 총세포수 및 세포생존율을 분석하였다.

1) 총세포수 측정

수확한 세포를 4종의 동결보존제 조성으로 각각 1x10⁶ cells/0.8 mL의 세포농도로 현탁한 후 저온(2~8℃)상태에서 세포성상, 총세포수 및 세포생존율 측정을 통해 CPA 물질의 세포독성(cytotoxicity) 발생여부를 확인하였다.

골수 유래 중간엽 줄기세포를 4종의 동결보존제 조성물(CPA1, CPA2, CPA3, CPA4)에 각각 1X10⁶ cells/0.8 mL의 세포농도로 현탁한 후 세포현탁액의 세포성상과 총세포수를 측정하였다. 측정 결과, 현미경-보조 육안상 세포의 성상에는 차이가 없었다. 또한 동결보존제로 현탁하지 않은 대조군(98.2± 10.7)과 동결보존제 세포현탁액인 시험군[CPA1(97.6± 4.4x10⁴ cells), CPA2(104.9± 2.5x10⁴ cells), CPA3(88.8± 2.6x10⁴ cells), CPA4(96.4± 2.7x10⁴ cells)]들 간에 총세포수의 유의적 차이가 없었으며, 기존 동물혈청(FBS) 유래 동결보존제 조성물인 CPA1와의 비교 결과도 유의적인 차이가 없음을 확인하였다(도 2A).

2) 세포생존율 분석

동결 전 4종의 동결보존제 세포현탁액의 세포생존율 측정 결과, 동결보존제로 현탁하지 않은 대조군(99.1± 0.7)과 동결보존제 세포현탁액인 시험군[CPA1(98.1± 1.0), CPA2(99.2± 0.5), CPA3(98.2± 0.9), CPA4(99.5± 0.6)]은 모두 98% 이상의 세포생존율을 보였으며, 대조군 대비 모든 시험군 간의 유의적 차이가 없었다(도 2B).

이로부터 본 발명의 동결보존제 조성물(CPA)은 세포에 대한 독성이 없음을 확인 할 수 있었다.

실시예 3 : 반제품(동결세포) 생존율 확인시험(Cell viability test)

본 발명의 동결보존제 조성물의 세포동결 보존효과를 검증하기 위하여, 동결 후 해동한 세포(cryo-thawed cell)의 세포성상, 총세포수 및 세포 생존율을 확인하였다. 또한, 동결 후 해동한 세포(cryo-thawed cell)를 동결 및 해동공정을 거치지 않은 세포와 생물학적 특성 비교 분석(세포표면항원 발현율 비교분석) 통해 중간엽 줄기세포 특성 유지여부를 확인하였다.

수확한 세포를 4종의 동결보존제(CPA1, CPA2, CPA3, CPA4) 조성으로 각각 1x10⁶ cells/0.8 mL의 세포농도로 조제한 동결바이알(cryovial)을 CRF 장비를 이용하여 동결(-80℃)하였다. 동결한 세포를 LN₂ 탱크(< -150℃)에서 3일간 동결보관 후 해동한 세포(cryo-thawed cell)의 생존율을 확인하였으며, 동결보관하지 않은 대조군(fresh cell)과의 생물학적 동등성 비교 분석을 통해 중간엽 줄기세포 특성유지 여부를 확인하였다.

1) 세포성상 및 총세포수 측정

먼저 동결 및 해동 후의 세포성상 확인 및 총세포수를 측정하였다.

상기 4종의 동결보존제 조성(CPA1, CPA2, CPA3, CPA4)으로 동결 보관된 세포를 해동한 다음 총세포수를 측정한 결과, 동결을 거치지 않은 세포인 대조군(98.2± 10.7)과 동결보존제 세포현탁액인 시험군[CPA1(110.2± 4.5x10⁴ cells), CPA2(102.2± 4.5x10⁴ cells), CPA3(100.3± 7.7x10⁴ cells), CPA4(110.0± 4.5x10⁴ cells)간에 통계적으로 유의적 차이가 없었으며, 또한 동물혈청(FBS) 유래 동결 보존제 조성물인 CPA1를 본 발명의 동결보존제 조성물인 CPA2, CPA3, CPA4와의 비교한 결과에도 유의적 차이가 없음을 확인할 수 있었다(도 3A).

상기 결과로부터 각 시험군 별로 동결-해동과정에서 세포의 손실 없이 균일하게 수득이 가능한 것을 확인하였다.

2) 세포생존율 분석

다음으로 동결 및 해동 후의 세포생존율을 분석하였다.

