JP2008539697A - 新規な細胞組成物およびその調製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規な細胞（たとえば、肝細胞など）組成物ならびにその調製方法および使用方法に関する。特に本発明は、実質的な生存を維持しながら凍結保存および融解を繰り返すことが可能となるように、こうした細胞の調製物を処理する方法に関する。本発明はまた、凍結保存および融解を繰り返した細胞（たとえば、肝細胞）調製物に関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第１１／１１０，８７９号（２００５年４月２１日出願）の継続出願である（この出願は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
本出願は、米国特許出願第１１／１１０，８７９号（２００５年４月２１日出願）の継続出願である（この出願は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
本発明は、新規な細胞（たとえば、肝細胞など）組成物ならびにその調製方法および使用方法に関する。特に本発明は、実質的な生存を維持しながら凍結保存および融解を繰り返すことが可能となるように、こうした細胞の調製物を処理する方法に関する。本発明はまた、凍結保存および融解を繰り返した細胞（たとえば、肝細胞）調製物に関する。
肝細胞は実質的な肝細胞であり、肝臓の細胞質の質量の６０〜８０％を構成する。肝細胞は、外因性物質および内因性物質の解毒、変性および排出に重要な役割を果たす（Ｐｏｎｓｏｄａ，Ｘ．ら（２００４）“Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｂｙ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｈｏｗ Ｆａｒ Ａｒｅ Ｗｅ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｒｅａｌｉｔｙ？”Ａｌｔｅｒｎ Ｌａｂ Ａｎｉｍ．３２（２）：１０１−１１０）。肝細胞の解毒機能の１つは、排出のためにアンモニアを尿素に変えることである。該細胞はまた、タンパク質の合成および貯蔵、炭水化物の変換、ならびにコレステロール、胆汁塩、およびリン脂質の合成においても重要である（Ｐｏｓｔｉｃ，Ｃ．ら（２００４）“Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｄ Ｌｉｐｉｄ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ”，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．３０（５）：３９８−４０８）。肝細胞は、アルブミン、フィブリノゲン、および凝固因子であるプロトロンビン群を製造する体内で唯一の細胞である。これは、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、および糖タンパク質を合成するための主要部位である。肝細胞は、自身の構造タンパク質および細胞内酵素を製造する。肝細胞はまた、ビタミンＢ１２および鉄の重要な貯蔵所である。
このような属性により、単離して培養された肝細胞は、肝機能研究のためのモデル系として非常に魅力的なものとなっている（Ｃｈｅｓｎｅ，Ｃ．ら（１９９３）“Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｅｉｎｇｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（２）：４０６−４１４；Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ，Ａ．ら（１９８６）“Ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｐａｒｉｓ：ｌｅｓ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ ＩＮＳＥＲＭ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ：Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ Ｅｕｒｏｔｅｘｔ）；Ｐｏｎｓｏｄａ．Ｘ．ら（２００４）“Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｂｙ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｈｏｗ Ｆａｒ Ａｒｅ Ｗｅ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｒｅａｌｉｔｙ？”Ａｌｔｅｒｎ Ｌａｂ Ａｎｉｍ．３２（２）：１０１−１１０；Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）“Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｔｈｅ Ｃｈｏｉｃｅ Ｔｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｍａｎ”，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．５（５）：４４３−４６２；Ｌｅｍａｉｇｒｅ，Ｆ．ら（２００４）“Ｌｉｖｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｕｐｄａｔｅ：Ｎｅｗ Ｅｍｂｒｙｏ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ．１４（５）：５８２−５９０；Ｎａｎｊｉ，Ａ．Ａ．（２００４）“Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ Ｏｆ Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｎｄ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ”，Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．８（３）：５５９−５７４；Ｈｅｗｉｔｔ，Ｎ．Ｊ．ら（２００４）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｒａｔ，Ｄｏｇ Ａｎｄ Ｍｏｎｋｅｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｉｎ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｈｕｍ Ｅｘｐ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３（６）：３０７−３１６）。
肝モデルにおける使用に加え、肝細胞は、バイオ人工肝臓（ＢＡＬ）を作製するため、または肝疾患もしくは肝不全を患う個体に肝機能を提供し得る肝細胞移植において使用される可能性を有する。バイオ人工肝臓（ＢＡＬ）は、Ａｎａｎｄ，Ａ．Ｃ．（１９９６）“Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｖｅｒｓ：Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｒｔ”，Ｔｒｏｐ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１７（４）：１９７−１９８，２０２−２１１；Ｇａｎ，Ｊ．Ｈ．ら（２００５）“Ｈｙｂｒｉｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｖｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｓｅｖｅｒｅ Ｌｉｖｅｒ Ｆａｉｌｕｒｅ”，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１（６）：８９０−８９４；Ｆｕｋｕｄａ，Ｊ．ら（２００４）“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎ Ｅｌｌｉｐｔｉｃ Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒｓ Ｔｏ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ａ Ｈｙｂｒｉｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｖｅｒ”，Ｉｎｔ Ｊ Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ．２７（１２）：１０９１−１０９９；Ｍｅｎｇ，Ｑ．ら（２００４）“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎ Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｖｅｒｓ Ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２６（１８）：１４０７−１４１２；Ｓｅｋｉｄｏ，Ｈ．ら（２００４）“Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ Ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｖｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｆｏｒ Ｐｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｆｕｌｍｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｆａｉｌｕｒｅ”，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３６（８）：２３５５−２３５６；ＷＯ０３／１０５６６３Ａ２、ＷＯ０５／０００３７６Ａ２、および米国特許第６，７５９，２４５号に記載されている。肝細胞移植は、Ｃｈａｎ，Ｃ．ら（２００４）“Ｈｅｐａｔｉｃ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｏｒ Ａｄｊｕｎｃｔ Ａｎｄ Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｌｉｖｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ：Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ”，Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ．１０（１１）：１３３１−１３４２；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．ら（２００４）“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｓｔａｔｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｒｔ Ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｆｏｒ Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ Ｅｘｉｓｔｉｎｇ Ｈｕｒｄｌｅｓ”，Ａｎｎ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３（２）：４８−５３；Ｈｏｒｓｌｅｎ，Ｓ．Ｐ．（２００４）“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７７（１０）：１４８１−１４８６；Ｂｕｒｌｉｎａ，Ａ．Ｂ．（２００４）“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｉｎｂｏｒｎ Ｅｒｒｏｒｓ Ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２７（３）：３７３−８３；およびＦｏｘ，Ｉ．Ｊ．ら（２００４）“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４．別冊６：７−１３に記載されている。