4종의 동결보존제 조성 세포현탁액에 동결보관 후 해동한 세포(cryo-thawed cell)의 세포생존율을 측정한 결과, 동결 공정을 거치지 않은 세포인 대조군(99.1±0.7%)과 동결보존제 세포현탁액인 시험군 CPA1(75.9±1.7%), CPA2(88.4±1.6%), CPA3(90.4±1.6%), CPA4(81.3±2.6%)는 모두 양호한 세포생존율을 나타내었다(도 4B). 특히, 동물혈청(FBS)유래 동결보존제 조성물인 CPA1과 xeno-free 조성물인 본 발명의 동결보존제 조성물(CPA2, CPA3, CPA4)을 비교한 결과, CPA3(90.4± 1.6%, p<0.001), CPA2(88.4± 1.6%, p<0.001), CPA4(81.3± 2.6%, p<0.05)의 순으로 유의하게 높은 생존율을 나타내었다(도 4B). 또한, 비이종성 및 비동물유래 물질(rHSA+trehalose)로 구성된 CPA3와 CPA1, CPA2, CPA4를 비교한 결과, CPA1　(p<0.001), CPA4(p<0.05) 순으로 유의하게 낮은 생존율을 나타내었으며, CPA2는 유의적 차이가 없었다(도 3B).

이로부터 본 발명의 동결보존제 조성물 중 CPA2(rHSA)와 CPA3(rHSA+trehalose) 조성물이 가장 높은 세포생존율을 유지시킬 수 있는 동결보존제인 것을 확인 할 수 있었다.

3) 세포표면 항원 분석

마지막으로 동결 및 해동된 골수유래 중간엽 줄기세포가 중간엽 줄기세포로서의 특성을 유지하는지 여부를 확인하기 위하여 세포표면 항원 마커를 분석하였다.

본 발명의 4종의 동결 보존제 조성물(CPA1, CPA2, CPA3, CPA4)로 3일간 초저온 동결 보존된 골수유래 중간엽 줄기세포를 해동하여 7일간 배양한 다음, 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 해동된 줄기세포의 세포 표면 항원 마커 발현율을 비교분석 하였다. 구체적으로 대조군인 미동결 세포(fresh cell)와, 시험군인 동결 및 해동 후 세포(cryo-thawed cell), 동결 및 해동 후 배양된 세포(recovery cell)의의 동등성을 비교분석하였다. 세포 표면 항원 마커 선정 및 시험기준 설정은 뉴로나타-알주의 품질시험법에 근거하여 수행하였다. 음성마커(negative marker) 항목 및 적합기준은 CD34 < 4%, CD45 <2% 였으며, 양성마커(positive marker)의 항목 및 적합기준은 CD29 > 80%, CD44 > 80%, CD105 > 80% 였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 음성마커인 CD34 (hematopietic lineage marker), CD45(hematopietic lineage marker)의 발현율을 확인한 결과, 모든 시험군에서 1% 미만의 발현율을 나타내었으며, 위 결과는 뉴로나타-알주 품질시험(순도시험) 기준에도 적합한 것으로 확인되었다. 또한, 양성마커인 CD29(Integrin marker; integrin β), CD44(adhesion molecule marker; HCAM), CD73 (5'-nucleotidase; SH3, 4), CD105 (endoglin; SH2)의 발현율을 확인한 결과, 모든 시험군에서 80% 이상의 발현율을 나타냈다.

결과적으로 대조군(fresh cell)과 시험군(cryo-thawed cell, recovery cell)의 비교 결과, 모든 동결보존제(CPA1, CPA2, CPA3, CPA4)에 동결된 세포의 해동 후 세포의 세포표면마커의 발현율 차이가 유의하지 않음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 동결보존제는 줄기세포의 냉동 보존 및 해동 후에도 중간엽 줄기세포의 특성이 유지됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 반제품(동결세포) 회복능 시험(Recovery test)

본 발명의 동결보존제 조성물의 세포동결 보존효과를 검증하기 위하여, 동결 후 해동한 세포(cryo-thawed cell)를 1회 배양한 세포를 세포수확량 및 CCK-8 어세이 방법을 이용하여 세포증식율 변화를 관찰하였다. 또한 동결 및 해동 후 배양된 세포(recovery cell)와 동일한 계대수(passage)의 대조군(fresh cell, passage 4)과의 생물학적 동등성 비교 분석을 위해 총세포수 측정법 및 유세포분석법을 이용하여 동결보존 세포의 중간엽 줄기세포의 특성유지여부를 비교분석하였다.

1) CCK-8 어세이(세포증식력 분석)

동결 후 해동한 세포(cryo-thawed cell)를 생세포수 기준으로 5.0×10³ cells/well밀도로 96웰 플레이트에 접종한 후 7일간 배양하였으며, 0일차, 4일차, 7일차 간격으로 CCK-8 어세이를 하여 세포증식력(cell proliferation ability)을 확인하였다. 각 CPA 조성물별 0일차, 4일차, 7일차별 O.D 값에 대한 기울기 값(slope values)은 CPA1(0.086± 0.005), CPA2(0.088± 0.008), CPA3(0.091± 0.002), CPA4(0.090± 0.007)으로 도출되었으며, 동물혈청(FBS)유래 동결보존제 조성물인 CPA1과 xeno-free 동결보존제 조성물인 CPA2, CPA3, CPA4와의 비교결과, 유의적 차이가 없음을 확인할 수 있었다(도 5). 따라서, 각 동결보존제의 조성별로 동결 및 해동한 후 배양된 세포(cryo-thawed cell) 간의 세포 증식력에 차이가 없음을 확인하였다.

2) 총세포수 측정

동결 후 해동한 세포(cryo-thawed cell)를 생세포수 기준으로 2.0×10⁵cells의 밀도로 T175 플라스크에 접종한 후 7일간 배양하고, 7일차에 세포를 수확하여 총세포수(total cell count)를 측정하였다. 비동결 세포(fresh cell)인 대조군(234.9± 4.8x10⁴ cells)과 동결보존제 세포현탁액인 시험군[CPA1(258.4± 11.9x10⁴ cells), CPA2(260.3± 18.3 x10⁴ cells), CPA3(249.9± 6.0 x10⁴ cells), CPA4(258.9± 13.5 x10⁴ cells)]을 비교한 결과, 총 4종의 동결보존제 조성 모두 유의하게 세포량이 증가됨을 확인하였으며(p<0.05), 동물혈청(FBS)유래 동결보존제 조성물인 CPA1과 CPA2, CPA3, CPA4와의 비교결과, 총세포수에서 유의적 차이가 없음을 확인하였다(도 6A).

상기 결과로부터 각 동결보존제의 조성 별로 동결 및 해동한 후 배양된 세포(cryo-thawed cell)간의 세포 증식력에 차이가 없음을 확인하였다.

3) 세포생존율 분석

또한, 상기 해동후 배양한 세포의 세포생존율(cell viability)을 측정한 결과, 동결 공정을 거치지 않은 비동결세포(fresh cell)인 대조군(99.2± 0.4%)과 동결보존제 세포현탁액인 시험군[CPA1(97.6± 1.3%), CPA2(98.8± 1.0%), CPA3(98.3± 0.5%), CPA4(97.4± 0.8%)]을 비교한 결과, CPA1과 CPA2는 세포생존율에 유의적인 차이가 없었으나 CPA3 및 CPA4는 세포생존율이 유의적으로 증가된 것을 확인하였다(p<0.05). 나아가 동물혈청(FBS)유래 동결보존제 조성물인 CPA1과 CPA2, CPA3, CPA4의 세포생존율을 비교하여도 유의적 차이가 없음을 확인하였다(도 6B).

상기 결과로부터 각 동결보존제의 조성 별로 동결 및 해동한 후 배양된 세포(cryo-thawed cell)간의 세포생존율에 차이가 없음을 확인하였다.

나아가, 상기에서 측정한 총세포수 측정결과를 근거로 세포생장율을 나타내는 지수인 세포배가수준(population doubling level, PDL)을 분석하였다.

동결 공정을 거치지 않은 비동결세포(fresh cell)인 대조군(3.55)과 동결보존제 세포현탁액인 시험군[CPA1(3.69), CPA2(3.70), CPA3(3.64), CPA4(3.69)]을 비교한 결과, 총세포수 측정결과와 동일하게 비동결세포(fresh cell)인 대조군과 각 동결보존제의 조성 별로 동결 및 해동한 후 배양된 세포(cryo-thawed cell)간의 세포배가수준에 차이가 없음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 0.5-3 (w/v)%의 재조합 인간 혈청 알부민(recombinant human serum albumin) 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 유효성분으로 포함하되, 우태아혈청(FBS)를 유효성분으로 포함하지 않는 줄기세포의 동결보존용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 트레할로스(trehalose)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 메틸셀룰로오스(methylcellulose)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 인간 혈청 알부민의 농도는 0.5-2(w/v)%인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 디메틸설폭사이드의 농도는 1-10%인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 디메틸설폭사이드의 농도는 3-7%인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 2 항에 있어서, 상기 트레할로스의 농도는 1-30 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 트레할로스의 농도는 5-20 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 3 항에 있어서, 상기 메틸셀룰로오스의 농도는 0.001-0.5%인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 메틸셀룰로오스의 농도는 0.01-0.3%인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 무이종(xeno-free) 및 무동물유래성분(animal component-free)인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embyonic stem cell), 성체줄기세포(Adult stem cell/Tissue-specific stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 조성물을 줄기세포와 혼합하여 줄기세포 혼합물을 만드는 단계 및 상기 줄기세포 혼합물을 동결하는 단계를 포함하는 줄기세포의 동결보존 방법.

Images