こうしたモデル系の開発およびバイオ人工肝臓（ＢＡＬ）の開発を制限する要因は、肝細胞、特にヒト肝細胞の供給源が不安定であること、およびその入手可能性が限定的なことである。新鮮な肝細胞は、肝臓切除または多臓器ドナーの移植不可能な肝臓からのみ得ることができる（Ｌｌｏｙｄ，Ｔ．Ｄ．Ｒ．ら（２００３）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｂａｎｋｉｎｇ”，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂａｎｋｉｎｇ ４：３−１５）。こうした組織の供給には一貫性がなく、肝組織の機能寿命に限りがあることを考慮すると、しばしば地理的に不都合である（Ｓｍｒｚｏｖａ，Ｊ．ら（２００１）“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｆｒｅｓｈ Ａｎｄ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｃｅｌｌｓ”，Ａｃｔａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ Ｂｒｕｎｅｎｓｉｓ ７０：１４１−１４７）。
この問題に対処するための一アプローチは、肝細胞をその細胞機能を維持しながら長期にわたって保存することのできる肝細胞保存条件の開発を含むものである。この必要性に対応するため、肝細胞を保存するための凍結保存法が開発されてきた（Ｌｌｏｙｄ，Ｔ．Ｄ．Ｒ．ら（２００３）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｂａｎｋｉｎｇ”，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂａｎｋｉｎｇ ４：３−１５；Ｌｏｒｅｔｚ，Ｌ．Ｊ．ら（１９８９）“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｒａｔ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．１９（５）：４８９−４９８；Ｓｈａｄｄｏｃｋ，Ｊ．Ｇ．ら（１９９３）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｕｎｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．９（４）：３４５−３５７；Ｎｏｖｉｃｋｉ，Ｄ．Ｌ．ら（１９８２）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ．１８（４）：３９３−３９９；Ｚａｌｅｓｋｉ，Ｊ．ら（１９９３）“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒａｔｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｓｔｏｒｅｄ Ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（１）：１１１−１１６を参照のこと）。通常、こうした手段は、液体窒素（−１９６℃）または凍結窒素ガス（−１５０℃）中での保存を含む。融解した生存細胞を取得する能力は、複数の要因、たとえば凍結速度、肝細胞濃度、使用する凍結防止剤の種類、および最終冷却温度、などに依存することがわかっている。通常、１０６〜ｌ０７個／ｍｌの細胞濃度を使用する。単離した肝細胞は、通常、懸濁状態で、ある時間（たとえば、４〜４８時間）にわたって培養し、単離プロセスから取得する。その後、凍結防止剤（たとえば、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポリビニルピロロジン、またはデキストランなど）を添加し、肝細胞を凍結させる。当該技術分野では種々の凍結手順が開発されており、いずれも、細胞内氷晶の発生を最小限にするかまたは防止するように設計されている。凍結速度は、通常、−０．０５℃／分から−５０℃／分までさまざまである（Ｌｌｏｙｄ，Ｔ．Ｄ．Ｒ．ら（２００３）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｂａｎｋｉｎｇ”，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂａｎｋｉｎｇ ４：３−１５を参照のこと）。
肝細胞を保存するための凍結保存法の開発により、ヒト肝細胞の入手可能性は大幅に高められたが、一方、凍結保存により細胞生存率が大幅に（たとえば、２５〜３５％）減少することがわかっている（Ｄｏｕ，Ｍ．ら（１９９２）“Ｔｈａｗｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９：４５４−４６９；Ａｌｅｘａｎｄｒｅ，Ｅ．ら（２００２）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｏｂｔａｉｎｅｄ Ｆｒｏｍ Ｒｅｓｅｃｔｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｂｉｏｐｓｉｅｓ”，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ４４：１０３−１１３）。Ｃｏｕｎｄｏｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９９３）により、２４時間後の生存率は６７％であり、１４日後には４９％に低下したことが報告された（Ｃｏｕｎｄｏｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９９３）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．２３（１２）：１３９９−１４０９）。Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｍ．らにより、特殊な凍結保存液の使用によって肝細胞の生存率が９０％を超えるほどに増大し得ることが報告されているが、複製能力を有する細胞は１６％に過ぎないことがわかった（Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９５）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｏｆ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４（６）：５７９−５８６）。凍結保存法は、米国特許第５，７９５，７１１号、同第６，１３６，５２５号、同第５，８９５，７４５号；国際特許公開ＷＯ０４／００９７６６、同ＷＯ９２／１２７２２、同ＷＯ／０１５３４６２、欧州特許第ＥＰ０８３４２５２Ｂ号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００２００３９７８６Ａ１号、および同第ＵＳ２００３０１３４４１８Ａ１号に開示されている。凍結保存した細胞の取得が悪いことから、インビトロ肝モデルにおける肝細胞の使用は依然として限定的である。
新鮮な肝細胞と凍結保存した肝細胞とを両方使用することに影響する第２の大きな問題は、異なるドナーに由来する組織に見られる肝酵素発現のばらつきである（Ｌｉ，Ａ．Ｐ．ら（１９９９）“Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ：Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｏｆ Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ”，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１２１（１）：１１７−１２３；Ｌｉ，Ａ．Ｐ．ら（１９９９）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｄｒｕｇ−Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ Ｆｏｒ Ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ａｎｄ Ｄｒｕｇ−Ｄｒｕｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１２１（１）：１７−３５；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｚ．Ｚ．ら（発行年不明）“Ｔｈｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｐｏｏｌ Ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｓｔｕｄｙ”，ｗｗｗ．ｌｉｏｎｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ＩＳＳＸ−２００２．ｐｄｆ）。この試料のばらつきに対する一解決策は、供給源の異なる試料をプールし、「平均的」な肝細胞の特徴を有する「複合」肝細胞調製物を作製することを含む。しかしながら、新鮮組織を得る頻度、および単離後直ちに肝細胞を凍結保存する必要性が、肝細胞プールの調製を妨げるものとして挙げられている。したがって、多くの会社（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，ＬＬＣ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなど）はプールした肝細胞の販売を避けており、そのためエンドユーザは、異なる数人の提供者に由来する肝細胞を融解およびプールすることを強いられる。プールした凍結保存ヒト肝細胞が代謝研究の妥当なモデルであるにもかかわらず、この問題は残っている（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｇ．ら（発行年不明）“Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｏｏｌｅｄ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ａｓ Ａ Ｍｏｄｅｌ Ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＿ｌａｂｗａｒｅ／ｇｅｎｔｅｓｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｄｆ／Ｓ０４Ｔ１２６．ｐｄｆ）。
このように、これまでのあらゆる進歩にもかかわらず、医学研究およびその他の目的のための肝細胞の入手を可能にする方法が依然必要とされている。さらに、ヒト肝細胞の安定的かつ再生可能な供給源が必要である。本発明により、生存率を許容できないほどに減損することなく凍結保存と融解とを繰り返し得る肝細胞調製物の作製および入手が可能となる。したがって、本発明により、プールした肝細胞調製物、特に、プールした凍結保存ヒト肝細胞調製物を作製するために多くの肝細胞試料をプールすることが可能となる。こうした進歩を利用し、現在、プールした凍結保存ヒト肝細胞が、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ボルティモア，ＭＤ）から市販されている。
本発明は、新規な細胞（たとえば、肝細胞など）組成物ならびにその製造方法および使用方法に関する。特に、本発明は、実質的な生存を維持しながら凍結保存と融解とを繰り返すことが可能となるように、細胞、特に、肝細胞の調製物を処理する方法に関する。本発明はまた、凍結保存と融解とを繰り返した細胞（たとえば、肝細胞）調製物に関する。
詳細には、本発明は特に、少なくとも２回凍結して融解した肝細胞を含み、調製物の肝細胞の５０％より多く、より好ましくは７０％以上が生存している反復凍結保存肝細胞調製物に関する。
本発明はさらに、肝細胞が、ヒト肝細胞、ブタ肝細胞、サル肝細胞、イヌ肝細胞、ネコ肝細胞、ウシ肝細胞、ウマ肝細胞、ヒツジ肝細胞および齧歯類肝細胞からなる群より選択される、こうした反復凍結保存肝細胞調製物の実施形態に関する。
本発明はさらに、該調製物が、同じもしくは異なる性別、種、もしくは健康状態のものであり得る、またはプールした調製物に所望のレベルの代謝活性をもたらす（特に、代謝活性が、ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸ、からなる群より選択される）、複数の供給源に由来する肝細胞をプールした調製物を含む、こうした反復凍結保存肝細胞調製物の実施形態に関する。
本発明はさらに、反復凍結保存肝細胞の所望の調製物の製造方法であって、肝細胞は少なくとも２回凍結して融解することが可能であり、該調製物において肝細胞の５０％より多く、より好ましくは７０％以上が生存している方法に関し、該方法は、
（Ａ）凍結して融解した肝細胞を密度勾配分画（特に、パーコール密度遠心分離）に付し、生存肝細胞を非生存肝細胞から分離し、
（Ｂ）分離した生存肝細胞を取得し、および
（Ｃ）取得した生存肝細胞を凍結保存し、それにより所望の肝細胞調製物を形成すること、
を含む。
（Ａ）凍結して融解した肝細胞を密度勾配分画（特に、パーコール密度遠心分離）に付し、生存肝細胞を非生存肝細胞から分離し、
（Ｂ）分離した生存肝細胞を取得し、および
（Ｃ）取得した生存肝細胞を凍結保存し、それにより所望の肝細胞調製物を形成すること、
を含む。
本発明はさらに、肝細胞が、ヒト肝細胞、ブタ肝細胞、サル肝細胞、イヌ肝細胞、ネコ肝細胞、ウシ肝細胞、ウマ肝細胞、ヒツジ肝細胞、および齧歯類肝細胞からなる群より選択される、こうした方法の実施形態に関する。
本発明はさらに、該調製物が、同じもしくは異なる性別、種もしくは健康状態のものであり得る、またはプールした調製物に所望のレベルの代謝活性をもたらす（特に、代謝活性が、ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸからなる群より選択される）複数の供給に由来する肝細胞をプールした調製物を含む、こうした方法の実施形態に関する。
本発明はまた、反復凍結保存肝細胞調製物の肝細胞を生体異物の存在下でインキュベートすること含むインビトロ薬物代謝を調べる方法、および生体異物の代謝的運命または肝細胞もしくはその酵素活性あるいは代謝活性に対する生体異物の影響を決定する方法に関し、該方法において肝細胞は少なくとも２回凍結して融解し、該調製物において肝細胞の５０％より多く、より好ましくは７０％以上が生存する。
本発明は、新規な細胞組成物ならびにその調製方法および使用方法に関する。特に本発明は、実質的な生存を維持しながら凍結保存と融解とを繰り返すことが可能となるように細胞の調製物を処理する方法に関する。本発明の方法は、概して、多種多様な細胞型、たとえば、肝細胞、腎細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、骨髄細胞、幹細胞、筋細胞（心筋細胞を含む）、内分泌細胞（たとえば、膵細胞、副腎細胞、甲状腺細胞など）、表皮細胞、内胚葉細胞などに適用可能である。本発明の方法を、以下に、好ましい細胞型すなわち肝細胞に関して説明する。
本発明はまた、実験上、診断上および治療上のさまざまな目的に有用な生存率の高い調製物を得るための、凍結保存と融解とを繰り返した細胞（たとえば、肝細胞）の調製物に関する。本発明は、生存率を許容し難いほど減損させることなく肝細胞調製物を繰り返し凍結保存および融解できるようにするため、後の使用に備えて凍結保存および融解される肝細胞の能力を拡張する。
本明細書で用いる場合、用語「細胞調製物」は、１種類以上の供給源に由来する細胞の液状または凍結した組成物を表す（たとえば、「肝細胞調製物」は、１種類以上の供給源に由来する肝細胞の組成物を表す）。供給源は、切除もしくは生検を行った組織もしくはドナー臓器から分離または単離された一次細胞であってもよく、または不死化もしくは形質転換された二次細胞培養物であってもよい。細胞は、任意の哺乳動物である供給源、たとえば、ヒト、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジまたは齧歯類である供給源由来のものであり得る。ヒト、ブタまたは齧歯類（特に、ラット）細胞の使用が好ましい。好ましくは、こうした調製物の肝細胞の５０％より多く、より好ましくは７０％以上が生存細胞である。
本明細書で用いる場合、用語「反復凍結保存細胞調製物」は、少なくとも２回凍結され次いで融解された細胞調製物を表す（たとえば、「反復凍結保存肝細胞調製物」は、少なくとも２回凍結され次いで融解された肝細胞調製物を表す）。こうした調製物は、３、４、５回、またはそれ以上、凍結され融解されたものであってよい。
用語「プールした調製物」は、細胞（たとえば、肝細胞）が、２、３、４、５種類またはそれ以上の異なる供給源、たとえば、異なるドナー、生検、異なる組織試料もしくは異なる組織供給源由来の切除組織、または異なる一次、二次、不死化もしくは形質転換細胞（たとえば、肝細胞）培養物などに由来する細胞（たとえば、肝細胞）調製物を表す。こうしたプールした調製物の細胞は、無作為に選択した細胞であってもよく、または、このプールした調製物に、所望のレベルの１種類以上の代謝活性（たとえば、所望のレベルのＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＰＨＥＮ、および／もしくはＣＺＸ活性を有する肝細胞調製物など）、あるいは所望の細胞特性（たとえば、同じ性別、年齢、種（たとえば、白色人種など）、もしくは健康状態（たとえば、肝炎ウイルス感染肝臓の肝細胞、ＨＩＶ−１感染肝臓の肝細胞、健常肝臓の肝細胞、喫煙者の肝細胞、肝硬変または他の疾患もしくは状態に苦しむ個体の肝細胞）の供給源に由来する肝細胞調製物など）を与えるために選択されていてもよい。たとえば、最小限のＤＥＸ活性を有するプールした肝細胞調製物を得るためには、プールした調製物は、ロット番号０６７、ＣＥＫ、ＥＴＲ、ＰＦＭ、ＶＴＡ、またはＷＷＭから調製されたものであり得る（表３を参照のこと）。
肝細胞に関して説明した好ましい実施形態において、本発明の実施は、以下のステップ：肝細胞の単離、第１の凍結保存肝細胞調製物を得るための単離した一次肝細胞の第１の凍結保存、生存肝細胞を得るための第１凍結保存肝細胞調製物の融解、ならびに凍結保存と融解とを繰り返して生存肝細胞を得るためのさらなる保存および使用を可能にするための融解生存肝細胞の再調整、の一部または全部を含む。
肝細胞の単離
本発明で使用する一次肝細胞の単離を可能とするために、多種多様な任意の方法を使用しまたは適合させ得る。たとえば、肝細胞の単離に好適な手法は、Ｍｏｒｓｉａｎｉら，（１９９５）“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，ＡＳＡＩＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ４１：１５５−１６１およびＳｅｇｌｅｎ，Ｐ．Ｏ．（１９７６）“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｃｅｌｌｓ”，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：２９−８３）に概要が示されている。Ｌｉ，Ａ．Ｐ．ら（１９９２）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ”，Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．１４：１３９−１４６に記載された２ステップのコラゲナーゼ消化手順に対しては、具体的な言及がなされている。
本発明で使用する一次肝細胞の単離を可能とするために、多種多様な任意の方法を使用しまたは適合させ得る。たとえば、肝細胞の単離に好適な手法は、Ｍｏｒｓｉａｎｉら，（１９９５）“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，ＡＳＡＩＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ４１：１５５−１６１およびＳｅｇｌｅｎ，Ｐ．Ｏ．（１９７６）“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｃｅｌｌｓ”，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：２９−８３）に概要が示されている。Ｌｉ，Ａ．Ｐ．ら（１９９２）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ”，Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．１４：１３９−１４６に記載された２ステップのコラゲナーゼ消化手順に対しては、具体的な言及がなされている。
肝細胞は、任意の好適な肝細胞培地中で培養されてよい。例示であって限定を意図するものではないが、以下の培地が挙げられる：ＣＥＭ培地（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｇ．Ａ．ら（２００１）“Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｆ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ａｓ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ Ａｎｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ”，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ．３７（１０）：６５６−６６７；Ｚｕｒｌｏ，Ｊ．ら（１９９６）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｆｏｒ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ．３２（４）：２１１−２２０；Ａｒｔｅｒｂｕｒｎ，Ｌ．Ｍ．ら（１９９５）“Ａ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２２（１）：１７５−１８７）、改変イーグル培地（またはダルベッコ改変イーグル培地）（Ａｒｉｋｕｒａ，Ｊ．ら（２００２）“ＵＷ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ｔｏｏｌ Ｆｏｒ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｉｌｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ Ｓｕｒｇ．９（６）：７４２−７４９；Ｗａｓｈｉｚｕ，Ｊ．ら（２０００）“Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｅｘｐｏｓｅｄ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ”，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．６（５）：４９７−５０４；Ｉｗａｔａ，Ｈ．ら（１９９９）“Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ａ Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｖｅｒ”，ＡＳＡＩＯ Ｊ．４５（４）：２９９−３０６；Ｓｔｕｔｅｎｋｅｍｐｅｒ，Ｒ．ら（１９９２）“Ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｏｎｎｅｘｉｎ３２ Ａｎｄ Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６ Ｂｕｔ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３”，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１（１）：４３−５４）、レイボビッツ培地（Ｃｏｕｎｄｏｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９９３）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．２３（１２）：１３９９−１４０９）、ウェイマウス（Ｖｉｎｄ，Ｃ．ら（１９９２）“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｎｄ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｏｆ Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｍａｌｅ Ａｎｄ Ｆｅｍａｌｅ Ｒａｔｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４（８）：１５２３−１５２８；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．ら（１９９１）“Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐ（１）４５０ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ−Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８２（８）：９０１−９０８；Ｄｉｃｈ，Ｊ．ら（１９８８）“Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ Ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃａｐａｃｉｔｙ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．８（１）：３９−４５；Ｇｏｅｔｈａｌｓ，Ｆ．ら（１９８４）“Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ａｓ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ Ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ”，Ｆｕｎｄａｍ Ａｐｐｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．４（３ Ｐｔ １）：４４１−４５０）、クレブス培地（Ｈｏｕｓｅ，Ｊ．Ｄ．（２００１）“Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２８１（６）：Ｅ１３００−１３０７；Ｉｒｖｉｎｅ，Ｆ．ら（１９９３）“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｉｎｓｕｌｉｎ’ｓ Ａｃｔｉｏｎ Ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｉｎｔａｃｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９３（Ｐｔ １）：２４９−２５３；Ｍａｒｓｈ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９１）“Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＩＩＩ．Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｆ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ Ｏｎ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｆｔｅｒ Ｕｐ Ｔｏ ７ Ｄａｙｓ Ｏｆ Ｓｔｏｒａｇｅ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １３（３）：５００−５０８）。
好ましい実施形態において、肝細胞は、およそ１０％のＤＭＳＯおよびおよそ９０％のウシ胎仔血清を含有する培地中で凍結保存される（Ｌｏｒｅｔｚ，Ｌ．Ｊ．ら（１９８９）“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｒａｔ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ １９：４８９−４９８；Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．Ｅ．ら（１９９７）“Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ−Ｐ４５０ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０：２１７−２２２）。
単離した肝細胞の生存率は、さまざまな任意の方法を用いて測定し得る。好ましくは、こうした生存率は、トリパンブルー排除法（たとえば、Ｂｅｒｒｙ，Ｍ．Ｎ．ら（１９９２）“Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ”，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５１（１）：１−１６を参照のこと）を用いて測定される。したがって、語句「生存肝細胞」または「生存百分率」は、本明細書で用いる場合、トリパンブルー排除法を用いて評価した肝細胞生存率をいう。
単離した一次肝細胞の凍結保存
本発明の肝細胞は、好ましくは液体窒素を用いて、最も好ましくはその単離から３６時間以内に凍結保存する。ヒト肝細胞の凍結保存に関する考慮事項は、Ｌｌｏｙｄ，Ｔ．Ｄ．Ｒ．ら（２００３）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｂａｎｋｉｎｇ”，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂａｎｋｉｎｇ ４：３−１５で考察されている。また、肝細胞を凍結保存するための好適な手順については、下記の文献：Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９５）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｏｆ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４（６）：５７９−５８６；Ｃｈｅｓｎｅ，Ｃ．ら（１９９３）“Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｅｉｎｇｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（２）：４０６−４１４；Ｃｏｕｎｄｏｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９９３）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．２３（１２）：１３９９−１４０９；Ｈｅｗｉｔｔ，Ｎ．Ｊ．ら（２００４）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｒａｔ，Ｄｏｇ Ａｎｄ Ｍｏｎｋｅｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｉｎ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｈｕｍ Ｅｘｐ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３（６）：３０７−３１６；Ｎｏｖｉｃｋｉ，Ｄ．Ｌ．ら（１９８２）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ．１８（４）：３９３−３９９；Ｓｈａｄｄｏｃｋ，Ｊ，Ｇ．ら（１９９３）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｕｎｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．９（４）：３４５−３５７；Ｚａｌｅｓｋｉ，Ｊ．ら（１９９３）“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒａｔｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｓｔｏｒｅｄ Ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（１）：１１１−１１６にも見られる。
本発明の肝細胞は、好ましくは液体窒素を用いて、最も好ましくはその単離から３６時間以内に凍結保存する。ヒト肝細胞の凍結保存に関する考慮事項は、Ｌｌｏｙｄ，Ｔ．Ｄ．Ｒ．ら（２００３）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｂａｎｋｉｎｇ”，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂａｎｋｉｎｇ ４：３−１５で考察されている。また、肝細胞を凍結保存するための好適な手順については、下記の文献：Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９５）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｏｆ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４（６）：５７９−５８６；Ｃｈｅｓｎｅ，Ｃ．ら（１９９３）“Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｅｉｎｇｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（２）：４０６−４１４；Ｃｏｕｎｄｏｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ら（１９９３）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．２３（１２）：１３９９−１４０９；Ｈｅｗｉｔｔ，Ｎ．Ｊ．ら（２００４）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｒａｔ，Ｄｏｇ Ａｎｄ Ｍｏｎｋｅｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｉｎ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｈｕｍ Ｅｘｐ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３（６）：３０７−３１６；Ｎｏｖｉｃｋｉ，Ｄ．Ｌ．ら（１９８２）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ．１８（４）：３９３−３９９；Ｓｈａｄｄｏｃｋ，Ｊ，Ｇ．ら（１９９３）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｕｎｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．９（４）：３４５−３５７；Ｚａｌｅｓｋｉ，Ｊ．ら（１９９３）“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒａｔｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｉｎ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｓｔｏｒｅｄ Ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（１）：１１１−１１６にも見られる。
好ましくは、単離した肝細胞を凍結防止培地に懸濁させ、懸濁細胞を冷凍で使用可能な容器に分配する。凍結防止培地は通常、凍結中に起こる細胞内氷晶生成など凍結保存による有害な影響を最小限にする少なくとも１種類の凍結防止剤を含有する肝細胞培地を含むものである。例示であって限定はされないが、一般的に使用されている以下の凍結防止剤：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール、アミノ酸、プロパンジオール、およびグリセロールが挙げられる。本発明における好ましい凍結防止剤はＤＭＳＯである。肝細胞の凍結保存における好適な凍結防止剤およびそれらの使用方法は、たとえば、Ｌｏｒｅｔｚ，Ｌ．Ｊ．ら（１９８９）“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｒａｔ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ．１９（５）：４８９−４９８；Ｃｈｅｓｎｅ，Ｃ．ら（１９９３）“Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｒｏｍ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｅｉｎｇｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（２）：４０６−４１４；Ｄｉｅｎｅｒ，Ｂ．ら（１９９３）“Ａ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｆｏｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｆ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ”，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３０（２）：１１６−１２７；Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｎ．ら（１９９１）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｎ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ”，５（１）：３９−５１；Ｈｏｕｌｅ，ｒ．ら（２００３）“Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ，Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓｉｔ．３１（４）：４４７−４５１；Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９９）“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ−Ｐ４５０ Ｉｎ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｒａｔ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ １２１：４９−６３に記載されている。
単離した肝細胞は、好ましくは、凍結に備えて凍結防止培地に懸濁させる。懸濁細胞は、好ましくは、細胞密度が約１０６個／ｍｌ〜約４×１０７個／ｍｌとなるよう耐冷凍性容器に分配する。好ましい凍結量は、０．１〜１０．０ｍｌの範囲にわたる。好ましい凍結量は１．０ｍｌである。
次いで、分配した肝細胞を、好ましくは速度制御された凍結プロセスを用いて、最も好ましくは約−１℃／分〜約−２５℃／分の凍結速度で、約−９０℃の最終温度に達するまで凍結保存する。凍結保存プロセスの初期段階の間に播種を行い、既に培地の凝固点よりも低い温度にまで冷却された細胞懸濁液中での制御された結晶化すなわち氷晶生成を誘導してもよい。こうした播種は、氷晶生成にかかわる損傷を最小限にする役割を果たし、したがって、細胞生存率に有益であり得る。好適な播種方法としては、凍結容器内への冷却金属ロッドの挿入、および凍結容器内への液体窒素噴射の導入が挙げられる。
所望の最終温度に達すると、凍結した細胞試料は長期保存用液体窒素式冷凍庫に移してもよい。凍結した試料は、液体窒素の液相中または液体窒素の気相中のいずれにおいて保存されてもよい。好ましくは、保存は液体窒素の気相中で行われる。液体窒素気相中での保存期間は融解後の生存率および機能にほとんど影響を与えないため、凍結した試料は、このようにして数日間、数ヶ月間あるいは数年間保存されてもよい。
凍結保存肝細胞の融解
凍結試料は、さらなる処理のために、液体窒素または液体窒素蒸気の存在下から取り出すことにより融解され得る。凍結試料は、好ましくは、予備加温した約３７℃〜約４２℃の水浴に直ちに入れることにより融解する。好ましくは、少なくとも試料容器を逆さにしたときに氷の塊が外れ得る段階まで、細胞を融解する。融解した細胞は、次いで好ましくは急速に処理し、たとえばパーコール勾配遠心分離（後述）あるいは逐次洗浄によって、ＤＭＳＯとの接触から取り除く。
凍結試料は、さらなる処理のために、液体窒素または液体窒素蒸気の存在下から取り出すことにより融解され得る。凍結試料は、好ましくは、予備加温した約３７℃〜約４２℃の水浴に直ちに入れることにより融解する。好ましくは、少なくとも試料容器を逆さにしたときに氷の塊が外れ得る段階まで、細胞を融解する。融解した細胞は、次いで好ましくは急速に処理し、たとえばパーコール勾配遠心分離（後述）あるいは逐次洗浄によって、ＤＭＳＯとの接触から取り除く。
好ましい実施形態において、細胞は、完全ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ボルティモア，ＭＤ；Ｒｏｙｍａｎｓ，Ｄ．ら（２００４）“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ １Ａ２ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０３α４ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（３）：４２７−４３７）中で融解される。該培地は、Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックス（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ボルティモア，ＭＤ）を３７℃までの水浴中に融解するまで浸すことにより融解して調製し、次いで水浴から取り出す。次いで、１．０ｍｌのＴｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックスを、４５ｍｌのＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地と混合する。Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質ミックスの添加後、該完全培地の貯蔵寿命は７日間である。バイアルを１個融解する場合、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地をおよそ３７℃まで予備加温する。加温したＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地５ｍｌを滅菌済の５０ｍｌコニカルチューブに加える。凍結肝細胞のバイアルを、注意深く冷凍庫から取り出す。バイアルを液相中に保存した場合は、そのキャップを注意深く外し、バイアル内に存在する液体窒素は完全にデカンテーションし、再度キャップを閉めた後、該バイアルを水浴に入れる。このとき、好ましくは、該バイアルを直ちに３７℃の水浴に浸し、氷は完全に溶けるがバイアルが完全に融解するのに要する時間を超えない間、バイアルを静かに振とうする。バイアルの内容物が見やすくなるよう、バイアルからラベル類ははがしておくとよいだろう。次いで、融解した内容物を、予備加温したＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地に空ける。次いで、予備加温したＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地を各バイアルに１．０ｍｌずつ加え、残った細胞を再懸濁させる。次いで、バイアルの内容物を、デカンテーションまたはピペットを用いて肝細胞懸濁液中に移す。好ましくは、受け側の容器（たとえばバイアル、試験管など）を数回（たとえば３回）静かに逆さにすることにより肝細胞を再懸濁させる。
複数のバイアルを融解する場合は、すべてのバイアルを該水浴中で同時に融解することが好ましい。前述のように、培地（好ましくは、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地）を３７℃まで加温する。凍結保存肝細胞の各バイアルに対し予備加温したＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地を５ｍｌずつ使用するに足る培地を確保することが望ましい。バイアルの融解後そのキャップを速やかに外し、その内容物を、融解したバイアル１本あたり少なくとも５ｍｌの予備加温したＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地を含む滅菌済試験管またはビーカー内に注入する。たとえば、容量５０ｍｌの容器に入れたバイアル５本に対し、好ましくは２５ｍｌの培地を使用する。
所望により、トリパンブルー排除法を用いて総細胞数および生存細胞数の測定が可能である。細胞は、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地において生存細胞濃度０．７０×ｌ０６個／ｍｌまで希釈できる。
さらなる凍結保存と融解とを可能にするための融解肝細胞の再構築
本発明の一態様は、融解した細胞を、後に１回以上再凍結および再融解され得るように再構築する能力に関する。こうした反復凍結保存肝細胞調製物は、多くの用途を有する。該調整物は、バイオ人工肝臓、肝細胞移植片、肝臓補助デバイス、肝細胞移植、およびインビトロの用途において使用され得る。特に、反復凍結保存肝細胞調製物は、インビトロ薬物代謝研究（たとえば、特有の性質（たとえば、代謝性多型、遺伝的多型など）を有する肝細胞の同定）、生体異物の代謝的運命に関する研究および肝細胞の薬物代謝性酵素プロフィールの改変における生体異物の影響に関する研究、肝臓の酵素および機能（たとえば、コレステロール代謝）に対する生体異物のＩＣ５０を決定するための阻害研究、生体異物を用いた遺伝子導入研究、生体異物を用いたタンパク質導入研究、肝細胞に対する生体異物の毒性評価、生体異物を用いた輸送研究（たとえば、Ｐ−糖タンパク質輸送系、有機イオン輸送体、有機カチオン輸送体などに関する研究）、生体異物を用いた代謝性クリアランス研究、ならびに有効性アッセイ（たとえば、リポタンパク質プロセシング、糖新生、タンパク質分泌など）において使用され得る。反復凍結保存肝細胞調製物はまた、肝炎ウイルスならびに他の感染性ウイルスおよび病原体を研究あるいは増殖させるために使用され得る。取得した細胞は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはプロテオミクス研究における使用のため、または代謝性多型の研究のために再構築され得る。反復凍結保存肝細胞調製物はまた、代謝性クリアランス研究および有効性アッセイ（たとえば、リポタンパク質プロセッシング、糖新生、タンパク質分泌など）において使用され得る。細胞は、大規模インキュベーションのためのバイオリアクターへの播種における使用、もしくはミクロＲＮＡによる遺伝子調節モデルとしての使用、または他の細胞型（たとえば、肝臓由来の非実質細胞もしくは他の供給源由来の細胞、たとえばＣａｃｏ−２細胞）との組み合わせ系における使用のために再構築され得る。
本発明の一態様は、融解した細胞を、後に１回以上再凍結および再融解され得るように再構築する能力に関する。こうした反復凍結保存肝細胞調製物は、多くの用途を有する。該調整物は、バイオ人工肝臓、肝細胞移植片、肝臓補助デバイス、肝細胞移植、およびインビトロの用途において使用され得る。特に、反復凍結保存肝細胞調製物は、インビトロ薬物代謝研究（たとえば、特有の性質（たとえば、代謝性多型、遺伝的多型など）を有する肝細胞の同定）、生体異物の代謝的運命に関する研究および肝細胞の薬物代謝性酵素プロフィールの改変における生体異物の影響に関する研究、肝臓の酵素および機能（たとえば、コレステロール代謝）に対する生体異物のＩＣ５０を決定するための阻害研究、生体異物を用いた遺伝子導入研究、生体異物を用いたタンパク質導入研究、肝細胞に対する生体異物の毒性評価、生体異物を用いた輸送研究（たとえば、Ｐ−糖タンパク質輸送系、有機イオン輸送体、有機カチオン輸送体などに関する研究）、生体異物を用いた代謝性クリアランス研究、ならびに有効性アッセイ（たとえば、リポタンパク質プロセシング、糖新生、タンパク質分泌など）において使用され得る。反復凍結保存肝細胞調製物はまた、肝炎ウイルスならびに他の感染性ウイルスおよび病原体を研究あるいは増殖させるために使用され得る。取得した細胞は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはプロテオミクス研究における使用のため、または代謝性多型の研究のために再構築され得る。反復凍結保存肝細胞調製物はまた、代謝性クリアランス研究および有効性アッセイ（たとえば、リポタンパク質プロセッシング、糖新生、タンパク質分泌など）において使用され得る。細胞は、大規模インキュベーションのためのバイオリアクターへの播種における使用、もしくはミクロＲＮＡによる遺伝子調節モデルとしての使用、または他の細胞型（たとえば、肝臓由来の非実質細胞もしくは他の供給源由来の細胞、たとえばＣａｃｏ−２細胞）との組み合わせ系における使用のために再構築され得る。
本発明の好ましい実施形態において、こうした再構築は、再凍結に先立って行う生存細胞と非生存細胞との分離を含む。好ましくは、密度勾配遠心分離がこの目的に使用される。たとえば、３０％パーコール勾配遠心分離法を使用してよい（Ｍａｄａｎ，Ａ．ら（１９９９）“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２７（３）：３２７−３３５；Ｓｕｎ，Ｅ．Ｌ．ら（１９９０）“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｆｏｒ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１４７−１５０；Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｎ．ら（１９９１）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｎ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ”，５（１）：３９−５１；Ｄｏｕ，Ｍ．ら（１９９２）“Ｔｈａｗｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９（４）：４５４−６９；Ｕｔｅｓｃｈ，Ｄ．ら（１９９２）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ Ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｏｆ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４：３０９−３１５）。たとえば、融解した細胞は、予備加温した（およそ３７℃）３０％パーコール等張性分画バッファー中に再懸濁し、次いで１００×ｇで２０分間室温にて遠心分離し、生存細胞をペレット化する。上澄みを捨て、直後の凍結保存ステップのため、または凍結保存に先立つさらなる処理のために、細胞を培地に再懸濁する。
先に凍結して融解した調製物の凍結により得られる凍結保存調製物は、好ましくは、５０％より高い、より好ましくは７０％以上の融解後細胞生存率を有する。こうした高い生存率によって、本発明において、許容し得ない細胞の減損なく、またこれまでほど多くの試料供給源を必要とせずに、肝細胞の凍結と融解とを繰り返すことが可能となる。
プールした肝細胞調製物
肝細胞の凍結および融解を繰り返すことのできる本発明の能力によって、プールした肝細胞調製物、特にプールしたヒト肝細胞調製物の作製がさらに容易になる。上記したように、個々の肝臓試料から得られる肝細胞は、異なる代謝能を有している。肝細胞の再生可能な使用または研究を促進するため、種々の供給源に由来する肝細胞をプールして複合すなわち「平均的」な肝細胞調製物を得ることにより、こうした試料のばらつきに起因する肝細胞間の差異を最小限にすることが望ましい。したがって、こうした複合肝細胞調製物は、「平均的」な肝細胞試料の代謝活性を有する調製物、または新たに単離された肝細胞の肝細胞酵素機能に近い肝細胞酵素機能を有する調製物を提供するように構成され得る。こうした代謝活性としては、たとえば、下記の酵素活性の一部および全部を含む：クマリン７−ヒドロキシラーゼ（ＣＯＵＭ）、デキストロメトルファンＯ−脱メチル化酵素（ＤＥＸ）、７−エトキシクマリンＯ−脱エチル化酵素（ＥＣＯＤ）、７−ヒドロキシクマリン（７−ＨＣＧ）の第２相代謝に関与する活性、７−ヒドロキシクマリン（７−ＨＣＳ）の第２相代謝に関与する活性、メフェニトイン４−ヒドロキシラーゼ（ＭＥＰＨ）、テストステロン６（β）−ヒドロキシラーゼ（ＴＥＳＴ）、トルブタミド４−ヒドロキシラーゼ（ＴＯＬＢ）、フェナセチンＯ−脱エチル化酵素（ＰＨＥＮ）、またはクロルゾキサゾン６−ヒドロキシラーゼ（ＣＺＸ）。こうした代謝活性アッセイを行うための基質、測定方法およびアッセイ単位を表１に示す。
肝細胞の凍結および融解を繰り返すことのできる本発明の能力によって、プールした肝細胞調製物、特にプールしたヒト肝細胞調製物の作製がさらに容易になる。上記したように、個々の肝臓試料から得られる肝細胞は、異なる代謝能を有している。肝細胞の再生可能な使用または研究を促進するため、種々の供給源に由来する肝細胞をプールして複合すなわち「平均的」な肝細胞調製物を得ることにより、こうした試料のばらつきに起因する肝細胞間の差異を最小限にすることが望ましい。したがって、こうした複合肝細胞調製物は、「平均的」な肝細胞試料の代謝活性を有する調製物、または新たに単離された肝細胞の肝細胞酵素機能に近い肝細胞酵素機能を有する調製物を提供するように構成され得る。こうした代謝活性としては、たとえば、下記の酵素活性の一部および全部を含む：クマリン７−ヒドロキシラーゼ（ＣＯＵＭ）、デキストロメトルファンＯ−脱メチル化酵素（ＤＥＸ）、７−エトキシクマリンＯ−脱エチル化酵素（ＥＣＯＤ）、７−ヒドロキシクマリン（７−ＨＣＧ）の第２相代謝に関与する活性、７−ヒドロキシクマリン（７−ＨＣＳ）の第２相代謝に関与する活性、メフェニトイン４−ヒドロキシラーゼ（ＭＥＰＨ）、テストステロン６（β）−ヒドロキシラーゼ（ＴＥＳＴ）、トルブタミド４−ヒドロキシラーゼ（ＴＯＬＢ）、フェナセチンＯ−脱エチル化酵素（ＰＨＥＮ）、またはクロルゾキサゾン６−ヒドロキシラーゼ（ＣＺＸ）。こうした代謝活性アッセイを行うための基質、測定方法およびアッセイ単位を表１に示す。
たとえば、プールした肝細胞の好ましい調製物は、表２に示した範囲内のアッセイ値を示す。あるいは、このプールした調製物を形成するために用いる肝細胞試料は、ユーザーが所望する肝臓細胞機能プロフィールを示すプールした調製物が得られるように、他の機能に比べてある特定の肝細胞機能を最大化、最小化、または強調するように選択し得る。
本発明のプールした肝細胞調製物は、同じ供給源から異なる時点で得た、または２種類以上の異なる供給源から得た肝細胞を含むものであってよい。好ましくは、プールした肝細胞調製物は、３、４、５、６種類またはそれ以上の異なる供給源から得た肝細胞をプールすることにより得られるものである。
最も好ましくは、本発明のプールした肝細胞調製物は、プール以前に凍結保存した肝細胞を少なくとも１集団含むものである。たとえば、プールした肝細胞調製物は、プール以前に凍結保存した１種類以上の肝細胞試料と、新たに単離した１種類以上の肝細胞被検物とを含むものであってよい。あるいはまた、プールした肝細胞調製物は、以前に凍結保存した肝細胞被検物のみを含むものであってもよい。表２に、正常範囲（すなわち、各アッセイの最小値から最大値までの範囲）を示す。表２の値は、ヒト凍結保存肝細胞のうち最後の１５０＋ロットから導き出したデータである。
本発明のある特定の実施形態において、肝細胞調製物は、以下のアッセイ：ＣＯＵＭアッセイ；ＤＥＸアッセイ；ＥＣＯＤアッセイ；７−ＨＣＧアッセイ；７−ＨＣＳアッセイ；ＭＥＰＨアッセイ；ＴＥＳＴアッセイ；ＴＯＬＢアッセイ；ＰＨＥＮアッセイ；ＣＺＸアッセイの少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも６つ、最も好ましくは少なくとも８つ、上記範囲内のアッセイ値を有する。
所望により、凍結保存肝細胞は、コラーゲンコート組織培養プレート上、または他の細胞外マトリックスタンパク質、たとえば、限定されないが、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、ポリ−Ｌ−リシン、ゼラチン、もしくはその任意の組み合わせでコートされた組織培養プレート上にプレーティングしてよい。好ましくは、これは、適当な量（たとえば、０．２ｍｌ〜２．５ｍｌ）の希釈細胞（たとえば、およそ０．７×１０６個／ｍｌの濃度を有する細胞）をプレート上へ希釈することにより行う。９６ウェルマイクロタイタープレート上でのプレーティングでは、細胞懸濁液をＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地で０．３５×１０６個／ｍｌの濃度までさらに希釈し、１００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに加えることが望ましい。細胞をウェル内に均一に分布させることが好ましい。これは、プレートを前後左右に静かに振とうすることにより成し遂げられる。円を描くように動かすと、細胞がウェルの中心に偏ってたまることになる。このようにして操作したヒト肝細胞は２〜４時間でプレートに接着するが、操作を最小限にしたい場合は、細胞を一晩かけて接着させてもよい。
本発明を一般的に記載したが、以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解されよう。実施例は例として挙げるのであって、特に記載のない限り、本発明の限定を意図するものではない。
融解肝細胞調製物の再凍結
凍結保存肝細胞は、以下に示すようにして融解し、再凍結させる。
凍結保存肝細胞は、以下に示すようにして融解し、再凍結させる。
準備物： ３０ｃｃ注射器、カプラー２個、１Ｌバッグ入パーコール、２Ｌバッグ入ＩｎＶｉｔｒｏＧｒｏ ＣＰ−２培地、オートクレーブ処理済み１〜２Ｌビーカー、加熱器、水浴、遠心チューブ用ラック。
手順：
１） 循環式水浴加熱器を３７〜４２℃に設定する。
２） およそ２００〜４００ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏＧｒｏ ＣＰ−２培地を１〜２Ｌのビーカーに加える。生物学的安全キャビネットに手動ピペットまたは液体操作ロボットを取り付ける。
３） およそ５０個のクリオバイアルをデューアー容器から取り出し、２つの試験管ラックに速やかに配置する。可能な場合は、バイアルの間隔をあける。
４） 固体の細胞懸濁液を加熱水浴中に浸し、バイアルを逆さにしたときに氷の塊が外れる状態になるまで浸しておく。
５） 細胞懸濁液を各バイアルからビーカー内に注入する。１ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏＧｒｏ ＣＰ−２培地を該小ビーカーから各バイアル内に加えてすすぎ、内容物を該ビーカー内に注入する。融解した細胞懸濁液を１Ｌの滅菌バッグに移す。
６） バッグ、すなわち２Ｌバッグ中のＩｎｖｉｔｒｏＧｒｏ ＣＰ−２培地および３０％の割合でバッグに入れたパーコールを、ＣＯＢＥ自動細胞処理装置に取り付け、標準的手法従って処理する。
７） 細胞の計数を行う。
８） 細胞懸濁液を凍結保存する。
１） 循環式水浴加熱器を３７〜４２℃に設定する。
２） およそ２００〜４００ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏＧｒｏ ＣＰ−２培地を１〜２Ｌのビーカーに加える。生物学的安全キャビネットに手動ピペットまたは液体操作ロボットを取り付ける。
３） およそ５０個のクリオバイアルをデューアー容器から取り出し、２つの試験管ラックに速やかに配置する。可能な場合は、バイアルの間隔をあける。
４） 固体の細胞懸濁液を加熱水浴中に浸し、バイアルを逆さにしたときに氷の塊が外れる状態になるまで浸しておく。
５） 細胞懸濁液を各バイアルからビーカー内に注入する。１ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏＧｒｏ ＣＰ−２培地を該小ビーカーから各バイアル内に加えてすすぎ、内容物を該ビーカー内に注入する。融解した細胞懸濁液を１Ｌの滅菌バッグに移す。
６） バッグ、すなわち２Ｌバッグ中のＩｎｖｉｔｒｏＧｒｏ ＣＰ−２培地および３０％の割合でバッグに入れたパーコールを、ＣＯＢＥ自動細胞処理装置に取り付け、標準的手法従って処理する。
７） 細胞の計数を行う。
８） 細胞懸濁液を凍結保存する。
Ｐｅｒｃｏｌｌ／ＲｅｄｉＧｒａｄＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してパーコール密度遠心分離を行う。Ｐｅｒｃｏｌｌは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）でコートされたコロイド状シリカで構成されている。ＲｅｄｉＧｒａｄＴＭ製剤もまたコロイド状シリカで構成されているが、共有結合によりシランでコートされている。このようなコーティングによって、該材料が無毒かつ生体材料での使用に理想的になると考えられている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｃｚｅｃｈ．ｃｚ／ｐｄｆ／ＤＦ＿ＲｅｄｉＧｒａｄ．ｐｄｆ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ５．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ａｐｔｒｉｘ／ｕｐｐ００９１９．ｎｓｆ／（ＦｉｌｅＤｏｗｎｌｏａｄ）？ＯｐｅｎＡｇｅｎｔ＆ｄｏｃｉｄ＝３１３９ＦＣ７２００６７ＣＡ６ＣＣ１２５６Ｆ３６０００８５６６Ｆ＆ｆｉｌｅ＝７１５００８７０ＡＢ．ｐｄｆ）。いずれの粒子も１．１３ｇ／ｍｌの密度を有する。Ｐｅｒｃｏｌｌ／ＲｅｄｉＧｒａｄの存在下で試料を遠心分離することにより、培地中での粒径が不均一であることから、密度勾配が自然に形成される。
Ｐｅｒｃｏｌｌ／ＲｅｄｉＧｒａｄは、０．２５Ｍスクロースを使用してもよいが、生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）などの平衡塩溶液においての使用に最も適している。９部（ｖ／ｖ）のＰｅｒｃｏｌｌ／ＲｅｄｉＧｒａｄを、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０倍濃縮細胞培地、または２．５Ｍスクロースのいずれか１部（ｖ／ｖ）に加えることにより、約３４０ｍＯｓ／ｋｇ Ｈ２０に調整された溶液が得られる。Ｐｅｒｃｏｌｌ／ＲｅｄｉＧｒａｄと塩またはスクロースの溶液との相対量を調整することにより、浸透圧の異なる溶液が作製され得る（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｒ．ら（１９８４）“Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ Ｏｆ Ｐｅｒｃｏｌｌ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｉｓｏｐｙｃｎｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ”，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４１（２）：３２２−３２８）。必要とされる浸透圧への最終調整は、塩または蒸留水を加えることによって行うことができる。濃度が１０倍以外である生理食塩水もまた、十分満足に使用し得る。
Ｐｅｒｃｏｌｌ／ＲｅｄｉＧｒａｄは、固定角ローターヘッド内での遠心分離によって、１５分後に自己生成勾配を形成する。肝細胞は、固定角またはスイングバケットローターヘッド内での５０〜１００ ｇａｖでの遠心分離によって１０〜３０分間後、分離され得る。
一次肝細胞試料のばらつき
個々の（プールしていない）肝細胞の種々の供給源の試料間のばらつきを示すため、肝細胞を８２例の異なるドナーから単離し、細胞生存率および酵素機能について分析する。下記の代謝活性：ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＴＯＬＢ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸを評価する。結果を表３に示す。
個々の（プールしていない）肝細胞の種々の供給源の試料間のばらつきを示すため、肝細胞を８２例の異なるドナーから単離し、細胞生存率および酵素機能について分析する。下記の代謝活性：ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＴＯＬＢ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸを評価する。結果を表３に示す。
プールした肝細胞の特性解析
肝細胞の凍結保存プールロットを調製し、融解後の生存率および酵素機能について解析する。以下の代謝活性：ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＴＯＬＢ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸを評価する。
肝細胞の凍結保存プールロットを調製し、融解後の生存率および酵素機能について解析する。以下の代謝活性：ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＴＯＬＢ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸを評価する。
５ドナープールまたは１０ドナープールのいずれかを含むプールした肝細胞ロットを上記のようにして６ロット調製する。肝細胞を個々のドナーから採取し、次いで凍結剤として液体窒素を使用し、個々のロットとして凍結保存する。凍結保存は、およそ１０％のＤＭＳＯおよびおよそ９０％の凍結保存培地を有する培地の入った冷凍使用可能なバイアル内に肝細胞を懸濁することにより行う。次いで、分注した肝細胞を速度制御した冷凍庫内で、およそ８０℃の最終温度に達するまで凍結させる。
プールした肝細胞調製物を形成するため、個々のロットを融解し、生存細胞をパーコール勾配遠心分離によって単離する。個々のドナー凍結保存肝細胞バイアルは、３７℃の水浴（３０〜４０℃の水浴などの範囲を示す方がよいかもしれない？）中で６０〜９０秒間融解した。融解した細胞を、３０％の等張性パーコールおよび７０％のＣＰ−２培地を含有する３７℃の培地中にデカンテーションする。この細胞懸濁液を１００ｇで２０分間遠心分離する。生存細胞を凍結保存培地中で取得し、計数する。該生存細胞を２０，０００，０００個／ｍＬに希釈する。２０％のＤＭＳ４および８０％の凍結保存培地（上記の細胞懸濁液と等容量）を含む第２の溶液を調製する。該２０％のＤＭＳＯおよび８０％の凍結保存培地をゆっくりと細胞懸濁液混合物に加える。この添加は５〜１０分間かけて行う。得られる混合物は、１０,０００，０００個／ｍＬの細胞を有する１０％ＤＭＳＯ、９０％凍結保存培地である。この溶液をクリオバイアル内に１．０ｍＬ／バイアルとなるよう分注する。次いで細胞を凍結保存する。次いで個々のロットの生存細胞をプールし、所望の範囲内の機能性アッセイ値を細胞が有する、プールした肝細胞調製物を形成する。
次いで、プールしたロットを凍結保存する。以下の表４に、プールしたロットの融解後の生存率（「％Ｖ」）および酵素機能解析の結果を示す。表３に示すように、プールは７９％（Ｓ．Ｄ．±６％）の平均生存率を有した。
比較のため、以下の表５に、凍結保存した（すなわち凍結保存の１サイクルを経た）８１ロットの融解後の生存率および酵素機能解析のデータのまとめを示す。このデータから、個々の肝細胞供給源に見られる酵素機能のロット間変動が非常に大きいことが確認できる。該データから、多種多様な酵素について「平均的」肝細胞の酵素機能に近い凍結保存細胞を提供するためのプールした肝細胞調製物を用いることの望ましさが確認される。
プールした肝細胞の融解後生存率特性解析
凍結保存肝細胞の一般的な使用は、該肝細胞を融解し、次いでこれを種々の生体異物とともにインキュベートすることである。この目的のため、少なくとも数時間、肝細胞がその生存率を維持することが好ましい。プールした凍結保存肝細胞の１ロットについて融解後生存率の経時変化を調べるため、細胞を融解し、１２ウェルプレートのウェルに分注し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。次いで、肝細胞の生存率を複数の時点で６時間まで測定する。表６はこの解析結果を示し、６時間の時点で肝細胞の３９％が生存状態を維持していた。
凍結保存肝細胞の一般的な使用は、該肝細胞を融解し、次いでこれを種々の生体異物とともにインキュベートすることである。この目的のため、少なくとも数時間、肝細胞がその生存率を維持することが好ましい。プールした凍結保存肝細胞の１ロットについて融解後生存率の経時変化を調べるため、細胞を融解し、１２ウェルプレートのウェルに分注し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。次いで、肝細胞の生存率を複数の時点で６時間まで測定する。表６はこの解析結果を示し、６時間の時点で肝細胞の３９％が生存状態を維持していた。
本明細書に挙げたすべての刊行物および特許は、引用により、あたかも個々の各刊行物あるいは特許出願が具体的に個々に示されているのと同程度に本明細書に組み込まれる。
本発明をその特定の実施形態に関して記載したが、さらなる変形が可能であること、および本出願が、一般的に本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野の範囲内で既知または慣用的手段の範囲内にあるような、また前述の本質的な特徴に適用されるような、本発明の開示からの逸脱を含むいかなる異型形態、使用または適合にも及ぶことが意図されることは理解されよう。
Claims (20)
- 少なくとも２回凍結して融解した肝細胞を含み、肝細胞のうち５０％を超える細胞が生存していることを特徴とする反復凍結保存肝細胞調製物。
- 前記肝細胞が、ヒト肝細胞、ブタ肝細胞、サル肝細胞、イヌ肝細胞、ネコ肝細胞、ウシ肝細胞、ウマ肝細胞、ヒツジ肝細胞、および齧歯類肝細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 前記肝細胞がヒト肝細胞である、請求項２に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 複数の供給源の肝細胞をプールした調製物を含む、請求項２に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 前記複数の供給源が同一の性別、種または健康状態のものである、請求項４に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 前記プールした肝細胞調製物の肝細胞が前記プールした調製物に所望のレベルの代謝活性をもたらす、請求項４に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 前記代謝活性が、ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸからなる群より選択される、請求項６に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 前記調製物の肝細胞のうち７０％を超える細胞が生存している、請求項１に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 前記調製物の肝細胞のうち８０％を超える細胞が生存している、請求項１に記載の反復凍結保存肝細胞調製物。
- 肝細胞を少なくとも２回凍結して融解することが可能であり、調製物の肝細胞のうち５０％を超える細胞が生存している、反復凍結保存肝細胞の所望の調製物を製造する方法であって、
（Ａ）凍結して融解した肝細胞を密度勾配分画に付し、生存肝細胞を非生存肝細胞から分離し、
（Ｂ）分離した生存肝細胞を取得し、および
（Ｃ）取得した生存肝細胞を凍結保存し、それにより前記所望の肝細胞調製物を形成することを特徴とする反復凍結保存肝細胞調製物の製造方法。 - 前記密度勾配分画がパーコール密度遠心分離を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記肝細胞が、ヒト肝細胞、ブタ肝細胞、サル肝細胞、イヌ肝細胞、ネコ肝細胞、ウシ肝細胞、ウマ肝細胞、ヒツジ肝細胞、および齧歯類肝細胞からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記肝細胞がヒト肝細胞である、請求項１２に記載の方法。
- 前記調製物が、複数の供給源の肝細胞をプールした調製物を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記複数の供給源が同一の性別、種または健康状態のものである、請求項１４に記載の方法。
- 前記プールした肝細胞調製物の肝細胞が前記プールした調製物に所望のレベルの代謝活性をもたらす、請求項１４に記載の方法。
- 前記代謝活性が、ＣＯＵＭ、ＤＥＸ、ＥＣＯＤ、７−ＨＣＧ、７−ＨＣＳ、ＭＥＰＨ、ＴＥＳＴ、ＰＨＥＮ、およびＣＺＸからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
- 前記調製物の肝細胞のうち７０％を超える細胞が生存可能である、請求項１０に記載の方法。
- 前記調製物の肝細胞の８０％を超える細胞が生存している、請求項１０に記載の方法。
- 反復凍結保存肝細胞調製物の肝細胞を生体異物の存在下でインキュベートすること、および生体異物の代謝的運命または肝細胞もしくはその酵素活性あるいは代謝活性に対する生体異物の影響を決定することを含むインビトロ薬物代謝を調べる方法であって、上記肝細胞が少なくとも２回凍結し、融解されたことがあり、前記調製物の肝細胞のうち５０％を超える細胞が生存していることを特徴とするインビトロ薬物代謝を調べる方法。
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